JPS611382A - 変異株ｋｙｍ−ａ - Google Patents
変異株ｋｙｍ−ａInfo
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- JPS611382A JPS611382A JP60079300A JP7930085A JPS611382A JP S611382 A JPS611382 A JP S611382A JP 60079300 A JP60079300 A JP 60079300A JP 7930085 A JP7930085 A JP 7930085A JP S611382 A JPS611382 A JP S611382A
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- kym
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- cell
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、浮遊攪拌培養できるヒト横絞筋腫細胞変異株
ＫＹＭ−Ａ に関するものである。
ＫＹＭ−Ａ に関するものである。
更に詳細には、本発明は、浮遊攪拌培養によってプラズ
ミノーゲンアクチベーターＫＹＭを著貴生産干るヒト横
絞筋腫細胞変異株ＫＹＭ−Ａ に関するものである。
ミノーゲンアクチベーターＫＹＭを著貴生産干るヒト横
絞筋腫細胞変異株ＫＹＭ−Ａ に関するものである。
近年血栓に起因する疾病が重要な問題としてりローズア
ップさね１、その治療にス） ｌ／ゾトキナーセ、ウロ
キナーゼ等がイψ用さねできた。ｌ−かｌ、そハら嬉い
ずわも目的と干る血栓溶解ばかりでなく、循環血中の＃
固因子等をも分解し、出血傾向を里子ることが知られて
いる。そのＪｌＨｊ因と（７て、ストレプトキナーゼ、
ウロキナーゼ等は溶解すべき血栓との親和性に乏しく、
循環血中に於て血液凝固因子等を分解してしまうと考え
られていみ。
ップさね１、その治療にス） ｌ／ゾトキナーセ、ウロ
キナーゼ等がイψ用さねできた。ｌ−かｌ、そハら嬉い
ずわも目的と干る血栓溶解ばかりでなく、循環血中の＃
固因子等をも分解し、出血傾向を里子ることが知られて
いる。そのＪｌＨｊ因と（７て、ストレプトキナーゼ、
ウロキナーゼ等は溶解すべき血栓との親和性に乏しく、
循環血中に於て血液凝固因子等を分解してしまうと考え
られていみ。
従って、血栓に対″Ｆ７−親和性が高く、ｄ“１血傾向
等の副作用が少ない血栓溶解剤の開発が求められたので
ある。
等の副作用が少ない血栓溶解剤の開発が求められたので
ある。
そこで、血栓を溶解し、副作用の少々いとされるプラズ
ミノーゲンアクチに一ター（以下ＰＡという）について
の研究が行なわｈ、これに関する発表も行なわ冶でいる
。ヒト由来のＰＡ、に関しては、内皮細胞及び子宮など
の正常組織、さらに腫瘍組餓およびその培養細胞などか
ら得らハた酵素について詳細な研究がなさノ１．ている
。（参考文献としてはウィルソンらによるキャンサーリ
サーチ誌、４０ ９３３−９３８（１９８０）及びリツ
ヶンとコランによるジャーナルオブバイオロジカルケミ
ストリー誌２５６ ７０３５−７０／１１（１９８１）
を主要文献としてあげることができる）。
ミノーゲンアクチに一ター（以下ＰＡという）について
の研究が行なわｈ、これに関する発表も行なわ冶でいる
。ヒト由来のＰＡ、に関しては、内皮細胞及び子宮など
の正常組織、さらに腫瘍組餓およびその培養細胞などか
ら得らハた酵素について詳細な研究がなさノ１．ている
。（参考文献としてはウィルソンらによるキャンサーリ
サーチ誌、４０ ９３３−９３８（１９８０）及びリツ
ヶンとコランによるジャーナルオブバイオロジカルケミ
ストリー誌２５６ ７０３５−７０／１１（１９８１）
を主要文献としてあげることができる）。
従来、ヒト内皮細胞、ヒト子宮細胞などの正常組繊細胞
やヒトメラノーマ、乳癌細胞などの胛バ・。
やヒトメラノーマ、乳癌細胞などの胛バ・。
細胞がＰＡを生産することは知られている。
しかしながら、正常組繊細胞ではやがて死滅してし１う
ので工業生産に使用することはできない。
ので工業生産に使用することはできない。
また、従来知られているヒトメラノーマ、乳癌細胞など
の肺炉細胞の培養はビンなどへの接着培養によるだけで
あり、ＰＡの生産性もきわめて低く、工業的に大量生産
できるというものではなかった。
の肺炉細胞の培養はビンなどへの接着培養によるだけで
あり、ＰＡの生産性もきわめて低く、工業的に大量生産
できるというものではなかった。
そこで、本発明者ちは、浮遊攪拌培養できる肺癌細胞を
求めて佃究した結果、ヒトｍ絞筋腫から分離された細胞
ＫＹＭ−Ｉ の培養物から浮遊して増殖できる変異株を
見出ｌ−１単離することに成功したのである。この変異
株は変異株ＫＹＭ−Ａ と名づけちれた。
求めて佃究した結果、ヒトｍ絞筋腫から分離された細胞
ＫＹＭ−Ｉ の培養物から浮遊して増殖できる変異株を
見出ｌ−１単離することに成功したのである。この変異
株は変異株ＫＹＭ−Ａ と名づけちれた。
本発明の変異株に、ＹＭ−Ａ は、ヒｌ−粒絞力ｆＩ
腫から分離された細胞ＫＹＭ−Ｉ の培養物から分離透
析培養を頂ねて見出された変異株で、浮力攪拌培養によ
ってＦＡ−ＫＹＭ を著量生産すＺことによってきわ
めて特徴的である。本変異株ＫＹＭ−Ａけ浮遊攪拌培養
によって継代培養中ることが可能であるが、微工研にお
ける寄託は受理されなかった。
腫から分離された細胞ＫＹＭ−Ｉ の培養物から分離透
析培養を頂ねて見出された変異株で、浮力攪拌培養によ
ってＦＡ−ＫＹＭ を著量生産すＺことによってきわ
めて特徴的である。本変異株ＫＹＭ−Ａけ浮遊攪拌培養
によって継代培養中ることが可能であるが、微工研にお
ける寄託は受理されなかった。
変異株に、ＹＭ−Ａ の性質は次の辿りである。
１ 個々の細胞は屈折性に豊む球形を呈している。
２ 細胞は単独で浮遊細胞として存在する場合もあるが
、連鎖状または球形の集合体を形成中る場合もある。集
合体に含オハ、る細胞数は約２〜１００個である。
、連鎖状または球形の集合体を形成中る場合もある。集
合体に含オハ、る細胞数は約２〜１００個である。
３ ヅラスチソクシャーレーの中で培養した場合、また
はタンクによる攪拌培養をした場合、本変異株１ｄ大部
分浮遊細胞として増殖することができる、 ４ 本変異株は浮遊攪拌培養によって継代培養するとと
ができる。
はタンクによる攪拌培養をした場合、本変異株１ｄ大部
分浮遊細胞として増殖することができる、 ４ 本変異株は浮遊攪拌培養によって継代培養するとと
ができる。
５ 本変異株はｊ順化培地等によって拌着性細胸に変化
する。
する。
変化した４１胞ｄ十皮紐（胸板の形態を示す。
側什培地＾しては、本変異株以外の細胞の培養上澄液で
、適当な基礎培地を用いて適当な細胞を１〜１００１１
；？間培養し、その培養液より細胞やその断片を除去し
、た溶液である。本変異株以外の細胞としては例えば、
ヒトの肝癌細胞（Ｈ＋市６−Ｃｌ５株やＨｕＨ７株）（
中村ほか、キャンザーリサーチＶ４４２ ３８５８−６
８６５ １９８２）などを用いることができる。
、適当な基礎培地を用いて適当な細胞を１〜１００１１
；？間培養し、その培養液より細胞やその断片を除去し
、た溶液である。本変異株以外の細胞としては例えば、
ヒトの肝癌細胞（Ｈ＋市６−Ｃｌ５株やＨｕＨ７株）（
中村ほか、キャンザーリサーチＶ４４２ ３８５８−６
８６５ １９８２）などを用いることができる。
本変異株を接着性に変えるためには、上記の１ｌｉｕｌ
化培地を使用する以外にフィブロネクチンを含んだ培地
を使用１．たり、シャーレ−などの接着面をコラーケ゛
ン、ゼラチン、ポリーＬ−リジンまたは卵白リゾチーム
なとの填塞性タンパク質などで処理することによって本
変異株の接着培養が可能となる。
化培地を使用する以外にフィブロネクチンを含んだ培地
を使用１．たり、シャーレ−などの接着面をコラーケ゛
ン、ゼラチン、ポリーＬ−リジンまたは卵白リゾチーム
なとの填塞性タンパク質などで処理することによって本
変異株の接着培養が可能となる。
６．１０’ケの本変異株細胞をヌードマウスの皮Ｔ１か
はＡ Ｉ、 Ｓ投与ハムヌターの類のう内に移植すると
胛瘤を形成する。
はＡ Ｉ、 Ｓ投与ハムヌターの類のう内に移植すると
胛瘤を形成する。
Ｚ 染色体
染色体数を細胞遺伝学の常法に従って決定したところ最
頻亭、−色体数け４６と４７で、その付近に多少の１］
を持つ分布を示す。従って、変異株ＫＹＭ−Ａの染色体
数は、この細胞が！匝瘍由米であるに拘らず、ヒトの正
常２倍体（染色体数４６本）Ｋ比軟的近似；−１ている
ことが判った。
頻亭、−色体数け４６と４７で、その付近に多少の１］
を持つ分布を示す。従って、変異株ＫＹＭ−Ａの染色体
数は、この細胞が！匝瘍由米であるに拘らず、ヒトの正
常２倍体（染色体数４６本）Ｋ比軟的近似；−１ている
ことが判った。
８、本変異株はＰＡ、−ＫＹＭ を著量／４：産″′
Ｆみ。
Ｆみ。
■に研究を進めた結果、この変ｐ・株Ｋ Ｙ Ｍ −Ａ
を培養すれば、培養液中に著量のＰＡを生産蓄積するこ
とが分ったのである。このＰＡけＰＡ−ＫＹＭと名づけ
られた。
を培養すれば、培養液中に著量のＰＡを生産蓄積するこ
とが分ったのである。このＰＡけＰＡ−ＫＹＭと名づけ
られた。
一般にヒトには主として２種類のＰＡが存在するものと
考えらｈている。すなわち、１梗類はフィブリンに対−
Ｆるイ４．１和性の乏１−．いウロキナーゼ型であり、
残７−．１種類はフィブリンに対【２て高い蓋。
考えらｈている。すなわち、１梗類はフィブリンに対−
Ｆるイ４．１和性の乏１−．いウロキナーゼ型であり、
残７−．１種類はフィブリンに対【２て高い蓋。
利付を示すいわゆる組織プラズミノーゲンアクチベータ
（ＴＰＡ）型である。
（ＴＰＡ）型である。
そＬ５て、腫抑、細胞１でＴＰＡ型のＰＡＱ産生する細
胞株としては従来メラノーマ細胞が良く知られている。
胞株としては従来メラノーマ細胞が良く知られている。
メラノーマ細胞は主とｌてＴＰＡ型のＦＡのみを産生す
Ｚことから注目をあびている。
Ｚことから注目をあびている。
一方、他の種類の腫瘍細胞でＴＰＡ型のＦＡのみを産生
ずるものとしては例外的に乳癌細胞が報告されているだ
けである。また、こり、ｔでの検索でば横絞筋腫細胞は
ウロキナーゼ型のＦＡのみを産生ずると者えちれてきた
。
ずるものとしては例外的に乳癌細胞が報告されているだ
けである。また、こり、ｔでの検索でば横絞筋腫細胞は
ウロキナーゼ型のＦＡのみを産生ずると者えちれてきた
。
変異株ＫＹＭ−Ａ の培養液中にはウロキナーゼ型のＦ
Ａは検出できない。
Ａは検出できない。
従って、ＰＡ−ＫＹＭ はヒト横絞筋腫細胞から生産
されるととるから、由来において新規であり、また、そ
の理化学的性質からＴＰＡ型の新規ＰＡと認められるも
のである。
されるととるから、由来において新規であり、また、そ
の理化学的性質からＴＰＡ型の新規ＰＡと認められるも
のである。
本発明の変異株ＫＹＭ−Ａ の培養は接着培養又は浮遊
攪拌培養のいずれでもよい。
攪拌培養のいずれでもよい。
変異株Ｋ Ｙ Ｍ −Ａ はプラスチックシャーレ−
やガラスシャーレ−に接着し、増殖するため、ローラー
ボトルやマイクロキャリヤーを利用した接着培養を行な
うことは可能である。
やガラスシャーレ−に接着し、増殖するため、ローラー
ボトルやマイクロキャリヤーを利用した接着培養を行な
うことは可能である。
しかし、工業的な生産に適しているのは浮遊攪拌培養で
ある。
ある。
ＰＡ−ＫＹＭ の生産のためには、変異株ＫＹＭ−Ａ
細胞を苅清添加培地で培養し、細胞の増殖が定常期に入
る時点で無血清培地に交換するのが好オしい。血清添加
培地としては、ＲＰＭＩ（Ｆｌｏｗ社製）、ＭＥＭ（Ｆ
ｌｏｗ社製）又はその両者の混合培地などに牛脂児面清
を１０％程度添加したものが良い。
細胞を苅清添加培地で培養し、細胞の増殖が定常期に入
る時点で無血清培地に交換するのが好オしい。血清添加
培地としては、ＲＰＭＩ（Ｆｌｏｗ社製）、ＭＥＭ（Ｆ
ｌｏｗ社製）又はその両者の混合培地などに牛脂児面清
を１０％程度添加したものが良い。
また無血清培地としては基本培地と【、てＲ，Ｐ Ｍ
Ｉ、ＭＥＭ又はその両者の混合培地かとを用い、それら
に、インスリン、ヒトのトランスフェリン、モノエタノ
ールアミン及び亜セレン酸を添加するのが好ましい（こ
の四成分添加培地を以下Ｉ Ｔ Ｆ、 Ｓ添加培地とい
う） 変異株ＫＹＭ−Ａ 細胞のＦＡ−ＫＹＭ の生産を目的
として、細胞株をプラスチックシャーレ−で浮遊培養し
、適当な細胞数に達した時点でスピナーフラスコによる
浮遊攪拌培養を開始する。スピナーフラスコは１００＋
＋＋ｊ！及至８０００ｒｒＬｌの容量が好ましい。また
、接種細胞密度は１０４及至１０’細胞／ ｍｌが好オ
しく、５Ｘ１０５及至２ Ｘ １０’細胞／ｄの密度で
定常期に達する。培養温度は特に規定されるものでｄｏ
ないが、約３０〜４０’Ｃが適し、特に６７６Ｃ前後が
好ましい。まだ、気相としては１００％空気１かは５〜
１０ｅＩｂの炭酸ガスを含有する空包、または５〜１０
０チ酸素を含む空気などが好ましい。
Ｉ、ＭＥＭ又はその両者の混合培地かとを用い、それら
に、インスリン、ヒトのトランスフェリン、モノエタノ
ールアミン及び亜セレン酸を添加するのが好ましい（こ
の四成分添加培地を以下Ｉ Ｔ Ｆ、 Ｓ添加培地とい
う） 変異株ＫＹＭ−Ａ 細胞のＦＡ−ＫＹＭ の生産を目的
として、細胞株をプラスチックシャーレ−で浮遊培養し
、適当な細胞数に達した時点でスピナーフラスコによる
浮遊攪拌培養を開始する。スピナーフラスコは１００＋
＋＋ｊ！及至８０００ｒｒＬｌの容量が好ましい。また
、接種細胞密度は１０４及至１０’細胞／ ｍｌが好オ
しく、５Ｘ１０５及至２ Ｘ １０’細胞／ｄの密度で
定常期に達する。培養温度は特に規定されるものでｄｏ
ないが、約３０〜４０’Ｃが適し、特に６７６Ｃ前後が
好ましい。まだ、気相としては１００％空気１かは５〜
１０ｅＩｂの炭酸ガスを含有する空包、または５〜１０
０チ酸素を含む空気などが好ましい。
培養は回分式でも良いが、細胞が十分生育すれば、１〜
Ｊ Ｅ１間の間隔で培地を連続的に交換１−で培養を開
始稜１ケ月前後にわたってＦＡ−に、ＹＭＬ含有する培
養液を取得することができる。
Ｊ Ｅ１間の間隔で培地を連続的に交換１−で培養を開
始稜１ケ月前後にわたってＦＡ−に、ＹＭＬ含有する培
養液を取得することができる。
変異株ＫＹＭ−Ａ 細胞のＰＡ−ＫＹＭ はプラスミ
ノーゲンをヅラスミンに活性化量る酵素で、蛋白質に属
することから蛋白質の精製に応用される一般的な方法は
いずれも適用され得る。一般には塩析、吸着、アフィニ
ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、分子ふるい等の適用とそわらの適宜な組み合せが
考えられる。寸だそれら心〜製過程は連続式でも回分式
でも可能であり、精製を干る上での効率、操作性等を考
慮して選定すればよい。
ノーゲンをヅラスミンに活性化量る酵素で、蛋白質に属
することから蛋白質の精製に応用される一般的な方法は
いずれも適用され得る。一般には塩析、吸着、アフィニ
ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、分子ふるい等の適用とそわらの適宜な組み合せが
考えられる。寸だそれら心〜製過程は連続式でも回分式
でも可能であり、精製を干る上での効率、操作性等を考
慮して選定すればよい。
次に、精製されたＰＡ−ＫＹＭ の理化学的性質を示寸
。
。
ａ ヒトタ・絞筋肝細胞変異株ＫＹＭ−Ａの生オー物で
ある。
ある。
ｂ 分子量
５ＤＳ−ポリアクＩＪルアミドゲル電気泳動法で測定し
た非還元型の本物質は分子量約５６，０００から６２．
ＯＤＤの間に近接した２本のバンドを有している。オた
、同様の方法で測定した還元型の本物質は分子量約３２
． ＯＤ Ｏ及び約３６，０００ に２本のバンドを有
している。
た非還元型の本物質は分子量約５６，０００から６２．
ＯＤＤの間に近接した２本のバンドを有している。オた
、同様の方法で測定した還元型の本物質は分子量約３２
． ＯＤ Ｏ及び約３６，０００ に２本のバンドを有
している。
Ｃ作用及び基質特異性
本物質はプラスミノーゲンの存在下でフィブリンの溶解
反応を引き起す酵素蛋白質であり、この反応にはプラス
ミノーゲンの存在が必要であることから典型的カブラズ
ミノーゲンアクチベーターと呼ばれる物質群に属し、ウ
ロキナーゼと比較した場合ウロキナーゼよりはるかに強
力なフィブリンに対中る結合能力を示す。
反応を引き起す酵素蛋白質であり、この反応にはプラス
ミノーゲンの存在が必要であることから典型的カブラズ
ミノーゲンアクチベーターと呼ばれる物質群に属し、ウ
ロキナーゼと比較した場合ウロキナーゼよりはるかに強
力なフィブリンに対中る結合能力を示す。
寸た合成基ｒｐｔ ｓ −２４４４を基τｆとして用い
た場合のＫｍけ１３２ Ｘｌ ０−３ Ｍであり、■
は０、０４６ ＩＴＪ ／ ｍｉｎ−ｍＩである。
た場合のＫｍけ１３２ Ｘｌ ０−３ Ｍであり、■
は０、０４６ ＩＴＪ ／ ｍｉｎ−ｍＩである。
ｄ 至適ｐｌ（
至適１）ｌ（け約８〜１０で、作用曲線は第１図に示さ
れる。
れる。
ｅ 安定１，１）
安定糾１け約５〜１１で、残存活性チは第２図に示され
る。
る。
ｆ 作用適温の範囲
６０〜４５℃で作用温度曲線は第３図に示さｈる。
ｇ 温度耐性
９［１分間の力ｐ熱処理で５０°Ｃ″ａｆでけ１１とん
ど失活しないが、６０℃以上で残存活性は６０％以下に
なる。残存活性チは第４図に示される。
ど失活しないが、６０℃以上で残存活性は６０％以下に
なる。残存活性チは第４図に示される。
ｈ 阻害
各ｔｉｌｌ害剤０，１ ｍＭ 、 １ｍｒ′Ｉ及び１０
ｍＭＴ＊存活性を獣４べ表１の結果を得る。
ｍＭＴ＊存活性を獣４べ表１の結果を得る。
表 １
薬剤無添加の試量の活性をＴ、 Ｏ０％として阻害およ
び活性化の検討を行なった。
び活性化の検討を行なった。
ｉ アミノ酸組成
酵素蛋白質である本物質を６Ｎ塩酸で加水分解をし、ア
ミノ酸分析に付すと、表２の結果を得た。
ミノ酸分析に付すと、表２の結果を得た。
アミノ酸組成は全アミノ酸残基数に対するチで示した。
表 ２
◎システィン及びトリプトファンの定量は行なわなかっ
た。
た。
」 紫外線吸収スはクトル
本物質の水溶液の紫外線吸収スはクトルは第５図に示す
通シである。
通シである。
ｋ 溶剤に対する溶解度
水、リン酸緩衝液などの塩類溶液に対する溶解度は約５
０μｆＡで、それ以上の濃度の溶液を調製するときは溶
解促進剤、例えば１．６Ｍのカリウムチオシアネートの
存在を必要とする。エタノールやエーテルなどの有機溶
媒には不溶である。
０μｆＡで、それ以上の濃度の溶液を調製するときは溶
解促進剤、例えば１．６Ｍのカリウムチオシアネートの
存在を必要とする。エタノールやエーテルなどの有機溶
媒には不溶である。
ｌ 物質の性状
凍結乾燥標品は白色粉末である。
ｍ 呈色反応
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なったの
ちＰＡＳ反応を行なうと糖蛋白質に特有なピンク色の呈
色を示し、糖蛋白質であることが示された。オた本物質
はコンカナバリンＡ−アガロース樹脂に親和性を示すこ
とからも糖蛋白質であることが示唆された。
ちＰＡＳ反応を行なうと糖蛋白質に特有なピンク色の呈
色を示し、糖蛋白質であることが示された。オた本物質
はコンカナバリンＡ−アガロース樹脂に親和性を示すこ
とからも糖蛋白質であることが示唆された。
ｎ 等電点
本物質を８Ｍ尿素の存在でクロマトフオーカシング法で
分析したところ主成分の等電点け１１１″Ｉ７．５及至
８．０であり、副成分の等電点けｐＨ７，Ｏ及至Ｚ５で
あり、弱塩基性蛋白質の混合物であることが示された。
分析したところ主成分の等電点け１１１″Ｉ７．５及至
８．０であり、副成分の等電点けｐＨ７，Ｏ及至Ｚ５で
あり、弱塩基性蛋白質の混合物であることが示された。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１．培養
変異株ＫＹＭ−Ａ の培養には、培地１１あたり重炭
酸ナトリウム２．０，９．Ｎ−２−ヒドロキシエチルヒ
ハラジ：／−Ｎ’−２−エタンスルホン酸１．１９２
ｇ、硫酸カナマイシン６０ｍ１を含みさらに熱不活性
化した牛胎児血清（米国ＫＣバイオロジカル社）を最終
濃度１０ｑ６に加えたＲＰＭＩ−１６４０培地（米国フ
ローラボラトリーズ社）、または培地１１あたり重炭酸
ナトリウム２．０ｇ、硫酸カナマイシン６０７７Ｌｆ
を含み、さらに熱不活性化した牛胎児血清を最終濃度１
０チに加えたＭＥＭ培地（米国フローラボラトリー社）
、または上記の２８１類の培地を１対１に混合したもの
を用いる。
酸ナトリウム２．０，９．Ｎ−２−ヒドロキシエチルヒ
ハラジ：／−Ｎ’−２−エタンスルホン酸１．１９２
ｇ、硫酸カナマイシン６０ｍ１を含みさらに熱不活性
化した牛胎児血清（米国ＫＣバイオロジカル社）を最終
濃度１０ｑ６に加えたＲＰＭＩ−１６４０培地（米国フ
ローラボラトリーズ社）、または培地１１あたり重炭酸
ナトリウム２．０ｇ、硫酸カナマイシン６０７７Ｌｆ
を含み、さらに熱不活性化した牛胎児血清を最終濃度１
０チに加えたＭＥＭ培地（米国フローラボラトリー社）
、または上記の２８１類の培地を１対１に混合したもの
を用いる。
ＫＹＭ−Ａ 細胞をプラスチックシャーレ−に接種して
、増殖の結果約１００Ｎの細胞懸濁液が得ちれた時点で
スピナーフラスコを用いた浮遊攪拌培養を開始する。ス
ピナーフラスコのサイズを次第に大きくすることによっ
て８１の浮遊攪拌培養が可能である。各段階の接種初密
度は１０４及至１０５細胞／ｍｅであって、５Ｘ１０’
及至２ Ｘ １０’細胞／ｄに達［７た時点で植え接ぎ
をする・実施例２、採取 細胞密度が５ Ｘ １０’及至２ Ｘ １０’ 細胞／
罰に達した時点で無杓清培地に交換する。その培地は１
７当り重炭酸ナトリウム２．０ＩＮ−ヒドロキシエチル
ピにラジンーＮ’−２−エタンスルホン酸１．１９２
、！ｉ’、 ａ酸カナマイシン６０ｍｆ、インスリン
８．５ｍ？、ヒトのトランスフェリン（シグマ社ｆｉ）
１ｍｆ、エタノールアミン４．６７’ｌｆ 及ヒ亜セレ
７２１３μ２、アプロチニン（シグマ社） ２０ Ｋ、
ＩＵ／ ｍｌを含むＲ，ＰＭＩ−１６４０培地である。
、増殖の結果約１００Ｎの細胞懸濁液が得ちれた時点で
スピナーフラスコを用いた浮遊攪拌培養を開始する。ス
ピナーフラスコのサイズを次第に大きくすることによっ
て８１の浮遊攪拌培養が可能である。各段階の接種初密
度は１０４及至１０５細胞／ｍｅであって、５Ｘ１０’
及至２ Ｘ １０’細胞／ｄに達［７た時点で植え接ぎ
をする・実施例２、採取 細胞密度が５ Ｘ １０’及至２ Ｘ １０’ 細胞／
罰に達した時点で無杓清培地に交換する。その培地は１
７当り重炭酸ナトリウム２．０ＩＮ−ヒドロキシエチル
ピにラジンーＮ’−２−エタンスルホン酸１．１９２
、！ｉ’、 ａ酸カナマイシン６０ｍｆ、インスリン
８．５ｍ？、ヒトのトランスフェリン（シグマ社ｆｉ）
１ｍｆ、エタノールアミン４．６７’ｌｆ 及ヒ亜セレ
７２１３μ２、アプロチニン（シグマ社） ２０ Ｋ、
ＩＵ／ ｍｌを含むＲ，ＰＭＩ−１６４０培地である。
この無血清培地中で浮遊攪拌培養を１及至４日間行力い
、これを４及至１０回繰り返して、培養液を濾過し１、
細胞を取得する。
、これを４及至１０回繰り返して、培養液を濾過し１、
細胞を取得する。
一方Ｐ液はＦＡ−ＫＹＭ の精製に供する。
第１図はＦＡ−ＫＹＭ の各−の作用曲線を示す−で
、第２図は各ｐ）ｌの残存活性を示す図で、第６図は作
用Ｙ島度曲紳を示す図で、第４図は各温ｍ゛における残
存活性を示す図で、第５図は紫外線吸収スばクトルを示
→゛図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 ＰＡ活性（係） ＰＡ活性（制 手続補正書 昭和６０年４月２６日
、第２図は各ｐ）ｌの残存活性を示す図で、第６図は作
用Ｙ島度曲紳を示す図で、第４図は各温ｍ゛における残
存活性を示す図で、第５図は紫外線吸収スばクトルを示
→゛図である。 代理人 弁理士 戸 １）親 男 ＰＡ活性（係） ＰＡ活性（制 手続補正書 昭和６０年４月２６日
Claims (1)
- （１）下記の性質を有するヒト横絞筋腫細胞変異株ＫＹ
Ｍ−Ａ。 １、個々の細胞は屈折性に豊む球形を呈している。 ２、細胞は単独で浮遊細胞として存在する場合もあるが
、連鎖状または球形の集合体を形成する場合もある。集
合体に含まれる細胞数は約２〜１００個である。 ３、プラスチツクシヤーレーの中で培養した場合、また
はタンクによる撹拌培養をした場合本変異株は大部分浮
遊細胞として増殖することができる。 ４、本変異株は浮遊攪拌培養によつて継代培養すること
ができる。 ５、本変異株は順化培地等によつて接着性細胞に変化す
る。変化した細胞は上皮細胞様の形態を示す。 ６、１０＾６ケの本変異細胞をヌードマウスの皮下また
はＡＬＳ投与ハムスターの類のう内に移植すると腫瘤を
形成する。 ７、染色体 染色体数を細胞遺伝学の常法に従つて決定したところ最
頻染色体数は４６と４７で、その付近に多少の巾を持つ
分布を示す。即ち、ＫＹＭ−Ａ株の染色体数は、この細
胞が腫瘍由来であるに拘らず、ヒトの正常２倍体（染色
体数４６本）に比較的近似している。 ８、本変異株はプラズミノーゲンアクチベーターＫＹＭ
を著量生産する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60079300A JPS611382A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | 変異株ｋｙｍ−ａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60079300A JPS611382A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | 変異株ｋｙｍ−ａ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59013397A Division JPS60158115A (ja) | 1984-01-30 | 1984-01-30 | プラズミノーゲンアクチベーターの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611382A true JPS611382A (ja) | 1986-01-07 |
| JPH0532025B2 JPH0532025B2 (ja) | 1993-05-14 |
Family
ID=13685992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60079300A Granted JPS611382A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | 変異株ｋｙｍ−ａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS611382A (ja) |
-
1985
- 1985-04-16 JP JP60079300A patent/JPS611382A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0532025B2 (ja) | 1993-05-14 |
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