JPH056998B2

JPH056998B2 -

Info

Publication number: JPH056998B2
Application number: JP20275988A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Horyo; Junzo Mizoguchi; Yutaka Sato
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1988-08-16
Filing date: 1988-08-16
Publication date: 1993-01-27
Also published as: JPH0253490A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規なアルギニン・デイミナーゼ遺
伝子および該遺伝子を用いたアルギニン・デイミ
ナーゼの製造法に関する。〔従来の技術〕アルギニン・デイミナーゼ（酵素分類番号
3.5.3.6）は、Ｌ−アルギニンと水からＬ−シトル
リンとアンモニアを生成する酵素反応を触媒する
酵素であり、動物、細菌、酵母類にその存在が知
られている〔酵素ハンドブツク、602頁、朝倉書
店、1984年版、第１版第３刷〕。これらの酵素のうち、精製されたと報告のある
ものとしては、シユードモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）、マイコプラズマ・ホミ
ニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズ
マ・アルスリテイデイス（Mycoplasma
arthritidis）が知られている〔カキモト、テイ
ー．ら（Kakimoto，T.etal）フエブスレター
（FEBS Lett.）VoL.19，Ｐ 166−168，
（1971）；シムケ、アール・テイー．（Shimke，
R.T.）メソツドオブエンザイモロジー
（Meth.Enzymol.）VOL.17A，Ｐ 310−313，
（1970）；ワイクマン、ジエー．エル．アンドフ
アルニー、デイー．イー．（weickman，J.L.＆
Fahrney，D.E.）ジヤーナルオブバイオロジ
カルケミストリー（J.Biol.Chem.）VOL.252，
P2615−2620，（1977）〕。〔発明が解決しようとする問題点〕腫瘍細胞増殖阻害剤として有用であるアルギニ
ン・デイミナーゼは、従来、アルギニン・デイミ
ナーゼ生産菌により生産していたが、これらの製
造法にはいくつかの問題点があつた。すなわち、
これらのアルギニン・デイミナーゼ生産菌は、ア
ルギニン・デイミナーゼ生産性が低いこと；マイ
コプラズマに属するマイコプラズマ・ホミニス
（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・ア
ルスリテイデイス（Mycoplasma arthritidis）
から採取する場合は培養管理が煩雑であり、該酵
素の大量生産における酵素源として用いるには難
点があること；精製純化するのに極めて困難であ
る等である。アルギニン・デイミナーゼをコードする詳細な
遺伝子の一次構造及び構成するタンパク質のアミ
ノ酸配列の一次構造は未だ報告されておらず、上
記問題点の具体的解決法が求められていた。〔問題点を解決するための手段〕本発明者らは、先に動物腫瘍細胞TRC−29R
の培養中、顕著に増殖阻害を示す細胞株を見出
し、その株について、種々研究を行つた結果、そ
の株に寄生したマイコプラズマ属に属する菌株マ
イコプラズマ・オラーレ（TGIF）〔微工研菌条
寄第1970号（FERM BP−1970）〕が、アルギニ
ン・デイミナーゼを産生することを見出した。さらに、本発明者らは、上記問題点に関し鋭意
研究の結果、アルギニン・デイミナーゼをコード
する詳細な遺伝子DNAの一次構造及び構成する
該酵素のアミノ酸配列の一次構造を決定すること
に成功し、該DNAを保持するベクターおよび形
質転換体を得、該形質転換体を培養するアルギニ
ン・デイミナーゼの製造法を確立し本発明を完成
するに至つた。即ち、本発明は、以下に示す通りである。アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプ
チドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む
DNA、アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペブ
チドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む
DNAを保持することを特徴とするベクター、宿主にとつて外来性であるアルギニン・デイミ
ナーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列を
コードする塩基配列を含むDNAを保持すること
を特徴とする形質転換体、Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａはアミノ酸残基
または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基または
−OHを示す〕で表されるポリペプチドを構成成
分とするアルギニン・デイミナーゼ、および宿主にとつて外来性であるアルギニン・デイミ
ナーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列を
コードする塩基配列を含むDNAを保持した形質
転換体を培養して、該DNAの遺伝情報を発現せ
しめ、該培養物からアルギニン・デイミナーゼを
構成するポリペプチドを採取することを特徴とす
るアルギニン・デイミナーゼの製造法。本発明のアルギニン・デイミナーゼを構成する
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配
列を含むDNAは新規物であり、本発明において
アルギニン・デイミナーゼとは前述の通りＬ−ア
ルギニンと水からＬ−シトルリンとアンモニアを
生成する酵素反応を触媒するものを示すが、特に
例えば下記の理化学的性状を有するものを挙げる
ことができる。 (a) 作用；Ｌ−アルギニンと水からＬ−シトルリ
ンとアンモニアを生成する酵素反応を触媒す
る、 (b) 基質特異性；Ｌ−アルギニンに基質特異性を
有する、 (c) 至適PH；7.0〜7.5、 (d) PH安定性；5.0〜10.0。また、アルギニン・デイミナーゼを構成するポ
リペプチドのアミノ酸配列が、Ｎ末端側より第１
図〔図中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示
し、Ｂはアミノ酸残基または−OHを示す〕で表
されるものであつてもよい。該ポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNAと
しては、図中のＡ，Ｂがアミノ酸残基を示す場合
であり、Ａ，Ｂを含め各アミノ酸に対応する一連
のコドンのうちのいずれか１個のコドンからなる
DNA（ポリデオキシリボ核酸）であればよい。アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプ
チドのアミノ酸配列をコードする塩基配列の代表
例として、5′末端側より第２図〔図中、＊＊＊は
TGAまたはTGGを示す〕で表される塩基配列を
有するDNAを挙げることができる。該塩基配列
を含むDNAは、該塩基配列の5′末端側にアミノ
酸をコードするコドンを１個以上有したものでも
よく、好ましくはATGまたはシグナルペプチド
に対応するコドンを有したものを挙げることがで
きる。3′末端側には、アミノ酸をコードするコド
ンを１個以上有するかまたは翻訳終止コドンを有
するかのいずれでもよく、更に、その3′末端側に
アミノ酸をコードするコドンを１個以上有する場
合には、このアミノ酸をコードするコドンの3′末
端に翻訳終止コドンを有することが好ましい。これらの塩基配列は以下の如く決定した。即
ち、予め、後記の精製法により精製したアルギニ
ン・デイミナーゼのＮ末端アミノ酸配列の一部
を、液相プロテインシーケンサー（ベツクマン
社製：BECKMAN System 890ME）で決定し、
該アミノ酸配列を基にして合成されたプローブを
作製する。次いでこのプローブを用い、後記の方
法により作成された遺伝子ライブラリーとコロニ
ーハイブリダイゼーシヨンを行い、クローニング
を行い、アルギニン・デイミナーゼを構成するポ
リペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含むDNAを保持する形質転換体を得、該形質
転換体より、アルギニン・デイミナーゼを構成す
るポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基
配列を含むDNAを採取する。その塩基配列は、
Science214 1205〜1210（1981年）に示されてい
るジデオキシ法で解読し、またアルギニン・デイ
ミナーゼの全アミノ酸配列は、塩基配列より予測
決定し、本発明のアルギニン・デイミナーゼの
DNA供与微生物より抽出されたアルギニン・デ
イミナーゼのＮ末端部分アミノ酸配列と一致する
ものであることを確認した。遺伝子ライブラリーの作成法としては、例えば
DNAの供与微生物より採取した遺伝子DNAを制
限酵素で切断し、該DNA断片をベクターに挿入
し、得られた組換えプラスミドで宿主微生物を形
質転換しライブラリーを作製する方法が挙げられ
る。分離精製された微生物DNAを切断する方法は、
例えば、超音波処理、制限酵素処理などにより行
うことができるが、得られるDNA断片とベクタ
ーとの結合を容易ならしめるため、制限酵素、と
りわけ特定ヌクレオチド配列に作用する、例え
ば、EcoR，Hind，BamHなどの型制限
酵素が適している。ベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に
増殖しうるフアージまたはプラスミドから遺伝子
組換え用として構築されたものが適している。フアージとしては、例えば、エシエリヒア・コ
リ（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合
には、λgt・λC，λgt・λBなどが使用できる。また、プラスミドとしては、例えば、エシエリ
ヒア・コリを宿主微生物とする場合には、
pBR322，pBR325，pACYC184，pUC12，
pUC13，pUC18，pUC19，pUC118などが、バチ
ルス・ズブチルス（Bacillus subtillis）を宿主微
生物とする場合にはpUB110，pC194などが使用
でき、さらに、エシエリヒア・コリおよびサツカ
ロマイセス・セレビシアなどの二種以上の宿主微
生物体内で自律的に増殖可能なシヤトルベクター
を利用することもできる。このようなベクター
を、先に述べたアルギニン・デイミナーゼ遺伝子
供与体である微生物DNAの切断に使用した制限
酵素と同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を
得ることが好ましい。微生物DNA断片とベクター断片とを結合させ
る方法は、公知のDNAリガーゼを用いる方法で
あればよく、例えば、微生物DNA断片の接着末
端とベクター断片の接着末端とのアニーリングの
後、適当なDNAリガーゼの作用により微生物
DNA断片とベクター断片との組換えDNAを作成
する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微生
物に移入して、生体内のDNAリガーゼを利用し
組換えDNAを作成することもできる。宿主微生物としては、組換えDNAが安定かつ
自律的に増殖可能で、且つ外来性DNAの形質が
発現のできるものであればよく、例えば、宿主微
生物がエシエリヒア・コリの場合、エシエリヒ
ア・コリDH1，エシエリヒア・コリHB101，エ
シエリヒア・コリW3110，エシエリヒア・コリ
C600、変異株としてエシエリヒア・コリCAJ64
等が利用出来る。宿主微生物に組換えDNAを移入する方法とし
ては、例えば、宿主微生物がエシエリヒア属に属
する微生物の場合には、カルシユウムイオンの存
在下で組換えDNAの移入を行い、またバチルス
属に属する微生物の場合には、コンピテントセル
法またはプロトプラスト法などを採用することが
でき、さらにマイクロインジエクシヨン法を用い
てもよい。前述のDNAを採取するには以下の如く行う。
即ち、DNAの供与微生物を、例えば、液体培地
で約１〜３日間通気撹拌培養し、得られる培養物
を遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させる
ことによつてアルギニン・デイミナーゼ遺伝子を
含有する溶菌物を調製する。溶菌方法としては、
例えばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞
壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプロ
テアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウ
ムなどの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の
物理的破壊法である凍結融解やフレンチプレス処
理を上述の溶菌法との組み合せで行つてもよい。このようにして得られた溶菌物からDNAを分
離、精製するには、常法に従つて、例えばフエノ
ール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、
リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分
離などの方法を適宜組み合わせることにより行う
ことができる。 DNAの供与微生物は、アルギニン・デイミナ
ーゼ産生能を有する微生物であればよく、例え
ば、マイコプラズマ属、シユードモナス属に属す
る生産菌等の群から適宜選ばれ、好ましくは、マ
イコプラズマ属に属するアルギニン・デイミナー
ゼ生産菌が挙げられる。また、後記の分類学的性
状を有する新規なマイコプラズマ・オラーレ
（TGIF）〔Mycoplasma orale（TGIF）、微工研
菌条寄第1970号（FERMBP−1970〕を利用する
ことが好まく、さらに、遺伝子組換え技術を駆使
して、アルギニン・デイミナーゼをコードする塩
基配列を保持する形質転換体をDNAの供与微生
物として利用してもよい。前述のマイコプラズマ・オラーレ（TGIF）の
分類学的性状は以下のとおりである。培地における生育状態マイコプラズマ・オラーレ（TGIF）の液体培
地〔培地組成；培地１中にPPLOブロスＷ／Ｏ
（DIFCO社製）15ｇ、Ｌ−アルギニン塩酸塩５
ｇ、ウマ血清200ml、酵母エキス25ｇ、酢酸タリ
ウム0.25ｇ、ペニシリンＧカリウム10万単位、フ
エーノールレツド５mgを含有する〕に於ける増殖
は、種菌として１×10⁵CFU／ml〔CFUは集落形
成単位（Colony Forming Unit）を示す〕接種
し、37℃で、静置培養した結果、誘導期に続いて
対数増殖期に入り、培養開始４〜５日後に菌数が
最大になる定常期に至る。定常期の期間は短く、
培養によつて異なり、且つほぼ数時間で、減数期
に入る生育形態をとる。生理的諸条件生育し得るPH；６〜８、至適PH；7.4〜7.6、生育し得る温度；30〜37℃、至適生育温度；37℃。顕微鏡下における形態的特徴寒天培地〔培地組成；培地１中に、バクトア
ガー（DIFCO社製）10ｇ、PPLOブロスｗ／
oCV（DIFCO社製）14.5ｇ、Ｌ−アルギニン塩酸
塩５ｇ、Ｌ−グルタミン３ｇ、DNA（粗製）20
mg、NAD150mg、グルコース10ｇ、イーグルビタ
ミン液（×100）10ml、ウマ血清200ml、酵母エキ
ス25ｇを含有する〕に於ける集落の大きさは、10
〜500μmであり、中心部が濃く、周辺が薄く、い
わゆる目玉焼状を呈する。染色はDienes（デイエ
ネス）液〔メチレンブルー 2.5ｇ；アズール
1.25ｇ；マルトース10.0ｇ；Na₂CO₃0.25ｇ；蒸
留水 100ml〕を用いて行つた。染色液を寒天面
に流し、１〜２分後に余分の液を捨て、顕微鏡観
測した。集落の中心部は濃青色に周辺部は淡青色
に染まつて見えた。100倍の顕微鏡倍率下では、
周辺部は顆粒状に見えた。抗体による発育阻害ワラス（Wallace A.Clyde，JR）著の文献
〔ジヤーナルオブイムノロジー（J.
Immunol.）VOL.92，P958−965，（1964）〕に従
い、各マイコプラズマ種に対する抗血清を含む培
地上の発育阻害よりマイコプラズマ・オラーレと
同定された〔東京大学医学部付属動物実験施設に
よる〕。グルコース、アルギニン、尿素の分解試験被
検菌を10％（Ｖ／Ｖ）ウマ血清添加ハートインフ
ユジヨンブロス（Heart infusion broth）〔Dico
社製）で、24時間培養し、その１mlをそれぞれグ
ルコース、アルギニン、尿素を含む被検培地およ
び対照培地に接種した。培養試験管を密栓して、
37℃で１週間培養した。被検物質を含まない対照
と0.5以上のPHの下降または上昇のみられたもの
を陽性として、判定した結果は以下の通りであつ
た。グルコース分解活性；陰性、アルギニン分解活性；陽性、尿素分解活性；陰性、以上の結果から、細胞壁の完全欠如、直径0.1〜
0.2μmの基本小体を有し、集落形態として、寒天
培地にくい込んで増殖し、目玉焼状集落を形成す
る特徴を有し、発育に血清を必要とすることから
マイコプラズマ属に属する。そこで、抗体による
増殖阻害試験により、本菌株は、マイコプラズ
マ・オラーレ（TGIF）〔Mycoplasmaorale
（TGIF）、微工研菌条寄第1970号（FERM BP−
1970〕と同定命名した。宿主微生物への目的組換えDNA移入の有無に
ついての選択は、目的組換えDNAを保持するベ
クターの薬剤耐性マーカーとアルギニン・デイミ
ナーゼとを同時に発現し得る微生物を検索すれば
よく、例えば、薬剤耐性マーカーに基づく選択培
地で生育し、且つアルギニン・デイミナーゼを生
成する微生物を選択すればよい。かくして得た形質転換体を具体的に例示すれ
ば、マイコプラズマ・オラーレ（TGIF）より採
取したアルギニン・デイミナーゼをコードする
DNAをプラスミドpUC118（宝酒造社製）に組み
込み、宿主微生物エシエリヒア・コリDH1（T.
Maniatis.，et al.Molecular cloning.Cold
Spring Harbor（1982），504−506）にトランスフ
オーメーシヨンし遺伝子ライブラリーを作製し、
予め合成したプローブによりコロニーハイブリダ
イゼーシヨンを行い、クローニングを行つて得た
エシエリヒア・コリDH1−PUC118−TGIF
〔Escherichia coli DH1−PUC118−TGIF、微
工研菌条寄第1969号（FERM BP−1969〕が挙
げられる。アルギニン・デイミナーゼをコードするDNA
を含むベクターを製造するに当たつては、前述の
如く得た遺伝子ライブラリーをプローブによりコ
ロニーハイブリダイゼーシヨンを行い、クローニ
ングを行つて得た形質転換体より通常の方法によ
り抽出すればよい。アルギニン・デイミナーゼを
コードするDNAを含むベクターの具体的な例示
としては、エシエリヒア・コリDH1−PUC118−
TGIFより採取したプラスミド（pcTGIF1と命
名）が挙げられる。プラスミドpcTGIF1の制限
酵素開裂地図は、第３図に示される通りであつ
た。アルギニン・デイミナーゼを製造するに当たつ
ては、宿主微生物と同一にコドンユーセージを有
する微生物をDNAの供与微生物とした場合とそ
うでない場合とに分け、それぞれに応じて操作を
行う必要がある。即ち、もともと同一のコドンユ
ーセージを有する場合かあるいは供与微生物と同
一のコドンユーセージを有するような変異株を宿
主微生物とした場合には、前記に記載の如く、採
取したアルギニン・デイミナーゼのアミノ酸配列
をコードするDNAを含む組換えDNAベクターを
複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターの
マーカーとアルギニン・デイミナーゼの活性とを
指標としてスクリーニングして取得した該組換え
DNAベクターを保持する微生物を培養しアルギ
ニン・デイミナーゼを採取すればよい。宿主微生物と同一のコドンユーセージを有しな
い微生物をDNAの供与微生物とした場合には、
例えば、供与微生物がマイコプラズマ属に属する
微生物であり、エシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）を宿主微生物とするような
場合には、マイコプラズマ属においてトリプトフ
アンをコードするコドンTGAが通常のエシエリ
ヒア・コリにおいては終止コドンであるので、
TGAをトリプトフアンとして認識する様にナン
センスサプレツシヨンのかかつた変異株エシエリ
ヒア・コリCAJ64（Escherichia coli CAJ64）
〔京都大学理学部生物物理学科小関治男教授よ
り分与を受けた〕等を使用してアルギニン・デイ
ミナーゼの発現を行えばよい。具体的には、エシ
エリヒア・コリCAJ64株をプラスミドpcTGIF1
で形質転換して得たエシエリヒア・コリCAJ64−
PUC118−TGIFを培養してアルギニン・デイミ
ナーゼの発現を行えばよい。また、例えば、供与微生物がマイコプラズマ属
に属する微生物であり、通常のエシエリヒア・コ
リ（Escherichia coli）を宿主微生物とするよう
な場合には、予めマイコプラズマ属等の供与微生
物から採取したDNAまたは組換えDNAベクター
中のコドンTGAを例えばトリプトフアンをコー
ドするTGGとするポイントミユーテーシヨンを
行つた後、得られた変換DNAを含むベクターに
て再度のエシエリヒア・コリを形質転換し、アル
ギニン・デイミナーゼの製造をせしめてもよい。 TGAをTGGとなすポイントミユーテーシヨン
としては以下の方法が例示される。前述のエシエリヒア・コリDH1−PUC118−
TGIFに、M13K07フアージを感染させ、
pcTGIFの一本鎖環状DNAを得る。次いで、こ
の一本鎖環状DNAに相補的で、かつTGAコドン
のうちの一つの相補配列を含むオリゴヌクレオチ
ドを設計し、そのTGAに相補的な部分の
3′ACT5′のＴをＣに換えたものを作製する。続い
て、一本鎖環状DNAに、オリゴヌクレオチドを
アニーリングさせ、これをプライマーとして
DNA合成を行い、一本鎖環状DNAを二本鎖環状
DNAとし、エシエリヒア・コリへトランスフオ
ーメーシヨンする。先のオリゴヌクレオチドを放
射能ラベルし、プローブとしてコロニーハイブリ
ダイゼーシヨンを行い、ポジテイブ株を目的の変
異DNA形質転換体として選択する。同様な操作
を順次繰り返すことにより全てのTGAコドンを
TGGとなすことができる。このようにして一度選択されたアルギニン・デ
イミナーゼ遺伝子を保有する組換えDNAは、形
質転換体から取り出され、他の宿主微生物に移入
することも容易に実施できる。また、アルギニ
ン・デイミナーゼ遺伝子を保持する組換えDNA
から制限酵素などにより切断してアルギニン・デ
イミナーゼ遺伝子であるDNAを切り出し、これ
と同様な方法により切断して得られる他のベクタ
ー断片とを結合させて、他の宿主微生物に移入す
ることも容易に実施できる。かくして得られた形質転換体である微生物は、
栄養培地に培養されることにより多量のアルギニ
ン・デイミナーゼを安定して産生し得る。形質転換体である微生物の培養形態はその栄養
生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良
く、通常多くの場合は、液体培養で行うか、工業
的には深部通気攪拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用い
られるものが広く使用され得る。炭素源として
は、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば
グルコース、シユクロース、ラクトース、マルト
ース、フラクトース、糖蜜、などが使用される。
窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよ
く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カ
ゼイン加水分解物などが使用される。その他、リ
ン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシ
ウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩
類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要
に応じて使用される。培養温度は微生物が発育し、アルギニン・デイ
ミナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エ
シエリヒア・コリの場合、好ましくは20〜42℃程
度である。培養時間は、条件によつて多少異なる
が、アルギニン・デイミナーゼが最高収量に達す
る時期を見計らつて適当な時期に培養を終了すれ
ばよく、通常は12〜48時間程度である。培地PHは
菌が発育し、アルギニン・デイミナーゼを生産す
る範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはPH
6.0〜8.0程度である。培養物中のアルギニン・デイミナーゼは、菌体
を含む培養液そのままを採取し、利用することも
できるが、一般には常法に従つて、アルギニン・
デイミナーゼが培養液中に存在する場合には、濾
過、遠心分離などによりアルギニン・デイミナー
ゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用さ
れる。アルギニン・デイミナーゼが菌体内に存在
する場合には、得られた培養物を濾過または遠心
分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこ
の菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素
的方法で破壊し、また必要に応じてEDTA等の
キレート剤および／または界面活性剤を添加して
アルギニン・デイミナーゼを可溶化し水溶液とし
て分離採取する。この様にして得られたアルギニン・デイミナー
ゼ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更
に、硫安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、ある
いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノ
ール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱
せしめればよい。次いでこの沈澱物を、水に溶解
し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不
純物を除去することができる。また吸着剤あるい
はゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマト
グラフイー、イオン交換クロマトグラフイーによ
り精製し、これらの手段を用いて得られるアルギ
ニン・デイミナーゼ含有溶液は、減圧濃縮凍結乾
燥等の処理にてより精製されたアルギニン・デイ
ミナーゼを得ることができる。以上の製造法により得られるアルギニン・デイ
ミナーゼとして例えば下記の諸物性を有する新規
なアルギニン・デイミナーゼが例示される。 (1) アルギニン・デイミナーゼ活性測定法基質溶液の調整： 200mMトリス−塩酸緩衝液（PH7.2）200μlに
50mMDTT（デイチオスレイトール）80μl、
100mMアルギニン・塩酸付加物40μlを溶解して、
基質溶液を調整する。酵素溶液の調整：後述の実施例により得られた本発明アルギニ
ン・デイミナーゼ溶液を10mMトリス塩酸緩衝液
（PH7.0）でOD₂₈₀＝0.005になるように希釈して酵
素溶液とした。活性測定：前記の基質溶液320μlを小試験管に取り、37℃、
水浴中に２分間静置した後、酵素溶液80μl添加
し、反応を開始する。正確に30分間、37℃で反応
した後、5M過塩素酸100μlを添加し反応を停止す
る。その後、反応液に、酸化環元緩衝液〔9.0ｇ
NH₄Fe（SO₄）₂・12H₂O，11.0ｇ（NH₄）₂Fe
（SO₄）₂・6H₂Oを1N硫酸溶液に溶解し100mlとし
た溶液〕125μlを加え、その後酸混合液〔蒸留水
200ml，H₃PO₄（ｄ＝1.74）300ml，H₂PO₄（ｄ＝
1.84）100ml〕625μlを加え、ジアセチルモノキシ
ム溶液〔ジアセチルモノキシム0.75ｇを蒸留水に
溶解し100mlとした溶液〕250μlを加え、遮光下、
20分間沸騰水中で加熱し、その後冷却し、490nm
の吸光度を測定する。シトルリン生成量を算定す
るための標準線は、1M過塩素酸で調整した種々
の濃度（0.01〜0.05μmole／ml）のＬ−シトルリ
ン溶液500μlを用い、上記酸化還元緩衝液125μl添
加以降の操作を行つてシトルリン濃度に対する
490nmの吸光度の関係をプロツトして作成し、直
線領域を標準検量線として使用した。 (2) 基質特異性：遊離アミノ酸に対する反応の特異性を調べるた
めに、アミノ酸混合液（１の10mMトリス塩酸
緩衝液（PH7.0）にＬ−アルギニン200mg、Ｌ−ア
スパラギン・H₂O56.8mg、Ｌ−アスパラギン酸20
mg，Ｌ−シスチン50mg、Ｌ−グルタミン酸20mg、
Ｌ−グルタミン300mg、グリシン10mg、Ｌ−ヒス
チジン15mg、Ｌ−ヒドロキシプロリン20mg、Ｌ−
イソロイシン50mg、Ｌ−ロイシン50mg、Ｌ−リジ
ン・HCl40mg、Ｌ−メチオニン15mg、Ｌ−フエニ
ルアラニン15mg、Ｌ−プロリン20mg、Ｌ−セリン
30mg、Ｌ−スレオニン20mg、Ｌ−チロシン20mg、
Ｌ−バリン20mg、Ｌ−トリプトフアン５mgを含有
する）800μlに200μlの本発明アルギニン・デイミ
ナーゼ溶液（OD_280on＝0.016）を添加し、37℃，
18時間インキユベートした後、アミノ酸濃度の変
化をアミノ酸自動分析装置（日立Ｌ−8500型）
を用いて解析した。対照として、本発明アルギニ
ン・デイミナーゼ溶液の代わりに10mMトリス塩
酸緩衝液を添加して同じ操作を行つた。その結果
第１表に示す如く本発明アルギニン・デイミナー
ゼは、Ｌ−アルギニンに特異的に作用してシトル
リンを生成する反応を触媒する酵素であることが
わかつた。【表】【表】 (3) 酵素作用：次の反応を触媒する。Ｌ−アルギニン＋H₂O→シトルリン＋NH₃ (4) PH安定性： 10μlの本発明酵素溶液（OD_280on＝0.8）を40μl
の試験PH緩衝液と混合し、37℃、３時間インキユ
ベートした後、950μlのPBSを加えて、20倍に希
釈し、残存する酵素活性を前記酵素活性測定法に
従つて測定した。その結果、PH5.0〜10.0まで安
定であつた。尚、試験PH緩衝液は、PH3.0〜6.0ま
では0.1Mクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、
PH7.0〜9.0までは0.1Mトリス塩酸緩衝液、PH10.0
は0.1Mグリシン−NaOH緩衝液を用いた。 (3) 至適PH：種々のPH値の緩衝液を用いて、前述の酵素活性
測定法に従い、測定した結果、PH7.0〜7.5の範囲
に至適PHを有していた。 (6) 分子量： 47000±5000（SDS−PAGE法） 55000±5000（ゲル濾過法） (7) 等電点：アンフオラインピーエージープレート
（AMPHOLINE PAGPLATE；LKB社製）を用
いる等電点電気泳動法により測定した結果、
pI7.4±0.5に等電点を有する。 (8) Ｎ末端アミノ酸配列解析後述の実施例に基づいて得られた本発明酵素
（総OD_280on＝0.01）を用いて液相プロテインシ
ーケンサー（ベツクマン社製：BECKMAN
System 890ME）によりＮ末端側からのアミノ
酸配列を解析した結果、まず、以下の如く５番目
までの配列が明らかとなり、Ｘ−Ser−Val−Phe−Ser−Asp−（式中、Ｘは水
素原子又はMetを示す）更に、総OD_280on＝0.05のサンプルで解析の結
果、以下の如く30番目までの配列が明らかとなつ
た。Ｘ−Ser−Val−Phe−Ser−Asp−Lys−Phe−
Asn−Gly−Ile−His−Val−Tyr−Ser−Glu−
Ile−Gly−Asp−Leu−Glu−Ser−Val−Leu−
Val−His−Glu−Pro−Gly−Lys−Glu−（式中、
Ｘは水素原子又はMetを示す） (9) アミノ酸組成分析精製した本発明酵素標品（OD_280on＝0.08）１
mlに12N塩酸を等量加え、105℃、24時間加水分
解した後、アミノ酸自動分析装置（日立Ｌ−8500
型）を用いて解析した。本発明酵素の分子量は
SDS電気泳動から約47000であり、アミノ酸の平
均分子量を110とすると構成アミノ酸は約427残基
となることから、分析結果を427残基当りのアミ
ノ酸残基数で表し、その結果を第２表に示す。【表】【表】以上の諸性質を公知のアルギニン・デイミナー
ゼと比較すると、いずれの酵素とも異なることが
判る。また、本発明酵素は腫瘍細胞にたいする強い増
殖阻害活性を示すことから抗癌剤としての用途が
考えられる。以下に本発明酵素の腫瘍細胞に対す
る理化学的諸性状を示す。 (a) 細胞増殖抑制活性の測定法測定に用いる細胞：本発明酵素に対し阻害感受
性の高い細胞としてCCRF−CEM細胞（ヒトリ
ンパ球系白血病細胞；大日本製薬(株)から購入）を
選定し、検定に使用した。培養用培地：10％牛胎児血清（FCS）添加
RPMI−1640培地（100mg／のペニシリンＧ及
び硫酸ジヒドロストレプトマイシンを含む）。測定方法：上記培養用培地で培養された対数増
殖期にあるCCRF−CEM細胞を集め、新鮮な培
養用培地に懸濁し、細胞濃度を1.11×10⁴個／ml
に調整する。その後、得られた細胞含有溶液を24
穴マルチプレート（MULTIDISH；NUNC社
製）に900μ／穴（well）づつ均質な細胞懸濁
液を播種する。フイルター（MILLEX GV フ
イルター；ミリポア社製）で濾過滅菌した試験溶
液を100μl／well添加し、ゆるく撹拌する。コン
トロールとしてPBS（リン酸緩衝液生理食塩水）
100μl／well添加する。細胞懸濁液を播種した24
穴マルチプレートそれぞれを、５％CO₂，95％空
気、100％湿度、37℃のインキユベーター４で４
日間培養した後、各well内の細胞数をコールター
カウンター（米国；コールター社製）を用いて計
測する。以下の式に従い増殖抑制率（％）を算出する。増殖抑制率％＝１−Ａ−Ｂ／Ｃ−Ｂ×100 Ａ；試験液細胞数Ｂ；播種細胞数Ｃ；コントロール溶液の細胞数この系で、CCRF−CEM細胞の増殖を50％阻
害する活性を１単位(u)とした。 (b) 細胞増殖抑制に対するPH安定性 10μlの本発明酵素溶液（10000u／ml）を40μlの
試験PH緩衝液と混合し、37℃、３時間インキユベ
ートした後、950μlのPBSを加えて、20倍に希釈
し、残存する細胞増殖抑制活性を前記細胞増殖抑
制活性の測定法に示した方法に従つて計測した。
その結果、PH5.0〜10.0まで安定であつた。尚、試験PH緩衝液は、PH3.0〜6.0までは0.1Mク
エン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、PH7.0〜9.0
までは0.1Mトリス塩酸緩衝液、PH10.0は0.1Mグ
リシン−NaOH緩衝液を用いた。 (c) 細胞増殖抑制に対する熱安定性 10μlの本発明酵素溶液（10000u／ml）を990μl
の0.05Mトリス塩酸緩衝液（PH7.0）に加え、37
℃で24時間、60℃で１時間、100℃で５分間処理
した後氷冷し、残存する細胞増殖抑制活性を測定
することにより評価した。以下の第３表にその結
果を示す。【表】 (d) 細胞増殖抑制作用の各種酵素に対する安定性各種の酵素を用い、それぞれの至適PHで37℃、
６時間反応した後、残存する細胞増殖抑制活性を
測定することにより評価した。以下にその結果を
第４表に示す。【表】【表】 (e) 細胞増殖抑制作用の各種の有機酸および有機
溶媒に対する安定性本発明酵素溶液（2000u／ml）に各種の有機酸
および有機溶媒を各添加濃度（Ｖ／Ｖ％）で添加
し、25℃、１時間反応した。その後反応液を
PBSを用いて希釈し、本発明酵素濃度を100u／
mlになる様に調整した後、残存する細胞増殖抑制
活性を測定することにより評価した。以下にその
結果を第５表に示す。【表】 (f) 各種腫瘍細胞に対する増殖抑制作用各種培養系の腫瘍細胞に対する本発明酵素の増
殖抑制作用について、ヒトリンパ球系白血病由来
細胞株（CCRF−CEM，CCRF−HSB2，CCRF
−SB，RPMI−8226）、ヒト骨髄系白血病由来細
胞株（Ｋ−562，HEL92・１・７）、ヒト腎癌由
来細胞株（TRC−29R）、ヒト肺癌由来細胞株
（TLC−7NC3）、マウス乳癌由来細胞株（Ｃ−
127I）を用い、これらの細胞株の増殖に及ぼす影
響を調べた。培養に用いた培地は、Ｃ−127I細胞
株には、Ｅ−MEM培地に10％牛胎児血清を添加
した培地を使用し、それ以外の細胞株は、RPMI
−1640培地に10％牛胎児血清を添加した培地を使
用した。それぞれの細胞株を各培地で培養し、対
数増殖期にあるこれらの腫瘍細胞株を進め、新鮮
な培養用培地に懸濁し、細胞濃度を１×10⁴個／
mlになる様に調整した。24穴マルチプレートに均
一に懸濁した細胞浮遊液を１ml／wellに播種した
後、PBSに溶解した本発明酵素の種々の濃度の
希釈液100μl／well添加し、５％CO₂，95％空気、
100％湿度、37℃のインキユベーターで４日間培
養した。対照として本発明酵素の希釈液の代わり
にPBSを添加して培養した。培養後の細胞数の測定は、浮遊系の細胞（白血
病由来細胞）は、ISOTON （米国；コール
ター社製）で20倍に希釈し、付着性細胞は、培地
を吸引除去した後0.1％トリプシン溶液１mlで、
培養基質から細胞を剥離し、ISOTON で20
倍に希釈して測定用サンプルとし、コールターカ
ウンター（米国；コールター社製）を用いて計測
した。更に以下の式に従い増殖抑制率（％）を算
出する。増殖抑制率％＝１−Ａ−Ｂ／Ｃ−Ｂ×100 Ａ；試験液細胞数Ｂ；播種細胞数Ｃ；対照溶液の細胞数その結果、試験に供したすべての腫瘍細胞株で
増殖抑制作用が認められ、50％の増殖阻害をしめ
す本発明酵素濃度は第６表に示す如く、280nmに
於けるOD値が10^-5〜10^-6の領域にあり、極めて
微量で作用することが明らかとなつた。【表】【表】 (g) 一般正常細胞に対する本発明酵素の影響マウス3T3細胞は長期分裂増殖可能であるが、
造腫瘍能を有さないことから、正常細胞に近い細
胞として、細胞変異及び細胞毒性の研究に広く用
いられており、今回一般正常細胞に対する本発明
酵素の影響の指標として用いた。マウス3T3細胞
を10％牛胎児血清を含むイーグルMEM培地に懸
濁し、５×10⁴個／mlになるように調整し、φ35
mmの組織培養用プラスチツクデイシユに２mlづつ
播種した。更にPBSに溶解したOD_280on値4.7×
10^-3の本発明酵素溶液を終濃度がOD_280on値2.35
×10^-4（10.2u／ml）になるように添加し、５％
CO₂，95％空気、100％湿度、37℃のインキユベ
ーターで培養した。対照として本発明酵素溶液の
代わりにPBSを添加して培養した。２日間及び
４日間培養した後、0.1％トリプシン溶液を用い
て細胞を剥離し、再度培養用培地に懸濁させて単
細胞浮遊液とした。細胞浮遊液１容にPBSに溶
解した0.1％トリパンブルー溶液９容を加えた後、
ノイバウエル氏血球計測盤を用いて細胞数を計測
した。トリパンブルーにより青色に染まる細胞は
死細胞、染まらない細胞は生細胞であるので、そ
の数を計測した結果、第７表に示す如く、本発明
酵素添加培養と無添加培養の場合に於いて、細胞
生存率に有意な差は認められず、本発明酵素が、
正常細胞に対して直接的な毒性を有さないことを
示した。【表】また本質的にアルギニン・デイミナーゼ活性の
あるアルギニン・デイミナーゼムテインのDNA
は、本発明のアルギニン・デイミナーゼ遺伝子か
ら遺伝子工学的手法により作製される人工変異遺
伝子を意味し、この人工変異遺伝子は上述の種々
なる遺伝子工学的方法を使用して得られ、特に優
れた性質を有するアルギニン・デイミナーゼムテ
インDNAは、最終的には、このムテインDNAを
ベクターに挿入せしめて組換えDNAを作成し、
これを宿主微生物に移入させることによつて、ア
ルギニン・デイミナーゼムテインの製造が可能で
ある。本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核酸、
核酸関連物質、その他に関する略号は、それらの
当該分野における慣用略号に基づくもので、それ
らの例を以下に列記する。またすべてのアミノ酸
はＬ体を示すものとする。 DNA：デオキシリボ核酸 RNA：リボ核酸Ａ：アデニンＴ：チミンＧ：グアニンＣ：シトシン Ala：アラニン Arg：アルギニン Asn：アスパラギン Asp：アスパラギン酸 Cys：システイン Gln：グルタミン Glu：グルタミン酸 Gly：グリシン His：ヒスチジン Ile：イソロイシン Leu：ロイシン Lys：リジン Met：メチオニン Phe：フエニルアラニン Pro：プロリン Ser：セリン Thr：スレオニン Trp：トリプトフアン Tyr：チロシン Vax：バリン〔実施例〕以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれらによつて何ら限定されるもの
ではない。実施例１マイコプラズマからのDNAの抽出 PPLOブロス（DIFCO社製）７容、ウマ血清
２容、酵母エキス１容、ペニシリンG1000u／ml、
酢酸タリウム500μg／mlを加えた液体培地１
に、１×10⁶CFU／mlのマイコプラズマ×オラー
レ（TGIF）を10ml接種し、37℃、５日間静置培
養した。培養液を高速冷却遠心分離機（日立
SCR−20BA型）を用い、14000rpm（25000G）で
15分間遠心分離し、2.8ｇのマイコプラズマ菌体
を得た。マイコプラズマからのDNAの抽出は、
J.Marmurの方法（J.Mol.Biol.（1961）3208−
218）により行つた。即ち、マイコプラズマ菌体
を50mlの0.1M EDTA含有生理食塩水に懸濁し、
先と同じ条件で菌体を遠心分離した後、再度25ml
の0.1M EDTA含有生理食塩水に懸濁した。これ
に20％SDSを加え、60℃で10分間処理し、細胞を
破壊した後、最終濃度が1Mになるように過塩素
酸ナトリウムを加え蛋白を変性せしめ、等量のク
ロロホルム：イソアミルアルコール＝24：１混合
液を加え30分間穏やかに振盪した後、10000rpm
（13000G）で10分間遠心し、分離した水層を他の
容器に移し、２倍量のエタノールを加え析出して
くる染色体をガラス棒にからめて取得した。この染色体を生理食塩含有クエン酸緩衝液（PH
7.0）10mlに溶解し、再度クロロホルムにて処理
し、2.5倍量のエタノールを加え、3000rpm
（2000G）で15分間遠心した。沈澱した染色体を
75％エタノールで洗い、乾燥後、再び生理食塩含
有クエン酸緩衝液（PH7.0）５mlに溶解し、最終
濃度50μg／mlのRNaseA（シグマ社製）を加え、
37℃、30分間RNAを分解した。次いでこれを再
度クロロホルムにて処理しエタノール沈澱した
後、染色体を0.1mM EDTA含有0.3M酢酸緩衝液
（PH7.0）に溶解した。これに0.54倍量のイソプロ
パノールを加え、析出してきた染色体を再びガラ
ス棒にからめて取得した。この染色体を再び0.3M酢酸緩衝液（PH7.0）に
溶解し、0.54倍量のイソプロパノールを加え
3000rpm（2000G）で15分間遠心し、沈澱した染
色体を75％エタノールで洗い、乾燥せしめ、染色
体標品179μgを得た。２マイコプラズマ遺伝子ライブラリーの作成マイコプラズマ染色体2μgを制限エンドヌクレ
アーゼSau3AI（東洋紡績社製）6uで10mM Tris
−HCl（PH7.5）、50mM NaCl、10mM MgCl₂、
1mMDTT、10μg／ml BSA（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）存在下37℃、２時間切断処理し
た。また、ベクタープラスミドpUC118（Col El
ori，Amp_r ，M13IG；宝酒造社製）2μgを制限エ
ンドヌクレアーゼBamHI（東洋紡績社製）6uで
50mM Tris−HCl（PH7.5）、100mM NaCl、
10mM MgCl₂、1mMDTT、10μg／ml BSA（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）存在下、37℃、16
時間切断処理した後、フエノール処理、フエノー
ル・クロロフオルム処理を行い、エタノール沈澱
した。この直鎖状になつたpUC118を大腸菌由来
アルカリフオスフアターゼ（東洋紡績社製）で、
50mM Tris−HCl（PH8.0）、1mM MgCl₂存在下、
65℃、１時間反応させ、5′末満のリン酸基を除去
した。以上の操作を行つたpUC118 100ng、マイコプ
ラズマ染色体200ngをT4DNAライゲース（宝酒
造社製）100uで、66mM Tris−HCl（PH7.6）、
6.6mM MgCl₂、10mM DTT、660μM ATP（ベ
ーリンガー・マンハイム社製）存在下16℃、16時
間ライゲーシヨンした。これをK.Shigesadaの方
法（細胞工学（1983）２，616−626）によつてコ
ンピテント細胞としたE.coli DH1（F^-，recA1，
enA1，gyrA96，thi−１，hsdR17（γ_k ^-，m_k ⁺），
supE44，re11，λ^-）（T.Maniatis.，et al.
Molecular cloning.Cold Spring Harbor
（1982），504−506）にトランスフオーメーシヨン
し、50μg／mlアンピシリン含有Ｌ平板寒天培地
（バクトトリプトン（DIFCO社製）20ｇ／、酵
母エキス（DIFCO社製）５ｇ／、NaCl5ｇ／
、バクトアガー（DIFCO社製）15ｇ／）に
て一夜培養し約30000のアンピシリン耐性コロニ
ーを得、マイコプラズマ遺伝子ライブラリーとし
た。３放射性オリゴヌクレオチドプローブの作製判明しているアルギニン・デイミナーゼのＮ末
端側の30アミノ酸配列を基に、その遺伝子の5′末
端側から90塩基配列を予想した。この予想配列の
中から17塩基配列２ケ所を選び、その配列を持つ
オリゴヌクレオチド２種を設計した。この際予想
される塩基配列は複数であり、それに対応するオ
リゴヌクレオチドも複数の配列のものの混合物と
した。このオリゴヌクレオチドをアール・エル・レツ
シンジヤーらの方法（R.L.Letsinger，．W.B.
Lursford Journal Am.Chem.Society 98，3655）
に基づきDNAシンセサイザー（ベツクマン社
製：Beckman Systeml Plus）を用いて作製し
た。完成したオリゴヌクレオチド200ngをT4ポリヌ
クレオチドキナーゼバツフアー（50mM Tris−
HCl（PH8.0）、10mM MgCl₂、10mM ２−メルカ
プトエタノール）および、20μCiのγ³²P−ATP
（アマシヤムジヤパン社製）存在下、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ（東洋紡績社製）8.5uで37℃、
30分間反応せしめ、アイソトープ³²Pを取り込ま
せ放射性オリゴヌクレオチドプローブとした。４アルギニン・デイミナーゼ遺伝子含有クロー
ンのスクリーニング前述の如くにより得た遺伝子ライブラリー即ち
平板寒天培地上のアンピシリン耐性コロニー上に
ナイロンメンブレンフイルター（PALL社製：バ
イオダインＡ）を重ね、フイルター上に該コロニ
ー菌体の一部を移行させた。さらに、同じ平板寒
天培地より同一の操作で該コロニー菌体の一部を
移行させたもう一枚のフイルターを作成し、以後
の操作を並行して行つた。該コロニー菌体の一部
を移行させたフイルターを別の50μg／mlアンピ
シリン含有Ｌ寒天平板培地上に重ね、フイルター
上の菌体を37℃で16時間培養した。培養後、この
フイルターをアルカリ変性溶液（0.5N NaOH、
1.5N NaCl）に５分間浸し、さらに3M酢酸ナト
リウム緩衝液（PH5.5）に５分間浸した後乾燥し
た。このフイルターを80℃で１時間加熱し、菌体
中にあつたプラスミドDNAをフイルターに固定
した。さらにこのフイルターをプレハイブリダイゼー
シヨン溶液（NaCl 52.6ｇ／、クエン酸三ナト
リウム26.5ｇ／、ピロリン酸ナトリウム0.5
ｇ／、ドデシル硫酸ナトリウム１ｇ／、フイ
コール（フアルマシア社製）１ｇ／、ポリビニ
ルピロリドン１ｇ／、BSA（ベーリンガー・マ
ンハイム社製）１ｇ／、サケ精子DNA（フアル
マシア社製）100mg／）に浸し、37℃で16時間
プレハイブリダイゼーシヨンを行つた。その後、
フイルターをハイブリダイゼーシヨン溶液（上記
プレハイブリダイゼーシヨン溶液の組成中より、
ドデシル硫酸ナトリウムおよびサケ精子DNAを
除き、tRNA（ベーリンガー・マンハイム社製）
20mg／を加えたもの）に浸し、先に用意した放
射性オリゴヌクレオチドプローブ２種を、二枚の
フイルターにそれぞれ１種ずつ加え、35〜40℃で
24時間ハイブリダイゼーシヨンを行つた。ハイブリダイゼーシヨン後、洗浄液
（NaCl52.6ｇ／、クエン酸三ナトリウム26.5
ｇ／、ピロリン酸ナトリウム0.5ｇ／）でフ
イルターを３回洗浄し、次いでこのフイルターを
38〜42℃の洗浄液に10分間浸し、余分なプローブ
を洗い落とした。フイルターは風乾後Ｘ線フイル
ム（富士写真フイルム社製：NewRXO−Ｈ）に
重ね、遮光下、−70℃で24時間オートラジオグラ
フイーを行つた。オートラジオグラフイー終了後、フイルムを現
像し、２種のプローブの両方にポジテイブシグナ
ルが観察されたコロニーを確認した。該コロニー
を、アルギニン・デイミナーゼをコードする
DNAを含む形質転換体（エシエリヒア・コリ
DH1−PUC118−TGIF）として取得した。５組換えプラスミドの抽出エシエリヒア・コリDH1−PUC118−TGIFよ
りテイー．マニアテイスらの方法（T.Maniatis.，
et al.Molecular cloning.Cold Spring Harbor
（1982），86−94）によつて、アルギニン・デイミ
ナーゼをコードするDNAを含む組換えプラスミ
ドpcTGIF1を抽出した。このプラスミド中のマ
イコプラズマ染色体由来の部位をジデオキシ法
（Science214 1205〜1210（1981年））により塩基
配列を決定し、アルギニン・デイミナーゼをコー
ドする全DNAが含まれていることを確認すると
共にその全塩基配列を決定した。EcoR，Hind
，Sau3Aを用いてこのプラスミドの制限酵
素開裂地図を作成し、その結果を第３図に示す。６トランスフエクシヨン E.coli CAJ64株を２×YT培地（1.6％ Bacto
Tripton（DIFCO社製）1.0％Yeast Extract
（DIFCO社製）0.5％NaCl）を用いて37℃で培養
し、OD_550on＝0.5に達したときの菌体を使用し
た。集菌した菌体を10mlの50mM CaCl₂に懸濁し、
０℃で20分間静置した後集菌し、再度２mlの
50mM CaCl₂に懸濁し、０℃で30分間静置した。
この懸濁液100μlにプラスミドpcTGIF1溶液1μl
（1ng／μl）を添加し０℃で30分間静置した後、42
℃90秒間、０℃90秒間のヒートシヨツクを加え、
続いて900μlのＬ培地（2.0％Bacto Tripton
（DIFCO社製）0.5％Yeast Extract（DIFCO社
製）0.5％NaCl）を添加して37℃50分間インキユ
ベートした。インキユベート後、菌体を50μg／
mlアンピシリン含有Ｌ寒天平板培地（Ｌ培地＋
1.5％Bacto Agar（DIFCO社製））上に播種し、
37℃で１晩培養しコロニーを形成した菌株をエシ
エリヒア・コリCAJ64−PUC118−TGIFとして
得た。７培養と細胞抽出物の調製 pcTGIF1で形質転換した菌株を50μg／mlアン
ピシリン含有Ｌ培地（1.0％Bacto Tripton
（DIFCO社製）0.5％Yeast Extract（DIFCO社
製）1.0％ Nacl）15ml中で37℃、18時間培養し
た後、遠心分離（6000rpm、10分間）により集菌
し300μlのTE（10mMTris−HCl（DIFCO社製）、
1mM EDTA，PH7.4）に懸濁した。超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、
14000rpm、５分間遠心分離し、上清を取得して
細胞抽出物とした。８細胞抽出物のアルギニン・デイミナーゼ活性
の確認 pcTGIF1で形質転換したE.coli CAJ64での
TGIF1遺伝子の発現を確認するために、形質転
換後の細胞抽出物中のアルギニン・デイミナーゼ
活性を測定した。細胞抽出物160μlに200mMトリス緩衝液（PH
7.2）を400μl、50mM DTT（ジチオステイトー
ル）を160μl、100mM Ｌ−アルギニン溶液を
80μl添加した後、ポアサイズ0.22μmのメンブラ
ンフイルター（Amico社製）で濾過滅菌し、無
菌的に37℃で18時間インキユベートした。インキ
ユベート後の反応液400μlに5M過塩素酸100μlを
添加して反応を停止させ、次いで酸還緩衝液
（1NH₂SO₄ 100ml中にNH₄Fe（SO₄）₂・12H₂Oを
9.0ｇおよび（NH₄）₂Fe（SO₄）₂・6H₂Oを11.0ｇを
含む）125μl、酸混合液（H₂O200ml，H₃PO₄（ｄ
＝1.74）300ml，H₂SO₄（ｄ＝1.84）100mlの混合
液）、ジアセチルモノオキシム溶液（0.75ｇ／100
mlH₂O）250μlを順次添加した後、遮光して沸騰
水上で20分間加熱した。冷水で温度を室温に戻し
た後490nmの吸光度を測定し、標準検量線からシ
トルリンの生成量を算定した。形質転換していないE.coli CAJ64の抽出物に
ついて、上記と同じ操作を行い対照とした。表８に示した結果から明らかな様に、
pcTGIF1プラスミドの移入により、アルギニ
ン・デイミナーゼ活性の発現が確認された。【表】「発明の効果」本発明のアルギニン・デイミナーゼをコードす
るNDAおよび該DNAを保持する形質転換体は、
該形質転換体を培養することを特徴とする該酵素
の製造法に用いられるものであり、腫瘍細胞増殖
阻害剤として有用である該酵素を大量に提供する
ことが可能でなつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルギニン・デイミナーゼを構成す
るポリペプチドのアミノ酸配列を示す。第２図
は、アルギニン・デイミナーゼを構成するポリペ
プチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
むDNAを示す。第３図は、プラスミドpcTGIF1
の制限酵素開裂地図である。

Claims

【特許請求の範囲】１Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａはアミノ酸残
基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基また
は−OHを示す〕で表されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を含むDNA。２塩基配列が、5′末端側より第２図〔図中、＊
＊＊はTGAまたはTGGを示す〕で表されるもの
である特許請求の範囲第１項記載のDNA。３Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａはアミノ酸残
基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基また
は−OHを示す〕で表されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を含むDNAを保持することを特
徴とするベクター。４塩基配列が、5′末端側より第２図〔図中、＊
＊＊はTGAまたはTGGを示す〕で表されるもの
である特許請求の範囲第３項記載のベクター。５ベクターが、プラスミドpcTGIF1である特
許請求の範囲第３項記載のベクター。６Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａはアミノ酸残
基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基また
は−OHを示す〕で表されるアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を含む宿主にとつて外来性である
DNAを保持することを特徴とする形質転換体。７塩基配列が、5′末端側より第２図〔図中、＊
＊＊はTGAまたはTGGを示す〕で表されるもの
である特許請求の範囲第６項記載の形質転換体。８形質転換体が、エシエリヒア・コリDH1−
PUC118−TGIF、エシエリヒア・コリCAJ64−
PUC118−TGIFおよびその突然変異体よりなる
群から選ばれたものである特許請求の範囲第６項
記載の形質転換体。９Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａはアミノ酸残
基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基また
は−OHを示す〕で表されるポリペプチドを構成
成分とするアルギニン・デイミナーゼ。１０Ｎ末端側より第１図〔図中、Ａはアミノ酸
残基または水素原子を示し、Ｂはアミノ酸残基ま
たは−OHを示す〕で表されるアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列を含む宿主にとつて外来性であ
るDNAを保持した形質転換体を培養して、該
DNAの遺伝情報を発現せしめ、該培養物からア
ルギニン・デイミナーゼを構成するポリペプチド
を採取することを特徴とするアルギニン・デイミ
ナーゼの製造法。