JPH0532025B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0532025B2 JPH0532025B2 JP60079300A JP7930085A JPH0532025B2 JP H0532025 B2 JPH0532025 B2 JP H0532025B2 JP 60079300 A JP60079300 A JP 60079300A JP 7930085 A JP7930085 A JP 7930085A JP H0532025 B2 JPH0532025 B2 JP H0532025B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- kym
- mutant strain
- mutant
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、浮遊撹拌培養できるヒト横絞筋肉腫
細胞変異株KYM−Ａに関するものである。 更に詳細には、本発明は、浮遊攪拌培養によつ
てプラズミノーゲンアクチベーターKYMを著量
生産するヒト横絞筋肉腫細胞変異株KYM−Ａに
関するものである。 近年血栓に起因する疾病が重要な問題としてク
ローズアツプされ、その治療にストレプトキナー
ゼ、ウロキナーゼ等が使用されてきた。しかし、
それらはいずれも目的とする血栓溶解ばかりでな
く、循環血中の凝固因子等をも分解し、出血傾向
を呈することが知られている。その原因として、
ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ等は溶解すべ
き血栓との親和性に乏しく、循環血中に於て血液
凝固因子等を分解してしまうと考えられている。
従つて、血栓に対する親和性が高く、出血傾向等
の副作用が少ない血栓溶解剤の開発が求められた
のである。 そこで、血栓を溶解し、副作用の少ないとされ
るプラズミノーゲンアクチベーター（以下PAと
いう）についての研究が行なわれ、これに関する
発表も行なわれている。ヒト由来のPAに関して
は、内皮細胞及び子宮などの正常組織、さらに腫
瘍組織およびその培養細胞などから得られた酵素
について詳細な研究がなされている。（参考文献
としてはウイルソンらによるキヤンサーリサーチ
誌、40 933−938（1980）及びリツケンとコラン
によるジヤーナルオブバイオロジカルケミストリ
ー誌256 7035−7041（1981）を主要文献としてあ
げることができる）。 従来、ヒト内皮細胞、ヒト子宮細胞などの正常
組織細胞やヒトメラノーマ、乳癌細胞などの腫瘍
細胞がPAを生産することは知られている。 しかしながら、正常組織細胞ではやがて死滅し
てしまうので工業生産に使用することはできな
い。 また、従来知られているヒトメラノーマ、乳癌
細胞などの腫瘍細胞の培養はビンなどへの接着培
養によるだけであり、PAの生産性もきわめて低
く、工業的に大量生産できるというものではなか
つた。 そこで、本発明者らは、浮遊撹拌培養できる腫
瘍細胞を求めて研究した結果、ヒト横絞筋肉腫か
ら分離された細胞KYM−Ｉの培養物から浮遊し
て増殖できる変異株を見出し、単離することに成
功したのである。この変異株は変異株KYM−Ａ
と名づけられた。 本発明の異変株KYM−Ａは、ヒト横絞筋肉腫
から分離された細胞KYM−Ｉの培養物から分離
選択培養を重ねて見出された変異株で、浮遊撹拌
培養によつてPA−KYMを著量生産することに
よつてきわめて特徴的である。本変異株KYM−
Ａは浮遊撹拌培養によつて継代培養することが可
能であるが、微工研における寄託は受理されなか
つた。 変異株KYM−Ａの性質は次の通りである。 １ 個々の細胞は屈折性に豊む球形を呈してい
る。 ２ 細胞は単独で浮遊細胞として存在する場合も
あるが、連鎖状または球形の集合体を形成する
場合もある。集合体に含まれる細胞数は約２〜
100個である。 ３ プラスチツクシヤーレーの中で培養した場
合、またはタンクによる撹拌培養をした場合、
本変異株は大部分浮遊細胞として増殖すること
ができる。 ４ 本変異株は浮遊撹拌培養によつて継代培養す
ることができる。 ５ 本変異株は順化培地等によつて接着性細胞に
変化する。 変化した細胞は上皮細胞様の形態を示す。 順化倍地としては、本変異株以外の細胞の培
養上澄液で、適当な基礎培地を用いて適当な細
胞を１〜100時間培養し、その培養液より細胞
やその断片を除去した溶液である。本変異株以
外の細胞としては例えば、ヒトの肝癌細胞
（HuH6−cl5株やHuH7株）（中村ほか、キヤン
サーリサーチ、Vol42 3858−3863 1982）など
を用いることができる。 本変異株を接着性に変えるためには、上記の
順化培地を使用する以外にフイブロネクチンを
含んだ培地を使用したり、シヤーレーなどの接
着面をコラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジ
ンまたは卵白リゾチームなどの塩基性タンパク
質などで処理することによつて本変異株の接着
培養が可能となる。 ６ 106ヶの本変異株細胞をヌードマウスの皮下
またはALS投与ハムスターの類のう内に移植
すると腫瘤を形成する。 ７ 染色体 染色体数を細胞遺伝学の常法に従つて決定し
たところ最頻染色体数は46と47で、その付近に
多少の巾を持つ分布を示す。従つて、変異株
KYM−Ａの染色体数は、この細胞が腫瘍由来
であるに拘らず、ヒトの正常２倍体（染色体数
46本）に比較的近似していることが判つた。 ８ 本変異株はPA−KYMを著量生産する。更
に研究を進めた結果、この変異株KYM−Ａを
培養すれば、培養液中に著量のPAを生産蓄積
することが分つたのである。このPAはPA−
KYMと名づけられた。 一般にヒトには主として２種類のPAが存在す
るものと考えられている。すなわち、１種類はフ
イブリンに対する親和性の乏しいウロキナーゼ型
であり、残る１種類はフイブリンに対して高い親
和性を示すいわゆる組織プラズミノーゲンアクチ
ベータ（TPA）型である。 そして、腫瘍細胞でTPA型のPAを産生する細
胞株としては従来メラノーマ細胞が良く知られて
いる。メラノーマ細胞は主としてTPA型のPAの
みを産生することから注目をあびている。一方、
他の種類の腫瘍細胞でTPA型のPAのみを産生す
るものとしては例外的に乳癌細胞が報告されてい
るだけである。また、これまでの検索では横絞筋
腫細胞はウロキナーゼ型のPAのみを産生すると
考えられてきた。 変異株KYM−Ａの培養液中にはウロキナーゼ
型のPAは検出できない。 従つて、PA−KYMはヒト横絞筋肉腫細胞か
ら生産されるところから、由来において新規であ
り、また、その理化学的性質からTPA型の新規
PAと認められるものである。 本発明の変異株KYM−Ａの培養は接着培養又
は浮遊撹拌培養のいずれでもよい。 変異株KYM−Ａはプラスチツクシヤーレーや
ガラスシヤーレーに接着し、増殖するため、ロー
ラーボトルやマイクロキヤリヤーを利用した接着
培養を行なうことは可能である。 しかし、工業的な生産に適しているのは浮遊撹
拌培養である。 PA−KYMの生産のためには、変異株KYM−
Ａ細胞を血清添加培地で培養し、細胞の増殖が定
常期に入る時点で無血清培地に交換するのが好ま
しい。血清添加培地としては、RPMI（Flow社
製）、MEM（Flow社製）又はその両者の混合培
地などに牛胎児血清を10％程度添加したものが良
い。 また無血清培地としては基本培地として
RPMI、MEM又はその両者の混合培地などを用
い、それらに、インスリン、ヒトのトランスフエ
リン、モノエタノールアミン及び亜セレン酸を添
加するのが好ましい（この四成分添加培地を以下
ITES添加培地という） 変異株KYM−Ａ細胞のPA−KYMの生産を目
的として、細胞株をプラスチツクシヤーレーで浮
遊培養し、適当な細胞数に達した時点でスピナー
フラスコによる浮遊撹拌培養を開始する。スピナ
ーフラスコは100ml乃至8000mlの容量が好ましい。
また、接種細胞密度は104乃至105細胞／mlが好ま
しく、５×105乃至２×106細胞／mlの密度で定常
期に達する。培養温度は特に規定されるものでは
ないが、約30〜40℃が適し、特に37℃前後が好ま
しい。また、気相としては100％空気または５〜
10％の炭酸ガスを含有する空気、または５〜100
％酸素を含む空気などが好ましい。 培養は回分式でも良いが、細胞が十分生育すれ
ば、１〜４日間の間隔で培地を連続的に交換して
培養を開始後１ヶ月前後にわたつてPA−KYM
を含有する培養液を取得することができる。 変異株KYM−Ａ細胞のPA−KYMはプラスミ
ノーゲンをプラスミンに活性化する酸素で、蛋白
質に属することから蛋白質の精製に応用される一
般的な方法はいずれも適用され得る。一般には塩
析、吸着、アフイニテイークロマトグラフイー、
イオン交換クロマトグラフイー、分子ふるい等の
適用とそれらの適宜な組み合せが考えられる。ま
たそれら精製過程は連続式でも回分式でも可能で
あり、精製をする上での効率、操作性等を考慮し
て選定すればよい。 次に、精製されたPA−KYMの理化学的性質
を示す。 ａ ヒト横絞筋肉腫細胞変異株KYM−Ａの生産
物である。 ｂ 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で
測定した非還元型の本物質は分子量約56000か
ら62000の間に近接した２本のバンドを有して
いる。また、同様の方法で測定した還元型の本
物質は分子量約32000及び約36000に２本のバン
ドを有している。 ｃ 作用及び基質特異性 本物質はプラズミノーゲンの存在下でフイブ
リンの溶解反応を引き起す酵素蛋白質であり、
この反応にはプラズミノーゲンの存在が必要で
あることから典型的なプラズミノーゲンアクチ
ベーターと呼ばれる物質群に属し、ウロキナー
ゼと比較した場合ウロキナーゼよりはるかに強
力なフイブリンに対する結合能力を示す。 また合成基質Ｓ−2444を基質として用いた場
合のKmは1.31×10-3Mであり、Vnaxは
0.046IU／min・mlである。 ｄ 至適PH 至適PHは約８〜10で、作用曲線は第１図に示
される。 ｅ 安定PH 安定PHは約５〜11で、残存活性％は第２図に
示される。 ｆ 作用適温の範囲 30〜45℃で作用温度曲線は第３図に示され
る。 ｇ 温度耐性 90分間の加熱処理で50℃まではほとんど失活
しないが、60℃以上で残存活性は60℃以下にな
る。残存活性％は第４図に示される。 ｈ 阻害 各阻害剤0.1mM、1mM及び10mMで残存活
性を調べ表１の結果を得る。
細胞変異株KYM−Ａに関するものである。 更に詳細には、本発明は、浮遊攪拌培養によつ
てプラズミノーゲンアクチベーターKYMを著量
生産するヒト横絞筋肉腫細胞変異株KYM−Ａに
関するものである。 近年血栓に起因する疾病が重要な問題としてク
ローズアツプされ、その治療にストレプトキナー
ゼ、ウロキナーゼ等が使用されてきた。しかし、
それらはいずれも目的とする血栓溶解ばかりでな
く、循環血中の凝固因子等をも分解し、出血傾向
を呈することが知られている。その原因として、
ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ等は溶解すべ
き血栓との親和性に乏しく、循環血中に於て血液
凝固因子等を分解してしまうと考えられている。
従つて、血栓に対する親和性が高く、出血傾向等
の副作用が少ない血栓溶解剤の開発が求められた
のである。 そこで、血栓を溶解し、副作用の少ないとされ
るプラズミノーゲンアクチベーター（以下PAと
いう）についての研究が行なわれ、これに関する
発表も行なわれている。ヒト由来のPAに関して
は、内皮細胞及び子宮などの正常組織、さらに腫
瘍組織およびその培養細胞などから得られた酵素
について詳細な研究がなされている。（参考文献
としてはウイルソンらによるキヤンサーリサーチ
誌、40 933−938（1980）及びリツケンとコラン
によるジヤーナルオブバイオロジカルケミストリ
ー誌256 7035−7041（1981）を主要文献としてあ
げることができる）。 従来、ヒト内皮細胞、ヒト子宮細胞などの正常
組織細胞やヒトメラノーマ、乳癌細胞などの腫瘍
細胞がPAを生産することは知られている。 しかしながら、正常組織細胞ではやがて死滅し
てしまうので工業生産に使用することはできな
い。 また、従来知られているヒトメラノーマ、乳癌
細胞などの腫瘍細胞の培養はビンなどへの接着培
養によるだけであり、PAの生産性もきわめて低
く、工業的に大量生産できるというものではなか
つた。 そこで、本発明者らは、浮遊撹拌培養できる腫
瘍細胞を求めて研究した結果、ヒト横絞筋肉腫か
ら分離された細胞KYM−Ｉの培養物から浮遊し
て増殖できる変異株を見出し、単離することに成
功したのである。この変異株は変異株KYM−Ａ
と名づけられた。 本発明の異変株KYM−Ａは、ヒト横絞筋肉腫
から分離された細胞KYM−Ｉの培養物から分離
選択培養を重ねて見出された変異株で、浮遊撹拌
培養によつてPA−KYMを著量生産することに
よつてきわめて特徴的である。本変異株KYM−
Ａは浮遊撹拌培養によつて継代培養することが可
能であるが、微工研における寄託は受理されなか
つた。 変異株KYM−Ａの性質は次の通りである。 １ 個々の細胞は屈折性に豊む球形を呈してい
る。 ２ 細胞は単独で浮遊細胞として存在する場合も
あるが、連鎖状または球形の集合体を形成する
場合もある。集合体に含まれる細胞数は約２〜
100個である。 ３ プラスチツクシヤーレーの中で培養した場
合、またはタンクによる撹拌培養をした場合、
本変異株は大部分浮遊細胞として増殖すること
ができる。 ４ 本変異株は浮遊撹拌培養によつて継代培養す
ることができる。 ５ 本変異株は順化培地等によつて接着性細胞に
変化する。 変化した細胞は上皮細胞様の形態を示す。 順化倍地としては、本変異株以外の細胞の培
養上澄液で、適当な基礎培地を用いて適当な細
胞を１〜100時間培養し、その培養液より細胞
やその断片を除去した溶液である。本変異株以
外の細胞としては例えば、ヒトの肝癌細胞
（HuH6−cl5株やHuH7株）（中村ほか、キヤン
サーリサーチ、Vol42 3858−3863 1982）など
を用いることができる。 本変異株を接着性に変えるためには、上記の
順化培地を使用する以外にフイブロネクチンを
含んだ培地を使用したり、シヤーレーなどの接
着面をコラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジ
ンまたは卵白リゾチームなどの塩基性タンパク
質などで処理することによつて本変異株の接着
培養が可能となる。 ６ 106ヶの本変異株細胞をヌードマウスの皮下
またはALS投与ハムスターの類のう内に移植
すると腫瘤を形成する。 ７ 染色体 染色体数を細胞遺伝学の常法に従つて決定し
たところ最頻染色体数は46と47で、その付近に
多少の巾を持つ分布を示す。従つて、変異株
KYM−Ａの染色体数は、この細胞が腫瘍由来
であるに拘らず、ヒトの正常２倍体（染色体数
46本）に比較的近似していることが判つた。 ８ 本変異株はPA−KYMを著量生産する。更
に研究を進めた結果、この変異株KYM−Ａを
培養すれば、培養液中に著量のPAを生産蓄積
することが分つたのである。このPAはPA−
KYMと名づけられた。 一般にヒトには主として２種類のPAが存在す
るものと考えられている。すなわち、１種類はフ
イブリンに対する親和性の乏しいウロキナーゼ型
であり、残る１種類はフイブリンに対して高い親
和性を示すいわゆる組織プラズミノーゲンアクチ
ベータ（TPA）型である。 そして、腫瘍細胞でTPA型のPAを産生する細
胞株としては従来メラノーマ細胞が良く知られて
いる。メラノーマ細胞は主としてTPA型のPAの
みを産生することから注目をあびている。一方、
他の種類の腫瘍細胞でTPA型のPAのみを産生す
るものとしては例外的に乳癌細胞が報告されてい
るだけである。また、これまでの検索では横絞筋
腫細胞はウロキナーゼ型のPAのみを産生すると
考えられてきた。 変異株KYM−Ａの培養液中にはウロキナーゼ
型のPAは検出できない。 従つて、PA−KYMはヒト横絞筋肉腫細胞か
ら生産されるところから、由来において新規であ
り、また、その理化学的性質からTPA型の新規
PAと認められるものである。 本発明の変異株KYM−Ａの培養は接着培養又
は浮遊撹拌培養のいずれでもよい。 変異株KYM−Ａはプラスチツクシヤーレーや
ガラスシヤーレーに接着し、増殖するため、ロー
ラーボトルやマイクロキヤリヤーを利用した接着
培養を行なうことは可能である。 しかし、工業的な生産に適しているのは浮遊撹
拌培養である。 PA−KYMの生産のためには、変異株KYM−
Ａ細胞を血清添加培地で培養し、細胞の増殖が定
常期に入る時点で無血清培地に交換するのが好ま
しい。血清添加培地としては、RPMI（Flow社
製）、MEM（Flow社製）又はその両者の混合培
地などに牛胎児血清を10％程度添加したものが良
い。 また無血清培地としては基本培地として
RPMI、MEM又はその両者の混合培地などを用
い、それらに、インスリン、ヒトのトランスフエ
リン、モノエタノールアミン及び亜セレン酸を添
加するのが好ましい（この四成分添加培地を以下
ITES添加培地という） 変異株KYM−Ａ細胞のPA−KYMの生産を目
的として、細胞株をプラスチツクシヤーレーで浮
遊培養し、適当な細胞数に達した時点でスピナー
フラスコによる浮遊撹拌培養を開始する。スピナ
ーフラスコは100ml乃至8000mlの容量が好ましい。
また、接種細胞密度は104乃至105細胞／mlが好ま
しく、５×105乃至２×106細胞／mlの密度で定常
期に達する。培養温度は特に規定されるものでは
ないが、約30〜40℃が適し、特に37℃前後が好ま
しい。また、気相としては100％空気または５〜
10％の炭酸ガスを含有する空気、または５〜100
％酸素を含む空気などが好ましい。 培養は回分式でも良いが、細胞が十分生育すれ
ば、１〜４日間の間隔で培地を連続的に交換して
培養を開始後１ヶ月前後にわたつてPA−KYM
を含有する培養液を取得することができる。 変異株KYM−Ａ細胞のPA−KYMはプラスミ
ノーゲンをプラスミンに活性化する酸素で、蛋白
質に属することから蛋白質の精製に応用される一
般的な方法はいずれも適用され得る。一般には塩
析、吸着、アフイニテイークロマトグラフイー、
イオン交換クロマトグラフイー、分子ふるい等の
適用とそれらの適宜な組み合せが考えられる。ま
たそれら精製過程は連続式でも回分式でも可能で
あり、精製をする上での効率、操作性等を考慮し
て選定すればよい。 次に、精製されたPA−KYMの理化学的性質
を示す。 ａ ヒト横絞筋肉腫細胞変異株KYM−Ａの生産
物である。 ｂ 分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で
測定した非還元型の本物質は分子量約56000か
ら62000の間に近接した２本のバンドを有して
いる。また、同様の方法で測定した還元型の本
物質は分子量約32000及び約36000に２本のバン
ドを有している。 ｃ 作用及び基質特異性 本物質はプラズミノーゲンの存在下でフイブ
リンの溶解反応を引き起す酵素蛋白質であり、
この反応にはプラズミノーゲンの存在が必要で
あることから典型的なプラズミノーゲンアクチ
ベーターと呼ばれる物質群に属し、ウロキナー
ゼと比較した場合ウロキナーゼよりはるかに強
力なフイブリンに対する結合能力を示す。 また合成基質Ｓ−2444を基質として用いた場
合のKmは1.31×10-3Mであり、Vnaxは
0.046IU／min・mlである。 ｄ 至適PH 至適PHは約８〜10で、作用曲線は第１図に示
される。 ｅ 安定PH 安定PHは約５〜11で、残存活性％は第２図に
示される。 ｆ 作用適温の範囲 30〜45℃で作用温度曲線は第３図に示され
る。 ｇ 温度耐性 90分間の加熱処理で50℃まではほとんど失活
しないが、60℃以上で残存活性は60℃以下にな
る。残存活性％は第４図に示される。 ｈ 阻害 各阻害剤0.1mM、1mM及び10mMで残存活
性を調べ表１の結果を得る。
【表】
薬剤無添加の試量の活性を100％として阻害およ
び活性化の検討を行なつた。 ｉ アミノ酸組成 酵素蛋白質である本物質を6N塩酸で加水分
解をし、アミノ酸分析に付すと、表２の結果を
得た。アミノ酸組成は全アミノ酸残基数に対す
る％で示した。
び活性化の検討を行なつた。 ｉ アミノ酸組成 酵素蛋白質である本物質を6N塩酸で加水分
解をし、アミノ酸分析に付すと、表２の結果を
得た。アミノ酸組成は全アミノ酸残基数に対す
る％で示した。
【表】
【表】
なわなかつた。
ｊ 紫外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第
５図に示す通りである。 ｋ 溶剤に対する溶解度 水、リン酸緩衝液などの塩類溶液に対する溶
解度は約50μｇ／mlで、それ以上の濃度の溶液
を調製するときは溶解促進剤、例えば1.6Mの
カリウムチオシアネートの存在を必要とする。
エタノールやエーテルなどの有機溶媒には不溶
である。 ｌ 物質の性状 凍結乾燥標品は白色粉末である。 ｍ 呈色反応 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
なつたのちPAS反応を行なうと糖蛋白質に特
有なピンク色の呈色を示し、糖蛋白質であるこ
とが示された。また本物質はコンカナバリンＡ
−アガロース樹脂に親和性を示すことからも糖
蛋白質であることが示唆された。 ｎ 等電点 本物質を8M尿素の存在でクロマトフオーカ
シング法で分析したところ主成分の等電点はPH
7.5乃至8.0であり、副成分の等電点はPH7.0乃至
7.5であり、弱塩基性蛋白質の混合物であるこ
とが示された。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 培養 変異株KYM−Ａの培養には、培地１あたり
重炭酸ナトリウム2.0ｇ、Ｎ−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸
1.192ｇ、硫酸カナマイシン60mgを含みさらに熱
不活性化した牛胎児血清（米国KCバイオロジカ
ル社）を最終濃度10％に加えたRPMI−1640培地
（米国フローラボラトリーズ社）、または培地１
あたり重炭酸ナトリウム2.0ｇ、硫酸カナマイシ
ン60mgを含み、さらに熱不活性化した牛胎児血清
を最終濃度10％に加えたMEM培地（米国フロー
ラボラトリー社）、または上記の２種類の培地を
１対１に混合したものを用いる。 KYM−Ａ細胞をプラスチツクシヤーレーに接
種して増殖の結果約100mlの細胞懸濁液が得られ
た時点でスピナーフラスコを用いた浮遊攪拌培養
を開始する。スピナーフラスコのサイズを次第に
大きくすることによつて８の浮遊攪拌培養が可
能である。各段階の接種初密度は104乃至105細
胞／mlであつて、５×105乃至２×106細胞／mlに
達した時点で植え接ぎをする。 実施例 ２ 採取 細胞密度が５×105乃至２×106細胞／mlに達し
た時点で無血清培地に交換する。その培地は１
当り重炭酸ナトリウム2.0ｇＮ−ヒドロキシエチ
ルピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸1.192
ｇ、硫酸カナマイシン60mg、インスリン8.5mg、
ヒトのトランスフエリン（シグマ社製）１mg、エ
タノールアミン4.6mg及び亜セレン酸13μｇ、アプ
ロチニン（シグマ社）20KIU／mlを含むRPMI−
1640培地である。この無血清培地中で浮遊撹拌培
養を１乃至４日間行ない、これを４乃至10回繰り
返して、培養液を過し、細胞を取得する。 一方液はPA−KYMの精製に供する。
ｊ 紫外線吸収スペクトル 本物質の水溶液の紫外線吸収スペクトルは第
５図に示す通りである。 ｋ 溶剤に対する溶解度 水、リン酸緩衝液などの塩類溶液に対する溶
解度は約50μｇ／mlで、それ以上の濃度の溶液
を調製するときは溶解促進剤、例えば1.6Mの
カリウムチオシアネートの存在を必要とする。
エタノールやエーテルなどの有機溶媒には不溶
である。 ｌ 物質の性状 凍結乾燥標品は白色粉末である。 ｍ 呈色反応 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行
なつたのちPAS反応を行なうと糖蛋白質に特
有なピンク色の呈色を示し、糖蛋白質であるこ
とが示された。また本物質はコンカナバリンＡ
−アガロース樹脂に親和性を示すことからも糖
蛋白質であることが示唆された。 ｎ 等電点 本物質を8M尿素の存在でクロマトフオーカ
シング法で分析したところ主成分の等電点はPH
7.5乃至8.0であり、副成分の等電点はPH7.0乃至
7.5であり、弱塩基性蛋白質の混合物であるこ
とが示された。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 培養 変異株KYM−Ａの培養には、培地１あたり
重炭酸ナトリウム2.0ｇ、Ｎ−２−ヒドロキシエ
チルピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸
1.192ｇ、硫酸カナマイシン60mgを含みさらに熱
不活性化した牛胎児血清（米国KCバイオロジカ
ル社）を最終濃度10％に加えたRPMI−1640培地
（米国フローラボラトリーズ社）、または培地１
あたり重炭酸ナトリウム2.0ｇ、硫酸カナマイシ
ン60mgを含み、さらに熱不活性化した牛胎児血清
を最終濃度10％に加えたMEM培地（米国フロー
ラボラトリー社）、または上記の２種類の培地を
１対１に混合したものを用いる。 KYM−Ａ細胞をプラスチツクシヤーレーに接
種して増殖の結果約100mlの細胞懸濁液が得られ
た時点でスピナーフラスコを用いた浮遊攪拌培養
を開始する。スピナーフラスコのサイズを次第に
大きくすることによつて８の浮遊攪拌培養が可
能である。各段階の接種初密度は104乃至105細
胞／mlであつて、５×105乃至２×106細胞／mlに
達した時点で植え接ぎをする。 実施例 ２ 採取 細胞密度が５×105乃至２×106細胞／mlに達し
た時点で無血清培地に交換する。その培地は１
当り重炭酸ナトリウム2.0ｇＮ−ヒドロキシエチ
ルピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸1.192
ｇ、硫酸カナマイシン60mg、インスリン8.5mg、
ヒトのトランスフエリン（シグマ社製）１mg、エ
タノールアミン4.6mg及び亜セレン酸13μｇ、アプ
ロチニン（シグマ社）20KIU／mlを含むRPMI−
1640培地である。この無血清培地中で浮遊撹拌培
養を１乃至４日間行ない、これを４乃至10回繰り
返して、培養液を過し、細胞を取得する。 一方液はPA−KYMの精製に供する。
第１図はPA−KYMの各PHの作用曲線を示す
図で、第２図は各PHの残存活性を示す図で、第３
図は作用温度曲線を示す図で、第４図は各温度に
おける残存活性を示す図で、第５図は紫外線吸収
スペクトルを示す図である。
図で、第２図は各PHの残存活性を示す図で、第３
図は作用温度曲線を示す図で、第４図は各温度に
おける残存活性を示す図で、第５図は紫外線吸収
スペクトルを示す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の性質を有するヒト横絞筋肉腫細胞変異
株KYM−Ａ。 １ 個々の細胞は屈折性に豊む球形を呈してい
る。 ２ 細胞は単独で浮遊細胞として存在する場合も
あるが、連鎖状または球形の集合体を形成する
場合もある。集合体に含まれる細胞数は約２〜
100個である。 ３ プラスチツクシヤーレーの中で培養した場
合、またはタンクによる攪拌培養をした場合本
変異株は大部分浮遊細胞として増殖することが
できる。 ４ 本変異株は浮遊攪拌培養によつて継代培養す
ることができる。 ５ 本変異株は順化培地等によつて接着性細胞に
変化する。変化した細胞は上皮細胞様の形態を
示す。 ６ 106ケの本変異細胞をヌードマウスの皮下ま
たはALS投与ハムスターの類のう内に移植す
ると腫瘤を形成する。 ７ 染色体 染色体数を細胞遺伝学の常法に従つて決定し
たところ最頻染色体数は46と47で、その付近に
多少の巾を持つ分布を示す。即ち、KYM−Ａ
株の染色体数は、この細胞が腫瘍由来であるに
拘らず、ヒトの正常２倍体（染色体数46本）に
比較的近似している。 ８ 本変異株はプラズミノーゲンアクチベーター
KYMを著量生産する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60079300A JPS611382A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | 変異株ｋｙｍ−ａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60079300A JPS611382A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | 変異株ｋｙｍ−ａ |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59013397A Division JPS60158115A (ja) | 1984-01-30 | 1984-01-30 | プラズミノーゲンアクチベーターの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611382A JPS611382A (ja) | 1986-01-07 |
| JPH0532025B2 true JPH0532025B2 (ja) | 1993-05-14 |
Family
ID=13685992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60079300A Granted JPS611382A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | 変異株ｋｙｍ−ａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS611382A (ja) |
-
1985
- 1985-04-16 JP JP60079300A patent/JPS611382A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS611382A (ja) | 1986-01-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR900008740B1 (ko) | 혈청-비의존성 사람 세포주 및 이의 돌연변이 세포주를 제조하는 방법 | |
| AU2018333356B2 (en) | Bacterial strain Clostridium histolyticum and its use | |
| Chiplonkar et al. | Applications of alkaline protease from Conidiobolus in animal cell culture | |
| Gronow et al. | Production of human plasminogen activators by cell culture | |
| JPH0532025B2 (ja) | ||
| JPS6119486A (ja) | 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−、その製法及びその利用 | |
| EP0163751B1 (en) | Process for the preparation of a plasminogen activator | |
| KR0180103B1 (ko) | 바실러스 서브틸리스 속 균주 유래의 혈전용해효소 | |
| JPH0569506B2 (ja) | ||
| JP3133148B2 (ja) | ヒト細胞性フィブロネクチン、その製造法及び細胞株 | |
| JPS60231611A (ja) | プラズミノ−ゲンアクチベ−タ−の製造法 | |
| EP0253314B1 (en) | Peptidase and process for producing the same | |
| JP2879906B2 (ja) | プロコラゲナーゼの製造方法 | |
| JP4190753B2 (ja) | 血管新生阻害活性をもつプラスミノゲン断片およびその生成を導く化合物の探索方法 | |
| KR980009454A (ko) | 바실러스속 균주 유래의 혈전용해효소 | |
| JPS62158220A (ja) | 変異株ｋｙｍ−ｅ | |
| JPS62153221A (ja) | ヒト子宮筋正常組織由来樹立化細胞ｋｗ株及びその培養によるプラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の製造法 | |
| Muranova et al. | Anti-adhesive property of the plasmin/plasminogen system: the use of plasmin (ogen) for cell detachment and disaggregation in cell culture technique | |
| JPH012573A (ja) | カルボキシペプチダーゼの製造方法 | |
| JPS62158219A (ja) | ヒト由来組織型プラスミノ−ゲン活性化因子、その製造方法及びこれを有効成分とする血栓溶解剤 | |
| JPH01157384A (ja) | 非会合の組織プラスミノーゲン活性化因子を培養細胞から高収率で得る方法 | |
| JPS6352879A (ja) | 組織性プラスミノ−ゲンアクチベ−タ前駆体 | |
| JPH05310796A (ja) | 新規なヒト細胞性フィブロネクチン | |
| JPS60248178A (ja) | ヒト血管内皮細胞の培養方法 | |
| JPS63313578A (ja) | プロテアーゼ活性および阻害剤活性が低下した動物血清 |