JPH0570109B2 - - Google Patents
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- JPH0570109B2 JPH0570109B2 JP59182872A JP18287284A JPH0570109B2 JP H0570109 B2 JPH0570109 B2 JP H0570109B2 JP 59182872 A JP59182872 A JP 59182872A JP 18287284 A JP18287284 A JP 18287284A JP H0570109 B2 JPH0570109 B2 JP H0570109B2
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- Japan
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- edta
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は2′−5′−オリゴアデニル酸（以下２−
5Aと称す）の免疫学的直接定量法に関する。 〔従来技術〕 ２−5Aは、生体内でインターフエロンの作用
を受けた細胞において、２本鎖RNAの存在下、
ATP（アデノシン３燐酸）を基質として２−5A
合成酵素により合成される、蛋白合成阻害活性を
有する物質である。 （宗川吉汪、免疫薬理Vol.1、No.１、80〜88、
1983） この２−5Aを定量することは、インターフエ
ロン・２−5A合成酵素系の機能を解明するため
に、あるいは感染症、特にウイルス性疾患の診断
においても大きな意義を有するものと考えられ、
注目されている。 現在一般に、２−5Aは、32Pで放射標識した２
−5Aを用いる、いわゆるラジオイムノアツセイ
（以下RIAと略す）によつて測定されている。 ところが生体液中、特に血液中の２−5Aを定
量する場合には、共存する２−5A分解酵素の作
用により、２−5Aが急速に分解消失するため、
通常のRIAでは正確な定量を行うことは困難であ
る。そのため、血液中の２−5Aの定量は、臨床
的に大きな意義を有するのにもかかわらず、正確
な、信頼できる定量法は確立されていない。 二三の文献には（Nature Vol.288、No.13、189
−192：1980、J.of Biological Chemistry
Vol.259.No.３、1727−1730：1984）２−5Aの定
量に関する記載が有るが、これらの方法で血液中
の２−5Aの定量を行つた場合には、２−5A分解
酵素の影響を避ける手段が講じられていないため
正確な定量を望めなかつたり、あるいは、その影
響を避け得たとしても、抽出等の操作を要するた
め手技が繁雑なものとなつていた。 〔発明の目的〕 本発明は、上記のような特別な操作を要しな
い、簡便で、かつ十分に２−5Aの分解消失を抑
え得る２−5Aの免疫学的直接定量法の提供を目
的としている。 〔発明の構成〕 本発明は、生体試料中の２−5Aの免疫学的直
接定量法において、予め試料にエチレンジアミン
４酢酸塩（以下EDTAと略す）を2′−5′−オリゴ
アデニル酸分解酵素の阻害剤として添加し、該試
料を過剰のエチレンジアミン４酢酸塩の除去剤と
しての金属イオンの存在下で抗２−5A特異抗体
と反応させることを特徴とする、２−5Aの免疫
学的直接定量法である。 上記EDTAとしては、ナトリウム塩、カリウ
ム塩等が挙げられる。又その添加量は、試料１ml
当り１〜５mgの範囲で用いることができるが、特
に２mg程度が好ましい。 又、その添加方法としては、試料採取後できる
だけ早く添加することが好ましく、たとえば、試
料採取用容器に必要量を予め充填しておくと、試
料の採取とEDTAとの混和を、ほぼ同時に行な
うことができるので便利である。 又、EDTAの効果をより確実なものとするた
めに、検体試料の希釈が必要な場合には、この希
釈操作に用いる希釈溶液にもEDTAを含有させ
ることが好ましい。 次に金属イオンとしては、マグネシウムを塩化
マグネシウムとして用いるのが有利であるが、他
の金属イオンを利用することも可能である。又そ
の添加量は、上記EDTAの使用量によつて左右
されるが、EDTAの使用量が試料１ml当り、１
〜５mgの範囲であれば、反応液１ml当り、塩化マ
グネシウムとして0.6mg程度で、十分本発明の効
果を奏し得る。 〔作用〕 本発明におけるEDTAは、２−5A分解酵素の
活性を阻害する目的で使用するものである。金属
イオン依存性の酵素の存在は古くから知られてお
り、又それらが、EDTA等のキレート化剤の作
用による阻害を受けることは公知の事実である。 しかし、本発明においては、２−5Aを免疫学
的に直接定量するため、EDTAを単独で酵素阻
害剤として用いた場合後述の実施例に示すとお
り、過剰のEDTAが免疫反応に影響を及ぼすの
で、免疫学的直接定量法にこれを使用することは
困難である。 そこで、本発明では反応液中にマグネシウム等
金属イオンを存在させ、過剰のEDTAの影響を
除去しているのである。 以下実施例に基いて、本発明を更に具体的に説
明する。 〔実施例〕 １ EDTAによる２−5A分解消失の抑制 ヘパリン採取時にEDTAを添加した血液よ
り得られた血漿中の２−5A濃度を定量し、
EDTAの２−5A分解消失抑制能を調べた。 0.1.2.4.および８mgのエチレンジアミン４酢
酸２ナトリウム（以下EDTA−2Naと略す）
の入つた試験管に異なる３種のヘパリン血液検
体A.B.及びＣを２mlずつ加えて混和し、冷却
遠心して血漿検体とした。この血漿検体及び、
正常ヒト血漿をチヤコール処理して、２−5A
フリーとしたものに２−5Aを添加して調製し
た２−5A標準液について、以下に述べる方法
によりRIAを行つた。 採血後３時間の血漿検体を、0.25％子牛血清
アルブミン（以下BSAと略す）および0.5％
EDTA2−Naを含む0.05Mリン酸緩衝液（以下
PBSと略す）で10倍希釈した血漿検体溶液
100μ（又は標準液100μ）と、125I標識２−
5A溶液100μ（15000cpm）を混和し、これに
抗２−5A家兎血清200μを加えて、室温で一
昼夜抗原−抗体反応を行わせた。（第１反応） 得られた反応液に抗家兎γ−グロブリン山羊
血清100μを加えて一晩放置した後（第２反
応）、3000rpm20分間遠心分離を行い、得られ
た沈殿部分の放射能量を計測した。標準液の計
測結果より、標準曲線を作製し、これから血漿
検体中の２−5A量を求めた。 尚、抗２−5A特異家兎血清は、5′−トリホ
スホ（アデニリル2′−5′）3アデノシンにキヤリ
ア蛋白としてBSAを結合させて得られた物質
を免疫原とし、常法に準じて家兎に免疫して得
られた抗血清原液を0.25％BSAと、１％正常家
兎血清を含む0.05MPBS（PH8.0）で10000倍に
希釈したものを用いた。 又、抗家兎γ−グロブリン山羊血清は市販の
ものを、125I標識２−5Aは２−5Aにアラニル−
チロシン基を導入し、該チロシンを125I標識し
たものを用いた。125I標識２−5Aの製法につい
ては、本出願人が先に出願の特許願「新規2′−
5′オリゴアデニル酸化合物、その製造方法、及
びその化合物から成る放射免疫化学的測定方法
による2′−5′オリゴアデニル酸測定用の125I標
識用抗原」に詳細な説明があるので、そちらを
参考にされたい。 以上の方法で行つた２−5Aの定量値を第１
表に示す。尚表中、EDTA−2Na添加量は血
液１ml当りのmg数で、２−5A量は、血漿検体
１ml当りのｎｇ数を示す。
5Aと称す）の免疫学的直接定量法に関する。 〔従来技術〕 ２−5Aは、生体内でインターフエロンの作用
を受けた細胞において、２本鎖RNAの存在下、
ATP（アデノシン３燐酸）を基質として２−5A
合成酵素により合成される、蛋白合成阻害活性を
有する物質である。 （宗川吉汪、免疫薬理Vol.1、No.１、80〜88、
1983） この２−5Aを定量することは、インターフエ
ロン・２−5A合成酵素系の機能を解明するため
に、あるいは感染症、特にウイルス性疾患の診断
においても大きな意義を有するものと考えられ、
注目されている。 現在一般に、２−5Aは、32Pで放射標識した２
−5Aを用いる、いわゆるラジオイムノアツセイ
（以下RIAと略す）によつて測定されている。 ところが生体液中、特に血液中の２−5Aを定
量する場合には、共存する２−5A分解酵素の作
用により、２−5Aが急速に分解消失するため、
通常のRIAでは正確な定量を行うことは困難であ
る。そのため、血液中の２−5Aの定量は、臨床
的に大きな意義を有するのにもかかわらず、正確
な、信頼できる定量法は確立されていない。 二三の文献には（Nature Vol.288、No.13、189
−192：1980、J.of Biological Chemistry
Vol.259.No.３、1727−1730：1984）２−5Aの定
量に関する記載が有るが、これらの方法で血液中
の２−5Aの定量を行つた場合には、２−5A分解
酵素の影響を避ける手段が講じられていないため
正確な定量を望めなかつたり、あるいは、その影
響を避け得たとしても、抽出等の操作を要するた
め手技が繁雑なものとなつていた。 〔発明の目的〕 本発明は、上記のような特別な操作を要しな
い、簡便で、かつ十分に２−5Aの分解消失を抑
え得る２−5Aの免疫学的直接定量法の提供を目
的としている。 〔発明の構成〕 本発明は、生体試料中の２−5Aの免疫学的直
接定量法において、予め試料にエチレンジアミン
４酢酸塩（以下EDTAと略す）を2′−5′−オリゴ
アデニル酸分解酵素の阻害剤として添加し、該試
料を過剰のエチレンジアミン４酢酸塩の除去剤と
しての金属イオンの存在下で抗２−5A特異抗体
と反応させることを特徴とする、２−5Aの免疫
学的直接定量法である。 上記EDTAとしては、ナトリウム塩、カリウ
ム塩等が挙げられる。又その添加量は、試料１ml
当り１〜５mgの範囲で用いることができるが、特
に２mg程度が好ましい。 又、その添加方法としては、試料採取後できる
だけ早く添加することが好ましく、たとえば、試
料採取用容器に必要量を予め充填しておくと、試
料の採取とEDTAとの混和を、ほぼ同時に行な
うことができるので便利である。 又、EDTAの効果をより確実なものとするた
めに、検体試料の希釈が必要な場合には、この希
釈操作に用いる希釈溶液にもEDTAを含有させ
ることが好ましい。 次に金属イオンとしては、マグネシウムを塩化
マグネシウムとして用いるのが有利であるが、他
の金属イオンを利用することも可能である。又そ
の添加量は、上記EDTAの使用量によつて左右
されるが、EDTAの使用量が試料１ml当り、１
〜５mgの範囲であれば、反応液１ml当り、塩化マ
グネシウムとして0.6mg程度で、十分本発明の効
果を奏し得る。 〔作用〕 本発明におけるEDTAは、２−5A分解酵素の
活性を阻害する目的で使用するものである。金属
イオン依存性の酵素の存在は古くから知られてお
り、又それらが、EDTA等のキレート化剤の作
用による阻害を受けることは公知の事実である。 しかし、本発明においては、２−5Aを免疫学
的に直接定量するため、EDTAを単独で酵素阻
害剤として用いた場合後述の実施例に示すとお
り、過剰のEDTAが免疫反応に影響を及ぼすの
で、免疫学的直接定量法にこれを使用することは
困難である。 そこで、本発明では反応液中にマグネシウム等
金属イオンを存在させ、過剰のEDTAの影響を
除去しているのである。 以下実施例に基いて、本発明を更に具体的に説
明する。 〔実施例〕 １ EDTAによる２−5A分解消失の抑制 ヘパリン採取時にEDTAを添加した血液よ
り得られた血漿中の２−5A濃度を定量し、
EDTAの２−5A分解消失抑制能を調べた。 0.1.2.4.および８mgのエチレンジアミン４酢
酸２ナトリウム（以下EDTA−2Naと略す）
の入つた試験管に異なる３種のヘパリン血液検
体A.B.及びＣを２mlずつ加えて混和し、冷却
遠心して血漿検体とした。この血漿検体及び、
正常ヒト血漿をチヤコール処理して、２−5A
フリーとしたものに２−5Aを添加して調製し
た２−5A標準液について、以下に述べる方法
によりRIAを行つた。 採血後３時間の血漿検体を、0.25％子牛血清
アルブミン（以下BSAと略す）および0.5％
EDTA2−Naを含む0.05Mリン酸緩衝液（以下
PBSと略す）で10倍希釈した血漿検体溶液
100μ（又は標準液100μ）と、125I標識２−
5A溶液100μ（15000cpm）を混和し、これに
抗２−5A家兎血清200μを加えて、室温で一
昼夜抗原−抗体反応を行わせた。（第１反応） 得られた反応液に抗家兎γ−グロブリン山羊
血清100μを加えて一晩放置した後（第２反
応）、3000rpm20分間遠心分離を行い、得られ
た沈殿部分の放射能量を計測した。標準液の計
測結果より、標準曲線を作製し、これから血漿
検体中の２−5A量を求めた。 尚、抗２−5A特異家兎血清は、5′−トリホ
スホ（アデニリル2′−5′）3アデノシンにキヤリ
ア蛋白としてBSAを結合させて得られた物質
を免疫原とし、常法に準じて家兎に免疫して得
られた抗血清原液を0.25％BSAと、１％正常家
兎血清を含む0.05MPBS（PH8.0）で10000倍に
希釈したものを用いた。 又、抗家兎γ−グロブリン山羊血清は市販の
ものを、125I標識２−5Aは２−5Aにアラニル−
チロシン基を導入し、該チロシンを125I標識し
たものを用いた。125I標識２−5Aの製法につい
ては、本出願人が先に出願の特許願「新規2′−
5′オリゴアデニル酸化合物、その製造方法、及
びその化合物から成る放射免疫化学的測定方法
による2′−5′オリゴアデニル酸測定用の125I標
識用抗原」に詳細な説明があるので、そちらを
参考にされたい。 以上の方法で行つた２−5Aの定量値を第１
表に示す。尚表中、EDTA−2Na添加量は血
液１ml当りのmg数で、２−5A量は、血漿検体
１ml当りのｎｇ数を示す。
本発明において、EDTAは、実施例１で述べ
たとおり抗原−抗体反応を室温で行つた場合で
も、２−5Aの酵素的分解を最小限度に抑える効
果を有する。 これは、実施例１において、EDTA2Na無添
加対照区の２−5A実測値が、３検体とも0.1n
ｇ／ml・血漿検体以下であるのに対し、EDTA
−2Naを血液１ml当り１mg以上添加した区では検
体A.B.C.の２−5A定量値が各々1.92 1.80 1.40n
ｇ／ml・血漿検体前後であることから明らかであ
る。 ここで注目すべきことは、EDTA無添加対照
区の血漿検体における２−5A定量値が、その10
倍希釈時に希釈用緩衝液にEDTAが含有されて
いるにもかかわらず異常に低くなつていることで
ある。これは血液を採取してから血漿を分離・希
釈するまでの間に２−5Aの大部分が分解消失し
てしまうことを示しており、EDTA添加の重要
性が、このことからも明らかである。 又、本発明において、マグネシウム等金属イオ
ンの添加は、実施例２で示したようなEDTA添
加による抗原−抗体結合率の低下を抑え、正確な
２−5Aの定量を可能にする。 又、実施例３から明らかなように、反応液
400μ中に塩化マグネシウムが250μｇ存在すれ
ば、被検試料中の過剰のEDTAの影響を無視し
得る程度に抑え得るものである。 以上述べたとおり、本発明によれば２−5Aの
酵素的分解消失を定量値に影響を与えることなく
抑制することができ、かつ従来必要とされていた
抽出操作を不要としたので、より簡便な手技によ
り、２−5Aの免疫学的直接定量を行うことが可
能である。 又、本発明は、実施例に開示したRIAのみなら
ず、ラジオバインデイングアツセイ、あるいは酵
素イムノアツセイ等他の免疫学的直接定量法にも
応用が可能であると考えられ、適用範囲の広い、
非常に有用な技術であるといえる。
たとおり抗原−抗体反応を室温で行つた場合で
も、２−5Aの酵素的分解を最小限度に抑える効
果を有する。 これは、実施例１において、EDTA2Na無添
加対照区の２−5A実測値が、３検体とも0.1n
ｇ／ml・血漿検体以下であるのに対し、EDTA
−2Naを血液１ml当り１mg以上添加した区では検
体A.B.C.の２−5A定量値が各々1.92 1.80 1.40n
ｇ／ml・血漿検体前後であることから明らかであ
る。 ここで注目すべきことは、EDTA無添加対照
区の血漿検体における２−5A定量値が、その10
倍希釈時に希釈用緩衝液にEDTAが含有されて
いるにもかかわらず異常に低くなつていることで
ある。これは血液を採取してから血漿を分離・希
釈するまでの間に２−5Aの大部分が分解消失し
てしまうことを示しており、EDTA添加の重要
性が、このことからも明らかである。 又、本発明において、マグネシウム等金属イオ
ンの添加は、実施例２で示したようなEDTA添
加による抗原−抗体結合率の低下を抑え、正確な
２−5Aの定量を可能にする。 又、実施例３から明らかなように、反応液
400μ中に塩化マグネシウムが250μｇ存在すれ
ば、被検試料中の過剰のEDTAの影響を無視し
得る程度に抑え得るものである。 以上述べたとおり、本発明によれば２−5Aの
酵素的分解消失を定量値に影響を与えることなく
抑制することができ、かつ従来必要とされていた
抽出操作を不要としたので、より簡便な手技によ
り、２−5Aの免疫学的直接定量を行うことが可
能である。 又、本発明は、実施例に開示したRIAのみなら
ず、ラジオバインデイングアツセイ、あるいは酵
素イムノアツセイ等他の免疫学的直接定量法にも
応用が可能であると考えられ、適用範囲の広い、
非常に有用な技術であるといえる。
第１図は、被検血液に添加したEDTA−2Na
量と抗原−抗体結合率（Ｂ／Ｔ％）の関係を示す
ものである。第２図は、反応液中に塩化マグネシ
ウムを加えた場合の、被検血液に添加した
EDTA−2Na量と抗原−抗体結合率の関係を示
したものである。第１図、第２図、ともに縦軸は
抗原−抗体結合率（％）を、横縦は血液１ml当り
のEDTA添加量（mg）を表す。又、第２図中の
塩化マグネシウムの量は、反応液400μに含ま
れる量（μｇ）として表示した。
量と抗原−抗体結合率（Ｂ／Ｔ％）の関係を示す
ものである。第２図は、反応液中に塩化マグネシ
ウムを加えた場合の、被検血液に添加した
EDTA−2Na量と抗原−抗体結合率の関係を示
したものである。第１図、第２図、ともに縦軸は
抗原−抗体結合率（％）を、横縦は血液１ml当り
のEDTA添加量（mg）を表す。又、第２図中の
塩化マグネシウムの量は、反応液400μに含ま
れる量（μｇ）として表示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 生体試料中の2′−5′−オリゴアデニル酸の免
疫学的直接定量法において、予め試料にエチレン
ジアミン４酢酸塩を2′−5′−オリゴアデニル酸分
解酵素の阻害剤として添加し、該試料を過剰のエ
チレンジアミン４酢酸塩の除去剤としての金属イ
オンの存在下で抗2′−5′−オリゴアデニル酸特異
抗体と反応させることを特徴とする2′−5′−オリ
ゴアデニル酸の免疫学的直接定量法。 ２ エチレンジアミン４酢酸塩がナトリウム塩で
あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
載の2′−5′−オリゴアデニル酸の免疫学的直接定
量法。 ３ エチレンジアミン４酢酸２ナトリウムが試料
１ml当り１〜５mgの範囲で添加されることを特徴
とする特許請求の範囲第２項に記載の2′−5′−オ
リゴアデニル酸の免疫学的直接定量法。 ４ 金属イオンが、塩化マグネシウムとして添加
されたマグネシウムイオンであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項に記載の2′−5′−オリゴ
アデニル酸の免疫学的直接定量法。 ５ 塩化マグネシウムの量が、反応液１ml中0.6
〜1.3mgであることを特徴とする特許請求の範囲
第４項に記載の2′−5′−オリゴアデニル酸の免疫
学的直接定量法。 ６ 免疫学的直接定量法が、ラジオイムノアツセ
イであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載の2′−5′−オリゴアデニル酸の免疫学的直
接定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18287284A JPS61280566A (ja) | 1984-09-03 | 1984-09-03 | ２’−５’−オリゴアデニル酸の免疫学的直接定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18287284A JPS61280566A (ja) | 1984-09-03 | 1984-09-03 | ２’−５’−オリゴアデニル酸の免疫学的直接定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61280566A JPS61280566A (ja) | 1986-12-11 |
| JPH0570109B2 true JPH0570109B2 (ja) | 1993-10-04 |
Family
ID=16125901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18287284A Granted JPS61280566A (ja) | 1984-09-03 | 1984-09-03 | ２’−５’−オリゴアデニル酸の免疫学的直接定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61280566A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004046723A1 (ja) * | 2002-11-18 | 2004-06-03 | Denka Seiken Co., Ltd. | 血清および血漿の測定値乖離を防止する免疫測定法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA723264B (en) * | 1972-10-13 | 1974-08-28 | H Van Til | Improvements in toys |
| JPS5446828A (en) * | 1977-09-20 | 1979-04-13 | Eisai Co Ltd | Reagent for detection of ursodesoxycholic acid and its preparation |
| JPS57208459A (en) * | 1981-06-19 | 1982-12-21 | Eisai Co Ltd | Measuring method using enzyme-labelled antibody and reagent |
-
1984
- 1984-09-03 JP JP18287284A patent/JPS61280566A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61280566A (ja) | 1986-12-11 |
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |