JPH022362A - 新規なグルタチオン・パーオキシダーゼ遺伝子およびその用途 - Google Patents
新規なグルタチオン・パーオキシダーゼ遺伝子およびその用途Info
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- JPH022362A JPH022362A JP63147884A JP14788488A JPH022362A JP H022362 A JPH022362 A JP H022362A JP 63147884 A JP63147884 A JP 63147884A JP 14788488 A JP14788488 A JP 14788488A JP H022362 A JPH022362 A JP H022362A
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- JP
- Japan
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- dna
- gene
- minutes
- add
- amino acid
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、新規なグルタチオン・バーオキンダーゼ遺伝
情報を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを保持してなる形質転換
体、該形質転換体により該ＤＮＡの遺伝情報を発現せし
めて得られるポリペプチドおよびその製造法に関する。
情報を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを保持してなる形質転換
体、該形質転換体により該ＤＮＡの遺伝情報を発現せし
めて得られるポリペプチドおよびその製造法に関する。
〈従来の技術〉
グルタチオン・パーオキシダーゼは、グルタチオンを基
質として、２分子のグルタチオンと１分子の過酸化水素
から２分子のグルクチオン酸化物と２分子の水分子を生
成する反応を触媒する酵素であって、哺乳動物の肝臓、
腎臓、心臓、肺、赤血球や血漿など生体内の組織、臓器
に存在していることが知られ（ＦＩｏｈｅ、Ｌ、 ｅｔ
ａｌ、ＦＥＢｓ Ｌｅｔｔ、、３２゜１３２−１３４
（１９７３））、グルタチオンによる過酸化脂質酸化物
の２電子還元を触媒して生体内の過酸化物処理に重要な
役割を果している。このようなグルタチオン・パーオキ
シダーゼは、セレンを含む蛋白質で、セレンはその活性
部位にセレノシスティン（Ｓｅｃ）の形で存在する。ク
ローニングされたマウス由来のグルタチオン・パーオキ
シダーゼ遺伝子から、通常は停止コドンとして読み取ら
れるデオキンリボヌクレオチド配列（ＤＮＡ）のオパー
ルコドンＴＧＡが、本酵素ではセレノシスティン（Ｓｅ
ｃ）をコードしている（ＵＭＢＯＪｏｕｒｎａｌＶｏ＋
、 ５．Ｎｏ、６．ｐｐ１２２１−１２２７（１９８６
））。
質として、２分子のグルタチオンと１分子の過酸化水素
から２分子のグルクチオン酸化物と２分子の水分子を生
成する反応を触媒する酵素であって、哺乳動物の肝臓、
腎臓、心臓、肺、赤血球や血漿など生体内の組織、臓器
に存在していることが知られ（ＦＩｏｈｅ、Ｌ、 ｅｔ
ａｌ、ＦＥＢｓ Ｌｅｔｔ、、３２゜１３２−１３４
（１９７３））、グルタチオンによる過酸化脂質酸化物
の２電子還元を触媒して生体内の過酸化物処理に重要な
役割を果している。このようなグルタチオン・パーオキ
シダーゼは、セレンを含む蛋白質で、セレンはその活性
部位にセレノシスティン（Ｓｅｃ）の形で存在する。ク
ローニングされたマウス由来のグルタチオン・パーオキ
シダーゼ遺伝子から、通常は停止コドンとして読み取ら
れるデオキンリボヌクレオチド配列（ＤＮＡ）のオパー
ルコドンＴＧＡが、本酵素ではセレノシスティン（Ｓｅ
ｃ）をコードしている（ＵＭＢＯＪｏｕｒｎａｌＶｏ＋
、 ５．Ｎｏ、６．ｐｐ１２２１−１２２７（１９８６
））。
またヒトグルタチオン・パーオキシダーゼ（以下、ｈ
−Ｇ Ｓ ＨＰ ｘと略すこともある）は、赤血球およ
び血漿から分離され、赤血球型のサブユニットの分子量
は分子９２０６００であるに対し、血漿型のサブユニッ
トの分子量は２１５００からなるホモテトラマーとして
存在することが知られている（Ａｒｃｈｉｖｓ ｏｆ
［ｌｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃｓ、Ｖｏｌ、２５６．Ｎｏ、２．ｐｐ６７７−６８
６（１９８７） 、Ｔｈｅ ＪｏｕｒｎａＩ ｏｆ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、２
６２．Ｎｏ、３６．ａｐ１７３９８−１７４０３（１９
８７））。
−Ｇ Ｓ ＨＰ ｘと略すこともある）は、赤血球およ
び血漿から分離され、赤血球型のサブユニットの分子量
は分子９２０６００であるに対し、血漿型のサブユニッ
トの分子量は２１５００からなるホモテトラマーとして
存在することが知られている（Ａｒｃｈｉｖｓ ｏｆ
［ｌｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃｓ、Ｖｏｌ、２５６．Ｎｏ、２．ｐｐ６７７−６８
６（１９８７） 、Ｔｈｅ ＪｏｕｒｎａＩ ｏｆ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ、２
６２．Ｎｏ、３６．ａｐ１７３９８−１７４０３（１９
８７））。
さらに赤血球由来のｈ −Ｇ Ｓ ＨＰ ｘと肝や腎臓
由来のｈ−ＧＳＨＰｘとは免疫的に交叉することやサブ
ユニットの分子量が分子量２０６００であることから同
一物質と推定され、またすでに報告されているマウス由
来のＧＳＨＰｘと極めて相同性の高い遺伝子であるが、
これらと血漿由来のｈＧＳＨＰＸとは明らかに異なって
おり、現在のところ２種類のｈ−ＧＳＨＰｘの存在が認
められている。
由来のｈ−ＧＳＨＰｘとは免疫的に交叉することやサブ
ユニットの分子量が分子量２０６００であることから同
一物質と推定され、またすでに報告されているマウス由
来のＧＳＨＰｘと極めて相同性の高い遺伝子であるが、
これらと血漿由来のｈＧＳＨＰＸとは明らかに異なって
おり、現在のところ２種類のｈ−ＧＳＨＰｘの存在が認
められている。
これらのｈ−ＧＳＨＰｘに関して、肝および腎細胞のｍ
−ＲＮＡから作ったｃ−ＤＮＡライブラリーからｈ−Ｇ
ＳＨＰｘがクローニングされ、遺伝子構造が明らかにさ
れている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１３．ｐｐ５４８４（１９８
７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ八ｃｉｄｓ へＲｅ５ｅａｒｃｈ
、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１７．ｐｐ７１７８（１９８７
）） が、しかし血漿由来のｈ −Ｇ Ｓ ＨＰ ｘ
については蛋白質は単離されたが、その遺伝子はクロー
ニングされていない状況である。
−ＲＮＡから作ったｃ−ＤＮＡライブラリーからｈ−Ｇ
ＳＨＰｘがクローニングされ、遺伝子構造が明らかにさ
れている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃ
ｈ、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１３．ｐｐ５４８４（１９８
７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ八ｃｉｄｓ へＲｅ５ｅａｒｃｈ
、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１７．ｐｐ７１７８（１９８７
）） が、しかし血漿由来のｈ −Ｇ Ｓ ＨＰ ｘ
については蛋白質は単離されたが、その遺伝子はクロー
ニングされていない状況である。
〈発明が解決しようとする問題点〉
以上の通り、ｈ −Ｇ Ｓ ＨＰ ｘ遺伝子としては、
肝および腎細胞からクローニングされ、構造が明らかに
されているに止まり、今回本発明者らは、ヒト肝細胞由
来のｃ−ＤＮＡライブラリーから、上記既知のｈ−ＧＳ
ＨＰｘｉｌｔ伝子とは異なるｈＧ Ｓ ｔ（Ｐ ｘ遺伝
子をクローニングし、その構造を確認し、新規なｈ−Ｇ
ＳＨＰｘ遺伝子を得ることに成功した。
肝および腎細胞からクローニングされ、構造が明らかに
されているに止まり、今回本発明者らは、ヒト肝細胞由
来のｃ−ＤＮＡライブラリーから、上記既知のｈ−ＧＳ
ＨＰｘｉｌｔ伝子とは異なるｈＧ Ｓ ｔ（Ｐ ｘ遺伝
子をクローニングし、その構造を確認し、新規なｈ−Ｇ
ＳＨＰｘ遺伝子を得ることに成功した。
く問題点を解決するための手段〉
本発明者らは、ヒト肝細胞由来のｃ−ＤＮＡライブラリ
ーから第３図に示されるポリＡテールから伸びた全長９
５１塩基対の遺伝子をクローニングし、このクローンが
開始コドンから停止コドンを含むオープンリーディング
フレームを有し、少なくともＮ端側より下記式（１） ％式％ （ただし式中、＊＊＊はセレノシスティンを示す）で表
わされるｈ−ＧＳＨＰｘを構成する１８９個のアミノ酸
からなるポリペプチドをコードするもので、この構造遺
伝子において、既知（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１７．ｐｐ７１
７８（１９８７））のヒト肝臓由来ｈ−ＧＳＨＰｘとは
ヌクレオチドで６１．０％、アミノ酸で６６．１％の相
同性を示すもので、新規な遺伝子であることを知った。
ーから第３図に示されるポリＡテールから伸びた全長９
５１塩基対の遺伝子をクローニングし、このクローンが
開始コドンから停止コドンを含むオープンリーディング
フレームを有し、少なくともＮ端側より下記式（１） ％式％ （ただし式中、＊＊＊はセレノシスティンを示す）で表
わされるｈ−ＧＳＨＰｘを構成する１８９個のアミノ酸
からなるポリペプチドをコードするもので、この構造遺
伝子において、既知（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１７．ｐｐ７１
７８（１９８７））のヒト肝臓由来ｈ−ＧＳＨＰｘとは
ヌクレオチドで６１．０％、アミノ酸で６６．１％の相
同性を示すもので、新規な遺伝子であることを知った。
さらに前述の既知の２種のｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子と比較
検討するために遺伝子の発現をノーサンプロティング法
で確認した結果、本発明のｈ−ｃｓＨＰ ｘ遺伝子はメ
ジャーに発現される細胞内で主要なｈ−ＧＳＨＰｘをコ
ードする遺伝子であり、また既知ｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子
はマイナーに発現されるもので本発明のｈ−ＧＳＨＰｘ
のアイソマ−であることを知った。かつ、上記の式（＋
）で表わされるｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチド
を得、またその塩基配列が、５″末端側より第２図にお
ける塩基１から５６７位で表わされ、セレノシスティン
をコードするオパールコドン（ＴＧＡ）を有する新規な
遺伝子であることを知った。
検討するために遺伝子の発現をノーサンプロティング法
で確認した結果、本発明のｈ−ｃｓＨＰ ｘ遺伝子はメ
ジャーに発現される細胞内で主要なｈ−ＧＳＨＰｘをコ
ードする遺伝子であり、また既知ｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子
はマイナーに発現されるもので本発明のｈ−ＧＳＨＰｘ
のアイソマ−であることを知った。かつ、上記の式（＋
）で表わされるｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチド
を得、またその塩基配列が、５″末端側より第２図にお
ける塩基１から５６７位で表わされ、セレノシスティン
をコードするオパールコドン（ＴＧＡ）を有する新規な
遺伝子であることを知った。
さらに本件ｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを遺伝子
操作の手段により、宿主に導入せしめて形質転換体を得
、これを培養して新規なｈＣ３ＨＰｘを構成するポリペ
プチドを大量生産する方法を確立した。
ミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを遺伝子
操作の手段により、宿主に導入せしめて形質転換体を得
、これを培養して新規なｈＣ３ＨＰｘを構成するポリペ
プチドを大量生産する方法を確立した。
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので、少
なくともＮ端側より下記式（１）％式％ （ただし式中、＊＊＊はセレノシスティンを示す）で表
わされるｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチドのアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ、宿主にとって外来性であ
る上記のアミノ酸配列で表わされるｈ −Ｇ Ｓ ＨＰ
ｘを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
る塩基配列を含むＤＮＡを保持することを特徴とする形
質転換体、上記のアミノ酸配列で表わされるｈ −Ｇ
Ｓ ＨＰ ｘを構成するポリペプチド、および宿主にと
って外来性である上記のアミノ酸配列で表わされるｈ
−Ｇ Ｓ ＨＰｘを構成するポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを保持した形質転
換体をセレン含有培地にて培養して該Ｄ Ｎ Ａの遺伝
情報を発現せしめ、該培養物からｈ−Ｃ３ＨＰＸを構成
するポリペプチドを採取することを特徴とするｈ−ＧＳ
ＨＩ’ｘの製造法に関する。
なくともＮ端側より下記式（１）％式％ （ただし式中、＊＊＊はセレノシスティンを示す）で表
わされるｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチドのアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ、宿主にとって外来性であ
る上記のアミノ酸配列で表わされるｈ −Ｇ Ｓ ＨＰ
ｘを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
る塩基配列を含むＤＮＡを保持することを特徴とする形
質転換体、上記のアミノ酸配列で表わされるｈ −Ｇ
Ｓ ＨＰ ｘを構成するポリペプチド、および宿主にと
って外来性である上記のアミノ酸配列で表わされるｈ
−Ｇ Ｓ ＨＰｘを構成するポリペプチドのアミノ酸配
列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを保持した形質転
換体をセレン含有培地にて培養して該Ｄ Ｎ Ａの遺伝
情報を発現せしめ、該培養物からｈ−Ｃ３ＨＰＸを構成
するポリペプチドを採取することを特徴とするｈ−ＧＳ
ＨＩ’ｘの製造法に関する。
まず本発明におけるｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子としては、市
販のヒト肝臓Ｃ−ＤＮＡライブラリーを用いるか、肝臓
組織から調製したｍ−ＲＮＡを用いてファージベクター
に組み込んで得られるライブラリーを用いて調製すれば
よく、例えばヒト肝臓組繊を粉末化したのちグアニジウ
ム液を加えホモジェナイズし、この懸ン蜀ン夜を１８１
／２ゲージの注射針に数回通して高分子ＤＮＡを分断し
、これを５．７Ｍ塩化セシウム液上に重層し、３６００
０ｒｐｍ、２５°Ｃで一夜遠心後、沈澱を少量のエタノ
ールで洗浄し、水に溶解し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍ
になるように加え、２．５容積のエタノールを加え、再
沈澱させ、さらに遠心して全ＲＮＡを回収し、これを０
．５Ｍ食塩水に溶解し、６５゛Ｃで５分加熱２冷し、オ
リゴｄＴセルロースカラムにチャージしてポリメラーゼ
をもっＲＮＡのみを溶出し、このポリ（Ａ）”ＲＮＡを
オリゴｄ （Ｔ）とアニーリングさせ、逆転写酵素を用
いて第−鎖を合成し、次いでＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡ
ポリメラーゼＩで第二鎖を合成し、さらにＥｃｏＲＩメ
チラーゼで遺伝子に内在しているＥｃｏＲ１サイトをメ
チル化し、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端となし、
さらにこの両末端にＥｃｏＲＩリンカ−を付着させた後
、制限酵素Ｅｃ。
販のヒト肝臓Ｃ−ＤＮＡライブラリーを用いるか、肝臓
組織から調製したｍ−ＲＮＡを用いてファージベクター
に組み込んで得られるライブラリーを用いて調製すれば
よく、例えばヒト肝臓組繊を粉末化したのちグアニジウ
ム液を加えホモジェナイズし、この懸ン蜀ン夜を１８１
／２ゲージの注射針に数回通して高分子ＤＮＡを分断し
、これを５．７Ｍ塩化セシウム液上に重層し、３６００
０ｒｐｍ、２５°Ｃで一夜遠心後、沈澱を少量のエタノ
ールで洗浄し、水に溶解し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍ
になるように加え、２．５容積のエタノールを加え、再
沈澱させ、さらに遠心して全ＲＮＡを回収し、これを０
．５Ｍ食塩水に溶解し、６５゛Ｃで５分加熱２冷し、オ
リゴｄＴセルロースカラムにチャージしてポリメラーゼ
をもっＲＮＡのみを溶出し、このポリ（Ａ）”ＲＮＡを
オリゴｄ （Ｔ）とアニーリングさせ、逆転写酵素を用
いて第−鎖を合成し、次いでＲＮａｓｅＨおよびＤＮＡ
ポリメラーゼＩで第二鎖を合成し、さらにＥｃｏＲＩメ
チラーゼで遺伝子に内在しているＥｃｏＲ１サイトをメ
チル化し、Ｔ、ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端となし、
さらにこの両末端にＥｃｏＲＩリンカ−を付着させた後
、制限酵素Ｅｃ。
ｒｌｌで消化し、これを電気泳動によってサイズを分画
するとともに過剰に加えたリンカ−を除去後、さらにフ
ァージベクターλｇ ｔ １． ｌに連結することによ
って肝臓組繊から調製したｍ−１’？ Ｎ Ａを用いて
なるλｇａｌｌベクターに組み込んだＣＤＮＡライブラ
リーが調製できる。さらにこのようなライブラリーを用
いて、例えばヒト肝臓組繊から調製したｍ−ＲＮＡを用
いてλｇｔｌｌベクターに組み込んで得たライブラリー
を、公知のＧＳＨＰｘ遺伝子を参考としてセレノシステ
ィンをコードするＴＧＡを含んだ数十ないし数百の塩基
を合成してプローブとして用いればよく、筒便には既知
のマウスＧＳＨＰｘ遺伝子を参考としてセレノシスティ
ンをコードするＴＧＡを含んだ塩基、例えばそのＮ、を
端Ｃｙｓから数えて３１番目のアミノ酸（Ｓｅｔ）から
５７番目のアミノ酸（Ａｓｎ）までをコードする８１ｍ
ｅｒの合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて
スクリーニングする。
するとともに過剰に加えたリンカ−を除去後、さらにフ
ァージベクターλｇ ｔ １． ｌに連結することによ
って肝臓組繊から調製したｍ−１’？ Ｎ Ａを用いて
なるλｇａｌｌベクターに組み込んだＣＤＮＡライブラ
リーが調製できる。さらにこのようなライブラリーを用
いて、例えばヒト肝臓組繊から調製したｍ−ＲＮＡを用
いてλｇｔｌｌベクターに組み込んで得たライブラリー
を、公知のＧＳＨＰｘ遺伝子を参考としてセレノシステ
ィンをコードするＴＧＡを含んだ数十ないし数百の塩基
を合成してプローブとして用いればよく、筒便には既知
のマウスＧＳＨＰｘ遺伝子を参考としてセレノシスティ
ンをコードするＴＧＡを含んだ塩基、例えばそのＮ、を
端Ｃｙｓから数えて３１番目のアミノ酸（Ｓｅｔ）から
５７番目のアミノ酸（Ａｓｎ）までをコードする８１ｍ
ｅｒの合成オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて
スクリーニングする。
ヌクリーニングにあたり、例えばλｇｔｌｌヘクターに
組み込んで得たライブラリーを、宿主菌（エシェリヒア
・コリーＬＥ３９２）に感染させ寒天培地上で増殖、溶
菌せしめ、溶菌した培地表面にナイロンメンブランフィ
ルタ−を載せてファージを吸着せしめ、さらにフィルタ
ーをアルカリ処理してＤＮＡを変性し、中和した後８０
°Ｃで６０分間焼付けてＤＮＡを固定し、このフィルタ
ーをプレハイブリダイゼイション液（例えば５ＸＤｅｎ
ｈａｒｔ ？夜、 ５ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ（Ｓ
ｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ 十Ｓｏｄｉｕｍ
Ｃ１ｔｒａｔｅ） 、５０ ｍＭリン酸ナトリウム、Ｐ
Ｈ６，５，０，１％ＳＤＳ （ラウリル硫酸ナトリウム
）、２５０μｇ／ｍｌ非相同性ＤＮＡ、５０％ホルムア
ミド）中で４２°Ｃ１６０分間保温し、この液に２２Ｐ
でラヘルした上述の如くのＤＮＡプローブを加え、４２
℃、−夜ハイブリダイズさせ、その移譲フィルターを室
温で２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で３回および５０°
Ｃで０．ｔｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、通風
乾燥して、オートラジオグラムをとり、シグナルの出た
位置にあるプラークを回収し、再度プレートにまき、プ
ラークを純化して、目的とするｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を
含むファージクローンをスクリーニングする。さらにこ
のようにしてスクリーニングされた純化ファージは、次
いで宿主に感染させ、液体培地中で一夜培養し、培養後
遠心して上清を回収し、これに等量の２．５ＭのＮａＣ
ｌ含有２０％ポリエチレングリコールを加え、水冷し、
１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、沈澱物をＳＭ （
０゜１ＭＮａｃｌ／８ｍＭＭｇ５Ｏ，１５０ｍＭ ト
リスｐ １４７ 、 ５ ／ ０ 、 ０２％ゼラチ
ン水溶液）に）容解し、フェノール抽出してＤＮＡを抽
出し、この抽出したファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、精製してｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を含む挿入
断片となし、この断片を、プラスミドｐＵｃｌ１８のＥ
ｃｏＲ［サイトにライゲイジョンしてサブクローニング
すればよく、このようにしてプラスミドｐＵｃ１１８の
ＥｃｏＲＩサイｌ−ｈ −Ｇ ＳＨＰ ｘ遺伝子を含む
挿入したプラスミドｐＵｃ１１１３−ＧＰＡを得る。な
おこのようなサブクローニングにおいて、上記のプラス
ミドｐＵｃ１１Ｂの代わりに適宜な制限酵素サイトを有
するプラスミ ドＰＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣ
ＹＣ１８４、ｐＵｃ１２、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９等の
エシェリヒア属に属する微生物を宿主とするプラスミド
を選択してもよく、その他バチルス・ズブチリスを宿主
とするプラスミドＰＵＢＩＩＯ，ＰＣ１９４等を用いて
もよい。
組み込んで得たライブラリーを、宿主菌（エシェリヒア
・コリーＬＥ３９２）に感染させ寒天培地上で増殖、溶
菌せしめ、溶菌した培地表面にナイロンメンブランフィ
ルタ−を載せてファージを吸着せしめ、さらにフィルタ
ーをアルカリ処理してＤＮＡを変性し、中和した後８０
°Ｃで６０分間焼付けてＤＮＡを固定し、このフィルタ
ーをプレハイブリダイゼイション液（例えば５ＸＤｅｎ
ｈａｒｔ ？夜、 ５ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ（Ｓ
ｏｄｉｕｍ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ 十Ｓｏｄｉｕｍ
Ｃ１ｔｒａｔｅ） 、５０ ｍＭリン酸ナトリウム、Ｐ
Ｈ６，５，０，１％ＳＤＳ （ラウリル硫酸ナトリウム
）、２５０μｇ／ｍｌ非相同性ＤＮＡ、５０％ホルムア
ミド）中で４２°Ｃ１６０分間保温し、この液に２２Ｐ
でラヘルした上述の如くのＤＮＡプローブを加え、４２
℃、−夜ハイブリダイズさせ、その移譲フィルターを室
温で２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で３回および５０°
Ｃで０．ｔｘｓｓｃ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄し、通風
乾燥して、オートラジオグラムをとり、シグナルの出た
位置にあるプラークを回収し、再度プレートにまき、プ
ラークを純化して、目的とするｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を
含むファージクローンをスクリーニングする。さらにこ
のようにしてスクリーニングされた純化ファージは、次
いで宿主に感染させ、液体培地中で一夜培養し、培養後
遠心して上清を回収し、これに等量の２．５ＭのＮａＣ
ｌ含有２０％ポリエチレングリコールを加え、水冷し、
１５０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、沈澱物をＳＭ （
０゜１ＭＮａｃｌ／８ｍＭＭｇ５Ｏ，１５０ｍＭ ト
リスｐ １４７ 、 ５ ／ ０ 、 ０２％ゼラチ
ン水溶液）に）容解し、フェノール抽出してＤＮＡを抽
出し、この抽出したファージＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで消化し、精製してｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を含む挿入
断片となし、この断片を、プラスミドｐＵｃｌ１８のＥ
ｃｏＲ［サイトにライゲイジョンしてサブクローニング
すればよく、このようにしてプラスミドｐＵｃ１１８の
ＥｃｏＲＩサイｌ−ｈ −Ｇ ＳＨＰ ｘ遺伝子を含む
挿入したプラスミドｐＵｃ１１１３−ＧＰＡを得る。な
おこのようなサブクローニングにおいて、上記のプラス
ミドｐＵｃ１１Ｂの代わりに適宜な制限酵素サイトを有
するプラスミ ドＰＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣ
ＹＣ１８４、ｐＵｃ１２、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９等の
エシェリヒア属に属する微生物を宿主とするプラスミド
を選択してもよく、その他バチルス・ズブチリスを宿主
とするプラスミドＰＵＢＩＩＯ，ＰＣ１９４等を用いて
もよい。
さらにこのｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を含む挿入したプラス
ミドル ＵＣ１１Ｂ−ＧＰＡが、目的とするｈ−ＧＳＨ
Ｐｘの活性を発現することの確認のために、適宜有効な
発現ベクターを構築すればよい。このような発現ベクタ
ーを構築するにあたり、宿主微生物としてエシェリヒア
属に属するエシェリヒア・コリー（大腸菌）、例えばエ
シェリヒア・コリーＤＨＩ、同ＨＢ Ｉ Ｏｈ同ＭＶ１
３０４、同Ｗ３１１０、同Ｃ６００株等に適する発現プ
ラスミド、例えばプラスミドｐｌＮ［、ｐｌＮ■等を使
用してもよく、またバチルス・ズブチルスを宿主微生物
とする場合には、例えばプラスミドｐＴＵ８２１ Ｂ、
ｐＴＵ８２８５等の発現用プラスミドが使用でき、また
サツカロマイセス・セレビシア等の酵母を宿主とする例
えばプラスミドｐＡＭ８２等の発現用ベクターを使用し
てもよく、さらにＳＶ４０ウイルスの後期ブロモターで
外来遺伝子を発現させるウィルスベクター例えばプラス
ミドｐＳＶＬ （ファルマシア社製）やプラスミドｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆ ｒ （ＢＲＬ社）を使用してなる動物細
胞、例えばサル腎（ＣＯ３）細胞やチャイニーズハムス
ターオバリー（ＣＨＯ）ｔａ胞、さらにまたＣＨＯ−ｄ
ｈｆｒ（葉酸還元酵素欠損）株細胞等を宿主として構築
すればよい。またこのような発現ベクターを用いる場合
、前記と同様にベクターを制限酵素で切断消化し、挿入
すべきｈ−Ｃ３ＨＰｘ遺伝子を含むＤＮＡ断片のサイト
とライゲイジョンできるように、適宜いずれかのサイト
を付加または削除するかし“ζ常法により調製し、組換
えに使用すればよい。
ミドル ＵＣ１１Ｂ−ＧＰＡが、目的とするｈ−ＧＳＨ
Ｐｘの活性を発現することの確認のために、適宜有効な
発現ベクターを構築すればよい。このような発現ベクタ
ーを構築するにあたり、宿主微生物としてエシェリヒア
属に属するエシェリヒア・コリー（大腸菌）、例えばエ
シェリヒア・コリーＤＨＩ、同ＨＢ Ｉ Ｏｈ同ＭＶ１
３０４、同Ｗ３１１０、同Ｃ６００株等に適する発現プ
ラスミド、例えばプラスミドｐｌＮ［、ｐｌＮ■等を使
用してもよく、またバチルス・ズブチルスを宿主微生物
とする場合には、例えばプラスミドｐＴＵ８２１ Ｂ、
ｐＴＵ８２８５等の発現用プラスミドが使用でき、また
サツカロマイセス・セレビシア等の酵母を宿主とする例
えばプラスミドｐＡＭ８２等の発現用ベクターを使用し
てもよく、さらにＳＶ４０ウイルスの後期ブロモターで
外来遺伝子を発現させるウィルスベクター例えばプラス
ミドｐＳＶＬ （ファルマシア社製）やプラスミドｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆ ｒ （ＢＲＬ社）を使用してなる動物細
胞、例えばサル腎（ＣＯ３）細胞やチャイニーズハムス
ターオバリー（ＣＨＯ）ｔａ胞、さらにまたＣＨＯ−ｄ
ｈｆｒ（葉酸還元酵素欠損）株細胞等を宿主として構築
すればよい。またこのような発現ベクターを用いる場合
、前記と同様にベクターを制限酵素で切断消化し、挿入
すべきｈ−Ｃ３ＨＰｘ遺伝子を含むＤＮＡ断片のサイト
とライゲイジョンできるように、適宜いずれかのサイト
を付加または削除するかし“ζ常法により調製し、組換
えに使用すればよい。
例えばこのような発現ベクターを構築するにあたり、目
的とするｈ−ＧＳＨＰｘの活性を発現することの確認の
ためにＣＨＯ細胞による発現を行うに、まずｈ−ＧＳＨ
Ｐｘ遺伝子を含む挿入したプラスミドｐＵｃ１１Ｂ−Ｇ
ＰＡを制限酵素で消化、切断してｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を得、次いでプラスミドｐｓＶ２−ｄ
ｈｆｒ中のｄｈｆｒ遺伝子部分の代わりに挿入する。こ
の様にしてＳＶ４０の初期遺伝子のブロモターの下流に
連結して作成したｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子発現用ＤＮＡ断
片を、再びプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｒｒのＥｃｏＲＩ
サイトに挿入して、発現用ベクターであるプラスミドｐ
５Ｖ−ＧＰＡ−（ｌ ｈ ｆｒを得る。
的とするｈ−ＧＳＨＰｘの活性を発現することの確認の
ためにＣＨＯ細胞による発現を行うに、まずｈ−ＧＳＨ
Ｐｘ遺伝子を含む挿入したプラスミドｐＵｃ１１Ｂ−Ｇ
ＰＡを制限酵素で消化、切断してｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を得、次いでプラスミドｐｓＶ２−ｄ
ｈｆｒ中のｄｈｆｒ遺伝子部分の代わりに挿入する。こ
の様にしてＳＶ４０の初期遺伝子のブロモターの下流に
連結して作成したｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子発現用ＤＮＡ断
片を、再びプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｒｒのＥｃｏＲＩ
サイトに挿入して、発現用ベクターであるプラスミドｐ
５Ｖ−ＧＰＡ−（ｌ ｈ ｆｒを得る。
次いでこのようにして調製した発現ベクターを宿主生物
に移入する方法としては、例えばリン酸カルシウム法に
よってＣＯ３細胞やＣＨＯ細胞等に直接上記の如くして
得られた発現用プラスミドヘククーの移入を行うか、そ
の他公知の宿主生物に移入する方法であるコンピテント
セル法、ポリエチレングリコール法を用いて形質転換体
を得ればよい。
に移入する方法としては、例えばリン酸カルシウム法に
よってＣＯ３細胞やＣＨＯ細胞等に直接上記の如くして
得られた発現用プラスミドヘククーの移入を行うか、そ
の他公知の宿主生物に移入する方法であるコンピテント
セル法、ポリエチレングリコール法を用いて形質転換体
を得ればよい。
このようにしてＣＨＯ細胞等に直接プラスミドｐＳＶ
−ＧＰＡ−ｄ ｈ ｒ ｒを保持せしめた形質転換体は
、常法によるＣＨＯ細胞等動物細胞の組織培養の手段を
使用してセレンを含有する培地を用いて培養すればよ（
、例えばＣＨＯ細胞の組織培養の培地、例えば、ダルベ
ンコ変法イーグルＭＥＭ培地＋１０％牛脂児血清＋０．
０１〜０．０５μＭ亜セレン酸を存する培養器、簡便に
はシャーレに、形質転換体を１０’個／Ｃｍ２程度１１
ｉ種して、２〜６日間、３０〜３７℃にて培養した後、
培養細胞を回収゛して細胞を破砕し、その上清を回収し
て目的とするｈ−ＧＳＨＰｘの活性を確認し、ｈ−ＧＳ
ＨＰｘが発現されたことを確認し、さらに適宜公知酵素
の回収、精製手段を利用して、目的とするｈ−ＧＳＨＰ
ｘを回収すればよい。このようにして得られたｈ−ＧＳ
ＨＰｘ含有溶液は、例えば減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫
酸ナトリウム等での塩析処理、メタノールやエタノール
、アセトン等の親水性有機溶媒での分別沈澱等の手段を
適宜選択し、組み合わせて行い沈澱せしめ、さらにこの
ｈ −Ｇ Ｓ ＨＰ ｘを含有する沈澱物を、必要に応
じて精製すればよく、例えばこの沈澱物を水または緩衝
液に溶解し、透析膜にて透析して、より低分子量の不純
物を除去してもよく、また吸着剤やゲル濾過剤等による
イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、やゲル濾過によりｔ＃製してもよく、精製ｈ−ＧＳ
ＨＰχは凍結乾燥して保存すればよい。
−ＧＰＡ−ｄ ｈ ｒ ｒを保持せしめた形質転換体は
、常法によるＣＨＯ細胞等動物細胞の組織培養の手段を
使用してセレンを含有する培地を用いて培養すればよ（
、例えばＣＨＯ細胞の組織培養の培地、例えば、ダルベ
ンコ変法イーグルＭＥＭ培地＋１０％牛脂児血清＋０．
０１〜０．０５μＭ亜セレン酸を存する培養器、簡便に
はシャーレに、形質転換体を１０’個／Ｃｍ２程度１１
ｉ種して、２〜６日間、３０〜３７℃にて培養した後、
培養細胞を回収゛して細胞を破砕し、その上清を回収し
て目的とするｈ−ＧＳＨＰｘの活性を確認し、ｈ−ＧＳ
ＨＰｘが発現されたことを確認し、さらに適宜公知酵素
の回収、精製手段を利用して、目的とするｈ−ＧＳＨＰ
ｘを回収すればよい。このようにして得られたｈ−ＧＳ
ＨＰｘ含有溶液は、例えば減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫
酸ナトリウム等での塩析処理、メタノールやエタノール
、アセトン等の親水性有機溶媒での分別沈澱等の手段を
適宜選択し、組み合わせて行い沈澱せしめ、さらにこの
ｈ −Ｇ Ｓ ＨＰ ｘを含有する沈澱物を、必要に応
じて精製すればよく、例えばこの沈澱物を水または緩衝
液に溶解し、透析膜にて透析して、より低分子量の不純
物を除去してもよく、また吸着剤やゲル濾過剤等による
イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、やゲル濾過によりｔ＃製してもよく、精製ｈ−ＧＳ
ＨＰχは凍結乾燥して保存すればよい。
さらにこのｈ−ＧＳＨＰｘを生産する遺伝子を有するプ
ラスミドｐＵｃ１］８−ＧＰＡは、これをエシェリヒア
・コリー ＤＨＩに保持せしめてエシェリヒア・コリー
ＤＨｌｐＵＣｌ １８−ＧＰＡ株と命名し、これを工
業技術院微生物工業技術研究所にブタベスト条約に基づ
く国際寄託にて［微工研条寄第１９０３号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１９０３）Ｊとして寄託した。
ラスミドｐＵｃ１］８−ＧＰＡは、これをエシェリヒア
・コリー ＤＨＩに保持せしめてエシェリヒア・コリー
ＤＨｌｐＵＣｌ １８−ＧＰＡ株と命名し、これを工
業技術院微生物工業技術研究所にブタベスト条約に基づ
く国際寄託にて［微工研条寄第１９０３号（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１９０３）Ｊとして寄託した。
またこのプラスミドを用いることにより、第３図に示さ
れるｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を含むポリＡテールから伸び
た全長９５１塩基対の遺伝子を得ることができるもので
、この第３図に示されるｈＧＳＨＰＸ遺伝子を含むポリ
Ａテールから伸びた全長９５１塩基対の遺伝子は、開始
コドン（５２〜５４位のＡＴＣ；）から停止コドン（６
２２〜６２４位のＴＡＧ）を含むオープンリーディング
フレームを有するものであることが明らかである、なお
この遺伝子は、シークエンサーキットを用いて塩基配列
を決定されたものである。
れるｈ−ＧＳＨＰｘ遺伝子を含むポリＡテールから伸び
た全長９５１塩基対の遺伝子を得ることができるもので
、この第３図に示されるｈＧＳＨＰＸ遺伝子を含むポリ
Ａテールから伸びた全長９５１塩基対の遺伝子は、開始
コドン（５２〜５４位のＡＴＣ；）から停止コドン（６
２２〜６２４位のＴＡＧ）を含むオープンリーディング
フレームを有するものであることが明らかである、なお
この遺伝子は、シークエンサーキットを用いて塩基配列
を決定されたものである。
さらに目的とするｈ−ＧＳＨＰｘは、第１図に示される
少なくとも１８９個のアミノ酸からなるポリペプチドを
コードするもので、この第１図中、Ｘ＋は水素原子、ア
セチル茫、メチオニンまたはメチオニンを含むシグナル
ペプチドを示してもよく、またこの構造遺伝子において
、既知（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１７．ＰＰ７１７８（１９８
７）〕のヒト肝臓由来ｈ−ＧＳＨＰｘとはヌクレオチド
で６１．０％、アミノ酸で６６．１％の相同性を示す新
規な遺伝子であることが明らかで、また第１図に示され
るｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチドの塩基配列は
、５゛末端側より第２図における塩基ｌから５６７位で
表わされ、セレノシスティンをコードするオパールコド
ン（ＴＧＡ）を有する新規な遺伝子であることが明らか
で、この第２図の５“末端側たるＧＣＴの上流コドンが
アミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよく、
さらにその５゛末端側にアミノ酸をコードするコドンを
１個以上有してもよいが、好ましくはＡＴＧまたはシグ
ナルペプチドに対応するポリデオキンリボ核酸を挙げる
ことができ、また３゛末端側たるＡＴＡの下流コドンは
翻訳停止コドンまたはアミノ酸、ペプチドをコードする
コドンであればいずれでもよ（、さらにその３°末端側
にアミノ酸、ペプチドをコードするコドンを１個以上有
する場合にはこのコドンの３°末端側にさらに翻訳停止
コドンを有することが好ましい。
少なくとも１８９個のアミノ酸からなるポリペプチドを
コードするもので、この第１図中、Ｘ＋は水素原子、ア
セチル茫、メチオニンまたはメチオニンを含むシグナル
ペプチドを示してもよく、またこの構造遺伝子において
、既知（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、Ｖｏｌ、１５．Ｎｏ、１７．ＰＰ７１７８（１９８
７）〕のヒト肝臓由来ｈ−ＧＳＨＰｘとはヌクレオチド
で６１．０％、アミノ酸で６６．１％の相同性を示す新
規な遺伝子であることが明らかで、また第１図に示され
るｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチドの塩基配列は
、５゛末端側より第２図における塩基ｌから５６７位で
表わされ、セレノシスティンをコードするオパールコド
ン（ＴＧＡ）を有する新規な遺伝子であることが明らか
で、この第２図の５“末端側たるＧＣＴの上流コドンが
アミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよく、
さらにその５゛末端側にアミノ酸をコードするコドンを
１個以上有してもよいが、好ましくはＡＴＧまたはシグ
ナルペプチドに対応するポリデオキンリボ核酸を挙げる
ことができ、また３゛末端側たるＡＴＡの下流コドンは
翻訳停止コドンまたはアミノ酸、ペプチドをコードする
コドンであればいずれでもよ（、さらにその３°末端側
にアミノ酸、ペプチドをコードするコドンを１個以上有
する場合にはこのコドンの３°末端側にさらに翻訳停止
コドンを有することが好ましい。
この新規なｈ−ＧＳＨＰｘを構成するポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードしたＤＮＡを発現させることにより
、生産された目的とするｈ−ｃｓＨＰｘのポリペプチド
のアミノ酸配列は、そのＤＮＡの塩基配列から決定でき
、また液相プロティン・ンークエンサー（ヘノクマン社
製）にテｈＧ Ｓ ｔ（Ｐ ｘのポリペプチドのＮ末端
を構成するアミノ酸配列を決定し、ＤＮＡ塩基配列から
決定したアミノ酸配列とＮ末端部分にて一敗することを
確認したもので、その結果、目的とするｈ−ＧＳＨＰ
ｘを構成するポリペプチドが少なくとも前記した式（１
）で表わされるアミノ酸配列である。
ミノ酸配列をコードしたＤＮＡを発現させることにより
、生産された目的とするｈ−ｃｓＨＰｘのポリペプチド
のアミノ酸配列は、そのＤＮＡの塩基配列から決定でき
、また液相プロティン・ンークエンサー（ヘノクマン社
製）にテｈＧ Ｓ ｔ（Ｐ ｘのポリペプチドのＮ末端
を構成するアミノ酸配列を決定し、ＤＮＡ塩基配列から
決定したアミノ酸配列とＮ末端部分にて一敗することを
確認したもので、その結果、目的とするｈ−ＧＳＨＰ
ｘを構成するポリペプチドが少なくとも前記した式（１
）で表わされるアミノ酸配列である。
また上記のＣＨＯ細胞を用いる代わりに宿主として微生
物を用いて適宜な発現用ベクターを用いて形質転換体を
得てもよく、このような微生物形質転換体を用いてｈ−
ＧＳＨＰｘを得るに、例えばエシェリヒア属に属する微
生物に形質転換せしめればよく、このようにして得られ
た形質転換体である微生物は、目的とするｈ−ＧＳＨＰ
ｘを発現せしめるために培養するが、培養の形態は液体
培養で行えばよく、工業的には深部通気撹拌培養を行う
のが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養
に通常使用されるものが広く使用でき、微生物の同化可
能な炭素源、例えばグルコース、シュクロース、糖蜜、
グリセリン、スターチ加水分解物等が使用され、窒素源
としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコ
ーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カゼイン加水分解物
、ペプトン、種々の肉エキス、酵母エキス、硫安、塩化
アンモニウム等が使用され、その他、ナ１リウム、カリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛
、銅等とのリン酸塩、塩化塩、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩
等との水溶性塩を添加してもよく、さらに亜セレン酸を
培地中に０．０５〜１０ｔＩＭ程度添加する。培養温度
は、微生物が生育し、ｈ−ＧＳＨＰｘを生産する範囲で
適宜変更できるが、エシェリヒア属に属する微生物の場
合、好ましくは２０〜４２°Ｃ程度である。培養時間は
、条件によって多少異なるが、ｈ＝ＧＳＨＰＸが最高収
量に達する時間を見計らって適当な時期に培養を収量す
ればよく、通常は１２〜７２時間程度である。次いで培
養後、ｈ−ＧＳＨＰｘは、菌体を含む培養液そのままを
採取して分離、精製すればよい、ｈ−ＧＳＨＰｘが菌体
内に存在する場合には、得られた培養物を濾過または遠
心分離等の手段にて菌体を回収し、次いでこの菌体をボ
ールミルや超音波による機械的破砕方法やリソチーム等
の酵素的破砕方法で破砕し、必要に応してキレート剤や
界面活性剤を添加してｈ −Ｇ Ｓ ＨＰｘを可溶化し
て分離採取し、前述の分離、精製手段を適宜選択組み合
わせて分離、精製すればよい。 このようにして得られ
たｈ−ＧＳＨＰｘの活性は、その１０μ！溶液を、Ｏ，
ＩＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、０．２ｍＭ還元
型ＮＡＤＰ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのグルタチ
オン、１単位のグルタチオン・リダクターゼを含有する
反応液０．９８ｍ１に混合し、１０μｌ（最終濃度７０
μＭ）の過酸化ブタノール（Ｂｕｏ ０ Ｈ）を添加し
、３７゛Ｃで還元型ＮＡＤＰの酸化による減少量を３４
０ｎｍの波長にて吸光度測定した結果、目的とするｈ−
ＧＳＨＰｘ活性を発現したもので、ＧＳＨＰｘが産生さ
れたことを確認した。
物を用いて適宜な発現用ベクターを用いて形質転換体を
得てもよく、このような微生物形質転換体を用いてｈ−
ＧＳＨＰｘを得るに、例えばエシェリヒア属に属する微
生物に形質転換せしめればよく、このようにして得られ
た形質転換体である微生物は、目的とするｈ−ＧＳＨＰ
ｘを発現せしめるために培養するが、培養の形態は液体
培養で行えばよく、工業的には深部通気撹拌培養を行う
のが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養
に通常使用されるものが広く使用でき、微生物の同化可
能な炭素源、例えばグルコース、シュクロース、糖蜜、
グリセリン、スターチ加水分解物等が使用され、窒素源
としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコ
ーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カゼイン加水分解物
、ペプトン、種々の肉エキス、酵母エキス、硫安、塩化
アンモニウム等が使用され、その他、ナ１リウム、カリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛
、銅等とのリン酸塩、塩化塩、硫酸塩、炭酸塩、硝酸塩
等との水溶性塩を添加してもよく、さらに亜セレン酸を
培地中に０．０５〜１０ｔＩＭ程度添加する。培養温度
は、微生物が生育し、ｈ−ＧＳＨＰｘを生産する範囲で
適宜変更できるが、エシェリヒア属に属する微生物の場
合、好ましくは２０〜４２°Ｃ程度である。培養時間は
、条件によって多少異なるが、ｈ＝ＧＳＨＰＸが最高収
量に達する時間を見計らって適当な時期に培養を収量す
ればよく、通常は１２〜７２時間程度である。次いで培
養後、ｈ−ＧＳＨＰｘは、菌体を含む培養液そのままを
採取して分離、精製すればよい、ｈ−ＧＳＨＰｘが菌体
内に存在する場合には、得られた培養物を濾過または遠
心分離等の手段にて菌体を回収し、次いでこの菌体をボ
ールミルや超音波による機械的破砕方法やリソチーム等
の酵素的破砕方法で破砕し、必要に応してキレート剤や
界面活性剤を添加してｈ −Ｇ Ｓ ＨＰｘを可溶化し
て分離採取し、前述の分離、精製手段を適宜選択組み合
わせて分離、精製すればよい。 このようにして得られ
たｈ−ＧＳＨＰｘの活性は、その１０μ！溶液を、Ｏ，
ＩＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、０．２ｍＭ還元
型ＮＡＤＰ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのグルタチ
オン、１単位のグルタチオン・リダクターゼを含有する
反応液０．９８ｍ１に混合し、１０μｌ（最終濃度７０
μＭ）の過酸化ブタノール（Ｂｕｏ ０ Ｈ）を添加し
、３７゛Ｃで還元型ＮＡＤＰの酸化による減少量を３４
０ｎｍの波長にて吸光度測定した結果、目的とするｈ−
ＧＳＨＰｘ活性を発現したもので、ＧＳＨＰｘが産生さ
れたことを確認した。
なお本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基、その
他に関する略号は、それらの当該分野における慣用略号
に基づ（もので、また全てのアミノ酸はＬ体を示す。
他に関する略号は、それらの当該分野における慣用略号
に基づ（もので、また全てのアミノ酸はＬ体を示す。
以下に本発明の参考例および実施例を挙げて具体的に説
明するが、本発明は何らこれにより限定されるものでは
ない。
明するが、本発明は何らこれにより限定されるものでは
ない。
〈実施例１〉
ヒト肝Ｋ１ｌ１１０ｇを液体チン素中で粉末にし、４０
ｍ１の６門グアニジンイソチオシアネート中でホモジナ
イズしたのち、１８．５ゲージの太さの注射針を通して
高分子ＤＮＡを切断し粘度を下げた。ホモジナイズを３
分の１容の５．７Ｍ塩化セシウム、０．１ＭＥＤＴＡ
（ｐＨ７，５）の溶液上に重層し、３５．００Ｏｒｐｍ
・２５°Ｃで１８時間遠心した。遠心後、沈澱を少量
のエタノールで洗浄し、過剰の塩化セシウムを除いた後
、水１ ｍｌに溶解し、１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリ
ウムおよび２．５倍容のエタノールを加えて遠心し、沈
澱を集め、減圧乾燥した。この様にして粗ＲＮ Ａ５
ｍｇを得た。
ｍ１の６門グアニジンイソチオシアネート中でホモジナ
イズしたのち、１８．５ゲージの太さの注射針を通して
高分子ＤＮＡを切断し粘度を下げた。ホモジナイズを３
分の１容の５．７Ｍ塩化セシウム、０．１ＭＥＤＴＡ
（ｐＨ７，５）の溶液上に重層し、３５．００Ｏｒｐｍ
・２５°Ｃで１８時間遠心した。遠心後、沈澱を少量
のエタノールで洗浄し、過剰の塩化セシウムを除いた後
、水１ ｍｌに溶解し、１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリ
ウムおよび２．５倍容のエタノールを加えて遠心し、沈
澱を集め、減圧乾燥した。この様にして粗ＲＮ Ａ５
ｍｇを得た。
この沈澱を１．５−の水に溶解後、６５°Ｃで５分間保
温し、急冷して１．５ｍＭの４０ｍＭ ）リス−塩酸（
ｐ Ｈ７，６） 、１．ＯＭＮ ａ ＣＬ ２ｍＭＥＤ
ＴＡ、 ０．２χＳＤＳを加えた。この溶液全量を２０
ｎＭ ）リス−塩酸（ｐＨ７，６） 、０．５ＭＮａ
Ｃ＋、 １．ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１χＳＤＳで平
衡化した７５＋ｍｇのオリゴ（ｄＴ）−セルロース（フ
ァルマシア社製）カラムに吸着させた。１０ｍ１の同じ
溶液で洗浄した後、５ｄの２０ｍＭ ）リス−塩酸（ｐ
Ｈ７，６） 、０．ＩＭＮ ａ Ｃ！、１ｍＭＥＤＴ
Ａおよび０．ｌＸ５ＤＳｔ容液でポリ （Ａ）゛ＲＮＡ
以外のＲＮ Ａを溶出させた。次に１０ｍＭトリス−塩
酸（ｐ Ｈ７，５） 、１ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、 ０．０
５！ ＳＤＳの？容？ｆｆＬでポリ （Ａ）’ＲＮＡを
？８出させ、始めに溶出してくる１ ｒｎｌを分画した
。これに１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．
５倍容のエタノールを加え、−２０°Ｃで一晩放置し、
１５．ＯＯＯｒｐｍ ・３０分の遠心で沈澱を集め、減
圧乾燥した。
温し、急冷して１．５ｍＭの４０ｍＭ ）リス−塩酸（
ｐ Ｈ７，６） 、１．ＯＭＮ ａ ＣＬ ２ｍＭＥＤ
ＴＡ、 ０．２χＳＤＳを加えた。この溶液全量を２０
ｎＭ ）リス−塩酸（ｐＨ７，６） 、０．５ＭＮａ
Ｃ＋、 １．ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１χＳＤＳで平
衡化した７５＋ｍｇのオリゴ（ｄＴ）−セルロース（フ
ァルマシア社製）カラムに吸着させた。１０ｍ１の同じ
溶液で洗浄した後、５ｄの２０ｍＭ ）リス−塩酸（ｐ
Ｈ７，６） 、０．ＩＭＮ ａ Ｃ！、１ｍＭＥＤＴ
Ａおよび０．ｌＸ５ＤＳｔ容液でポリ （Ａ）゛ＲＮＡ
以外のＲＮ Ａを溶出させた。次に１０ｍＭトリス−塩
酸（ｐ Ｈ７，５） 、１ｍＭ Ｅ ＤＴＡ、 ０．０
５！ ＳＤＳの？容？ｆｆＬでポリ （Ａ）’ＲＮＡを
？８出させ、始めに溶出してくる１ ｒｎｌを分画した
。これに１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．
５倍容のエタノールを加え、−２０°Ｃで一晩放置し、
１５．ＯＯＯｒｐｍ ・３０分の遠心で沈澱を集め、減
圧乾燥した。
この様にしてポリ（Ａ）’ＲＮＡ５０μｇを得た。
〈実施例２〉
実施例１で得たポリ（Ａ）”ＲＮＡを１μｇ／μｌにな
るように水にン容解し、その５μｉをマイクロチューブ
に移し、６５°Ｃで５分間加熱し、急冷した後に、これ
に５０ｍＭ ）リス−塩酸（ｐＨ８，３） 、１０＋ｗ
ＭＭｇＣＩｚ 、１４０＋Ｍ ＫＣＬ １０ｍＭジチオ
スレイトールおよび２ｍＭのｄＮＴＰｓ （ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量混合物）、５μｇ
のオリゴｄＴ（ファルマシア社製）と１５ｍ位の逆転写
酵素（全酒造社製）を加え、全量を２０μ２とし、４２
”Ｃで１時間反応させた。その反応液に８０１トリス−
塩酸（ｐ Ｈ７，５） 、２００ｍＭ ＫＣＩ、１０ｍ
ＭＭｇ Ｃｌｘ 、２５＃ｇ ／ｍ１ＢｓＡにＲＮａｓ
ｅＨ（全酒造社製）６０単位およびＤＮＡポリメラーゼ
ｌ （ヘーリンガーマンハイム社製）５１ｔ１位を加え
て総量を１５０μｌにし、１２゛Ｃで１時間反応させた
のち、２２°Ｃで１時間反応させた。２０ ｕ ｆ（７
）０．２５Ｍ ＥＤＴＡと１０μ、ｆｆ（７）１０２
ＳＤＳを加えて反応を停止した後、等量のフェノール−
クロロホルムを加え、１０．００Ｏｒｐｍ ・５分間
遠心し、水層を分取した。それに等量の４門酢酸アンモ
ニウムと２倍のエタノールを加え、１５，０００ｒｐｍ
・１５分間遠心し、沈澱を集め減圧乾燥した。沈澱に１
００ｍＭ ｌ−リス−塩酸（ｐ Ｈ８，０） 、１０
ｍＭＥ ＤＴＡ、８０μ？ＩＳ−アデノシルメチオニン
、１００ μｇ／ｍｊ！ＢＳＡおよび２単位のＥｃｏＲ
１メチレース（プロメガバイオチック社製）を加え、１
０μｌとし、３７°Ｃで１時間反応させた。反応後、反
応液に４０μ２の水を加え、等量のフェノール−クロロ
ホルムで処理し、遠心により分取した水層に、等量の４
Ｍ酢酸アンモニウムと２倍のエタノールを加え、−７０
’Ｃで１５分間放置した。１５，０００ｒｐｍ −１
５分間遠心後の沈澱物に６７ｍＭ ）リス−塩酸（ｐＨ
８，８） 、６．７ｍＭ Ｍ ｇ ＣＩ□、１６．６ｍ
Ｍ硫酸アンモニウム、ｌ０ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール、６．７ μ門ＥＤＴＡ、０．１６７χＢＳＡ、各
７５０ μ門ｄＡＴＰ、ｄＣ，ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
ＰおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）４単位
加え、全量を１２μρとし、３７°Ｃで１時間反応させ
た。等量のフェノール−クロロホルム液で処理し、エタ
ノール沈澱し、遠心によって沈澱物を回収し、減圧乾燥
した。１μｇのＥｃｏＲＩリンカ−に５０ｍＭ トリス
−塩酸（ｐＨ７，６） 、１０ｍＭＭｇＣｌｚ 、１０
ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭスペルミジン、０
．１１ＥＤＴＡ、１ｍＭＡＴＰおよび３単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドカイネース（宝酒造社製）を加え、全量を
１０μｌとし、３７°Ｃで３０分間反応させた。
るように水にン容解し、その５μｉをマイクロチューブ
に移し、６５°Ｃで５分間加熱し、急冷した後に、これ
に５０ｍＭ ）リス−塩酸（ｐＨ８，３） 、１０＋ｗ
ＭＭｇＣＩｚ 、１４０＋Ｍ ＫＣＬ １０ｍＭジチオ
スレイトールおよび２ｍＭのｄＮＴＰｓ （ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量混合物）、５μｇ
のオリゴｄＴ（ファルマシア社製）と１５ｍ位の逆転写
酵素（全酒造社製）を加え、全量を２０μ２とし、４２
”Ｃで１時間反応させた。その反応液に８０１トリス−
塩酸（ｐ Ｈ７，５） 、２００ｍＭ ＫＣＩ、１０ｍ
ＭＭｇ Ｃｌｘ 、２５＃ｇ ／ｍ１ＢｓＡにＲＮａｓ
ｅＨ（全酒造社製）６０単位およびＤＮＡポリメラーゼ
ｌ （ヘーリンガーマンハイム社製）５１ｔ１位を加え
て総量を１５０μｌにし、１２゛Ｃで１時間反応させた
のち、２２°Ｃで１時間反応させた。２０ ｕ ｆ（７
）０．２５Ｍ ＥＤＴＡと１０μ、ｆｆ（７）１０２
ＳＤＳを加えて反応を停止した後、等量のフェノール−
クロロホルムを加え、１０．００Ｏｒｐｍ ・５分間
遠心し、水層を分取した。それに等量の４門酢酸アンモ
ニウムと２倍のエタノールを加え、１５，０００ｒｐｍ
・１５分間遠心し、沈澱を集め減圧乾燥した。沈澱に１
００ｍＭ ｌ−リス−塩酸（ｐ Ｈ８，０） 、１０
ｍＭＥ ＤＴＡ、８０μ？ＩＳ−アデノシルメチオニン
、１００ μｇ／ｍｊ！ＢＳＡおよび２単位のＥｃｏＲ
１メチレース（プロメガバイオチック社製）を加え、１
０μｌとし、３７°Ｃで１時間反応させた。反応後、反
応液に４０μ２の水を加え、等量のフェノール−クロロ
ホルムで処理し、遠心により分取した水層に、等量の４
Ｍ酢酸アンモニウムと２倍のエタノールを加え、−７０
’Ｃで１５分間放置した。１５，０００ｒｐｍ −１
５分間遠心後の沈澱物に６７ｍＭ ）リス−塩酸（ｐＨ
８，８） 、６．７ｍＭ Ｍ ｇ ＣＩ□、１６．６ｍ
Ｍ硫酸アンモニウム、ｌ０ｍＭ ２−メルカプトエタノ
ール、６．７ μ門ＥＤＴＡ、０．１６７χＢＳＡ、各
７５０ μ門ｄＡＴＰ、ｄＣ，ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴ
ＰおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）４単位
加え、全量を１２μρとし、３７°Ｃで１時間反応させ
た。等量のフェノール−クロロホルム液で処理し、エタ
ノール沈澱し、遠心によって沈澱物を回収し、減圧乾燥
した。１μｇのＥｃｏＲＩリンカ−に５０ｍＭ トリス
−塩酸（ｐＨ７，６） 、１０ｍＭＭｇＣｌｚ 、１０
ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭスペルミジン、０
．１１ＥＤＴＡ、１ｍＭＡＴＰおよび３単位のＴ４ポリ
ヌクレオチドカイネース（宝酒造社製）を加え、全量を
１０μｌとし、３７°Ｃで３０分間反応させた。
これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理後のサンプルに全量
加え、６０単位のＴ４リガーゼ（ファルマシア社製）を
加え、１４°Ｃで一晩反応させた。この反応液に１００
ｍＭ Ｎ ａ Ｃｌ 、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ
７，５） 、１０ｍＭＭｇ ＣＩｇ 、７ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール、１００ μｇ／成りＳＡおよび２
５０単位のＥｃｏＲＩを加え、全量４０ｕｌにて、３７
°Ｃで２時間反応させた。この反応液を１ｚ低融点アガ
ロースゲルにて分画し、６００−２０００ヘースのＤＮ
Ａを含むゲルを回収した。６５°Ｃで１０分間保温し、
ゲルを融解した後、等量のフェノールを加え、１０分間
水冷後、＋５，０００ｒｐ＋ｍ ・４°Ｃで１０分間
遠心した。水層に等量のフェノールを加え操作を繰り返
し、再々度フェノールで処理した後、水層をクロロホル
ムで処理し、１０分の１容の３Ｍ酢酸す１−リウムおよ
び２．５倍容のエタノールを加え、７０゛Ｃに放置した
。１５，０００ｒｐｍ−１５分間遠心した後、沈澱を７
５χエタノールで２回洗浄し、減圧乾燥した。それにラ
ムダファージベクターλｇｔ！ｌアーム（ストラドジー
ン社製）を１μｇ加え、ライゲーシゴンキット（宝酒造
社製）を用いて、２６°Ｃで１０分間反応させた。反応
後のサンプルはインビトロバノケージングキノト（スト
ラドジーン社製）を用いて反応させた。得られたλファ
ージを大腸菌ＬＥ３９２に怒染させ、総数を調べたとこ
ろ、８．Ｏｘｔｏ’ ｐ ｒ ｕ （ｐｌａｑｕｅ ｆ
ｏｒｍｉｎｇＵ旧（）よりなっていた。
加え、６０単位のＴ４リガーゼ（ファルマシア社製）を
加え、１４°Ｃで一晩反応させた。この反応液に１００
ｍＭ Ｎ ａ Ｃｌ 、５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ
７，５） 、１０ｍＭＭｇ ＣＩｇ 、７ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノール、１００ μｇ／成りＳＡおよび２
５０単位のＥｃｏＲＩを加え、全量４０ｕｌにて、３７
°Ｃで２時間反応させた。この反応液を１ｚ低融点アガ
ロースゲルにて分画し、６００−２０００ヘースのＤＮ
Ａを含むゲルを回収した。６５°Ｃで１０分間保温し、
ゲルを融解した後、等量のフェノールを加え、１０分間
水冷後、＋５，０００ｒｐ＋ｍ ・４°Ｃで１０分間
遠心した。水層に等量のフェノールを加え操作を繰り返
し、再々度フェノールで処理した後、水層をクロロホル
ムで処理し、１０分の１容の３Ｍ酢酸す１−リウムおよ
び２．５倍容のエタノールを加え、７０゛Ｃに放置した
。１５，０００ｒｐｍ−１５分間遠心した後、沈澱を７
５χエタノールで２回洗浄し、減圧乾燥した。それにラ
ムダファージベクターλｇｔ！ｌアーム（ストラドジー
ン社製）を１μｇ加え、ライゲーシゴンキット（宝酒造
社製）を用いて、２６°Ｃで１０分間反応させた。反応
後のサンプルはインビトロバノケージングキノト（スト
ラドジーン社製）を用いて反応させた。得られたλファ
ージを大腸菌ＬＥ３９２に怒染させ、総数を調べたとこ
ろ、８．Ｏｘｔｏ’ ｐ ｒ ｕ （ｐｌａｑｕｅ ｆ
ｏｒｍｉｎｇＵ旧（）よりなっていた。
〈実施例３〉
作製したヒト肝臓、ｃＤＮＡライブラリー８．０ＸＩＯ
’ ｐ ｒ ｕを大腸菌ＬＥ３９２ （ストラジーン
社から購入）を指示菌として、１．５χＬＢ寒天培地（
１１につき、バクトドリブトンＬｏｇ 、バクトイ−ス
トエキストラクト５ｇ、 Ｎａ Ｃ１１０ｇ ）上にひ
らき、プラークハイブリダイゼーション法を用いて、Ｇ
ＳＨＰχ遺伝子のクローンの選択を行った。
’ ｐ ｒ ｕを大腸菌ＬＥ３９２ （ストラジーン
社から購入）を指示菌として、１．５χＬＢ寒天培地（
１１につき、バクトドリブトンＬｏｇ 、バクトイ−ス
トエキストラクト５ｇ、 Ｎａ Ｃ１１０ｇ ）上にひ
らき、プラークハイブリダイゼーション法を用いて、Ｇ
ＳＨＰχ遺伝子のクローンの選択を行った。
Ｌ Ｂプレート上に溶菌したプラークをナイロン膜上に
移してから、膜を０．５ＭＮ ａ ＯＨ，１，５ＭＮ
ａ Ｃ１で５分、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）で
５分処理した後、８０゛Ｃ減圧下で２時間乾燥した。次
にこの膜をビニール袋にいれ、１０成の５倍濃度ＳＳＣ
（１倍： １５０ｍＭ Ｎ ａ Ｃ１、１５ｍＭクエン
酸ナトリウム）、５倍デンハルト液（０，０２Ｘフイコ
ール、０．０２χポリビニルピロリドン、０．０２χＢ
ＳＡ）、５０ｍＭ’Ｊ ７酸す）ｌＪ’７ム（ｐＨ６，
５）、０．１ＸＳＤＳ、２５０９８７ｍｌサケ精子ＤＮ
Ａ、５０χホルムアミド中で、４２°Ｃ・６０分間保温
した。液を除いてから、５ 端をｙｔｐでラベルした合
成オリゴヌクレオチド（１０’ ｃｐｍ／μｇ ） 、
５°ＧＴＴＣＡＴＣＴＣＧＧＴＧＴＡＧＴＣＣＣＣ，Ｇ
ＡＴＣＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＣＧＡ
ＣＡＴＴＣＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＣＣ
ＣＣＧＣＡＧＧＧＡ３′ （この合成オリゴヌクレオチ
ドはマウスＧＳＨＰχのセレノシスティンをコードして
いる領域を含むアミノ酸部分（Ｓｅｒ、 Ｌｅｕ、 Ａ
ｒｇ＋ ｃｔｙ、 Ｌｙｓ、 Ｖａｔ、 Ｌｅｕ、 Ｌ
ｅｕ、 ［ｌｅ、 Ｇｌｕ、 Ａｓｎ＋Ｖａｌ、八ｌａ
、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｃ、Ｇｌｙ＋Ｔｈｒ、Ｔｈｒ＋
Ｉｌｅ、Ａｒｇ、ＡｓｐＴｙｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｍ
ｅｔ、Ａｓｎ ）をコードする塩基配列である。）を２
０ｎｇ上液に加え、４２°Ｃで一晩ハイフリダイズさせ
た。その後フィルターを２倍５ＳＣ５０，ｌχＳＤＳで
室温で３回、５０°Ｃで１０分洗浄後、さらに０． １
倍５ＳＣ１０，１χＳＤＳで５０°Ｃで１０分洗浄し、
通風乾燥し、オートラジオグラムを行った。゛シグナル
の出た位置の培地をくり抜き、ＳＭ （０，ＩＭＮａ
Ｃｌ、８ｍＭ Ｍｇ Ｓｏ、 、５０ｍＭトリス−塩酸
（Ｐ Ｈ７，５，０，０１χゼラチン）で希釈し、ＬＢ
プレートにひらき直し、同しプローブでスクリーニング
を繰り返し、プラークを純化した結果、１０株のクロー
ンを得た。
移してから、膜を０．５ＭＮ ａ ＯＨ，１，５ＭＮ
ａ Ｃ１で５分、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）で
５分処理した後、８０゛Ｃ減圧下で２時間乾燥した。次
にこの膜をビニール袋にいれ、１０成の５倍濃度ＳＳＣ
（１倍： １５０ｍＭ Ｎ ａ Ｃ１、１５ｍＭクエン
酸ナトリウム）、５倍デンハルト液（０，０２Ｘフイコ
ール、０．０２χポリビニルピロリドン、０．０２χＢ
ＳＡ）、５０ｍＭ’Ｊ ７酸す）ｌＪ’７ム（ｐＨ６，
５）、０．１ＸＳＤＳ、２５０９８７ｍｌサケ精子ＤＮ
Ａ、５０χホルムアミド中で、４２°Ｃ・６０分間保温
した。液を除いてから、５ 端をｙｔｐでラベルした合
成オリゴヌクレオチド（１０’ ｃｐｍ／μｇ ） 、
５°ＧＴＴＣＡＴＣＴＣＧＧＴＧＴＡＧＴＣＣＣＣ，Ｇ
ＡＴＣＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＡＧＡＧＡＣＧＣＧＡ
ＣＡＴＴＣＴＣＡＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧＣＣ
ＣＣＧＣＡＧＧＧＡ３′ （この合成オリゴヌクレオチ
ドはマウスＧＳＨＰχのセレノシスティンをコードして
いる領域を含むアミノ酸部分（Ｓｅｒ、 Ｌｅｕ、 Ａ
ｒｇ＋ ｃｔｙ、 Ｌｙｓ、 Ｖａｔ、 Ｌｅｕ、 Ｌ
ｅｕ、 ［ｌｅ、 Ｇｌｕ、 Ａｓｎ＋Ｖａｌ、八ｌａ
、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｃ、Ｇｌｙ＋Ｔｈｒ、Ｔｈｒ＋
Ｉｌｅ、Ａｒｇ、ＡｓｐＴｙｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｍ
ｅｔ、Ａｓｎ ）をコードする塩基配列である。）を２
０ｎｇ上液に加え、４２°Ｃで一晩ハイフリダイズさせ
た。その後フィルターを２倍５ＳＣ５０，ｌχＳＤＳで
室温で３回、５０°Ｃで１０分洗浄後、さらに０． １
倍５ＳＣ１０，１χＳＤＳで５０°Ｃで１０分洗浄し、
通風乾燥し、オートラジオグラムを行った。゛シグナル
の出た位置の培地をくり抜き、ＳＭ （０，ＩＭＮａ
Ｃｌ、８ｍＭ Ｍｇ Ｓｏ、 、５０ｍＭトリス−塩酸
（Ｐ Ｈ７，５，０，０１χゼラチン）で希釈し、ＬＢ
プレートにひらき直し、同しプローブでスクリーニング
を繰り返し、プラークを純化した結果、１０株のクロー
ンを得た。
〈実施例４〉
実施例３で得た組換え体ラムダファージを宿主菌ＬＥ３
９２に感染させ、ＬＢＢ地１０ｍ１中で一晩浸とう培養
した。８． ＯＯＯｒｐｍ・１０分遠心後の上清に、６
０単位のＤＮａｓｅｌ（宝酒造社製）および、＋００
ｕｇのＲＮａ ｓ ｅＡ （シグマ社製）を加え、３７
°Ｃで３０分間保温した。これに等量の２０χポリエチ
レングリコール、２．５ＭＮ ａ Ｃｌを加え、１時間
水冷した後、１５．ｏｏＯｒｐｍ ・２０分遠心し、
沈澱を得た。この沈殿を０．５ｍｌのＳＭに混濁し、等
量のフェノールを加えて処理し、遠心後の水層をクロロ
ホルム−フェノールを加えて処理し、１０分の１容の酢
酸ナトリウムおよび２倍容のエタノールを加え一７０°
Ｃに１５分放置した。 １５，０００ｒｐ１１ ・１
５分の遠心にて回収した沈澱を７５２エタノールで２回
洗浄し、減圧乾燥した。５μｇ／ｍ１ＲＮａ ＳｅＡを
含む水５０μβに沈澱を溶かし、１０μｉをＥｃｏ、Ｒ
［で完全消化して挿入断片を調べると、約１ｋｂの最長
の断片を有する、ヒ）Ｏ３ＨＰ、クローンが得られた。
９２に感染させ、ＬＢＢ地１０ｍ１中で一晩浸とう培養
した。８． ＯＯＯｒｐｍ・１０分遠心後の上清に、６
０単位のＤＮａｓｅｌ（宝酒造社製）および、＋００
ｕｇのＲＮａ ｓ ｅＡ （シグマ社製）を加え、３７
°Ｃで３０分間保温した。これに等量の２０χポリエチ
レングリコール、２．５ＭＮ ａ Ｃｌを加え、１時間
水冷した後、１５．ｏｏＯｒｐｍ ・２０分遠心し、
沈澱を得た。この沈殿を０．５ｍｌのＳＭに混濁し、等
量のフェノールを加えて処理し、遠心後の水層をクロロ
ホルム−フェノールを加えて処理し、１０分の１容の酢
酸ナトリウムおよび２倍容のエタノールを加え一７０°
Ｃに１５分放置した。 １５，０００ｒｐ１１ ・１
５分の遠心にて回収した沈澱を７５２エタノールで２回
洗浄し、減圧乾燥した。５μｇ／ｍ１ＲＮａ ＳｅＡを
含む水５０μβに沈澱を溶かし、１０μｉをＥｃｏ、Ｒ
［で完全消化して挿入断片を調べると、約１ｋｂの最長
の断片を有する、ヒ）Ｏ３ＨＰ、クローンが得られた。
ＥｃｏＲＩ消化後に得られた約１ｋｂの挿入断片を低融
点アガロースゲルから回収した。ベクターｐＵｃ１１８
をＥｃｏＲＩで完全消化した後、５０ｄ）リス−塩酸（
ｐＨ８，０）中にバクテリアアルカリホスファターゼ（
東洋紡績社製）を０．５単位加え、６５゛Ｃで１時間反
応させた。クロロホルム−フェノール液で２回処理した
後、水層に１０分の１容３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍
容のエタノールを加え、遠心してベクターを回収した。
点アガロースゲルから回収した。ベクターｐＵｃ１１８
をＥｃｏＲＩで完全消化した後、５０ｄ）リス−塩酸（
ｐＨ８，０）中にバクテリアアルカリホスファターゼ（
東洋紡績社製）を０．５単位加え、６５゛Ｃで１時間反
応させた。クロロホルム−フェノール液で２回処理した
後、水層に１０分の１容３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍
容のエタノールを加え、遠心してベクターを回収した。
ゲルから回収した挿入断片とＥｃｏＲ１消化したベクタ
ーｐＵｃ１１Ｂを、ライゲーションキット（宝酒造社製
）を用いて連結させた。 １００ ｄのψ培地（１ｆｆ
ｉにつきバタトトリプトン２０ｇ、バクトイ−ストエキ
ストラクト５ｇ、 Ｍ ｇ ５０．１４ｇ 、 ｐ Ｈ
７，６）で培養した対数増殖期の大腸菌ＭＶ１３０４（
宝酒造社から購入）を集菌し、４０ｍ１の水冷した３０
ｍＭ酢酸カリウム、１００ｎ＋Ｍ ＲｂＣｌ、１０ｍＭ
Ｃａ Ｃ１，，５０ｍＭＭｎＣ１２および１５χグリセ
リン（ｐｌ＋５． ８）で？−，？Ｑした後、０°Ｃで
５分間放置後遠心集菌し、さらに４ ｍｌの１０ｍＭＭ
ＯＰ ３１１衝′ａ（ドータイ社製） 、７５ｍＭＣ
ａＣ＋２．１０ｍＭＲｂＣｌおよび１５χグリセリン（
ｐＨ６，５）に懸濁し０°Ｃで１５分間放置してコンピ
テント細胞とした。この大腸菌ＭＦＡ液２００ｕｆにラ
イゲーションしたＤ Ｎ Ａ ？８？Ｆ１２０μｆを加
え、０°Ｃで３０分間放置した。４２°Ｃ９０秒間熱処
理し、ＬＢ壇境地８００ｕｌ加え、３７°Ｃ６０分間保
温した。この３００ μ！をアンピシリン５０μｇ／成
、０．０２Ｘ Ｘ−ｇａｌ （５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−ガラクシド）および５０μＭＩ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオーガラクトビラノ
ンド）を含んだＬＢＢ天プレートにまき、−晩培養して
形質転換体を得た。形質転換した単一の白コロニーを２
ｍｌのＬＢ培地で一晩培養し、遠心により集菌した。
ーｐＵｃ１１Ｂを、ライゲーションキット（宝酒造社製
）を用いて連結させた。 １００ ｄのψ培地（１ｆｆ
ｉにつきバタトトリプトン２０ｇ、バクトイ−ストエキ
ストラクト５ｇ、 Ｍ ｇ ５０．１４ｇ 、 ｐ Ｈ
７，６）で培養した対数増殖期の大腸菌ＭＶ１３０４（
宝酒造社から購入）を集菌し、４０ｍ１の水冷した３０
ｍＭ酢酸カリウム、１００ｎ＋Ｍ ＲｂＣｌ、１０ｍＭ
Ｃａ Ｃ１，，５０ｍＭＭｎＣ１２および１５χグリセ
リン（ｐｌ＋５． ８）で？−，？Ｑした後、０°Ｃで
５分間放置後遠心集菌し、さらに４ ｍｌの１０ｍＭＭ
ＯＰ ３１１衝′ａ（ドータイ社製） 、７５ｍＭＣ
ａＣ＋２．１０ｍＭＲｂＣｌおよび１５χグリセリン（
ｐＨ６，５）に懸濁し０°Ｃで１５分間放置してコンピ
テント細胞とした。この大腸菌ＭＦＡ液２００ｕｆにラ
イゲーションしたＤ Ｎ Ａ ？８？Ｆ１２０μｆを加
え、０°Ｃで３０分間放置した。４２°Ｃ９０秒間熱処
理し、ＬＢ壇境地８００ｕｌ加え、３７°Ｃ６０分間保
温した。この３００ μ！をアンピシリン５０μｇ／成
、０．０２Ｘ Ｘ−ｇａｌ （５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−ガラクシド）および５０μＭＩ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオーガラクトビラノ
ンド）を含んだＬＢＢ天プレートにまき、−晩培養して
形質転換体を得た。形質転換した単一の白コロニーを２
ｍｌのＬＢ培地で一晩培養し、遠心により集菌した。
これに１ｍｇ／ｍ１リゾチーム（シグマ社製）を含む５
０ｆｆｉＭトリスー塩酸（ｐ Ｈ８，０） 、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ （ｐ Ｈ８，０） 、１５χシａｔ唐を０．
６ ｍＱｊＪ口え、３７°Ｃで１５分反応させた後、ｌ
ＯχＳＤＳを１２μｉを加え混ぜ合わせた後、５Ｍ酢酸
カリウムを６０μ２加え、０°Ｃで３０分間放置した。
０ｆｆｉＭトリスー塩酸（ｐ Ｈ８，０） 、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ （ｐ Ｈ８，０） 、１５χシａｔ唐を０．
６ ｍＱｊＪ口え、３７°Ｃで１５分反応させた後、ｌ
ＯχＳＤＳを１２μｉを加え混ぜ合わせた後、５Ｍ酢酸
カリウムを６０μ２加え、０°Ｃで３０分間放置した。
１０，０００ｒｐｍ ・１５分間遠心し、上清に等量の
クロロホルム−フェノールを加えて処理し、水層をエー
テルで２回処理してから、２倍容のエタノールを加え、
７０゛Ｃで１５分間放放置た。１５，０ＯＯｒｐｎ
・１５分間遠心して沈澱を回収し、７５Ｘエタノールで
２回洗浄後、減圧乾燥した。沈澱を５μｇ／ｄＲＮａｓ
ｅを含む水に溶き、ＥｃｏＲＩで消化して、挿入断片を
含むクローンを選別した。
クロロホルム−フェノールを加えて処理し、水層をエー
テルで２回処理してから、２倍容のエタノールを加え、
７０゛Ｃで１５分間放放置た。１５，０ＯＯｒｐｎ
・１５分間遠心して沈澱を回収し、７５Ｘエタノールで
２回洗浄後、減圧乾燥した。沈澱を５μｇ／ｄＲＮａｓ
ｅを含む水に溶き、ＥｃｏＲＩで消化して、挿入断片を
含むクローンを選別した。
〈実施例５〉
このクローンを含む単一コロニーを６ ｍｌのＬＢ液に
て３７°Ｃで一晩培養後、その５雁を５００雁のＬ Ｂ
液に植菌し、３７°Ｃで培養した。対数増殖期の菌液に
２０μｌ７ｍ１のクロラムフェニコールを加え、さらに
−晩培養した。６．０００ｒｐｍ・１０分の遠心により
集菌し、１５ｍの８χシヨ糖、１０χ トリトンＸ、２
５ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ、５０ｍＭ トリス−塩酸（Ｐ
Ｈ８，０）および０．２５と トリス−塩酸（ｐ Ｈ８
，０）に溶解した１０ｍｇ／ ｄのリゾチーム１．５ｍ
ｌを加え、加熱により溶菌させた。１４，０ＯＯｒρｍ
・３０分の遠心後の上清に、等量のクロロポルム−フ
ェノールを加えて処理し、水層に１０分の１容の卦酢酸
ナトリウムと２倍容のエタノールを加えて、−７０°Ｃ
で１５分放置した。３． ＯＯＯｒｐｍ・１５分の遠心
にて回収した沈澱に、２１ｍ１のトリス−塩酸（ｐＨ７
，４）を加えて溶解し、２０ｇの塩化セシウムおよびＬ
ｏｎｇ／ ｍｌのエチジウムブロマイドｌＩｎ１を加え
、５０．００Ｏｒｐｍ ・４“Ｃにて一晩遠心した。
て３７°Ｃで一晩培養後、その５雁を５００雁のＬ Ｂ
液に植菌し、３７°Ｃで培養した。対数増殖期の菌液に
２０μｌ７ｍ１のクロラムフェニコールを加え、さらに
−晩培養した。６．０００ｒｐｍ・１０分の遠心により
集菌し、１５ｍの８χシヨ糖、１０χ トリトンＸ、２
５ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ、５０ｍＭ トリス−塩酸（Ｐ
Ｈ８，０）および０．２５と トリス−塩酸（ｐ Ｈ８
，０）に溶解した１０ｍｇ／ ｄのリゾチーム１．５ｍ
ｌを加え、加熱により溶菌させた。１４，０ＯＯｒρｍ
・３０分の遠心後の上清に、等量のクロロポルム−フ
ェノールを加えて処理し、水層に１０分の１容の卦酢酸
ナトリウムと２倍容のエタノールを加えて、−７０°Ｃ
で１５分放置した。３． ＯＯＯｒｐｍ・１５分の遠心
にて回収した沈澱に、２１ｍ１のトリス−塩酸（ｐＨ７
，４）を加えて溶解し、２０ｇの塩化セシウムおよびＬ
ｏｎｇ／ ｍｌのエチジウムブロマイドｌＩｎ１を加え
、５０．００Ｏｒｐｍ ・４“Ｃにて一晩遠心した。
遠心後間環状プラスミドＤ Ｎ Ａを分取し、エチジウ
ムブロマイドを除くために等量のブタノールで３回処理
した。さらに、０．２門ＮａＣ１を含んだトリス−塩酸
（ｐＨ７，４）を洗浄したＣＬ４Ｂセファロースゲル（
ファルマシア社製）にて、サンプルをゲル濾過し不純物
を除いた後、２倍容のエタノールを加えて、−７０’Ｃ
で１５分間放面した。３，０００ｒｐｎ＋ ・３０分間
遠心し、沈澱を７５χエタノールで２回洗浄後、乾燥し
、濃度を１Ｍｇ／μ℃になるように調整した。得られた
プラスミドから、全領域にわたり、正負両頂の一本ｔ３
￥ＤＮＡを調整し、Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ
法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１４ １２０５−１２１０ （
１９８１） ）を用いて決定した（第３図）。
ムブロマイドを除くために等量のブタノールで３回処理
した。さらに、０．２門ＮａＣ１を含んだトリス−塩酸
（ｐＨ７，４）を洗浄したＣＬ４Ｂセファロースゲル（
ファルマシア社製）にて、サンプルをゲル濾過し不純物
を除いた後、２倍容のエタノールを加えて、−７０’Ｃ
で１５分間放面した。３，０００ｒｐｎ＋ ・３０分間
遠心し、沈澱を７５χエタノールで２回洗浄後、乾燥し
、濃度を１Ｍｇ／μ℃になるように調整した。得られた
プラスミドから、全領域にわたり、正負両頂の一本ｔ３
￥ＤＮＡを調整し、Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ
法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１４ １２０５−１２１０ （
１９８１） ）を用いて決定した（第３図）。
更に、このプラスミド０．５μｇを前述のエシェリヒア
・コリＭＶ１３０４コンピテント細胞と同様に処理した
エシェリヒア・コリＤＨＩ（国立遺伝学研究所より分与
を受ける）コンピテント細胞に形質転換し、アンピシリ
ン５０μｇ／ｍρを含んだＬＢ寒天培地に接種し、−晩
培養して形質転換体を得た。このヒトＧＳＨＰｘを含む
プラスミドを大腸菌（エシェリヒア・コリー） ＤＨ
１ｐＵＣ１１８−ＧＰＡとした。
・コリＭＶ１３０４コンピテント細胞と同様に処理した
エシェリヒア・コリＤＨＩ（国立遺伝学研究所より分与
を受ける）コンピテント細胞に形質転換し、アンピシリ
ン５０μｇ／ｍρを含んだＬＢ寒天培地に接種し、−晩
培養して形質転換体を得た。このヒトＧＳＨＰｘを含む
プラスミドを大腸菌（エシェリヒア・コリー） ＤＨ
１ｐＵＣ１１８−ＧＰＡとした。
〈実施例６〉
このｈ−ｃＳＨＰｘ遺伝子を挿入したプラスミドｐＵｃ
ｌ １８−ＧＰＡが目的とするｈ−ＧＳＨＰ、の活性を
発現することの確認のために、動物細胞で発現させるベ
クターを構築した。ｐＵｃｌｌ Ｂ−ＧＰＡＤＮＡ１０
μｓをＨ緩衝ｌ夜（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｒｎｉｎｇ ＋ＩＯ虹、Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ １ｉａｒｂａｒ （１９８２） ）を用い
て１５単位のＥｃｏＲＩを加え全量を２０μ２として、
３７°Ｃ・２時間切断し、１χ低融点アガロース電気泳
動により、約９９０塩基対のＤＮＡ断片を抽出精製乾燥
した。これとは別にブルースクリプトＫＳ（ストラドジ
ーン社製）ＤＮＡＩμｇを１１緩衝液（前出）を用いて
、２単位のＥｃｏＲＩを加え全量を２０μＰとして、３
７°Ｃ・２時間切断した。１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８
，０）５μｅを蒸留水７５μｌを加えた後、１単位のバ
クテリアアルアルカリフォスファターゼで６５°Ｃ・１
時間処理した（以下ＢＡＰ処理と略す）。Ｗ”ｌのクロ
ロホルム−フェノールで２回処理した後、エタノール沈
澱でＤＮＡを回収し、減圧乾燥した。９９０塩基対のＤ
ＮＡ断片とＢＡＰ処理したベクターとを１７μｌの水に
溶解し、１０倍濃度のライゲーション緩衝液（前出、Ｐ
２４６）２μｌとＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、３
５０１／μＱ）１ μｉを力ｎえ、１４゛Ｃで一晩放置
した。コンピテント化した大腸菌Ｄ Ｈ−１２００μｌ
に、上で反応したＤＮＡ液を加え０°Ｃ・３０分間放置
後、４２°で９０秒置き、Ｌ培地８００μｌを加え、３
７’Ｃ・６０分間保温した。この１００μｌをアンピノ
リン５０μｇ／ｍを含んだし寒天培地にまき、３７°Ｃ
で一晩培養して形質転換体を得た。この様にして得られ
たクローンをブルースクリプトＫＳ−ＧＰＡとした。次
に、ブルースクリプトＫＳ−ＧＰＡＤＮＡＩＯμｇをＨ
緩衝液を用いて、１５単位のｔ（ｉ ｎ ｄ ＩＩＩと
１５単位のＢａｍＨＩを加え全量を２０μ２として、３
７°Ｃ・２時間切断し、１χ低融点アガロース電気泳動
により、約１，０００塩基対のＤＮＡ断片を抽出精製乾
燥した。これとは別にｐＳＶ２−ｄｈｆ ｒ （ＢＲＬ
社製）ＤＮＡ１μｓをｌ］緩衝液を用いて２単位のＨｉ
ｎｄｌｌｌと２単位のＢｇｌ■を加え全量を２０μ２と
して、３７°Ｃ・２時間切断した。前述した如＜ ＢＡ
Ｐ処理を行ってベクターを得た。このベクターと約１，
０００塩基対のＤＮＡ断片を前述の如くライゲーション
反応と形質転換を行い、形質転換体ｐＳＶ２−ＧＰＡと
した。最後に、ｐ Ｓ Ｖ ２−Ｃ，ＰＡＤＮＡＩＯμ
ｇを８３３）重液を用いて、１５単位のＥｃｏＲｌを加
え全量を２０ｕｌとして、３７°Ｃ・２時間切断し、１
χ低融点アガロース電気泳動により、約２．９７０塩基
対のＤＮＡ断片を抽出精製乾燥した。これとは別に、ｐ
ｓＶ２−ｄｈｆ ｒＤＮＡｌｕｇをＨ緩衝液を用いて２
単位のＥｃｏＲ［を加え全量を２０μｌとして、３７°
Ｃ・２時間切断し、前述した如＜ ＢＡＰ処理を行って
ベクターを得た。このベクターと約２，９７０塩基対の
ＤＮＡ断片を前述の如くライゲーション反応と形質転換
を行い、形質転換体ｐＳＶ２−ＧＰＡ−ｄ ｈ ｒ ｒ
とした（第４図）。
ｌ １８−ＧＰＡが目的とするｈ−ＧＳＨＰ、の活性を
発現することの確認のために、動物細胞で発現させるベ
クターを構築した。ｐＵｃｌｌ Ｂ−ＧＰＡＤＮＡ１０
μｓをＨ緩衝ｌ夜（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｒｎｉｎｇ ＋ＩＯ虹、Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ １ｉａｒｂａｒ （１９８２） ）を用い
て１５単位のＥｃｏＲＩを加え全量を２０μ２として、
３７°Ｃ・２時間切断し、１χ低融点アガロース電気泳
動により、約９９０塩基対のＤＮＡ断片を抽出精製乾燥
した。これとは別にブルースクリプトＫＳ（ストラドジ
ーン社製）ＤＮＡＩμｇを１１緩衝液（前出）を用いて
、２単位のＥｃｏＲＩを加え全量を２０μＰとして、３
７°Ｃ・２時間切断した。１Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８
，０）５μｅを蒸留水７５μｌを加えた後、１単位のバ
クテリアアルアルカリフォスファターゼで６５°Ｃ・１
時間処理した（以下ＢＡＰ処理と略す）。Ｗ”ｌのクロ
ロホルム−フェノールで２回処理した後、エタノール沈
澱でＤＮＡを回収し、減圧乾燥した。９９０塩基対のＤ
ＮＡ断片とＢＡＰ処理したベクターとを１７μｌの水に
溶解し、１０倍濃度のライゲーション緩衝液（前出、Ｐ
２４６）２μｌとＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製、３
５０１／μＱ）１ μｉを力ｎえ、１４゛Ｃで一晩放置
した。コンピテント化した大腸菌Ｄ Ｈ−１２００μｌ
に、上で反応したＤＮＡ液を加え０°Ｃ・３０分間放置
後、４２°で９０秒置き、Ｌ培地８００μｌを加え、３
７’Ｃ・６０分間保温した。この１００μｌをアンピノ
リン５０μｇ／ｍを含んだし寒天培地にまき、３７°Ｃ
で一晩培養して形質転換体を得た。この様にして得られ
たクローンをブルースクリプトＫＳ−ＧＰＡとした。次
に、ブルースクリプトＫＳ−ＧＰＡＤＮＡＩＯμｇをＨ
緩衝液を用いて、１５単位のｔ（ｉ ｎ ｄ ＩＩＩと
１５単位のＢａｍＨＩを加え全量を２０μ２として、３
７°Ｃ・２時間切断し、１χ低融点アガロース電気泳動
により、約１，０００塩基対のＤＮＡ断片を抽出精製乾
燥した。これとは別にｐＳＶ２−ｄｈｆ ｒ （ＢＲＬ
社製）ＤＮＡ１μｓをｌ］緩衝液を用いて２単位のＨｉ
ｎｄｌｌｌと２単位のＢｇｌ■を加え全量を２０μ２と
して、３７°Ｃ・２時間切断した。前述した如＜ ＢＡ
Ｐ処理を行ってベクターを得た。このベクターと約１，
０００塩基対のＤＮＡ断片を前述の如くライゲーション
反応と形質転換を行い、形質転換体ｐＳＶ２−ＧＰＡと
した。最後に、ｐ Ｓ Ｖ ２−Ｃ，ＰＡＤＮＡＩＯμ
ｇを８３３）重液を用いて、１５単位のＥｃｏＲｌを加
え全量を２０ｕｌとして、３７°Ｃ・２時間切断し、１
χ低融点アガロース電気泳動により、約２．９７０塩基
対のＤＮＡ断片を抽出精製乾燥した。これとは別に、ｐ
ｓＶ２−ｄｈｆ ｒＤＮＡｌｕｇをＨ緩衝液を用いて２
単位のＥｃｏＲ［を加え全量を２０μｌとして、３７°
Ｃ・２時間切断し、前述した如＜ ＢＡＰ処理を行って
ベクターを得た。このベクターと約２，９７０塩基対の
ＤＮＡ断片を前述の如くライゲーション反応と形質転換
を行い、形質転換体ｐＳＶ２−ＧＰＡ−ｄ ｈ ｒ ｒ
とした（第４図）。
〈実施例７〉
ｈ Ｇ Ｓ ＨＰ ｘを継続発現させるために、前述
した方法で構築した発現ベクターｐＳ■２−ＧＰＡ−ｄ
ｈｒｒを、ＣＨＯｄ ｈ ｆ ｒ−細胞へ遺伝子移入し
て形質転換細胞を育株した。２ＸＨＢＳ （ＨＥＰＥＳ
１０ｇ／ｌ Ｎａ Ｃｌ ６ｇ／ｌ ｐ Ｈ７，１０）
２．５ｍｆｆ１と１ｏＯＸＰＯ４（７０ｍＭＮａＨｚ
ＰＯ＋ ＋７０ｍＭＮ ａ ｚ ＨＰ Ｏａ ）
０．０５ｍｆｆ１とからなるＡ？ｆｆｌに対シテ、ｐＳ
Ｖ２−ＧＰＡ−ｄ ｈ ｆ ｒＤＮＡｌｏｏ ｕｇを含
む水溶液２．２ｍｌと２Ｍ Ｃａ Ｃ１２０，３ｍｌと
からなるＢ液を除々に空気注入しながら滴下し、ＤＮＡ
−リン酸カルシウム沈澱を生成させる。牛胎児血清１０
χを含むＨａ ｍ Ｆ −１２培ｉｔ！！ （フロー社
製）ＩＭの中で増殖させたＣＨＯ−ｄｈｒｒ−細胞に上
述したＤＮＡ−リン酸カルシウム沈澱液ｌＩｄを添加し
、炭酸ガス濃度５χ・３７°Ｃで一晩放置する。同し培
地１０ｄで培地交換し、さらに２４時間培養する。最後
に選択培地として用いる透析した牛胎児血清ｌＯχを含
むＤ−ＭＥＭ培地（ギブコ社製）に交換し、４日に一度
づつ培地交換を行い約１ケ月間培養を続け、この選択培
地中で増殖する形質転換細胞ＣＨＯ−ＧＰＡ株を得た。
した方法で構築した発現ベクターｐＳ■２−ＧＰＡ−ｄ
ｈｒｒを、ＣＨＯｄ ｈ ｆ ｒ−細胞へ遺伝子移入し
て形質転換細胞を育株した。２ＸＨＢＳ （ＨＥＰＥＳ
１０ｇ／ｌ Ｎａ Ｃｌ ６ｇ／ｌ ｐ Ｈ７，１０）
２．５ｍｆｆ１と１ｏＯＸＰＯ４（７０ｍＭＮａＨｚ
ＰＯ＋ ＋７０ｍＭＮ ａ ｚ ＨＰ Ｏａ ）
０．０５ｍｆｆ１とからなるＡ？ｆｆｌに対シテ、ｐＳ
Ｖ２−ＧＰＡ−ｄ ｈ ｆ ｒＤＮＡｌｏｏ ｕｇを含
む水溶液２．２ｍｌと２Ｍ Ｃａ Ｃ１２０，３ｍｌと
からなるＢ液を除々に空気注入しながら滴下し、ＤＮＡ
−リン酸カルシウム沈澱を生成させる。牛胎児血清１０
χを含むＨａ ｍ Ｆ −１２培ｉｔ！！ （フロー社
製）ＩＭの中で増殖させたＣＨＯ−ｄｈｒｒ−細胞に上
述したＤＮＡ−リン酸カルシウム沈澱液ｌＩｄを添加し
、炭酸ガス濃度５χ・３７°Ｃで一晩放置する。同し培
地１０ｄで培地交換し、さらに２４時間培養する。最後
に選択培地として用いる透析した牛胎児血清ｌＯχを含
むＤ−ＭＥＭ培地（ギブコ社製）に交換し、４日に一度
づつ培地交換を行い約１ケ月間培養を続け、この選択培
地中で増殖する形質転換細胞ＣＨＯ−ＧＰＡ株を得た。
次にｈＧ Ｓ ＨＰ ｘの細胞当りの発現量を増加させ
るために、メトトレキセート（シグマ社製）による遺伝
子増幅を行った。さきに得られた形質転換細胞ＣＨＯ−
ＧＰＡ株をメトトレキセート１彌ｉ、ｌｏｍＭ、１００
ｍＭを含有する１０χ生胎児血清入りＤ−ＭＥＭ培地で
各々培養した。４日に一度づつ培地交換を行い、約１ケ
月間培養を続け、メトトレキセート１００ｍＭで増殖し
てきた形質転換細胞ＣＨＯ−ＯＰＡ１００を得た。
るために、メトトレキセート（シグマ社製）による遺伝
子増幅を行った。さきに得られた形質転換細胞ＣＨＯ−
ＧＰＡ株をメトトレキセート１彌ｉ、ｌｏｍＭ、１００
ｍＭを含有する１０χ生胎児血清入りＤ−ＭＥＭ培地で
各々培養した。４日に一度づつ培地交換を行い、約１ケ
月間培養を続け、メトトレキセート１００ｍＭで増殖し
てきた形質転換細胞ＣＨＯ−ＯＰＡ１００を得た。
〈実施例８〉
このＣＨＯ−ＣＰＡ Ｉ ００株を直径１０ｃｍのプラ
スチックシャーレ５０枚を用いて、ＩＯ！牛脂児血清お
よび１００ｍＭのメトトレキセートを含むＤ−ＭＥＭ培
地で３日間培養した。培養した細胞約１０”を１００
ｄの０．７１の２−メルカプトエタノールを含む１０ｎ
＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、川音破砕す
る。破砕液を１０．ＯＯＯｒｐｍ−１５分間遠心し、上
清を酵素精製原ｒ４とした。この溶液に硫安を加えて、
２５２から５０χの間で沈澱する部分を１５．ＯＱＱｒ
ｐｍ ・３０分間遠心して硫安沈澱を得た。この沈澱を
１０ｍ１の０．７ｍＭメルカプトエタノールを含む１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）再溶解し、５０倍量の
同じ緩衝液に対して３回透析した。透析内液をＤＥＡＥ
−セルロースＤＥ５２ （ワットマン社２．５ Ｘ２Ｏ
ｒ、ｍカラム）に吸着させ、同じ緩衝液に０〜１００ｍ
ＭのＮａＣ１濃度で作成したリニアーグラジェントで溶
出させる。ＮａＣＮ４度４５〜７５ｍＭの間で溶出した
酵素活性画分をａ縮した後、セファデックスＧ−２００
（ファルマシア社製、２×９０ｃｍ ）で分子ふるいを
行い酵素活性画分を得た。
スチックシャーレ５０枚を用いて、ＩＯ！牛脂児血清お
よび１００ｍＭのメトトレキセートを含むＤ−ＭＥＭ培
地で３日間培養した。培養した細胞約１０”を１００
ｄの０．７１の２−メルカプトエタノールを含む１０ｎ
＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に懸濁し、川音破砕す
る。破砕液を１０．ＯＯＯｒｐｍ−１５分間遠心し、上
清を酵素精製原ｒ４とした。この溶液に硫安を加えて、
２５２から５０χの間で沈澱する部分を１５．ＯＱＱｒ
ｐｍ ・３０分間遠心して硫安沈澱を得た。この沈澱を
１０ｍ１の０．７ｍＭメルカプトエタノールを含む１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）再溶解し、５０倍量の
同じ緩衝液に対して３回透析した。透析内液をＤＥＡＥ
−セルロースＤＥ５２ （ワットマン社２．５ Ｘ２Ｏ
ｒ、ｍカラム）に吸着させ、同じ緩衝液に０〜１００ｍ
ＭのＮａＣ１濃度で作成したリニアーグラジェントで溶
出させる。ＮａＣＮ４度４５〜７５ｍＭの間で溶出した
酵素活性画分をａ縮した後、セファデックスＧ−２００
（ファルマシア社製、２×９０ｃｍ ）で分子ふるいを
行い酵素活性画分を得た。
この両分をＤＥＡＥ−セファデックス（ファルマンア社
製、 １．５ ＸＩＯｃｍ）に吸着させ、０．７＋ｎＭ
２−メルカプトエタノールを含む５ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）に０−１００ｍＭのＮａ Ｃｌａ度で作
成したりニアーグラジヱントでｔ６出させた。ＮａＣ１
′ａ度１０〜２０ｍＭの間で溶出された酵素活性画分を
同じ１１衝１夜の５０倍量に対して３回透析し、内）夜
を４１宿してｈ−ｃｓＨＰｘ標品とした。この標品の総
量をローリ−法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９３．２
６３−２７５ 、 （１９５１））でタンパク質の定
量をしたところ、１１０ μｇのＧＳＨＰＸが得られた
。次に、この標品１μｇ、あるいは標準タンパク質とし
て、牛血清アルブミン（６８キロダルトン）、卵アルブ
ミン（４５キロダルトン）、キモトリプシノーゲン（２
４キロダルトン）、リヅチーム（１，１，４キロダルト
ン）、ＲＮＡ分Ａ？ ｔ’４素Ａ （１３，７キロダル
トン）の各々５μｇを含む・？容、（！を０．１χＳＤ
Ｓと０．５？Ｉ２−メルカフ゛トエタノール存在下で９
５°Ｃ・２分間処理した。これらをラメリーの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ、２２７，６８０−６８５ 、 （１９７０
））に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動した
結果、分子量約２１キロダルトンのほぼ単一なバンドを
示した（第５図）。また、この０．１μεを０．１１ト
リス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ８，０） 、０゜２ｍＭ還元
型ＮＡＤＰ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのグルタチ
オン、１単位のグルタチオン・リダクターゼ（シグマ社
製）を含存する反応液０．９８ｍｆｆ１に混合し、１０
μｌ（最終濃度７０μｈ）の過酸化ブタノールを添加し
、３７°Ｃで還元型ＮＡＤＰの酸化による減少量を３４
０ｎｍの波長にて吸光度測定した。その結果、３７°Ｃ
−１分間に１μモルのグルタチオンを酸化型に変換する
活性を１ユニツトとした時に、０．１ユニツトの活性が
あった。最後に、この標品１０μｇを０．ＯＩ門５ＤＳ
ｉ容ン夜として、８９０ＭＥ型シーケンサー（ベンクマ
ン社製）によって、Ｎ末端側からのアミノ酸配列を決め
た。その配列、ＡｌａＰｈｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−八５ｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−
Ａｌａｌｉｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌが決定され、この配列はこの標品を
得るための遺伝子操作に用いたプラスミドｐＵｃ１１８
−ＧＰＡによってコードされるアミノ酸配列に一致した
。
製、 １．５ ＸＩＯｃｍ）に吸着させ、０．７＋ｎＭ
２−メルカプトエタノールを含む５ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）に０−１００ｍＭのＮａ Ｃｌａ度で作
成したりニアーグラジヱントでｔ６出させた。ＮａＣ１
′ａ度１０〜２０ｍＭの間で溶出された酵素活性画分を
同じ１１衝１夜の５０倍量に対して３回透析し、内）夜
を４１宿してｈ−ｃｓＨＰｘ標品とした。この標品の総
量をローリ−法（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１９３．２
６３−２７５ 、 （１９５１））でタンパク質の定
量をしたところ、１１０ μｇのＧＳＨＰＸが得られた
。次に、この標品１μｇ、あるいは標準タンパク質とし
て、牛血清アルブミン（６８キロダルトン）、卵アルブ
ミン（４５キロダルトン）、キモトリプシノーゲン（２
４キロダルトン）、リヅチーム（１，１，４キロダルト
ン）、ＲＮＡ分Ａ？ ｔ’４素Ａ （１３，７キロダル
トン）の各々５μｇを含む・？容、（！を０．１χＳＤ
Ｓと０．５？Ｉ２−メルカフ゛トエタノール存在下で９
５°Ｃ・２分間処理した。これらをラメリーの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ、２２７，６８０−６８５ 、 （１９７０
））に従って５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動した
結果、分子量約２１キロダルトンのほぼ単一なバンドを
示した（第５図）。また、この０．１μεを０．１１ト
リス−塩酸緩衝液（ｐ Ｈ８，０） 、０゜２ｍＭ還元
型ＮＡＤＰ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのグルタチ
オン、１単位のグルタチオン・リダクターゼ（シグマ社
製）を含存する反応液０．９８ｍｆｆ１に混合し、１０
μｌ（最終濃度７０μｈ）の過酸化ブタノールを添加し
、３７°Ｃで還元型ＮＡＤＰの酸化による減少量を３４
０ｎｍの波長にて吸光度測定した。その結果、３７°Ｃ
−１分間に１μモルのグルタチオンを酸化型に変換する
活性を１ユニツトとした時に、０．１ユニツトの活性が
あった。最後に、この標品１０μｇを０．ＯＩ門５ＤＳ
ｉ容ン夜として、８９０ＭＥ型シーケンサー（ベンクマ
ン社製）によって、Ｎ末端側からのアミノ酸配列を決め
た。その配列、ＡｌａＰｈｅ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ
−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−八５ｐ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−
Ａｌａｌｉｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−＾５ｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌが決定され、この配列はこの標品を
得るための遺伝子操作に用いたプラスミドｐＵｃ１１８
−ＧＰＡによってコードされるアミノ酸配列に一致した
。
〈発明の効果〉
本発明のＤＮＡおよび形質転換体を用いることによって
、効率よくグルタチオンパーオキシダーゼを製造するこ
とが可能となった。また本発明によって新規なヒト由来
のグルタチオンパーオキシダーゼのアミノ酸配列を明ら
かとすると共に、単諦した。更にそのグルタチオンパー
オキシダーゼ遺伝子が明らかとなった。
、効率よくグルタチオンパーオキシダーゼを製造するこ
とが可能となった。また本発明によって新規なヒト由来
のグルタチオンパーオキシダーゼのアミノ酸配列を明ら
かとすると共に、単諦した。更にそのグルタチオンパー
オキシダーゼ遺伝子が明らかとなった。
第１図は本発明のグルタチオンパーオキシダーゼのアミ
ノ酸配列を示す図面であり、第２図は本発明のグルタチ
オンパーオキシダーゼ遺伝子の塩法配列を示す図面であ
り、第３図はグルタチオンパーオキシダーゼ遺伝子を含
むポリデオキシリボ核酸およびアミノ酸コード領域を示
す図面である。 第４１１ＦはプラスミドｐｓＶ２−ＣＰＡ−ｄｈｆｒの
構成を示す模式図であり、第５図は本発明のゲルタデオ
ン・パーオキシダーゼの発現を示す電気泳動図の模式図
である。
ノ酸配列を示す図面であり、第２図は本発明のグルタチ
オンパーオキシダーゼ遺伝子の塩法配列を示す図面であ
り、第３図はグルタチオンパーオキシダーゼ遺伝子を含
むポリデオキシリボ核酸およびアミノ酸コード領域を示
す図面である。 第４１１ＦはプラスミドｐｓＶ２−ＣＰＡ−ｄｈｆｒの
構成を示す模式図であり、第５図は本発明のゲルタデオ
ン・パーオキシダーゼの発現を示す電気泳動図の模式図
である。
Claims (8)
- （１）少なくともＮ端側より下記式〔 I 〕 【遺伝子配列があります】 〔 I 〕 （ただし式中、＊＊＊はセレノシステインを示す）で表
わされるグルタチオン・パーオキシダーゼを構成するポ
リペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。 - （２）アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が、５′末
端側より第２図における少なくとも塩基１から５６７位
で表わされる特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - （３）宿主にとって外来性である特許請求の範囲第１項
記載のグルタチオン・パーオキシダーゼを構成するポリ
ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤ
ＮＡを保持することを特徴とする形質転換体。 - （４）アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列が、５′末
端側より第２図における少なくとも塩基１から５６７位
で表わされる特許請求の範囲第３項記載の形質転換体。 - （５）形質転換体が、動物細胞または微生物細胞である
特許請求の範囲第３項記載の形質転換体。 - （６）特許請求の範囲第１項記載のグルタチオン・パー
オキシダーゼを構成するポリペプチド。 - （７）宿主にとって外来性である特許請求の範囲第１項
記載のグルタチオン・パーオキシダーゼを構成するポリ
ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤ
ＮＡを保持した形質転換体をセレン含有培地にて培養し
て該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物からグル
タチオン・パーオキシダーゼを構成するポリペプチドを
採取することを特徴とするグルタチオン・パーオキシダ
ーゼの製造法。 - （８）宿主が、動物細胞または微生物細胞である特許請
求の範囲第７項記載の製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63147884A JPH022362A (ja) | 1988-06-15 | 1988-06-15 | 新規なグルタチオン・パーオキシダーゼ遺伝子およびその用途 |
| US07/368,982 US5089408A (en) | 1988-06-15 | 1989-06-15 | Glutathione peroxidase gene and process for production of the gene product |
| EP19890306071 EP0347224A3 (en) | 1988-06-15 | 1989-06-15 | Novel glutathione peroxidase gene |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63147884A JPH022362A (ja) | 1988-06-15 | 1988-06-15 | 新規なグルタチオン・パーオキシダーゼ遺伝子およびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH022362A true JPH022362A (ja) | 1990-01-08 |
Family
ID=15440384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63147884A Pending JPH022362A (ja) | 1988-06-15 | 1988-06-15 | 新規なグルタチオン・パーオキシダーゼ遺伝子およびその用途 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5089408A (ja) |
| EP (1) | EP0347224A3 (ja) |
| JP (1) | JPH022362A (ja) |
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| FR2709492B1 (fr) * | 1993-09-03 | 1995-11-24 | Bioxytech | Méthode d'immunodosage spécifique de la glutathion peroxydase plasmatique humaine, kit pour sa mise en Óoeuvre, oligopeptides et anticorps spécifiques de la méthode . |
| US5859308A (en) * | 1994-12-29 | 1999-01-12 | University Of Medicine And Denistry Of New Jersey | Transgenic animals and related aspects |
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| CN1301739A (zh) * | 1999-12-24 | 2001-07-04 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——过氧化物酶蛋白11和编码这种多肽的多核苷酸 |
| US20100272701A1 (en) * | 2007-01-17 | 2010-10-28 | Bion Tech Inc. | Method for producing bactericide or soil conditioner containing bacillus subtilis |
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1988
- 1988-06-15 JP JP63147884A patent/JPH022362A/ja active Pending
-
1989
- 1989-06-15 EP EP19890306071 patent/EP0347224A3/en not_active Ceased
- 1989-06-15 US US07/368,982 patent/US5089408A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0347224A2 (en) | 1989-12-20 |
| US5089408A (en) | 1992-02-18 |
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