JPH0569506B2 - - Google Patents
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- JPH0569506B2 JPH0569506B2 JP59013397A JP1339784A JPH0569506B2 JP H0569506 B2 JPH0569506 B2 JP H0569506B2 JP 59013397 A JP59013397 A JP 59013397A JP 1339784 A JP1339784 A JP 1339784A JP H0569506 B2 JPH0569506 B2 JP H0569506B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプラズミノーゲンアクチベーターの製
造法に関する。 近年、血栓に起因する疾病が重要な問題として
クローズアツプされ、その治療にストレプトキナ
ーゼ、ウロキナーゼ等が使用されてきた。しか
し、それらはいずれも目的とする血栓溶解ばかり
でなく、循環血中の凝固因子等をも分解し、出血
傾向を呈することが知られている。その原因とし
て、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ等は溶解
すべき血栓との親和性に乏しく、循環血中に於
て、血液凝固因子等を分解してしまうと考えられ
ている。従つて、血栓に対する親和性が高く、出
血傾向等の副作用が少ない血栓溶解剤の開発が求
められたのである。 そこで、血栓を溶解し、副作用の少ないとされ
るプラズミノーゲンアクチベーター（以下PAと
いう）についての研究が行なわれ、これに関する
発表も行なわれている。ヒト由来のPAに関して
は、内皮細胞及び子宮などの正常組織、さらに腫
瘍組織およびその培養細胞などから得られた酵素
について詳細な研究がなされている。（参考文献
としてはウイルソンらによるキヤンサーリサーチ
誌、40 933−938（1980）及びリツケンとコラン
によるジヤーナルオブバイオロジカルケミストリ
ー誌256 7035−7041（1981）を主要文献としてあ
げることができる）。 従来、ヒト内皮細胞、ヒト子宮細胞などの正常
組織細胞やヒトメラノーマ、乳癌細胞などの腫瘍
細胞がPAを生産することは知られている。 しかしながら、正常組織細胞ではやがて死滅し
てしまうので工業生産に使用することはできな
い。 また。従来知られているヒトメラノーマ、乳癌
細胞などの腫瘍細胞の培養はビンなどへの接着培
養によるだけであり、PAの生産性もきわめて低
く、工業的に大量生産できるというものではなか
つた。 そこで、本発明者らは、まず、浮遊撹拌培養で
きる腫瘍細胞を求めて研究した結果、ヒト横絞筋
肉腫から分離された細胞KYM−Ｉ（東京大学医
科学研究所 関口守正氏より譲受）の培養物から
浮遊して増殖できる変異株を見出し、単離するこ
とに成功したのである。この変異株は変異株
KYM−Ａと名づけられた。 更に研究を進めた結果、この変異株KYM−Ａ
を培養すれば、培養液中に著量のPAを生産蓄積
することが分つたのである。このPAはPA−
KYMと名づけられた。 一般に、ヒトには主として２種類のPAが存在
するものと考えられる。すなわち、１種類はフイ
ブリンに対する親和性の乏しいウロキナーゼ型で
あり、残る１種類はフイブリンに対して高い親和
性を示す、いわゆる組織プラズミノーゲンアクチ
ベーター（TPA）型である。 そして、腫瘍細胞でTPA型のPAを産生する細
胞株としては従来メラノーマ細胞が良く知られて
いる。メラノーマ細胞は、主としてTPA型のPA
のみを産生することから注目をあびている。一
方、他の種類の腫瘍細胞でTPA型のPAのみを産
生するものとしては例外的に乳癌細胞が報告され
ているだけである。また、これまでの検索では横
絞筋肉腫細胞はウロキナーゼ型のPAのみを産生
すると考えられてきた。 変異株KYM−Ａの培養液中にはウロキナーゼ
型のPFは検出できない。 従つて、本発明のPA−KYMはヒト横紋筋肉
腫細胞から生産されることから、由来において新
規であり、また、その理化学的性質からTPA型
のPAであると認められるものである。 本発明のPA−KYMの生産に用いる変異株
KYM−Ａは、ヒト横紋筋肉腫から分離された細
胞KYM−Ｉの培養物から分離選択培養を重ねて
見出された変異株で、浮遊攪拌培養によつてPA
−KYMを著量生産することによつてきわめて特
徴的である。本変異株KYM−Ａは浮遊攪拌培養
によつて継代培養することが可能であるが、微工
研における寄託は受理されなかつた。 変異株KYM−Ａの性質は次の通りである。 １ 個々の細胞は屈折性に富む球形を呈してい
る。 ２ 細胞は単独で浮遊細胞として存在する場合も
あるが、連鎖状または、球形の集合体を形成す
る場合もある。集合体に含まれる細胞数は約２
〜100個である。 ３ プラスチツクシヤーレーの中で培養した場
合、またはタンクによる攪拌培養をした場合本
変異株は大部分浮遊細胞として増殖することが
できる。 ４ 本変異株は浮遊攪拌培養によつて継代培養す
ることができる。 ５ 本変異株は順化培地等によつて接着性細胞に
変化する。 変化した細胞は上皮細胞様の形態を示す。 順化培地としては、本変異株以外の細胞の培
養上澄液で、適当な基礎培地を用いて適当な細
胞を１〜100時間培養し、その培養液より細胞
やその断片を除去した溶液である。本変異株以
外の細胞としては例えば、ヒト肝癌細胞
（HuH6−Cl5株、HuH7株）（中村ほか、キヤ
ンサーリサーチ、vol42 3858−3863 1982）な
どを用いることができる。 本変異株を接着性に変えるためには、上記の
順化培地を使用する以外にフイブロネクチンを
含んだ培地を使用したり、シヤーレーなどの接
着面を、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リ
ジンまたは卵白リゾチームなどの塩基性タンパ
ク質などで処理することによつて本変異株の接
着培養が可能となる。 ６ 106ケの本変異株細胞をヌードマウスの皮下
またはALS投与ハムスターの類のう内に移植
すると腫瘤を形成する。 ７ 染色体 染色体数を細胞遺伝学の常法に従つて決定し
たところ最頻染色体数は46と47で、その近辺に
多少の巾を持つ分布を示す。従つて、変異株
KYM−Ａの染色体数は、この細胞が腫瘍由来
であるに拘らず、ヒトの正常２倍体（染色体数
46本）に比較的近似していることが判つた。 ８ 本変異株はPA−KYMを著量生産する。 本発明のPA−KYMを生産する培養は接着
培養又は浮遊攪拌培養のいずれでもよい。 変異株KYM−Ａはプラスチツクシヤーレー
やガラスシヤーレーに接着し、増殖するため
PA−KYMの生産の目的で、ローラーボトル
や、マイクロキヤリヤーを利用した接着培養を
行なうことは可能である。 しかし、工業的な生産に適しているのは浮遊
攪拌培養である。 PA−KYMの生産のためには、変異株KYM
−Ａ細胞を、血清添加培地で培養し、細胞の増
殖か定常期に入る時点で無血清培地に交換する
のが好ましい。血清添加培地としては、RPMI
（Flow社製）MEM（Flow社製）又はその両者
の混合培地などに牛胎児血清を10％程度添加し
たものが良い。 また無血清培地としては基本培地として
RPMI、MEM又はその両者の混合培地などを
用い、それらにインスリン、ヒトのトランスフ
エリン、モノエタノールアミン及び亜セリン酸
を添加するのが好ましい（この四成分添加培地
を、以下ITES添加培地という） 変異株KYM−Ａ細胞のPA−KYMの生産を
目的として、細胞株を、プラスチツクシヤーレ
ーで浮遊培養し、適当な細胞数に達した時点
で、スピナーフラスコによる浮遊攪拌培養を開
始する。スピナーフラスコは、100ml乃至8000
mlの容量が好ましい。また、接種細胞密度は
104乃至105細胞／mlが好ましく、５×105乃至
２×106細胞／mlの密度で定常期に達する。培
養温度は特に規定されるものではないが、約30
〜40℃が適し、特に37℃前後が好ましい。ま
た、気相としては100％空気または、５〜10％
の炭酸ガスを含有する空気、または、５〜100
％酸素を含む空気などが好ましい。 培養は回分式でも良いが、細胞が十分生育す
れば、１〜４日間の間隔で培地を連続的に交換
して、培養を開始後１ケ月前後にわたつてPA
−KYMを含有する培養液を取得することがで
きる。 変異株KYM−Ａ細胞のPM−KYMは、プラ
ズミノーゲンをプラスミンに活性化する酵素
で、蛋白質に属することから、蛋白質の精製に
応用される一般的な方法はいずれも適用され得
る。一般には塩析、吸着、アフイニテイークロ
マトグラフイー、イオン交換クロマトグラフイ
ー、分子ふるい等の適用とそれらの適宜な組み
合わせが考えられる。また、それら精製過程は
連続式でも回分式でも可能であり、精製をする
上での効率、操作性等を考慮して選定すればよ
い。 培養して得られたPA−KYM含有無血清培
地を塩化ナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液
（Tween80および窒化ナトリウムを含む、以下
全ての乾燥液にも添加する）で十分緩衝化した
亜鉛キレートアガロースカラムに負荷する。負
荷終了後、同緩衝液を用いカラムを洗浄する。
その後、同緩衝液とイミダゾールを添加した緩
衝液とを用いグラジエント溶出する。RA−
KYM活性はイミダゾールのグラジエト部分に
認められる。活性画分を集めた後、ポリエチレ
ングリコールを用い濃縮し、りん酸緩衝液に対
して、４℃で24時間、外液を交換しつつ透析を
行う。 PA−KYM活性は透析内液に認められる。
ここに得られた透析内液は、同じリン酸乾燥液
にて充分に緩衝化されたコンカナバリンＡセフ
アロースカラムに負荷する。負荷を終了した
後、同緩衝液でカラムを洗浄する。続いて、カ
リウムチオシアネートおよびα−メチルマンノ
シドを添加した乾燥液とを用いグラジエント溶
出する。PA−KYM活性はカリウムチオシア
ネートおよびα−メチルマンノシドのグラジエ
ント溶出部分に認められる。活性画分を集めた
後、ポリエチレングリコールを用い適量まで濃
縮し、その後Tween80および窒化ナトリウム
を含む生理食塩水等に対して、４℃24時間、透
析外液を交換しつつ透析する。透析後、透析内
液中に、白濁した沈殿が生ずるが、この沈殿を
遠心分離によつて、回収する。PA−KYM活
性は、おもに回収された沈殿部分に認められ
る。この沈殿をカリウムチオシアネートを含む
リン酸緩衝液少量に溶解せしめ、遠心分離して
不溶物を遠心除去した後、PA−KYM活性を
含有する上清液を得る。 ここに得られた上澄液を、カリウムチオシア
ネートを含むリン酸緩衝液にて、充分に、緩衝
化された、スヘアデツクス（Ｇ−200）カラム
に負荷し、同緩衝液で展開すると、PA−
KYM活性を含有する、流出分画が得られる。 次に、精製されたPA−KYMの理化学的性質
を示す。 ａ ヒト横紋筋肉腫細胞変異株KYM−Ａの生産
物である。 ｂ 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で
測定した非還元型の本物質は分子量約56000か
ら62000の間に近接した２本のバンドを有して
いる。また、同様の方法で測定した還元型の本
物質は分子量約32000及び約36000に２本のバン
ドを有している。 ｃ 作用及び基質特異性 本物質はプラズミノーゲンの存在下でフイブ
リンの溶解反応を引き起す酵素蛋白質であり、
この反応にはプラズミノーゲンの存在が必要で
あることから典型的なプラズミノーゲンアクチ
ベーターと呼ばれる物質群に属し、ウロキナー
ゼと比較した場合ウロキナーゼよりはるかに強
力なフイブリンに対する結合能力を示す。 また合成基質Ｓ−2444を基質として用いた場
合のKmは1.32×10-3Mであり、Vmaxは
0.046IU／min・mlである。 ｄ 至適PH 至適PHは約８−10で、作用曲線は第１図に示
される。 ｅ 安定PH 安定PHは、約５〜11で、残存活性％は第２図
に示される。 ｆ 作用適温の範囲 30〜45℃で作用温度曲線は、第３図に示され
る。 ｇ 温度耐性 90分間の加熱処理で50℃まではほとんど失活
しないが、60℃以上で、残存活性は60％以下に
なる。残存活性％は第４図に示される。 ｈ 阻害 各阻害剤0.1ｍＭ、１ｍＭ及び10ｍＭで残存
活性を調べ表１の結果を得る。 【表】 薬剤無添加の試量の活性を100％として、阻
害および活性化の検討を行なつた。 ｉ アミノ酸組成 酵素蛋白質である本物質を6N塩酸で加水分
解をし、アミノ酸分析に付すと、表２の結果を
得た。アミノ酸組成は、全アミノ酸残基数に対
する％で示した。 【表】 の定量は行なわなかつた。
ｊ 紫外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第
５図に示す通りである。 ｋ 溶剤に対する溶解度 水、リン酸緩衝液などの塩類溶液に対する溶
解度は約50μｇ／mlで、それ以上の濃度の溶液
を調製するときは溶解促進剤、例えば1.6Mの
カリウムチオシアネートの存在を必要とする。 エタノールやエーテルなどの有機溶媒には不
溶である。 ｌ 物質の性状 凍結乾燥標品は白色粉末である。 ｍ 呈色反応 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
なつたのち、PAS反応を行なうと、糖蛋白質
に特有なピンク色の呈色を示し、糖蛋白質であ
ることが示された。また本物質はコンカナバリ
ンＡ−アガロース樹脂に親和性を示すことから
も糖蛋白質であることが示唆された。 ｎ 等電点 本物質を8M尿素の存在下でクロマトフオー
カシング法で分析したところ主成分の等電点は
PH7.5乃至8.0であり、副成分の等電点はPH7.0乃
至7.5であり、弱塩基性蛋白質の混合物である
ことが示された。 次に、PA−KYMの活性を測定法を示すが、
従来のPAの活性の測定法と同じである。 (i) フイブリンプレート法（アストラツプらの方
法に準ず。）（Arch.Biochem.Biophys.40 346
−351（1952））フイブリノーゲンおよびプラズ
ミノーゲンを含むアガロース懸濁液に37℃でス
ロンビンを作用させることにより、プラズミノ
ーゲンを含有するフイブリンプレートを作製す
る。フイブリンプレートは直径３mmの活性測定
用試料の添加穴が開けられる。この試料穴には
試料容量５〜10μが添加され、添加されたフ
イブリンプレートは約37℃のふ卵器に静置さ
れ、一定時間の後にとり出し、明確なフイブリ
ン溶解ゾーンの直径を測定する。試料中の活性
はフイブリン溶解ゾーンの直径に反映されるの
で、直径の大きさを比較して活性を求める。 (ii) 合成基質（Ｓ−2251）を用いる２段階反応を
利用するPA−KYM活性測定法。 0.15M塩化ナトリウムを含む50ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（PH7.4）に溶解したプラズミノー
ゲンとPA−KYM溶液〔0.15M塩化ナトリウム
を含む50ｍＭトリス−塩酸緩衝液溶液（PH
7.4）〕とを37℃で10分間保持する（第１段階反
応）、正確に10分間保持した後、ただちに
0.33Mリジン溶液〔0.15M塩化ナトリウムを含
む0.15Mトリス−塩酸緩衝液を加え、第１段反
応を停止する。 続いて合成基質溶液〔0.15M塩化ナトリウム
を含む50ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）に
合成基質Ｓ−2251を３mg／ml溶解した溶液〕を
用い、37℃で30分間保持し、第１段反応で生じ
たプラズミン含量を比色定量（波長405nｍ）
する（第２段反応）。なお、第２段反応の停止
は、正確に30分間保持した後、ただちに2.5M
酢酸溶液を加えることにより実施する。PA−
KYM活性は405nｍの吸収によつて測定され
る。 (iii) 合成基質（Ｓ−2444）を用いる１段階反応を
利用するPA−KYM活性測定法。0.15M塩化ナ
トリウムを含む50ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH
8.8）に溶解したPA−KYM溶液〔1.6Nカリウ
ムチオシアネートを含む50ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.5）〕に、合成基質溶液〔合成基質Ｓ−
2444を0.15M塩化ナトリウムを含む50ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.8）に３mg／ml溶解した
溶液〕を加え、37℃で正確に90分間保持した
後、25M酢酸溶液で反応を停止し、PA−
KYM活性を比色定量（波長405nｍ）する。 本発明のPA−KYMは血液中に生じた血栓
を溶解するのに有効に使用される。 本発明のPA−KYMは、静脈内投与可能な
剤型が好ましい。組成物の添加剤としてはマン
ニツト、アルブミン、ゼラチン、亜硫酸水素ナ
トリウム等の安定化剤；水酸化ナトリウム、リ
ン酸ナトリウム等のPH調整剤；塩化ナトリウ
ム、マンニツト、ブドウ糖等の等張化剤などを
挙げることができる。 本発明のPA−KYMの臨床使用における投
与量および投与方法は、100−100000IUの本品
を上記添加剤を含む溶液として、年令、体重、
症状、経過などに応じて、適宜加減して、静脈
内注射、点滴静注、点滴注射、結膜下又は球後
注射して用いる。 次に本発明の実施例示す。 実施例 １ 培養 変異株KYM−Ａの培養には、培地１あたり
重炭酸ナトリウム2.0ｇ、Ｎ−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸
1.192ｇ、硫酸カナマイシン60mgを含みさらに熱
不活性化した牛胎児血清（米国KCバイオロジカ
ル社）を最終濃度10％に加えたRPMI−1640培地
（米国フローラボラトリーズ社）、または、培地１
あたり重炭酸ナトリウム2.0ｇ、硫酸カナマイ
シン60mgを含み、さらに熱不活性化した牛胎児血
清を最終濃度10％に加えたMEM培地（米国フロ
ーラボラトリー社）、または上記の２種類の培地
を１対１に混合したものを用いる。 KYM−Ａ細胞をプラスチツクシヤーレーに接
種して、増殖の結果約100mlの細胞懸濁液が得ら
れた時点で、スピナーフラスコを用いた浮遊攪拌
培養を開始する。スピナーフラスコのサイズを次
第に大きくすることによつて、８の浮遊攪拌培
養が可能である。各段階の接種初密度は、104乃
至105細胞／mlであつて、５×105乃至２×106細
胞／mlに達した時点で植え接ぎをする。 実施例 ２ 採取 細胞密度が５×105乃至２×106細胞／mlに達し
た時点で無血清培地に交換する。その培地は１
当り重炭酸ナトリウム2.0ｇ、Ｎ−ヒドロキシエ
チルピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸
1.192ｇ硫酸カナマイシン60mg、インスリン8.5
mg、ヒトのトランスフエリン（シグマ社製）１
mg、エタノールアミン4.6mg及び亜セレン酸13μ
ｇ、アプロチニン（シグマ社）20KIU／mlを含
むRPMI−1640培地である。この無血清培地中で
浮遊攪拌培養を１乃至４日間行ない、これを、４
乃至10回繰り返して、過、取得した回収液を精
製に供する。 実施例 ３ 精製 実施例２で得られた回収液をそれぞれ合一しア
プロチニン、Tween80および窒化ナトリウムを、
それぞれ最終濃度が20KIU／ml、0.01および0.02
％になるように加える。（以下すべての緩衝液に
はこの３種類の薬品をこの濃度に添加する。）こ
の試料を以下の方法で精製した。 (a) Porathらの方法（Nature、Uol258 598−
599、1975）で調整した亜鉛キレートアガロー
スカラム（９cmφ×21cm）を1MNaClを含む20
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.05）で十分緩衝
化した後、培養液30を負荷する。負荷終了
後、同緩衝液を3000ml流し、カラムを洗浄す
る。通過した培養液およびカラムの洗浄液に
はPA−KYM活性は認められなかつた。続い
て同緩衝液1500mlと同緩衝液に150ｍＭイミダ
ゾールを含ませた緩衝液（PH7.3）とでグラジ
エント溶出を行い、１フラクシヨン15mlの割合
で画分する。各フラクシヨンについてPA−
KYM活性を測定すると分画番号125番を中心
としてPA−KYM活性が顕著であつた。この
活性画分を透析チユーブに集め、ポリエチレン
グリコール20000の粉末をふりかけ４℃で濃縮
する。濃縮後、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.7）
に対して４℃で24時間外液を交換しつつ透析を
行う。透析終了後、チユーブ内溶液を遠心分離
（10000rpm、10min）し上澄液を得る。 (b) このようにして得られたPA−KYMを含む
溶液130mlを予め0.01Mリン酸緩衝液（PH6.7）
で十分緩衝化したコンカナバリンＡセフアロー
スカラム（１×20cm）（Pharmacia Fine
Chemicals社）に負荷する。負荷を終了後、同
一の緩衝液100mlで洗浄する。つづいて、同緩
衝液（150ml）と、それに0.6Mカリウムチオシ
アネートおよび3Mα−メチルマンノシドを含
む緩衝液（150ml）とで形成した着接勾配で溶
出を行なう。分画は、3.5mlずつ集め、分画番
号32番を中心として、PA−KYM活性が認め
られた。 この画分を集めたのち、ポリエチレングリコ
ール20000を用いて５mlに濃縮し、これを40℃
で生理食塩水に対して24時間、透析外液を交換
しつつ透析する。透析中に酵素溶液は白濁し、
遠心分離（15000rpm、30分）をすると、沈殿
画分にPA−KYM活性が回収される。この段
階で、ゲル口過去ではPA−KYMより高分子
と認められる蛋白質を中心とした混在蛋白質の
除去が可能であつた。遠心分離で得られた沈殿
物を、２mlの1.6Nカリウムチオシアネートを
含む0.01Mリン酸緩衝液（PH6.7）に溶解する。
完全に溶解し得ない残渣を遠心分離によつて除
去した後、PA−KYM活性を有する上清液を
得る。ここに得られた液を1.6Nカリウムチオ
シアネートを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH6.7）
で充分に緩衝化したセフアデツクスＧ−200
（Pharmacia Fine Chemicals）のカラム（1.6
×85cm）に負荷し、同一の緩衝液で展開する。
分画は2.4mlずつ分取すると、分画番号35番を
中心として、PA−KYM活性が認められる。 以上のように、分別沈殿法を含めて４段階の
方法でPA−KYMの精製標品が得られたが、
各段階の精製度を表３に示した。 【表】 蛋白質濃度はローリー法により求め、μ
ｇ／mlで表示した。 適当容量（ａml）酵素溶液を用いて合成基
質Ｓ−2444を用いた発色反応を37℃で90分間
行なう。その場合の405nｍにおける発色度
OD405＝ｂであつた場合、表示の酵素濃度Ｃ
はＣ＝ｂ×1.0／ａで表わす。 比活性は、／である。 精製度は、培地の状態を1.0であるとし、
各段階での比活性の上昇を示したものである。 実施例 ４ 分子量および純度 実施例３で得られた精製標品について、分子量
を決定し、同時に純度を検定した。 はじめに非還元標品を、Laemmliの方法
（Nature Vol227 680（1970））に準じて10％のア
クリルアミドを含んだSDSポリアクリルアミド電
気泳動を室温で、５ｍＡの定電流で18時間行なつ
た。このようにして得られたゲルを、2.5％の
Triton Ｘ−100水溶液中で１時間振トウし、
SDSを除去する。これをフイブリンおよびプラズ
ミノーゲンを含んだアガロースプレート
（Granelli Piperno and Reich、J.Exp.Med Vol
148 223−234、（1978）に準じて作製した）に重
層させ、37℃に、１乃至５時間保持した後観察す
ると、推定分子量が56000乃至62000の付近に近接
する２本の溶解ゾーンが見られ、それ以外の場所
には溶解ゾーンは観察されなかつた。一方、同様
のフイブリンプレートに重層する分析方法で、ア
ガロースゲルにプラズミノーゲンを添加しなかつ
た場合には、溶解ゾーンが観察できないことか
ら、フイブリンの溶解は、プラズミノーゲンに依
存することが判明した。また、フイブリンプレー
トに抗ウロキナーゼ抗血清のIgG分画を20μｇ／
mlに加えた場合は、溶解ゾーンはIgGを添加しな
いフイブリンプレートと同程度である。従つて、
分子量が56000乃至62000の付近に存在する２本の
バンドは、ウロキナーゼ型のプラズミノーゲン活
性化因子ではなく、TPA型のPAに属するもので
あることが示された。 実施例３で得られたPA−KYMの精製標品
（約0.1μｇ）を非還元のまま、若しくは、５％２
−メルカプトエタノールの添加によつて還元して
上記と同様の方法でSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法によつて分離した。このようにして
得られたゲルをOaklyらの方法（Analytical
Biochem Vol 105 361−363（1980））に準じて、
含有される蛋白質の染色を行なつた。このように
して得られた結果から、非還元の精製標品は、分
子量56000乃至62000の付近に２本のバンドを示
し、還元した標品では、分子量約32000及び約
36000に２本のバンドが見られた。さらに、これ
らのバンド以外には、顕著なバンドが観察されな
いことから、精製標品は、ほぼ純粋な状態にまで
精製されたことが示された。 なお、分子量測定に用いた分子量が既知の標準
蛋白質は、フオスフオリラーゼｂ（94000）、牛血
清アルブミン（67000）、卵白アルブミン（43000）
及び炭酸アンハイドラーゼ（30000）である。 実施例 ５ フイブリンに対する親和性の検討 CNBr−activated Sepharose 4B（Pharmacia
社）10ｇを１ｍＭ HCl2で膨潤、洗浄後フイ
ブリノーゲン（Kabi社）１ｇを0.5MNaCl／
0.1MNaHCO3（PH8.3）のカツプリング緩衝液200
ml中で、室温約10時間放置し吸着させた。次のこ
の樹脂をトロンビン（２単位、牛トロンビン、持
田製薬）を含んだ0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5）
100ml中に入れ、37℃で10分間保温してfibrin−
Sepharose樹脂を得た。このようにして得られた
樹脂をミニカウムに充填し（６ml）0.05Mリン酸
緩衝液（0.01％Tween80を含む、PH7.5）で平衡
化した。このカラムにPA−KYM溶液またはウ
ロキナーゼ溶液１mlを負荷した。まず、0.05Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）15mlで洗浄し、この分画を
１ml毎に回収した。ついで、1.6Mカリウムチオ
シアネートを含む同一のリン酸緩衝液25mlで展開
し、１mlの分画に分取した。洗浄液およびカリウ
ムチオシアネート溶液に含まれる酵素活性を合成
基質Ｓ−2444を用いて測定して回収率を求めた。
表４に示したようにPA−KYMは洗浄液に含ま
れず、その溶出にはカリウムチオシアネートを必
要とすることからフイブリンに対する親和性が高
いと評価されるが、ウロキナーゼは親和性に乏し
く、洗浄液中にその活性が回収される。 【表】 【表】
造法に関する。 近年、血栓に起因する疾病が重要な問題として
クローズアツプされ、その治療にストレプトキナ
ーゼ、ウロキナーゼ等が使用されてきた。しか
し、それらはいずれも目的とする血栓溶解ばかり
でなく、循環血中の凝固因子等をも分解し、出血
傾向を呈することが知られている。その原因とし
て、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ等は溶解
すべき血栓との親和性に乏しく、循環血中に於
て、血液凝固因子等を分解してしまうと考えられ
ている。従つて、血栓に対する親和性が高く、出
血傾向等の副作用が少ない血栓溶解剤の開発が求
められたのである。 そこで、血栓を溶解し、副作用の少ないとされ
るプラズミノーゲンアクチベーター（以下PAと
いう）についての研究が行なわれ、これに関する
発表も行なわれている。ヒト由来のPAに関して
は、内皮細胞及び子宮などの正常組織、さらに腫
瘍組織およびその培養細胞などから得られた酵素
について詳細な研究がなされている。（参考文献
としてはウイルソンらによるキヤンサーリサーチ
誌、40 933−938（1980）及びリツケンとコラン
によるジヤーナルオブバイオロジカルケミストリ
ー誌256 7035−7041（1981）を主要文献としてあ
げることができる）。 従来、ヒト内皮細胞、ヒト子宮細胞などの正常
組織細胞やヒトメラノーマ、乳癌細胞などの腫瘍
細胞がPAを生産することは知られている。 しかしながら、正常組織細胞ではやがて死滅し
てしまうので工業生産に使用することはできな
い。 また。従来知られているヒトメラノーマ、乳癌
細胞などの腫瘍細胞の培養はビンなどへの接着培
養によるだけであり、PAの生産性もきわめて低
く、工業的に大量生産できるというものではなか
つた。 そこで、本発明者らは、まず、浮遊撹拌培養で
きる腫瘍細胞を求めて研究した結果、ヒト横絞筋
肉腫から分離された細胞KYM−Ｉ（東京大学医
科学研究所 関口守正氏より譲受）の培養物から
浮遊して増殖できる変異株を見出し、単離するこ
とに成功したのである。この変異株は変異株
KYM−Ａと名づけられた。 更に研究を進めた結果、この変異株KYM−Ａ
を培養すれば、培養液中に著量のPAを生産蓄積
することが分つたのである。このPAはPA−
KYMと名づけられた。 一般に、ヒトには主として２種類のPAが存在
するものと考えられる。すなわち、１種類はフイ
ブリンに対する親和性の乏しいウロキナーゼ型で
あり、残る１種類はフイブリンに対して高い親和
性を示す、いわゆる組織プラズミノーゲンアクチ
ベーター（TPA）型である。 そして、腫瘍細胞でTPA型のPAを産生する細
胞株としては従来メラノーマ細胞が良く知られて
いる。メラノーマ細胞は、主としてTPA型のPA
のみを産生することから注目をあびている。一
方、他の種類の腫瘍細胞でTPA型のPAのみを産
生するものとしては例外的に乳癌細胞が報告され
ているだけである。また、これまでの検索では横
絞筋肉腫細胞はウロキナーゼ型のPAのみを産生
すると考えられてきた。 変異株KYM−Ａの培養液中にはウロキナーゼ
型のPFは検出できない。 従つて、本発明のPA−KYMはヒト横紋筋肉
腫細胞から生産されることから、由来において新
規であり、また、その理化学的性質からTPA型
のPAであると認められるものである。 本発明のPA−KYMの生産に用いる変異株
KYM−Ａは、ヒト横紋筋肉腫から分離された細
胞KYM−Ｉの培養物から分離選択培養を重ねて
見出された変異株で、浮遊攪拌培養によつてPA
−KYMを著量生産することによつてきわめて特
徴的である。本変異株KYM−Ａは浮遊攪拌培養
によつて継代培養することが可能であるが、微工
研における寄託は受理されなかつた。 変異株KYM−Ａの性質は次の通りである。 １ 個々の細胞は屈折性に富む球形を呈してい
る。 ２ 細胞は単独で浮遊細胞として存在する場合も
あるが、連鎖状または、球形の集合体を形成す
る場合もある。集合体に含まれる細胞数は約２
〜100個である。 ３ プラスチツクシヤーレーの中で培養した場
合、またはタンクによる攪拌培養をした場合本
変異株は大部分浮遊細胞として増殖することが
できる。 ４ 本変異株は浮遊攪拌培養によつて継代培養す
ることができる。 ５ 本変異株は順化培地等によつて接着性細胞に
変化する。 変化した細胞は上皮細胞様の形態を示す。 順化培地としては、本変異株以外の細胞の培
養上澄液で、適当な基礎培地を用いて適当な細
胞を１〜100時間培養し、その培養液より細胞
やその断片を除去した溶液である。本変異株以
外の細胞としては例えば、ヒト肝癌細胞
（HuH6−Cl5株、HuH7株）（中村ほか、キヤ
ンサーリサーチ、vol42 3858−3863 1982）な
どを用いることができる。 本変異株を接着性に変えるためには、上記の
順化培地を使用する以外にフイブロネクチンを
含んだ培地を使用したり、シヤーレーなどの接
着面を、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リ
ジンまたは卵白リゾチームなどの塩基性タンパ
ク質などで処理することによつて本変異株の接
着培養が可能となる。 ６ 106ケの本変異株細胞をヌードマウスの皮下
またはALS投与ハムスターの類のう内に移植
すると腫瘤を形成する。 ７ 染色体 染色体数を細胞遺伝学の常法に従つて決定し
たところ最頻染色体数は46と47で、その近辺に
多少の巾を持つ分布を示す。従つて、変異株
KYM−Ａの染色体数は、この細胞が腫瘍由来
であるに拘らず、ヒトの正常２倍体（染色体数
46本）に比較的近似していることが判つた。 ８ 本変異株はPA−KYMを著量生産する。 本発明のPA−KYMを生産する培養は接着
培養又は浮遊攪拌培養のいずれでもよい。 変異株KYM−Ａはプラスチツクシヤーレー
やガラスシヤーレーに接着し、増殖するため
PA−KYMの生産の目的で、ローラーボトル
や、マイクロキヤリヤーを利用した接着培養を
行なうことは可能である。 しかし、工業的な生産に適しているのは浮遊
攪拌培養である。 PA−KYMの生産のためには、変異株KYM
−Ａ細胞を、血清添加培地で培養し、細胞の増
殖か定常期に入る時点で無血清培地に交換する
のが好ましい。血清添加培地としては、RPMI
（Flow社製）MEM（Flow社製）又はその両者
の混合培地などに牛胎児血清を10％程度添加し
たものが良い。 また無血清培地としては基本培地として
RPMI、MEM又はその両者の混合培地などを
用い、それらにインスリン、ヒトのトランスフ
エリン、モノエタノールアミン及び亜セリン酸
を添加するのが好ましい（この四成分添加培地
を、以下ITES添加培地という） 変異株KYM−Ａ細胞のPA−KYMの生産を
目的として、細胞株を、プラスチツクシヤーレ
ーで浮遊培養し、適当な細胞数に達した時点
で、スピナーフラスコによる浮遊攪拌培養を開
始する。スピナーフラスコは、100ml乃至8000
mlの容量が好ましい。また、接種細胞密度は
104乃至105細胞／mlが好ましく、５×105乃至
２×106細胞／mlの密度で定常期に達する。培
養温度は特に規定されるものではないが、約30
〜40℃が適し、特に37℃前後が好ましい。ま
た、気相としては100％空気または、５〜10％
の炭酸ガスを含有する空気、または、５〜100
％酸素を含む空気などが好ましい。 培養は回分式でも良いが、細胞が十分生育す
れば、１〜４日間の間隔で培地を連続的に交換
して、培養を開始後１ケ月前後にわたつてPA
−KYMを含有する培養液を取得することがで
きる。 変異株KYM−Ａ細胞のPM−KYMは、プラ
ズミノーゲンをプラスミンに活性化する酵素
で、蛋白質に属することから、蛋白質の精製に
応用される一般的な方法はいずれも適用され得
る。一般には塩析、吸着、アフイニテイークロ
マトグラフイー、イオン交換クロマトグラフイ
ー、分子ふるい等の適用とそれらの適宜な組み
合わせが考えられる。また、それら精製過程は
連続式でも回分式でも可能であり、精製をする
上での効率、操作性等を考慮して選定すればよ
い。 培養して得られたPA−KYM含有無血清培
地を塩化ナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液
（Tween80および窒化ナトリウムを含む、以下
全ての乾燥液にも添加する）で十分緩衝化した
亜鉛キレートアガロースカラムに負荷する。負
荷終了後、同緩衝液を用いカラムを洗浄する。
その後、同緩衝液とイミダゾールを添加した緩
衝液とを用いグラジエント溶出する。RA−
KYM活性はイミダゾールのグラジエト部分に
認められる。活性画分を集めた後、ポリエチレ
ングリコールを用い濃縮し、りん酸緩衝液に対
して、４℃で24時間、外液を交換しつつ透析を
行う。 PA−KYM活性は透析内液に認められる。
ここに得られた透析内液は、同じリン酸乾燥液
にて充分に緩衝化されたコンカナバリンＡセフ
アロースカラムに負荷する。負荷を終了した
後、同緩衝液でカラムを洗浄する。続いて、カ
リウムチオシアネートおよびα−メチルマンノ
シドを添加した乾燥液とを用いグラジエント溶
出する。PA−KYM活性はカリウムチオシア
ネートおよびα−メチルマンノシドのグラジエ
ント溶出部分に認められる。活性画分を集めた
後、ポリエチレングリコールを用い適量まで濃
縮し、その後Tween80および窒化ナトリウム
を含む生理食塩水等に対して、４℃24時間、透
析外液を交換しつつ透析する。透析後、透析内
液中に、白濁した沈殿が生ずるが、この沈殿を
遠心分離によつて、回収する。PA−KYM活
性は、おもに回収された沈殿部分に認められ
る。この沈殿をカリウムチオシアネートを含む
リン酸緩衝液少量に溶解せしめ、遠心分離して
不溶物を遠心除去した後、PA−KYM活性を
含有する上清液を得る。 ここに得られた上澄液を、カリウムチオシア
ネートを含むリン酸緩衝液にて、充分に、緩衝
化された、スヘアデツクス（Ｇ−200）カラム
に負荷し、同緩衝液で展開すると、PA−
KYM活性を含有する、流出分画が得られる。 次に、精製されたPA−KYMの理化学的性質
を示す。 ａ ヒト横紋筋肉腫細胞変異株KYM−Ａの生産
物である。 ｂ 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で
測定した非還元型の本物質は分子量約56000か
ら62000の間に近接した２本のバンドを有して
いる。また、同様の方法で測定した還元型の本
物質は分子量約32000及び約36000に２本のバン
ドを有している。 ｃ 作用及び基質特異性 本物質はプラズミノーゲンの存在下でフイブ
リンの溶解反応を引き起す酵素蛋白質であり、
この反応にはプラズミノーゲンの存在が必要で
あることから典型的なプラズミノーゲンアクチ
ベーターと呼ばれる物質群に属し、ウロキナー
ゼと比較した場合ウロキナーゼよりはるかに強
力なフイブリンに対する結合能力を示す。 また合成基質Ｓ−2444を基質として用いた場
合のKmは1.32×10-3Mであり、Vmaxは
0.046IU／min・mlである。 ｄ 至適PH 至適PHは約８−10で、作用曲線は第１図に示
される。 ｅ 安定PH 安定PHは、約５〜11で、残存活性％は第２図
に示される。 ｆ 作用適温の範囲 30〜45℃で作用温度曲線は、第３図に示され
る。 ｇ 温度耐性 90分間の加熱処理で50℃まではほとんど失活
しないが、60℃以上で、残存活性は60％以下に
なる。残存活性％は第４図に示される。 ｈ 阻害 各阻害剤0.1ｍＭ、１ｍＭ及び10ｍＭで残存
活性を調べ表１の結果を得る。 【表】 薬剤無添加の試量の活性を100％として、阻
害および活性化の検討を行なつた。 ｉ アミノ酸組成 酵素蛋白質である本物質を6N塩酸で加水分
解をし、アミノ酸分析に付すと、表２の結果を
得た。アミノ酸組成は、全アミノ酸残基数に対
する％で示した。 【表】 の定量は行なわなかつた。
ｊ 紫外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第
５図に示す通りである。 ｋ 溶剤に対する溶解度 水、リン酸緩衝液などの塩類溶液に対する溶
解度は約50μｇ／mlで、それ以上の濃度の溶液
を調製するときは溶解促進剤、例えば1.6Mの
カリウムチオシアネートの存在を必要とする。 エタノールやエーテルなどの有機溶媒には不
溶である。 ｌ 物質の性状 凍結乾燥標品は白色粉末である。 ｍ 呈色反応 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
なつたのち、PAS反応を行なうと、糖蛋白質
に特有なピンク色の呈色を示し、糖蛋白質であ
ることが示された。また本物質はコンカナバリ
ンＡ−アガロース樹脂に親和性を示すことから
も糖蛋白質であることが示唆された。 ｎ 等電点 本物質を8M尿素の存在下でクロマトフオー
カシング法で分析したところ主成分の等電点は
PH7.5乃至8.0であり、副成分の等電点はPH7.0乃
至7.5であり、弱塩基性蛋白質の混合物である
ことが示された。 次に、PA−KYMの活性を測定法を示すが、
従来のPAの活性の測定法と同じである。 (i) フイブリンプレート法（アストラツプらの方
法に準ず。）（Arch.Biochem.Biophys.40 346
−351（1952））フイブリノーゲンおよびプラズ
ミノーゲンを含むアガロース懸濁液に37℃でス
ロンビンを作用させることにより、プラズミノ
ーゲンを含有するフイブリンプレートを作製す
る。フイブリンプレートは直径３mmの活性測定
用試料の添加穴が開けられる。この試料穴には
試料容量５〜10μが添加され、添加されたフ
イブリンプレートは約37℃のふ卵器に静置さ
れ、一定時間の後にとり出し、明確なフイブリ
ン溶解ゾーンの直径を測定する。試料中の活性
はフイブリン溶解ゾーンの直径に反映されるの
で、直径の大きさを比較して活性を求める。 (ii) 合成基質（Ｓ−2251）を用いる２段階反応を
利用するPA−KYM活性測定法。 0.15M塩化ナトリウムを含む50ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（PH7.4）に溶解したプラズミノー
ゲンとPA−KYM溶液〔0.15M塩化ナトリウム
を含む50ｍＭトリス−塩酸緩衝液溶液（PH
7.4）〕とを37℃で10分間保持する（第１段階反
応）、正確に10分間保持した後、ただちに
0.33Mリジン溶液〔0.15M塩化ナトリウムを含
む0.15Mトリス−塩酸緩衝液を加え、第１段反
応を停止する。 続いて合成基質溶液〔0.15M塩化ナトリウム
を含む50ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.4）に
合成基質Ｓ−2251を３mg／ml溶解した溶液〕を
用い、37℃で30分間保持し、第１段反応で生じ
たプラズミン含量を比色定量（波長405nｍ）
する（第２段反応）。なお、第２段反応の停止
は、正確に30分間保持した後、ただちに2.5M
酢酸溶液を加えることにより実施する。PA−
KYM活性は405nｍの吸収によつて測定され
る。 (iii) 合成基質（Ｓ−2444）を用いる１段階反応を
利用するPA−KYM活性測定法。0.15M塩化ナ
トリウムを含む50ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH
8.8）に溶解したPA−KYM溶液〔1.6Nカリウ
ムチオシアネートを含む50ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.5）〕に、合成基質溶液〔合成基質Ｓ−
2444を0.15M塩化ナトリウムを含む50ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.8）に３mg／ml溶解した
溶液〕を加え、37℃で正確に90分間保持した
後、25M酢酸溶液で反応を停止し、PA−
KYM活性を比色定量（波長405nｍ）する。 本発明のPA−KYMは血液中に生じた血栓
を溶解するのに有効に使用される。 本発明のPA−KYMは、静脈内投与可能な
剤型が好ましい。組成物の添加剤としてはマン
ニツト、アルブミン、ゼラチン、亜硫酸水素ナ
トリウム等の安定化剤；水酸化ナトリウム、リ
ン酸ナトリウム等のPH調整剤；塩化ナトリウ
ム、マンニツト、ブドウ糖等の等張化剤などを
挙げることができる。 本発明のPA−KYMの臨床使用における投
与量および投与方法は、100−100000IUの本品
を上記添加剤を含む溶液として、年令、体重、
症状、経過などに応じて、適宜加減して、静脈
内注射、点滴静注、点滴注射、結膜下又は球後
注射して用いる。 次に本発明の実施例示す。 実施例 １ 培養 変異株KYM−Ａの培養には、培地１あたり
重炭酸ナトリウム2.0ｇ、Ｎ−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸
1.192ｇ、硫酸カナマイシン60mgを含みさらに熱
不活性化した牛胎児血清（米国KCバイオロジカ
ル社）を最終濃度10％に加えたRPMI−1640培地
（米国フローラボラトリーズ社）、または、培地１
あたり重炭酸ナトリウム2.0ｇ、硫酸カナマイ
シン60mgを含み、さらに熱不活性化した牛胎児血
清を最終濃度10％に加えたMEM培地（米国フロ
ーラボラトリー社）、または上記の２種類の培地
を１対１に混合したものを用いる。 KYM−Ａ細胞をプラスチツクシヤーレーに接
種して、増殖の結果約100mlの細胞懸濁液が得ら
れた時点で、スピナーフラスコを用いた浮遊攪拌
培養を開始する。スピナーフラスコのサイズを次
第に大きくすることによつて、８の浮遊攪拌培
養が可能である。各段階の接種初密度は、104乃
至105細胞／mlであつて、５×105乃至２×106細
胞／mlに達した時点で植え接ぎをする。 実施例 ２ 採取 細胞密度が５×105乃至２×106細胞／mlに達し
た時点で無血清培地に交換する。その培地は１
当り重炭酸ナトリウム2.0ｇ、Ｎ−ヒドロキシエ
チルピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸
1.192ｇ硫酸カナマイシン60mg、インスリン8.5
mg、ヒトのトランスフエリン（シグマ社製）１
mg、エタノールアミン4.6mg及び亜セレン酸13μ
ｇ、アプロチニン（シグマ社）20KIU／mlを含
むRPMI−1640培地である。この無血清培地中で
浮遊攪拌培養を１乃至４日間行ない、これを、４
乃至10回繰り返して、過、取得した回収液を精
製に供する。 実施例 ３ 精製 実施例２で得られた回収液をそれぞれ合一しア
プロチニン、Tween80および窒化ナトリウムを、
それぞれ最終濃度が20KIU／ml、0.01および0.02
％になるように加える。（以下すべての緩衝液に
はこの３種類の薬品をこの濃度に添加する。）こ
の試料を以下の方法で精製した。 (a) Porathらの方法（Nature、Uol258 598−
599、1975）で調整した亜鉛キレートアガロー
スカラム（９cmφ×21cm）を1MNaClを含む20
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH7.05）で十分緩衝
化した後、培養液30を負荷する。負荷終了
後、同緩衝液を3000ml流し、カラムを洗浄す
る。通過した培養液およびカラムの洗浄液に
はPA−KYM活性は認められなかつた。続い
て同緩衝液1500mlと同緩衝液に150ｍＭイミダ
ゾールを含ませた緩衝液（PH7.3）とでグラジ
エント溶出を行い、１フラクシヨン15mlの割合
で画分する。各フラクシヨンについてPA−
KYM活性を測定すると分画番号125番を中心
としてPA−KYM活性が顕著であつた。この
活性画分を透析チユーブに集め、ポリエチレン
グリコール20000の粉末をふりかけ４℃で濃縮
する。濃縮後、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.7）
に対して４℃で24時間外液を交換しつつ透析を
行う。透析終了後、チユーブ内溶液を遠心分離
（10000rpm、10min）し上澄液を得る。 (b) このようにして得られたPA−KYMを含む
溶液130mlを予め0.01Mリン酸緩衝液（PH6.7）
で十分緩衝化したコンカナバリンＡセフアロー
スカラム（１×20cm）（Pharmacia Fine
Chemicals社）に負荷する。負荷を終了後、同
一の緩衝液100mlで洗浄する。つづいて、同緩
衝液（150ml）と、それに0.6Mカリウムチオシ
アネートおよび3Mα−メチルマンノシドを含
む緩衝液（150ml）とで形成した着接勾配で溶
出を行なう。分画は、3.5mlずつ集め、分画番
号32番を中心として、PA−KYM活性が認め
られた。 この画分を集めたのち、ポリエチレングリコ
ール20000を用いて５mlに濃縮し、これを40℃
で生理食塩水に対して24時間、透析外液を交換
しつつ透析する。透析中に酵素溶液は白濁し、
遠心分離（15000rpm、30分）をすると、沈殿
画分にPA−KYM活性が回収される。この段
階で、ゲル口過去ではPA−KYMより高分子
と認められる蛋白質を中心とした混在蛋白質の
除去が可能であつた。遠心分離で得られた沈殿
物を、２mlの1.6Nカリウムチオシアネートを
含む0.01Mリン酸緩衝液（PH6.7）に溶解する。
完全に溶解し得ない残渣を遠心分離によつて除
去した後、PA−KYM活性を有する上清液を
得る。ここに得られた液を1.6Nカリウムチオ
シアネートを含む0.01Mリン酸緩衝液（PH6.7）
で充分に緩衝化したセフアデツクスＧ−200
（Pharmacia Fine Chemicals）のカラム（1.6
×85cm）に負荷し、同一の緩衝液で展開する。
分画は2.4mlずつ分取すると、分画番号35番を
中心として、PA−KYM活性が認められる。 以上のように、分別沈殿法を含めて４段階の
方法でPA−KYMの精製標品が得られたが、
各段階の精製度を表３に示した。 【表】 蛋白質濃度はローリー法により求め、μ
ｇ／mlで表示した。 適当容量（ａml）酵素溶液を用いて合成基
質Ｓ−2444を用いた発色反応を37℃で90分間
行なう。その場合の405nｍにおける発色度
OD405＝ｂであつた場合、表示の酵素濃度Ｃ
はＣ＝ｂ×1.0／ａで表わす。 比活性は、／である。 精製度は、培地の状態を1.0であるとし、
各段階での比活性の上昇を示したものである。 実施例 ４ 分子量および純度 実施例３で得られた精製標品について、分子量
を決定し、同時に純度を検定した。 はじめに非還元標品を、Laemmliの方法
（Nature Vol227 680（1970））に準じて10％のア
クリルアミドを含んだSDSポリアクリルアミド電
気泳動を室温で、５ｍＡの定電流で18時間行なつ
た。このようにして得られたゲルを、2.5％の
Triton Ｘ−100水溶液中で１時間振トウし、
SDSを除去する。これをフイブリンおよびプラズ
ミノーゲンを含んだアガロースプレート
（Granelli Piperno and Reich、J.Exp.Med Vol
148 223−234、（1978）に準じて作製した）に重
層させ、37℃に、１乃至５時間保持した後観察す
ると、推定分子量が56000乃至62000の付近に近接
する２本の溶解ゾーンが見られ、それ以外の場所
には溶解ゾーンは観察されなかつた。一方、同様
のフイブリンプレートに重層する分析方法で、ア
ガロースゲルにプラズミノーゲンを添加しなかつ
た場合には、溶解ゾーンが観察できないことか
ら、フイブリンの溶解は、プラズミノーゲンに依
存することが判明した。また、フイブリンプレー
トに抗ウロキナーゼ抗血清のIgG分画を20μｇ／
mlに加えた場合は、溶解ゾーンはIgGを添加しな
いフイブリンプレートと同程度である。従つて、
分子量が56000乃至62000の付近に存在する２本の
バンドは、ウロキナーゼ型のプラズミノーゲン活
性化因子ではなく、TPA型のPAに属するもので
あることが示された。 実施例３で得られたPA−KYMの精製標品
（約0.1μｇ）を非還元のまま、若しくは、５％２
−メルカプトエタノールの添加によつて還元して
上記と同様の方法でSDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法によつて分離した。このようにして
得られたゲルをOaklyらの方法（Analytical
Biochem Vol 105 361−363（1980））に準じて、
含有される蛋白質の染色を行なつた。このように
して得られた結果から、非還元の精製標品は、分
子量56000乃至62000の付近に２本のバンドを示
し、還元した標品では、分子量約32000及び約
36000に２本のバンドが見られた。さらに、これ
らのバンド以外には、顕著なバンドが観察されな
いことから、精製標品は、ほぼ純粋な状態にまで
精製されたことが示された。 なお、分子量測定に用いた分子量が既知の標準
蛋白質は、フオスフオリラーゼｂ（94000）、牛血
清アルブミン（67000）、卵白アルブミン（43000）
及び炭酸アンハイドラーゼ（30000）である。 実施例 ５ フイブリンに対する親和性の検討 CNBr−activated Sepharose 4B（Pharmacia
社）10ｇを１ｍＭ HCl2で膨潤、洗浄後フイ
ブリノーゲン（Kabi社）１ｇを0.5MNaCl／
0.1MNaHCO3（PH8.3）のカツプリング緩衝液200
ml中で、室温約10時間放置し吸着させた。次のこ
の樹脂をトロンビン（２単位、牛トロンビン、持
田製薬）を含んだ0.05Mリン酸緩衝液（PH7.5）
100ml中に入れ、37℃で10分間保温してfibrin−
Sepharose樹脂を得た。このようにして得られた
樹脂をミニカウムに充填し（６ml）0.05Mリン酸
緩衝液（0.01％Tween80を含む、PH7.5）で平衡
化した。このカラムにPA−KYM溶液またはウ
ロキナーゼ溶液１mlを負荷した。まず、0.05Mリ
ン酸緩衝液（PH7.5）15mlで洗浄し、この分画を
１ml毎に回収した。ついで、1.6Mカリウムチオ
シアネートを含む同一のリン酸緩衝液25mlで展開
し、１mlの分画に分取した。洗浄液およびカリウ
ムチオシアネート溶液に含まれる酵素活性を合成
基質Ｓ−2444を用いて測定して回収率を求めた。
表４に示したようにPA−KYMは洗浄液に含ま
れず、その溶出にはカリウムチオシアネートを必
要とすることからフイブリンに対する親和性が高
いと評価されるが、ウロキナーゼは親和性に乏し
く、洗浄液中にその活性が回収される。 【表】 【表】
第１図はPA−KYMの各PHの作用曲線を示す
図で、第２図は各PHの残存活性を示す図で、第３
図は作用温度曲線を示す図で、第４図は各温度に
おける残存活性を示す図で、第５図は紫外線吸収
スペクトルを示す図である。
図で、第２図は各PHの残存活性を示す図で、第３
図は作用温度曲線を示す図で、第４図は各温度に
おける残存活性を示す図で、第５図は紫外線吸収
スペクトルを示す図である。
Claims (1)
- １ ヒト横紋筋肉腫細胞変異株KYM−Ａを浮遊
撹拌培養し、得られた培養液からプラズミノーゲ
ンアクチベーターを採取することを特徴とするプ
ラズミノーゲンアクチベーターの製造法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59013397A JPS60158115A (ja) | 1984-01-30 | 1984-01-30 | プラズミノーゲンアクチベーターの製造法 |
| NL8500132A NL8500132A (nl) | 1984-01-30 | 1985-01-19 | Plasmogeen activeringsmiddel kym. |
| GB08501532A GB2153366B (en) | 1984-01-30 | 1985-01-22 | Plasminogen activator |
| CA000472999A CA1275062A (en) | 1984-01-30 | 1985-01-28 | Plasminogen activator kym |
| DE19853502760 DE3502760A1 (de) | 1984-01-30 | 1985-01-28 | Plasminogen-aktivator kym |
| BE0/214409A BE901598A (fr) | 1984-01-30 | 1985-01-29 | Activeur de plasminogene kym. |
| FR8501183A FR2558848B1 (fr) | 1984-01-30 | 1985-01-29 | Activeur de plasminogene kym, procede de preparation par culture d'un mutant de rhabdomyosarcome humain et composition pharmaceutique le renfermant dotee d'une activite thrombolytique |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59013397A JPS60158115A (ja) | 1984-01-30 | 1984-01-30 | プラズミノーゲンアクチベーターの製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60079300A Division JPS611382A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | 変異株ｋｙｍ−ａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60158115A JPS60158115A (ja) | 1985-08-19 |
| JPH0569506B2 true JPH0569506B2 (ja) | 1993-10-01 |
Family
ID=11831979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59013397A Granted JPS60158115A (ja) | 1984-01-30 | 1984-01-30 | プラズミノーゲンアクチベーターの製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60158115A (ja) |
| BE (1) | BE901598A (ja) |
| CA (1) | CA1275062A (ja) |
| DE (1) | DE3502760A1 (ja) |
| FR (1) | FR2558848B1 (ja) |
| GB (1) | GB2153366B (ja) |
| NL (1) | NL8500132A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| WO1981001417A1 (en) * | 1979-11-13 | 1981-05-28 | S Husain | Isolation of plasminogen activators useful as therapeutic and diagnostic agents |
| NL8003402A (nl) * | 1980-06-11 | 1982-01-04 | Leuven Res & Dev Vzw | Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking. |
| JPS5852634B2 (ja) * | 1980-12-05 | 1983-11-24 | 株式会社林原生物化学研究所 | ウロキナ−ゼの製造法 |
| IL63317A (en) * | 1981-07-15 | 1985-05-31 | Yeda Res & Dev | Production of plasminogen activator |
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| JPS5913732A (ja) * | 1982-07-16 | 1984-01-24 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 血栓溶解剤 |
| JPS5951220A (ja) * | 1982-08-02 | 1984-03-24 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規なプラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−およびその製法ならびにこれを含有する薬剤 |
-
1984
- 1984-01-30 JP JP59013397A patent/JPS60158115A/ja active Granted
-
1985
- 1985-01-19 NL NL8500132A patent/NL8500132A/nl not_active Application Discontinuation
- 1985-01-22 GB GB08501532A patent/GB2153366B/en not_active Expired
- 1985-01-28 DE DE19853502760 patent/DE3502760A1/de not_active Withdrawn
- 1985-01-28 CA CA000472999A patent/CA1275062A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-01-29 BE BE0/214409A patent/BE901598A/fr not_active IP Right Cessation
- 1985-01-29 FR FR8501183A patent/FR2558848B1/fr not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2558848B1 (fr) | 1989-06-09 |
| GB2153366A (en) | 1985-08-21 |
| DE3502760A1 (de) | 1985-08-08 |
| JPS60158115A (ja) | 1985-08-19 |
| GB2153366B (en) | 1988-05-18 |
| BE901598A (fr) | 1985-07-29 |
| NL8500132A (nl) | 1985-08-16 |
| GB8501532D0 (en) | 1985-02-20 |
| CA1275062A (en) | 1990-10-09 |
| FR2558848A1 (fr) | 1985-08-02 |
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