JPS637780A - 細胞への鉄供給方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は鉄イオンをキレート剤により安定化して細胞に
供給する方法及びそれに使用する無血清合成培地に関す
るものである。

［従来の技術］ 例えば、動物細胞を生体から切り離していわゆる試験管
内で培養するためには、当該細胞をよく吟味された栄養
分（アミノ酸、ビタミン、糖、電解質など）を含む等張
緩新液より構成される培地−これらはイーグルの）ＩＢ
Ｍ　、　ＲＰＭ１１６４０、ハムのＦ１２培地などとし
てなじみのものである−に適当量の動物血清を加えた培
養液が必要である。

このとき、血清は細胞の生育や増殖などにとって必要な
栄養環境をつくる役目の他に、各種の細胞増殖因子や脂
溶性ビタミン、脂質成分など或は種々の金属元素の細胞
内補給と言う重要な任務を司っている。すなわち血清の
存在によって、初めて細胞の培養が可能となったわけで
ある。

しかしながら血清は動物の繁殖環境、飼料の種類、健康
状態、採血時期成は産地などによってその品質に大きな
変動があることは周知の事実であり、細胞培養を行なう
に当っては綿密な予備培養試験のもと高品質の血清を入
手することとなる。これらの血清の選別には手間がかか
るが、血清の適否は培養の成否に直結し且つ培養液の原
価の中で血清の占める割合が８割以上を占めるほど高価
なのでおろそかにはできない。

この様に、手間と費用をかけた血清添加培地でも、培地
細胞から産業的或は医学的に重要な活性因子を抽出・精
製する際は、血清成分の存在は邪魔物となり、これらの
血清成分の除去操作が必要となる。

そこで血清を添加せず化学的に合成された成分のみで構
成された、いわゆる無血清培地の開発が要望されて久し
い。

しかしながら、これ迄に公表された無血清培地には、化
学的に構成成分が解明されていない血清アルブミン分画
を含んでいたり、血清より分離したトランスフェリン蛋
白を必須因子として添加しているのが実状である。

以下にこれ迄公表されてきた無血清培地の代表例を参考
として表示する。

（Ｄ　　ＣＩＴＴＬ培地〔ダルフレアー（Ｆ、　Ｊ、　
Ｄａｒｆ’１ｅｒ）、インセル（Ｐ、Ａ、　Ｉｎ５ｅｌ
）等、１９８２年〕基礎培地−ダルベッコ変法イーグル
培地十ノλムのＦ１２培地（１：　１） 添加物−カゼイン、インスリン、テストステロン、リノ
ール酸 （ｎ）　　５ＦＦＤ培地（Ｈ，ムラカミ等、１９８２年
）基礎培地−ダルベツコ変法イーグル培地十ノ１ムのＦ
１２培地（１：　１） 添加物−インスリン、トランスフェリン、エタノールア
ミン、セレン （至）　ＫＳＬＭ培地（Ｔ、カワモト等、１９８３年）
基礎培地−ＰＰＭ１１６４０＋ダルベツコ変法イーグル
培地＋ハムのＰＬ２培地 （２：　１　：　１） 添加物−インスリン、トランスフェリン、低比重リポ蛋
白、遊離脂肪酸不含牛血 清アルブミン、オレイン酸、エタノ ールアミン、２−メルカプトエタノー ル、セレン、ヘペス 血清添加培地の性能が血清の品質に影響を受ける事は前
述の通りであるが、無血清培地にアルブミンを添加する
場合にもアルブミン中に含まれる夾雑成分（アルブミン
は生体内で多くの重要な元素類と機能的に結合している
と言われている。）が培地性能に与える影響は少なくな
い。

更に、これら培地性能の変動要因を生む血清或は血清ア
ルブミンを除去した場合でも無血清培地の微量添加因子
としてトランスフェリンは必要とされていた。トランス
フェリンは、細胞にとって必須元素である鉄と結合し、
細胞内に取り込む役割を果すことが証明され、高価な血
清蛋白成分であるにも拘らず無血清培地に使われ続けて
きた。

［発明が解決しようとする問題点コ このように動物細胞の培養において鉄の供給は不可欠で
あるため、従来は血清或は血清成分としてアルブミン画
分や高価なトランスフェリンを合成培地に添加していた
ので、培養液のコストが高くなり或は量的な制限を受け
ていた。

又、培養液から目的の成分を抽出する場合は、これらの
添加蛋白質が不純物となりめんどうな除去操作が必要と
なる。

例えば、従来の無血清培地に添加されるトランスフェリ
ンは、通常ヒト血清より工業的に分離・精製され、高価
なものであり、培養液１リツトルに対し概略５〜ｌｏｍ
ｇ使用され、培養液原価の約２０〜４０％を占る。動物
細胞による物質生産を考えるとき、トランスフェリン蛋
白の一部或は全部を安価な化学合成物質で代替すること
は、培養液の原価低減のみならず、生産物の精製におい
てもメリットは大きい。

又、ワクチンウィルス増殖に供される細胞の培養におい
ては蛋白成分が少ないほどワクチン接種時の副作用（ア
ナフィラキシ−など）は少ないと言われているのでワク
チン製造における安全性への寄与も大きい。

更に医学、生物学或は農学など細胞培養に関連する研究
分野で、いま最も注目されているテーマは生物の癌化及
び老化の発生メカニズムの解析であろう。従来の血清を
必要とする培地はもとより、アルブミンやトランスフェ
リン等の血清成分は少なからず抗癌、老化に関与する因
子を含んでいるとみなされているので、血清成分を含ま
ない培養系の提供は新らしい研究の進展を約束するもの
として貢献度は大きい。

更に又、臨床医学的には胃潰瘍等に起因する或は遺伝的
素因による貧血や金属元素欠如疾患の病体解明に役立つ
ほか、治療法に対しても新らしい方法論を提供するもの
となろう。

他方、トランスフェリンを介さない鉄の細胞内への取り
込みは、実験的には２価鉄を細胞に素早く接触させるこ
とで可能である事は証明されている。

しかしながら、２価鉄は通常用いられる動物細胞培養用
培地の液性（中性〜弱アルカリ性）では直ちに酸化され
、水酸化第２鉄として沈殿し、産業上実用的ではない。

本発明は、トランスフェリンを含まない無血清培地にお
いて、鉄をより安定な３価鉄として処方し、同時に鉄を
適当にキレート結合する化学合成物を添加することによ
り細胞培養を可能とするもので、蛋白成分であるトラン
スフェリンの一部或は全部を代替しようとするものであ
る。

［問題点を解決するための手段］ すなわち、本発明の目的は、細胞が必要とする不溶化し
やすい鉄元素を、安定な形で細胞内に供給することにあ
る。

従来、誤飲した毒性を有する重金属類を解毒する目的で
キレート剤を投与し、体内に於て安定な錯体を形成させ
て排泄させる方法が知られている。即ち、この様なキレ
ート剤は体内の臓器や組織に不溶化し、沈着した重金属
を可溶化させ、体外に出す作用がある訳である。

本発明者等はこの様なキレート剤のもつ解毒作用の意味
をとらえ、鋭意研究の結果、或種のキレート剤は沈殿を
形成し易い金属元素を錯体として安定化することにより
、細胞に積極的に供給し得るという事を初めて細胞培養
の分野において確立したのである。

即ち、本発明は鉄をキレート剤により安定化して細胞に
供給することを特徴とする細胞への鉄供給方法と、鉄イ
オン・及びキレート剤を含有することを特徴とする細胞
用無血清合成培地にかかるものである。

ここで、細胞内に取り込まれる鉄は主として３価鉄イオ
ンであるが、細胞は２価鉄イオンも取り込み可能である
。

従って、無機又は有機の第２鉄塩或は無機又は有機の第
１鉄塩を鉄源として使用することができる。これらの鉄
源は培養細胞に悪影響を与えないものであればいずれも
使用可能であるが、例えば塩化第２鉄、硫酸第１鉄など
の可溶性のものが好ましい。

しかしながら、培養液或は体液のｐｌは中性乃至弱アル
カリ性であるため、２価鉄イオンは３価鉄イオンに酸化
され、更に水酸化第２鉄となって沈殿し易い。

キレート剤は中性乃至弱アルカリ性で３価鉄イオンと安
定な錯体を形成するものを使用する。

２価鉄イオンよりも３価鉄イオンとより安定な錯体を形
成するものが好ましい。しかし、３価鉄との結合力が強
すぎると３価鉄イオンを細胞へ供給する際の妨げとなる
ので、３価鉄イオンとのキレート安定度定数（１ｏｇＫ
ＭＬ）が１５以下のものを使用する。例えば、エチレン
ジアミンニプロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルイミ
ノ二酢酸、イミノ二酢酸などが挙げられる。

鉄の供給対象となる細胞は動物又は植物由来の細胞のい
ずれでもよく、鉄依存性の細胞にはすべて適用可能であ
る。

培地の処方としては種々の処方のものが使用可能であり
、例えば後記実施例に示した処方が適当である。又、市
販の基礎培地も使用することができる。

基礎培地としては一般的な無血清合成培地例えばイーグ
ルＨＥＭ　、ＲＰＭＩ１６４０、ダルベツコ変法イーグ
ル培地、ハムのＦ１２等を単独で或は二種以上を混合し
て使用することができる。

以上において、培養液１１当りの鉄イオンの濃度は０，
０５〜ｌｏａＭが適当であり、キレート剤の濃度は０．
１〜１５ｍＭが適当である。

本質的にはトランスフェリンやアルブミン画分、血清等
は添加不要であるが、少量のトランスフェリンを必要（
と応じて添加してもよい。

次に、本発明の無血清合成培地の調製方法を述べる。

先ず、２倍濃度の無血清合成培地（増殖因子として、例
えばインスリン、エタノールアミン、セレン、上皮性成
長因子、トリヨードサイロニンなどを含有する。）を調
製しておく。別途０．２〜３０ｍＭのキレート剤溶液を
調製すると共に鉄化合物溶液を調製し、先ずキレート剤
溶液に鉄化合物溶液を加えて錯体を形成させる。しかる
後前記２倍濃度の無血清合成培地と錯体溶液を等量混合
する。

前もって当該金属類とキレート剤を結合させておく事が
重要で、この前処理をしないでそれぞれ単独に培地の他
の成分と混合するならば効果は半減する。

鉄を例として調製方法を示す。２価鉄或は３価鉄の無機
塩０．２〜２ｇを１１となる様に０．０１規定の塩酸で
溶解し、このうち１容を９９容のキレート剤溶液に加え
る。こうして調製した錯体溶液と２倍濃度の無血清合成
培地を等量混合して目的とするトランスフェリンを含ま
ない培養液を得る。或は必要があれば適宜トランスフェ
リンを補給してもよい。又は錯体溶液を予め準備してお
き、これに他の培地成分を順次添加して所望の無血清合
成培地を処方しても勿論さしつかえない。

最終的に得られた培養液は当然のことながら一過減菌し
て無菌的に保存する。

なお、合成培地に補添されるインスリン、セレン、エタ
ールアミン、上皮性成長因子、トリヨードサイロニンな
どは細胞の増殖性を向上させるのに寄与するもので、既
に公知の物質であり、無血清培養での必須成分の一部を
構成するものである。

［作　　　用］ この様にして調製したアルブミン及びトランスフェリン
を含まないか、微量のトランスフェリンを含む無血清合
成培地を用いて、ノ１イブリドーマなどのリンパ球系細
胞や線維芽細胞などの間質系細胞もしくは腎細胞などの
上皮系細胞の培養を行なうと、以下の試験例の如く良好
な培養結果が得られた。

試験例１ 予め血清及びキレート剤などを添加していない培地（例
えばイーグルＭＥＮとＲＰＭ１１８４０培地の１：１の
混合）で２日間、マウスハイブリドーマＣ２ａ　”−Ｅ
　Ｔ細胞を３７℃の５％炭酸ガス岬卵器でで前培養し細
胞周期を停止させた後、後記実施例１．２．３の各培地
及び実施例１．２．３の処方より塩化第二鉄を除きトラ
ンスフェリンを添加した培地及び対照としてキレート剤
を添加しない培地の各々１１！を１２穴培養プレートに
同一培地を３穴宛分注し、前培養しておいたＣ２ａ−Ｅ
１細胞の５Ｘ１０’個を播き、３日間３７℃の５％炭酸
ガス解卵器で本培養した。それぞれの培地の細胞増殖支
持能力は増殖してきた生細胞数をかぞえその多寡で判定
した。その結果を表−１に示す。

トランスフェリンによる鉄の細胞内供給（これは通常血
清の添加によってまかなえられる）の代りにキレート剤
を使用することで細胞の増殖が行なわれることが明らか
である。しかし、トランスフェリンやキレート剤を添加
せずに鉄のみの補給では、細胞周期の再回転は起こらな
い。

これによってキレート剤として使用した化合物の有効性
が明らかである。

試験例２ 後記実施例１の培地、及びこの処方より塩化第二鉄を除
去した培地、或はこれらの鉄添加もしくは鉄不含培地に
鉄をまた結合させていないアポトランスフェリンもしく
は鉄イオンを飽和結合したホロトランスフェリンなどを
更に添加した培地、又はキレート剤を含んでいない無血
清培地を準備し、これらの各々の培地でのハイブリドー
マ（Ｃ２ａ−Ｅｌ）の増殖支持能を試験例１の実施要領
に準じて行い判定した。その結果を第１図に示す。

遊離の鉄或はホロトランスフェリンの存在下ではキレー
ト剤により細胞の増殖性を著しく向上させる。無血清無
アルブミン培養条件下においてはトランスフェリンの濃
度はこれまで知られている無血清培地の処方では通常５
ｍｇ７１以上、平均的には１０ｍｇ／’ｆで使用されて
いる。第１図より明らかなように、キレート剤を添加す
ることにより、常置の１０分の１程度のトランスフェリ
ンかあれば、あとは３価鉄の補給によって細胞の増殖が
改善される。これは鉄トランスフェリン結合体（ホロ型
）が細胞表面の受容体を介して細胞内に取り込まれ、鉄
は細胞内に、トランスフェリンはアポ型となって細胞外
にはき出され再度培養液中の３価鉄イオンと結合して細
胞の増殖及び代謝に利用される、いわゆるトランスフェ
リン周期をキレート剤が円滑に行わせているためである
。すなわち、キレート剤による鉄錯体はトランスフェリ
ンの不存在下においても細胞の増殖を支持し、かつトラ
ンスフェリンの存在下にあっては、トランスフェリン周
期の回転を促進させ鉄の利用効率を著しく改善するもの
である。

試験例３ 後記実施例３の培地１厭にマウスハイブリドーマＣ２ａ
−Ｅ１細胞を５ＸｌＯ’個播き、３日間３７℃５％炭酸
ガス４卵器で培養したのち、再び５Ｘ１０’の細胞数に
もどし新鮮な実施例３の培地で培養をくり返す継代培養
を行なった。その結果を第２図に示す。

トランスフェリンの不存在下において鉄錯体の添加によ
り細胞が継代培養できる。このことはほぼ完全にトラン
スフェリンの必要性（従来の知見）を根底からくつがえ
すものである。

試験例４ トランスフェリンの代りに塩化第二鉄（６水塩）　８０
ｍｇ／　ｊと下記表−２に示すキレート剤を表−２に示
す濃度に添加し、マウスハイブリドーマＣ２ａ−Ｅ　Ｉ
細胞を用いて前記試験例１の実施要領に準じて行い判定
した。その結果を表−２に示す。

３価鉄イオンとのキレート安定度定数が１５．８７以上
のキレート剤は、３価鉄イオンとの結合力が強すぎるた
め、錯体として安定化された鉄イオンを細胞が利用する
ことができず、細胞は増殖しない。以上の結果からキレ
ート剤の３価鉄イオンのキレート安定度定数は１５以下
が好ましいことがわかる。

試験例５ 後記実施例３の培地及びこの培地の処方中塩化第二鉄の
代りにトランスフェリンを添加した培地、対照として実
施例３の培地よりイミノ二酢酸を除去した培地を用いて
ＮＬＦＫ細胞（ネコ腎細胞）の増殖支持能を試験例１の
実施要領に準じて行なった。但しこの細胞は基質接着性
細胞なので細胞計測にあたってはトリプシン処理によっ
て器壁より細胞をはがして行なった。結果を表−３に示
す。

表−３ 本培養穴４個の平均値士漂準偏差（ＸＩＯ’個の細胞数
／培養穴）接着性の細胞でもリンパ球系細胞（浮遊細胞
）と同様なキレート剤による効果を認めた。即ちこのよ
うなキレート剤の作用は培養細胞−般へとその使用を拡
大できることを示唆するものである。

試験例６ 実施例３の培地及び対照としてトランスフェリンを添加
した培地の１１１にマウスノ＼イブリドーマ細胞Ｒ２−
Ｐｔ−Ｅ４−ＯＢ細胞（Ｐ３Ｕ−１ミエローマ由来抗犬
パルボウイルス抗体を産生）の５×１０４個を播き３日
間３７℃の５％炭酸ガスｍ卵器で培養する。その後、そ
の培養上清の抗体価を酵素免疫測定法を用いて半定量し
た。その結果を第３図に示す。

キレート剤を用いた無トランスフェリン培養においても
トランスフェリン添加培養と同等の抗体生産が認められ
た。これは、将来治療用にモノクローナル抗体を用いる
場合、精製時でのトランスフェリンの混入を減じ、純度
の高い抗体を得ることができることを示すものである。

試験例７ 後記実施例３の培地及び対照として１０％牛脂児血清添
加のイーグルＭＥＭ培地にｌＸ１０５個のＮＬＦＫ細胞
と、１０’−８ＴＣＩＤ切／ｘ１単位の犬パルボウィル
スを共に播き８日間３７℃の５％炭酸ガス貯卵器で培養
し、その培養上清のウィルスΩを測定した。その結果を
第４図に示す。

従来法の血清培養と同程度或はそれ以上のウィルス収量
を認めた。ワクチン製造用の腎細胞への鉄錯体の適用は
、ウィルス精製の簡素化を可能にするものであり、ワク
チン製造の産業分野においても有用なものである。

試験例８ 実施例４．５の各培地及びこれらの処方から鉄及びキレ
ート剤を除いた培地、或は対照として１０％牛血清添加
のイーグルＭＥＮをそれぞれ３　、５ｃｍ直径の培養皿
に１．５ｙｆに分注し、これに正常ヒト線維芽細胞を２
ＸＩＯ’個播き、５日間３７℃の５％炭酸ガス解卵器７
％酸素ガス及び８８％窒素ガスで培養する。そののち、
トリプシンで培養皿壁より細胞をはがし、増殖細胞数を
数えた。その結果を第５図に示す。

従来は、この種の正常細胞ではトランスフェリン不存在
下においては細胞か器壁にはりついて、しかも培養環境
の酸化還元電位が還元側に傾いている２価鉄（硫酸第一
鉄）を加えた直後のみに増殖することか知られている。

しかし、ここに示されたように、前もって培養液に処方
として３価鉄を錯体として加えておくだけで増殖し、こ
れまで知られていなかった事が新しく判明した。無アル
ブミン無トランスフェリン培地での正常の細胞のこのよ
うな新しい発想に基づく培養法はとりわけ、細胞内代謝
機能の発現制御に関する研究のみならず抗癌、老化の機
構解明に対しても新規の研究方法論を提供するものであ
る。

［実　施　例］ 以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ 下記諸成分を２回蒸溜水に溶解し、Ａ液とする。

諸成分　　　　　　　　　　量 Ｌ−アルギニン　　　　　　　　１９３．８４６ｍｇ　
／　ＩＬ−アルギニン塩酸　　　　　１５２．２４８Ｌ
−アスパラギン（１水塩）　　　８５．０５２Ｌ−アス
パラギン酸　　　　　　１９．３８４Ｌ−シスチン２塩
酸　　　　　　６３．００ＯＬ−シスチン塩酸（１水塩
）　　　３０．４８４Ｌ−グルタミン酸　　　　　　　
　１９．３８４Ｌ−グルタミン　　　　　　　　８９０
．７７０グルタチオン　　　　　　　　　　０．９７０
グリシン　　　　　　　　　　　１９．６９２Ｌ−チロ
シン　　　　　　　　　５４．２６ＯＬ−ヒスチジン　
　　　　　　　１４．５３１１Ｌ−ヒスチジン塩酸（１
水塩）　　４０．７４８Ｌ−ヒドロキシプロリン　　　
　１９．３８４Ｌ−インロイシン　　　　　　　９８．
９１２Ｌ−ロイシン　　　　　　　　　９８．９１２Ｌ
−リジン塩酸　　　　　　　１０９．５９４Ｌ−メチオ
ニン　　　　　　　　２９．０９２Ｌ−フェニルアラニ
ン　　　　　４５．５８８Ｌ−プロリン　　　　　　　
　　　２９．３８４Ｌ−セリン　　　　　　　　　５９
．０７８Ｌ−スレオニン　　　　　　　　９５．９５４
Ｌ−トリプトファン　　　　　　１４．５４８Ｌ−バリ
ン　　　　　　　　　９４．０１４ビオチン　　　　　
　　　　　　　０．２１８パントテン酸カルシウム　　
　　　１．２１２コリン塩酸　　　　　　　　　　５２
．９０８重酒石酸コリン　　　　　　　　１．７４６葉
酸　　　　　　　　　　　　　１．９４０１−イノシト
ール　　　　　　　３５．８６４ニコチン酸アミド　　
　　　　　　１．９４０パラアミノ安息香酸　　　　　
　０．９７０塩酸ピリドキシン　　　　　　　　０．９
７０塩酸ピリドキサール　　　　　　０．９７０リボフ
ラビン　　　　　　　　　　０．２９０塩酸チアミン　
　　　　　　　　　１．９４０ジアノコバラミン　　　
　　　　　０．００７３４モノエタノールアミン　　　
　　４０．０００牛インシユリン　　　　　　　　２０
．０００プトレシン２塩酸　　　　　　　０．０２５ピ
ルビン酸ナトリウム　　　　　２２０．０００チミジン
　　　　　　　　　　　　０．０２５ヒボキサンチン　
　　　　　　　０．０５０亜セレン酸ナトリウム　　　
　　　０．００３４グルコース　　　　　　　　　３，
９０８．６７４塩化ナトリウム　　　　　　１２，４１
２．７７８塩化カリウム　　　　　　　　　７７５．７
７８塩化カルシウム　　　　　　　１９４．０４２硝酸
カルシウム　　　　　　　　６７．３６２硫酸マグネシ
ウム　　　　　　　１３８．０１４リン酸−水素ナトリ
ウム　　　　７７ＢＪ５４リン酸二水素ナトリウム　　
　１１１．５７４炭酸水素ナトリウム　　　　２，８０
０．０００硫酸カナマイシン　　　　　　　６０．００
０カナマイシン　　　　　　　　　５８．２１２フエノ
ールレツド　　　　　　　１０．８８８次に４．４３６
ｇのエチレンジアミンニブロビオン酸塩酸塩を８００１
１の２回蒸留水に溶解し、水酸化ナトリウムを用いてｐ
Ｈを７．２〜７．４に調整する（Ｂ液）。塩化第二鉄の
０．２〜２０ｇを（この量は培養に供する細胞によって
適宜加減してよい）１！の０．Ｏ１規規定度の塩酸に溶
解する（Ｃ液）。Ｂ液の９９容とＣ液の１容を混合して
Ｄ液とする。Ａ液の１容とＤ液の１容を混合して所望の
無血清培地を得る。

実施例２ 実施例１におけるエチレンジアミンニブロピオン酸塩酸
塩の代わりにヒドロキシエチルイミノ二酢酸２．２８３
ｇを用いてＢ液を調製し、実施例１に準じて無血清合成
培地を調製した。

実施例３ 実施例１におけるエチレンジアミンニブロビオン酸塩酸
塩の代わりにイミノ二酢酸２．１．２８ｇを用いてｈ液
を調製し、実施例１に準じて無血清合成培地を調製した
。

実施例４ 下記諸成分を２回蒸溜水に溶解し、Ｅ液とする。

諸成分　　　　　　　　　　量Ｃｍｇ／　１　）イーグ
ルＭ　Ｅ　Ｍ　　　　　　　１８．８００アミノ酸 Ｌ−アスパラギン酸　　　　　２６．６Ｌ−グルタミン
　　　　　　　５８．４グリシン　　　　　　　　　　
１５．０Ｌ−グルタミン酸　　　　　　　０．３Ｌ−プ
ロリン　　　　　　　　　７．０Ｌ−セリン　　　　　
　　　２１．０ ビタミン、ホルモン 葉酸　　　　　　　　　　　　０．００１トリヨードサ
イロニン　　　　　０．０００４マウス上皮性成長因子
　　　　０．０２インスリン　　　　　　　　　　２．
０ビタミンＢＩ２　　　　　　　　　　０．０４ビオチ
ン　　　　　　　　　　　０．０４その他有機酸塩 プトレシン塩酸　　　　　　　０．０４ピルビン酸ナト
リウム　　　　２２０．０塩化コリン　　　　　　　　
　８２．Ｏチミジン　　　　　　　　　　　０．１４ヒ
ポキサンチン　　　　　　　　０．４８微量元素 硫酸鋼（５水塩）　　　　　　　　０．００００１硫酸
マンガン（７水塩）　　　　　０．０００００４８モリ
ブデン酸アンモニウム（１水塩） ０．００２４ 塩化ニッケル（６水塩’）　　　　　０．００００２４
メタバナジン酸アンモニウム　Ｏ，０ＯＱ１０Ｂ亜セレ
ン酸　　　　　　　　　　０．０００７８緩衝剤 炭酸水素ナトリウム　　　２，８００ 水酸化ナトリウム　　　　　３００ 次に０．１Ｂｇの硫酸第一鉄もしくは、０．２ｇの塩酸
第二鉄を１１の０．０１規定程度の塩酸に溶解する（Ｇ
液）。実施例１におけるＢ液の９９容とＦ液の１容を混
合しくＨ液）、これにＧ液を１７１０００容添加して！
液を得る。Ｅ液の１容と１液の１容を混合して所望の無
血清合成培地とする。

実施例５ 実施例１のＢ液にエチレンジアミンニブロピオン酸塩酸
塩の代わりにイミノ二酢酸２．２８３ｇを用いてＢ液を
調製し、実施例４に準じて無血清合成培地を調製した。

以上調製された無血清合成培地は低蛋白吸着性のメンブ
ランフィルタ−（孔径０．２２１１１、米国ミリポア社
のＧＶ膜として入手できる）を用いて一過滅菌し、無菌
状態を保ち冷暗所にて貯蔵する。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明の細胞への鉄供給方法によ
れば、培養細胞の増殖に不可欠であり且つ重要な作用を
果す鉄イオンを安定な錯体としたので、血清、アルブミ
ン画分、トランスフェリン等の蛋白成分を介することな
く、鉄イオンを細胞内に取り込み可能とし利用し得るよ
うにすることができる。従って、細胞は増殖し継代培養
も可能となる。

又、本発明の無血清合成培地によれば、鉄化合物をキレ
ート剤により安定な錯体としたので、鉄が不溶化するこ
となく細胞内に取り込まれて利用され、細胞が増殖し、
継代培養が可能となる。従って、従来適合検査の必要で
あった血清、アルブミン画分、或は高価なトランスフェ
リンを本質的には添加する必要がなくなり、安価に且つ
品質の安定した培地を大量に供給することができる。更
に、トランスフェリンを添加する場合でも従来の１０分
の１程度でよい。

更に又、トランスフェリン等の血清蛋白質を全く含まな
い完全無血清合成培地により細胞培養が可能となるため
、細胞生産物の分離・精製、使用の際に手間が省けると
ともに、新らしい発想に基づく培養法により新規な研究
方法論の展開が期待で−きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は細胞の増殖支持能におけるキレート剤、塩化第
二鉄（６水塩）、アポトランスフェリン、ホロトランス
フェリンの効果を比較した図、第２図は本発明による継
代培養における細胞増殖状態を示す線図、第３図は本発
明により培養した細胞の培養生産物量と鉄添加量との関
係を示す図、第４図は本発明により培養した犬バルボウ
イルスの培養土浦中のウィルス量の比較図、第５図は本
発明による正常ヒト線維芽細胞の培養細胞数比較図であ
る。 第２図 第３図 第５図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）鉄をキレート剤により安定化して細胞に供給するこ
   とを特徴とする細胞への鉄供給方法。 ２）鉄が３価及び／又は２価の鉄イオンである特許請求
   の範囲第１）項記載の細胞への鉄供給方法。 ３）キレート剤が中性乃至弱アルカリ性で少なくとも２
   価鉄イオンよりも３価鉄イオンとより安定な錯体を形成
   するキレート剤である特許請求の範囲第１）項記載の細
   胞への鉄供給方法。 ４）キレート剤が３価鉄イオンとのキレート安定度定数
   が１５以下のキレート剤である特許請求の範囲第１）項
   記載の細胞への鉄供給方法。 ５）キレート剤がエチレンジアミン二プロピオン酸塩酸
   塩、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸のい
   ずれかである特許請求の範囲第１）項記載の細胞への鉄
   供給方法。 ６）キレート剤の濃度が０．１〜１５ｍＭである特許請
   求の範囲第１）項記載の細胞への鉄供給方法。 ７）細胞が動物細胞、植物細胞のいずれかである特許請
   求の範囲第１）項記載の細胞への鉄供給方法。 ８）合成培地内において鉄を細胞に供給する方法である
   特許請求の範囲第１）項記載の細胞への鉄供給方法。 ９）合成培地が無血清合成培地、トランスフェリン非添
   加無血清合成培地、トランスフェリン少量添加無血清合
   成培地のいずれかである特許請求の範囲第８）項記載の
   細胞への鉄供給方法。 １０）３価及び／又は２価の鉄イオンと、中性乃至弱ア
   ルカリ性で少なくとも２価鉄イオンよりも３価鉄イオン
   とより安定な錯体を形成するキレート剤を含有すること
   を特徴とする細胞用無血清合成培地。 １１）キレート剤が３価鉄イオンとのキレート安定度定
   数が１５以下のキレート剤である特許請求の範囲第１０
   ）項記載の細胞用無血清合成培地。 １２）キレート剤がエチレンジアミン二プロピオン酸塩
   酸塩、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸の
   いずれかである特許請求の範囲第１０）項記載の細胞用
   無血清合成培地。 １３）鉄イオンの濃度が０．０５〜１０ｍＭである特許
   請求の範囲第１０）項記載の細胞用無血清合成培地。 １４）キレート剤の濃度が０．１〜１５ｍＭである特許
   請求の範囲第１０）項記載の細胞用無血清合成培地。 １５）基礎培地がイーグルＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、
   ダルベッコ変法イーグル培地、ハムのＦ１２のいずれか
   又はこれらの二種以上の混合培地である特許請求の範囲
   第１０）項記載の細胞用無血清合成培地。