JPH10512362A - 安定化された水性ステロイド免疫検定用標準 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生物学的活性を有しかつ２℃〜８℃の温度にて数ヵ月を越える貯蔵で酸化分解の傾向を有するステロイド化合物の水溶液が、キレート化剤の添加により安定化される。特に興味ある水溶液は、血清のようなヒト体液の挙動に酷似し、従ってそのような体液中のステロイドの免疫検定用の標準として適している蛋白質含有溶液である。特に興味あるキレート化剤は、遷移金属キレート化剤、特に効率的に鉄を封鎖するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 安定化された水性ステロイド免疫検定用標準 発明の分野 水性の蛋白質含有媒質中の、酸素による分解を受け易い生物学的に活性なステ ロイド化合物は、遷移金属キレート化剤の添加によりその貯蔵安定性が向上する 。 発明の背景 天然および合成の生物学的に活性な化合物の存在または量についてヒトの体液 を分析するために広範に用いられている方法は、免疫検定による方法であり、目 的の分析物（analyte）とこの分析物を認識する抗体との間の相互作用が測定さ れる。これはしばしば、所与の分析物の量を定量する比較的迅速で安価な方法を 提供する。分析物・抗体反応は、種々様々な技法によって測定され得る。一つの 技法は競合検定法であり、この検定法においては、抗分析物抗体を固相に固定し 、既知量の標識分析物および分析物を含有する疑いのある試料の両方と反応させ る。該試料中の分析物はその際、固定化された抗体に結合するために該標識抗体 と競合する。固定化抗体により捕獲される標識の量は、試料中に存在する分析物 の量に反比例する。 どの分析技法も標準（standard）への何らかの参照を必要とするが、かかる参 照は免疫検定法にとって特に重要である。かかる検定法において利用される試薬 には、正確には反応性に再現性がなく所与の範囲内でのみ再現性のある生物学的 物質が含まれる。加えて、抗体とその分析物の間の免疫学的結合は、必ずしも制 御され得るとは限らない敏感な因子により影響され得る。この点で、精確な再現 性を得るための厳格すぎる試みは、迅速で安価な検定の目標と両立しない。 それ故、免疫検定法の各試験について含まれるべき１個またはそれ以上の標準 を提供するプラクティスが開発されている。例えば、アボット・ラボラトリーズ 社により製造されているＩＭｘ（登録商標）器具は、各試験当たり２０個を越え る試料を分析し得る。バラツキの尺度を与えるために各試験において、ある既知 量の分析物を含有する数個の試料を含むのが一般的である。かかる標準試料は、 対照物質として普通知られている。 さらに、分析装置を較正しおよび時々再較正するために種々の既知量の分析物 を含有する多数の試料を提供することも一般的である。かかる標準試料は、キャ リブレータと普通称される。 キャリブレータおよび対照物質の両方について、分析物につ いて検定されることになっている体液の挙動と同様な挙動を検定において示す希 釈剤を用いることが好ましい。例えば、ヒト血清が分析されることになっている 場合、キャリブレータおよび対照物質は両方共、適切に処理された正常ヒト血清 中に希釈され得る。あるいは、血清と同様な蛋白質分を有する水性媒質例えばウ シ血清アルブミン（ＢＳＡ）の緩衝化溶液が用いられ得る。 目的の或るクラスの分析物即ちステロイドは、かかる緩衝化水性蛋白質含有媒 質において経時的に分解する傾向を示す。この傾向は、木炭ストリッピング（ch arcoal stripped）されたヒト血清においておよびＢＳＡの水溶液においても観 察された。これに関して、キャリブレータまたは対照物質のマトリックスまたは 担体として用いるために意図されたヒト血清は、存在し得るステロイドを除去す るために木炭ストリッピングされる。かくして、初期のステロイド含有率は、単 に、ストリッピングされた血清に計測量を添加することにより精確に制御され得 る。 このように、標準的現場条件下で長期貯蔵安定性を示す、ステロイド免疫検定 用のキャリブレータ溶液および対照物質溶液に対するニーズがある。特に、約２ ℃と８℃の間の温度にて長 期間貯蔵されるとき有意に分解しないかかる溶液に対するニーズがある。このよ うな溶液が６ヵ月を越える間安定であることが、特に望ましい。 発明の簡単な説明 ヒト体液の免疫検定の標準化のために適する希薄水性蛋白質含有溶液中の、酸 化による分解を受け易い生物学的に活性なステロイド化合物は、該溶液中に遷移 金属キレート化剤を混入することより、より貯蔵安定になる。興味あるステロイ ドとしては、例えばエストラジオールおよびプロゲステロンのような天然ホルモ ンステロイドが含まれる。キレート化剤として、例えばジエチレントリアミン五 酢酸（ＤＥＴＰ）およびエチレンジアミン四酢酸のような四座および一層多座の アミノ酢酸キレート化剤を含む。興味ある水性媒質として、例えば木炭ストリッ ピングされた正常ヒト血清およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の水溶液、特に 約６と９の間のｐＨに緩衝されたものが含まれる。特に興味ある溶液としては、 約２．５×１０^-11ｇ／ｍＬ〜１．０×１０^-7ｇ／ｍＬのステロイド濃度および 約０．１ｍＭより大きい、好ましくは約０．２ｍＭ〜５０ｍＭのキレート化剤濃 度を有するものが含まれる。 図面の簡単な説明 図１は、種々のキレート化剤および対照検体についての、３７℃における日数 に対する標準溶液中のプロゲステロンの損失の一連のプロットである。 図２は、キレート化剤および対照検体についての、３７℃における日数に対す る標準溶液中のエストラジオールの損失のプロットである。 図３は、キレート化剤および対照検体についての、３７℃における日数に対す る標準溶液中のエストラジオールの損失のプロットである。 発明の詳細な記載 本発明に関して興味あるステロイドは、ヒトにおいて生物学的活性を示しかつ 水性媒質中で酸化分解を受ける傾向を有するものである。これらのステロイドは 免疫検定用の標的となり得、従ってかかる検定用の標準として利用できそうであ る。かかる標準は、典型的には、免疫検定が行われつつある体液と同様な媒質中 における検定に対して参照ステロイドを呈するようにするために水性媒質を利用 する。これらのステロイドの中には天然のホルモンステロイドがあり、そして特 に興味あるもの は、女性性ホルモンのような、正常な生物学的レベルが変動するものである。こ のグループ内に、プロゲステロン、エストロンおよびエストラジオールが含まれ る。他の興味あるステロイドは、コルチソルおよびテストステロンを含む。 興味あるキレート化剤は、水性媒質から金属イオンを封鎖することのできるも のである。特に興味あるものは、遷移金属を封鎖することのできるキレート化剤 である。水性媒質中のステロイドの酸化分解は、遷移金属が触媒する経路を通じ て進行すると考えられ、従ってこの活性をかかる金属と錯化することにより阻害 し得るキレート化剤が特に興味ある。鉄がかかる分解反応における特に重要な物 質であると考えられ、従って鉄を封鎖するのに特に有効であるキレート化剤が興 味ある。 興味あるキレート化剤は、次のものを含む。即ち、 ２，２′−ジピリジン、即ちビピリジン， １，２−ビス（ジエチルホスフィノ）エタン， １，２−ビス（ジエチルホスフィノ）メタン， ｏ−フェニレンビスジメチルアルシン［ｏ−Ｃ₆Ｈ₄（ＡｓＭｅ₂）₂］， ジエチレントリアミン［Ｈ₂Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ）₂Ｈ］， ｛［２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４，５−ジイル）ビス（メチレ ン）］ビス（ジフェニルホスフィン）｝， １，２−ビス（ジフェニルホスフィノ）エタン、ｄｐｐｅ， エチレンジアミン四酢酸， エチレンジアミン［Ｈ₂ＮＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂］， トリス−（２−ジメチルアミノエチル）アミン［Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＭｅ₂）₃］， ビス−（２−ジフェニルホスフィノエチル）アミン［ＨＮ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＰＰｈ₂ ）₂］， トリス−（２−ジフェニルホスフィノエチル）アミン［Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＰＰｈ₂ ）₃］， １，１０−フェナントロリン， プロピレンジアミン（１，２−ジアミノプロパン）， ビス−（２−ジフェニルホスフィノエチル）アミン［ＨＮ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＰＰｈ₂ ）₂］， トリス−（２−ジフェニルホスフィノエチル）ホスフィン［Ｐ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＰＰ ｈ₂）₃］， サリチルアルデヒド， ビス−サリチルアルデヒドエチレンジアミン， トリス−（２−ジフェニルアルシノエチル）アミン［Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＡｓＰｈ₂ ）₃］， トリス−（３−ジメチルアルシノプロピル）ホスフィン［Ｐ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ ＡｓＭｅ₂）₃］， ビス−（３−ジメチルアルシノプロピル）メチルアルシン［ＭｅＡｓ（ＣＨ₂Ｃ Ｈ₂ＣＨ₂ＡｓＭｅ₂）₂］， Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤ又はｔｍｅｄと も称する）， １，３−ジアミノプロパン（トリメチレンジアミン）， トリス−（２−ジフェニルホスフィノエチル）アミン［Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＰＰｈ₂ ）₃］， トリス−（２−アミノエチル）アミン［Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂）₃］， トリエチレンテトラミン［（−ＣＨ₂ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂）₂］， トリス−（２−メチルチオメチル）アミン［Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＳＭｅ）₃］， デフェロキサミン［Ｎ′−［５−［［４−［［５−（アセチルヒドロキシアミノ ）ペンチル］アミノ］−１，４−ジオキソブ チル］ヒドロキシアミノ］ペンチル］−Ｎ−（５−アミノペンチル）−Ｎ−ヒド ロキシブタンジアミド］。 好ましいキレート化剤は三座または一層多座であるものを含み、四座および五 座が特に好ましい。好ましいキレート化剤の中ではアミノ酢酸構造を有するもの が、そしてこれらの中ではエチレンジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン 五酢酸が特に好ましい。 特に興味ある水性媒質は、実質的蛋白質分（protein content）を有するもの である。血清のようなヒト体液の挙動と同様であるかまたは酷似する媒質中で免 疫検定を行うことが、本発明の標準にとってしばしば望ましい。ある場合には、 検定されるべきヒト体液の蛋白質分から劇的に相違する蛋白質分を用いることが 有利な場合もある。このことは、該体液の他の特性についての調整を可能にし得 る。血清を含めてヒト体液は、実質的蛋白質分を有する。典型的な蛋白質濃度は 約１０ｍｇ／ｍＬと３００ｍｇ／ｍＬの間の範囲であり得、血清では約５０ｍｇ ／ｍＬが一般的である。この蛋白質分は天然に例えば正常ヒト血清において存在 し得、あるいは５パーセント重量／容量のような、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）の水溶液が添加され得る。 水性媒質はフィブリノゲンを実質的に含まないことが好ましい。かくして、血 漿以外の媒質を用いることが好ましい。これに関して、粒子形成性成分を含有す る媒質を避けることも好ましい。 蛋白質溶液は固有のステロイドを本質的に含まないことが好ましい。従って、 蛋白質溶液が正常ヒト血清である場合、好ましくは、天然に存在するステロイド を除去するために木炭ストリッピングされる。他方では、ステロイド不含有の木 炭ストリッピングされていない市販のＢＳＡのような、他の技法により該ステロ イドが除去されている蛋白質製剤が、特に好ましい。これらの中には、有機相で の洗浄により得られたものがある。木炭ストリッピングは鉄のような望ましくな い遷移金属を与え得る、と考えられる。 蛋白質はそれ自体不所望な遷移金属の源であり得る、と考えられる。蛋白質は 、遷移金属不含有の蛋白質を得ることを困難にする仕方で金属と錯化することが 、知られている。 必ずではないけれども、水性媒質がヒト体液のｐＨと同様なｐＨを有すること が好ましい。水性媒質が約６と９の間のｐＨを有することが特に好ましく、７と ８．５の間のｐＨが特に好 ましい。水性媒質のｐＨは、ＴＲＩＳとして普通知られているトリス（ヒドロキ シメチル）アミノメタンのような、生物学的物質と共に使用される通常の緩衝剤 のいずれかによって好都合に調整され得る。 興味ある水溶液のステロイド濃度は、ヒト体液を検定する際に遭遇するステロ イド濃度の範囲にわたるべきである。典型的には、種々のステロイドが、１ｍＬ 当たり約５ピコグラムと１ｍＬ当たり１００ナノグラムの間のレベルにおいて検 定される。１ｍＬ当たり約５×１０^-11グラムと４×１０^-8グラムの間の濃度が 、特に興味ある。 キレート化剤は、水性ステロイド溶液の酸化分解を阻止するために有効な量に て使用されるべきである。それらを約０．１ｍＭを越える量にて用いることが好 ましく、そしてそれらを約０．２ｍＭと５０ｍＭの間の量にて用いることが特に 好ましい。少なくとも約１ｍＭのキレート化剤濃度を使用することが特に有利で ある。約２０ｍＭを越えるキレート化剤濃度を使用する際、特にアミノ四酢酸お よび五酢酸のクラスの一層有効な鉄キレート化剤では、限られた利点が存在する ように思える。しかしながら、コスト以外には、一層高い濃度を用いることにあ ま り不利益が存在するとは思われない。 キレート化剤により達成される酸化分解の阻止は、水性ステロイド溶液に種々 の時間、高められた温度にて応力をかけそして免疫検定により検出できるステロ イド含有量の損失を観測することにより、好都合に検定され得る。高温試験によ り得られた結果は、より低い温度に保持されるステロイド溶液のより長い期間の 安定性の予言となる。 免疫検定用ステロイド標準は典型的には約２℃と８℃の間の温度に維持され、 そして望ましくは約６ヵ月を越える安定性を有し即ち６ヵ月以内に有意の分解を 示さない。該標準が約１０パーセントより小さい好ましくは約５パーセントより 小さい免疫検定における信号損失を示す、ことが特に望ましい。 かかる安定性は、４週間と５週間の間の期間にわたる約３７℃にての熱老化か ら好都合に投影され得る。４週間の間約１０％より小さい損失を示す組成物は、 約６ヵ月を越える安定性を有すると予期される。 以下の実施例は本発明の例示であり、そして請求の範囲において定められる本 発明の範囲を制限するものとして決して解釈されるべきでない。当業者は本発明 の概念が適用され得る多く の他の装置および使用方法を考え得る、ということが理解されよう。実施例１： ＩＭｘ（登録商標）エストラジオール検定 エストラジオール検定を、ＩＭｘ（登録商標）器具によりＩＭｘ（登録商標） 使い捨てカートリッジ上で次の方式で実施した。７５マイクロリットル（７５μ Ｌ）の血清試料を３５μＬの５α−ジヒドロテストステロン緩衝液（ＤＨＴ緩衝 液）、５０μＬのウサギ抗エストラジオール抗体被覆微粒子懸濁液および９０μ ＬのＩＭｘ（登録商標）緩衝液と混合した。この反応混合物を、３７℃にて２７ ．５分間インキュベートした。ＤＨＴ緩衝液は、２μｇ／ｍＬの５α−ジヒドロ テストステロン、０．７５％（ｗ／ｖ）サポニン、０．５Ｍグリシン、０．２５ ｍＭクエン酸ナトリウムおよび０．１２％メチルイソチアゾリノンのｐＨ４．５ の水溶液であった。該ウサギ抗エストラジオール抗体被覆微粒子懸濁液は、０． １Ｍビス−（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン （Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１３．６％スクロース、０． １％アジ化ナトリウムおよび０．２ｍｇ／ｍＬの正常ウサギＩｇＧのｐＨ６．５ の水溶液である微粒子緩衝 液中に懸濁された０．０１％固形分を含有していた。ＩＭｘ（登録商標）緩衝液 は、０．３ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）ア ミノメタン）および０．１％アジ化ナトリウムのｐＨ７．５の水溶液であった。 ＩＭｘ（登録商標）エストラジオール試薬（ＤＨＴ緩衝液、ウサギ抗エストラジ オール抗体被覆微粒子懸濁液、結合体およびメチルウンベリフェロンホスフェー ト基質を含む。）、ＩＭｘ（登録商標）緩衝液、ＩＭｘ（登録商標）使い捨てカ ートリッジおよびＩＭｘ（登録商標）器具は、イリノイ州アボットパークのアボ ット・ラボラトリーズ社から市販されており、並びにＵＳ５，３４２，７６０、 ＥＰ−Ａ−２８８ ７９３および「Ｆｉｏｒｅ等，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３４ ／９：１７２６〜１７３２，１９８８」（それらはすべて、参考として本明細書 中に組み入れるものとする。）に記載されている。 １７５マイクロリットル（１７５μＬ）の上記の反応混合物を、ＩＭｘ（登録 商標）使い捨てカートリッジの繊維マトリックスに移した。該繊維マトリックス は、該ＩＭｘ（登録商標）カートリッジの吸収パッド上に置かれている。微粒子 は該繊維マトリックスにより捕獲され、そして溶液は該吸収パッドによ り吸収された。微粒子を、次いでＩＭｘ（登録商標）緩衝液で洗浄した。６０マ イクロリットル（６０μＬ）のエストロン６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシ ムアルカリ性ホスファターゼ結合体溶液を該マトリックスに添加し、３７℃にて １２秒間インキュベートし、そして次いでＩＭｘ（登録商標）緩衝液で再び洗浄 した。該結合体溶液は、分析物不含有の試料の検定に使用されるとき或る強さの 信号を与えるのに十分な結合体を含有する、０．１ＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、０． ５Ｍ塩化ナトリウム、１％カゼイン、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化 亜鉛および０．１％アジ化物のｐＨ６．５の水溶液であった。 ６５マイクロリットル（６５μＬ）の、１．２ｍＭの４−メチルウンベリフェ ロンホスフェートおよび０．１Ｍの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール のｐＨ９の水溶液を該マトリックスに添加し、そして４−メチルウンベリフェロ ンの形成速度を蛍光反射率により測定した。ＩＭｘ（登録商標）器具により、水 銀アークランプを光源として用いる蛍光計で蛍光が測定された（「Ｆｉｏｒｅ等 ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３４／９：１７２６〜１７３２，１９８８」（その内 容は、参考として本明細書中に組み入れるものとする。）に記載されているのと 同 様に行った）。０、５０、２５０、７５０、１５００および３０００ｐｇ／ｍＬ のエストラジオールを含有するキャリブレータを用いて、標準曲線を作成した。 この曲線を用いて、この検定は、１３．９±４．３ｐｇ／ｍＬの平均感度を有す ると決定された。実施例２： ＩＭｘ（登録商標）プロゲステロン検定 プロゲステロン検定を、次の変更を除いて実施例１におけるエストラジオール 検定と同様の方式を用いてＩＭｘ（登録商標）器具によりＩＭｘ（登録商標）使 い捨てカートリッジ上で実施した。１５マイクロリットル（１５μＬ）の血清試 料を８０μＬのプロゲステロン試料緩衝液、８０μＬの抗プロゲステロン抗体被 覆微粒子懸濁液および７５μＬのＩＭｘ（登録商標）緩衝液と混合した。この反 応混合物を、３７℃にて２０．８分間インキュベートした。プロゲステロン試料 緩衝液は、２．２５Ｍグリシン、０．５μｇ／ｍＬの５α−ジヒドロテストステ ロン、０．２％（ｗ／ｖ）サポニン、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．１％メ チルイソチアゾリノンのｐＨ２．８の水溶液（ペンシルバニア州フィラデルフィ アのローム・アンド・ハース社から入手できる。）であった。該抗プロゲステロ ン抗体 （オーストラリア国のサリー大学から入手できる。）被覆微粒子懸濁液は、０． ５Ｍモルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１０％ スクロース、２％ウシ血清アルブミン（ニューヨーク州ホーソーンのインテルゲ ン社から入手できる。）、０．１ｍｇ／ｍＬヒツジＩｇＧ（カリフォルニア州サ ンタアナのアーヴィン・サイエンティフィック社から得られる、ヒツジ血清の５ ０％硫酸アンモニウムカット。）および０．２％アジ化ナトリウムのｐＨ６．５ の水溶液である緩衝液中に懸濁された０．００１％固形分（インディアナ州イン ディアナポリスのセラダイン社から入手できる微粒子）を含有していた。 １７５マイクロリットル（１７５μＬ）の上記の反応混合物を、ＩＭｘ（登録 商標）使い捨てカートリッジの繊維マトリックスに移した。該微粒子を、次いで ＩＭｘ（登録商標）緩衝液で洗浄した。６０マイクロリットル（６０μＬ）の１ ７−ヒドロキシプロゲステロン−３−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシムアルカ リ性ホスファターゼ結合体溶液を該マトリックスに添加し、反応を３７℃にて８ 秒間インキュベートし、そして次いでＩＭｘ（登録商標）緩衝液で再び洗浄した 。該結合体溶液は、 ＵＳ５，３４２，７６０に記載されているようなＥＤＡＣカップリング法により アルカリ性ホスファターゼ（独国のベーリンガー・マンハイム社から入手できる 。）に結合された１７−ヒドロキシプロゲステロン（ニューハンプシャ州ウィル トンのステラロイズ社から入手できる。）を含有していた。該結合体溶液は、分 析物不含有の試料の検定において使用されるとき或る強さの信号を与えるのに十 分な結合体を含有する、５０ｍＭのｔｒｉｓ、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化亜鉛、０．５％カゼイン（ミズーリ州セ ントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）および０．１％アジ化ナト リウムのｐＨ７．４の水溶液であった。 ４−メチルウンベリフェロンホスフェートの添加並びに４−メチルウンベリフ ェロンの形成速度の定量は、実施例１に記載された通りに行った。０、１、４、 １０、２０および４０ｎｇ／ｍＬのプロゲステロンを含有するキャリブレータを 用いて、標準曲線を作成した。この曲線を用いて、この検定は、０．１３ｎｇ／ ｍＬの平均感度を有すると決定された。実施例３： 血清マトリックスの製造 １リットルの正常ヒト血清（テネシー州メンフィスのインタ ーステート・ブラッド・バンクから入手できる。）を５０グラムの活性炭（イリ ノイ州オーランドパークのアール・ダブリュー・グリーフ・アンド・カンパニー 社から入手できる。）と混合することにより、ステロイドがストリッピングされ た血清を製造した。２時間の室温混合後、該活性炭を濾過により除去した。アル カリショックした血清（alkaline shocked serum）を、エストラジオール血清マ トリックス（ＩＭｘ（登録商標）エストラジオール検体希釈剤として、アボット ・ラボラトリーズ社から入手できる。）に対して用いた。アルカリショックした 血清は、木炭ストリッピングされた血清を６Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ１１に上 げ、この混合物を２〜８℃にておおよそ１８時間インキュベートし、６Ｎ−ＨＣ ｌでｐＨを約８．０に調整し、この最終混合物を濾過することにより製造された 。アジ化ナトリウムを、すべての血清マトリックスに対して０．２％（ｗ／ｖ） まで添加した。エストラジオール（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル 社から入手できる。）またはプロゲステロン（ミズーリ州セントルイスのシグマ ・ケミカル社から入手できる。）を、ステロイドがストリッピングされた血清の アリコートに添加して、下記に記載の安定性実験のためのキャリブ レータ、対照物質または試験試料を作製した。実施例４： ＢＳＡマトリックスの製造 ＩＭｘ（登録商標）エストラジオール用の、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を 基剤としたキャリブレータマトリックスを、有機洗浄によりステロイドがストリ ッピングされたＢＳＡ（イリノイ州カンカキーのマイルズ・ペンテックス社から 入手できる。）を０．１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび０． ２％アジ化ナトリウムのｐＨ８の水溶液中５％（ｗ／ｖ）の濃度まで溶解するこ とにより製造した。実施例５： 血清中のプロゲステロンの安定性に対する種々の キレート化剤の効果 マトリックス安定性実験からプロゲステロンおよびエストラジオールのキャリ ブレータおよび対照物質の安定性に関する有用な情報を妥当な時間で得るために 、ステロイド試料の分解を測定するのに必要な観察時間を低減する技法を案出し た。試験試料を３７℃にてインキュベートし、そして数日間または数週間の期間 観察した。かかるより高い温度は、キャリブレータおよび対照物質が全期間にわ たって２〜８℃にて貯蔵されていたなら標準的には数ヵ月間の期間にわたる観察 を必要としたであ ろうステロイド分解を加速した。 実施例３において製造されたような木炭ストリッピングされたヒト血清（アル カリショックがされていない）（１０ｍＬ）をガラスシンチレーションバイアル 中に分取し、そして種々の金属キレート化剤を次の最終濃度まで添加した。 ａ）１．０ｍＭジエチレントリアミン五酢酸（ＤＥＴＰ，ミズーリ州セントルイ スのシグマ・ケミカル社から入手できる。）。 ｂ）１０．０ｍＭジエチレントリアミン五酢酸（ＤＥＴＰ）。 ｃ）１．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ，ミズーリ州セントルイスの シグマ・ケミカル社から入手できる。）。 ｄ）１０．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）。 ｅ）１．０ｍＭデフェロキサミンメシレート（ミズーリ州セントルイスのシグマ ・ケミカル社から入手できる。）。 試料を室温にて１２分間ロッカー（rocker）上でインキュベートし、次いでこ れに、エタノールストック溶液中で調製された１０μｇ／ｍＬのプロゲステロン （ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）を５ｎｇ／ ｍＬまで薬剤添加した（ｓｐｉｋｅｄ）。室温にてロッカー上で８分インキュベ ートした後、試料をプロゲステロンのベースライン濃 度について検定した。各組成物の４個の１．０ｍＬアリコートをＴＤｘ（登録商 標）ミクロ遠心分離管（イリノイ州アボットパークのアボット・ラボラトリーズ 社から入手できる。）中に入れ、そして−２０℃にて凍結貯蔵した。シンチレー ションバイアルを、３７℃にてインキュベートした。指摘された日数時に、アリ コートを解凍し、そして３７℃にて貯蔵されたバイアルから取り出した対応する アリコートと共に試験して損失パーセントを検定した。 損失パーセント（損失％）は、凍結されたアリコートに対する、応力がかけら れた試料中のプロゲステロンの損失の絶対的測定値である。２４個のような多数 の試料が、ＩＭｘ（登録商標）器具の単一実験中試験され得る。該ＩＭｘ（登録 商標）により、ステロイド−アルカリ性ホスファターゼ結合体の結合の量に比例 する４−メチルウンベリフェロンの形成速度が測定される。ＩＭｘ（登録商標） エストラジオールおよびプロゲステロンの検定は競合的であるため、４−メチル ウンベリフェロンの形成速度は、分析物濃度に反比例する。単一実験からの試験 試料についての濃度の比較は、それ故、分析物濃度の内部的に制御される指標を 与え得る。かかる比較は、実験間または器具 間の変動により複雑化されない。 これらの実験について、薬剤添加されていない（ｕｎｓｐｉｋｅｄ）アリコー トを、薬剤添加されたアリコートと共に同じ実験に含めた。応力がかけられたま たは凍結された薬剤添加された試料からの信号を薬剤添加されていないアリコー トからの信号で割りそしてこの結果をこの検定のために予め作成しておいた置換 曲線上にプロットすることにより、各老化条件について濃度を決定した。損失パ ーセントは、凍結された濃度と応力がかけられた濃度の間の差を凍結されたアリ コートについて得られた濃度で割ることにより決定される。これらの結果は、損 失パーセント即ち［（凍結された濃度−応力がかけられた濃度）／凍結された濃 度］×１００％として示される。図１は、試薬無添加と比較されたデフェロキサ ミン、ＤＥＴＰおよびＥＤＴＡの添加による経時（日数０、３、８、１５および ２９）損失％の低減を示す。損失％の低減は、１０ｍＭのＤＥＴＰについて最も 有効であり、そしてその次は１ｍＭのＤＥＴＰであった。２９日後試薬無添加の 場合のほぼ８０％損失と比較して、１０ｍＭのＤＥＴＰの場合損失パーセントは 除去された。実施例６： ＤＥＴＰによる血清中のエストラジオールの 安定化 １５ミリリットル（１５ｍＬ）の、実施例３において製造されたアルカリショ ックされかつ木炭ストリッピングされたヒト血清を、ガラスシンチレーションバ イアル中に分取し、そしてジエチレントリアミン五酢酸（ＤＥＴＰ）を１０ｍＭ まで添加した。ＤＥＴＰ無添加の対照試料も調製した。これらの試料を室温にて ８分間ロッカー上でインキュベートし、２時間平衡化させ、次いでこれに、木炭 ストリッピングされた血清中で調製された５００ｎｇ／ｍＬのエストラジオール （ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から入手できる。）ストック溶 液を７５０ｐｇ／ｍＬまで薬剤添加した。室温にてロッカー上で５分インキュベ ートした後、試料をベースライン濃度について検定した。４個の１ｍＬアリコー トをＴＤｘ（登録商標）ミクロ遠心分離管（イリノイ州アボットパークのアボッ ト・ラボラトリーズ社から入手できる。）中に入れ、そして−２０℃にて凍結し た。シンチレーションバイアルを、３７℃にてインキュベートした。指示された 日数時に凍結アリコートを解凍し、そして３７℃にて貯蔵されたバイアルから取 り出した対応する アリコートと共に試験して、実施例５において概説されたデータ処理を用い、し かし結果は薬剤添加されていない検体についての標準信号を用いて正規化され得 ると仮定して、損失パーセントを検定した。図２は、試薬無添加と比較された１ ０ｍＭのＤＥＴＰの添加による経時（日数０、７、１４、２１および２８）損失 ％の低減を示す。損失パーセントは、１０ｍＭのＤＥＴＰの添加により２８日後 ２０％超からほぼ損失なしへ低減することが観察された。実施例７： ＤＥＴＰによる５％ＢＳＡマトリックス中のエス トラジオールの安定化 ＢＳＡ試料マトリックスを実施例４における記載のようにして製造し、そして ２個のマスターアリコートに分けた。ＤＥＴＰを一方のアリコートに２０ｍＭま で添加した。エストラジオールを両方のアリコートに７５０ｐｇ／ｍＬの濃度ま で添加し、そして各アリコートを更に１０個のポリエチレン製滴瓶中に分取した 。各マスターアリコートからの５個の滴瓶を３７℃にてインキュベートし、そし て他の５個を−２０℃にて凍結した。指示された日数時に凍結アリコートを解凍 しそして対応する３７℃アリコートと共に試験して、実施例６に記載のようにし て損失パーセントを検定した。図３は、試薬無添加と比較された２０ｍＭのＤＥ ＴＰの添加による経時（日数０、７、１４、２１、２８および３５）損失％の低 減を示す。損失パーセントは、２０ｍＭのＤＥＴＰの添加により２８日後１０％ 超からほぼ損失なしへ低減することが観察された。 記載された実施態様並びに示された代替的実施態様は、限定というよりむしろ 具体例として意図されている。従って、本発明の説明は、開示された特定の実施 態様に本発明を限定するよう意図されているものではなくて、上記に説明され、 また請求の範囲に記載されている本発明の思想および範囲内のすべての均等物お よび主題を包含するよう意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アボレニーン，ホダ・アイ アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ ーテイビル、ポートワイン・1506 (72)発明者 グロスコツフ，ウイリアム・アール アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバ ーテイビル、ドーズ・1131

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 水性媒質中にステロイドおよびキレート化剤を含む組成物。 ２． 蛋白質含有水性媒質中に生物学的に活性なステロイドと遷移金属キレート 化剤とを含む組成物。 ３． 蛋白質含有水性マトリックス中に分解を受け易い生物学的に活性なステロ イドと遷移金属キレート化剤とを含む組成物。 ４． 水性媒質中に溶解された、酸素感受性ステロイド、遷移金属キレート化剤 および蛋白質を含む組成物。 ５． 貯蔵安定な水性ステロイドキャリブレータ溶液であって、 １）酸素分解性の生物学的に活性なステロイド化合物、 ２）遷移金属キレート化剤、および ３）蛋白質 を含む上記溶液。 ６． ヒトの血清または血漿の免疫診断検定の較正に適した貯蔵安定なステロイ ド含有緩衝化水溶液であって、 １）酸素分解性の生物学的に活性なステロイド化合物、 ２）遷移金属キレート化剤、および ３）正常ヒト血清の蛋白質分に酷似する蛋白質分 を含む上記溶液。 ７． ヒトの血清または血漿の免疫診断検定の較正に適した貯蔵安定なステロイ ド含有緩衝化水溶液であって、 １）酸素分解性の生物学的に活性なステロイド化合物、 ２）遷移金属キレート化剤、および ３）正常ヒト血清の蛋白質分に酷似する蛋白質分 を含む上記溶液。 ８． 蛋白質分がウシ血清アルブミンにより供給される、請求項７に記載の組成 物。 ９． 蛋白質分が木炭ストリッピングされた正常ヒト血清により供給される、請 求項７に記載の組成物。 １０． ステロイドがエストラジオールまたはプロゲステロンである、請求項７ に記載の組成物。