JPH0570435B2 - - Google Patents
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- JPH0570435B2 JPH0570435B2 JP61163414A JP16341486A JPH0570435B2 JP H0570435 B2 JPH0570435 B2 JP H0570435B2 JP 61163414 A JP61163414 A JP 61163414A JP 16341486 A JP16341486 A JP 16341486A JP H0570435 B2 JPH0570435 B2 JP H0570435B2
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- rough
- glycogen
- monoclonal antibody
- cells
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
- G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒトのラフオーラ小体に対する単ク
ローン性抗体に関する。本発明の単クローン性抗
体は、ラフオーラ病、糖原病型の検出に有用で
ある。
ローン性抗体に関する。本発明の単クローン性抗
体は、ラフオーラ病、糖原病型の検出に有用で
ある。
従来の技術
ラフオーラ病、糖原病型の検出は、筋生検、
肝生検などによつて病理学的に行われている。
肝生検などによつて病理学的に行われている。
ラフオーラ病（ミオクーヌスてんかん）および
糖原病型は、グリコーゲン分子の枝分かれを形
成する酵素であるα−１，４−クリカン−６−グ
リコシルトランスフエラーゼの欠損によつて生じ
る外側枝の長い異常グリコーゲン（ラフオーラ小
体）が、心筋、神経細胞、肝細胞、皮膚などに蓄
積する疾患である。
糖原病型は、グリコーゲン分子の枝分かれを形
成する酵素であるα−１，４−クリカン−６−グ
リコシルトランスフエラーゼの欠損によつて生じ
る外側枝の長い異常グリコーゲン（ラフオーラ小
体）が、心筋、神経細胞、肝細胞、皮膚などに蓄
積する疾患である。
ラフオーラ病の多くは家族性に出現し、思春期
前後に発病、けいれん発作、ミオクロニー痴呆、
小脳症状、性格変化などの臨床症状を呈し、進行
性の経過をとつて10余年を経て全身衰弱のため死
亡する症候群である。
前後に発病、けいれん発作、ミオクロニー痴呆、
小脳症状、性格変化などの臨床症状を呈し、進行
性の経過をとつて10余年を経て全身衰弱のため死
亡する症候群である。
糖原病型（Andersen病）は、生後まもなく
発育障害があり、肝腫、脾腫、筋緊張抵下が出現
し、腹水の合併をみ、２年以内に死亡する症候群
である。
発育障害があり、肝腫、脾腫、筋緊張抵下が出現
し、腹水の合併をみ、２年以内に死亡する症候群
である。
発明が解決しようとする問題点
ラフオーラ病、糖原病型の診断は、筋生検、
肝生検などによつて病理学的に診断をしている
が、α−アミラーゼ処理、β−アミラーゼ処理、
PAS染色など繁雑な手法が必要であり、かつ、
確定的なものはない。
肝生検などによつて病理学的に診断をしている
が、α−アミラーゼ処理、β−アミラーゼ処理、
PAS染色など繁雑な手法が必要であり、かつ、
確定的なものはない。
異常グリコーゲン（ラフオーラ小体）と反応
し、正常のグリコーゲンとは反応しない単クロー
ン性抗体を確立すれば、ラフオーラ病、糖原病
型の診断上極めて有効な手段となるものと期待さ
れる。
し、正常のグリコーゲンとは反応しない単クロー
ン性抗体を確立すれば、ラフオーラ病、糖原病
型の診断上極めて有効な手段となるものと期待さ
れる。
問題点を解決するための手段
本発明者らは、ラフオーラ病患者心筋ホモジネ
ート、あるいは、それより抽出した異常グリコー
ゲンでマウスを免疫し、ハイブリドーマを作製
し、異常グリコーゲンと反応し、正常グリコーゲ
ンと反応しない単クローン性抗体を確立し、本願
発明を完成するに到つた。
ート、あるいは、それより抽出した異常グリコー
ゲンでマウスを免疫し、ハイブリドーマを作製
し、異常グリコーゲンと反応し、正常グリコーゲ
ンと反応しない単クローン性抗体を確立し、本願
発明を完成するに到つた。
従来、このような異常グリコーゲンに対する単
クローン性抗体に関する報告は全くない。
クローン性抗体に関する報告は全くない。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明は、ラフオーラ小体に反応する単クロー
ン性抗体を提供する。本発明の単クローン性抗体
はIgGクラスに属し、その具体例としては、KM
−279と名付けたものがあげられる。
ン性抗体を提供する。本発明の単クローン性抗体
はIgGクラスに属し、その具体例としては、KM
−279と名付けたものがあげられる。
本発明の単クローン性抗体は、ラフオーラ病患
者の心筋ホモジネートまたはそれから抽出したラ
フオーラ小体で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の
脾細胞と哺乳動物の骨随腫細胞と融合させ、得ら
れるハイブリドーマ細胞株からラフオーラ小体に
反応するハイブリドーマ細胞株を選び、該細胞株
を培地に培養するか、哺乳動物の腹腔に投与して
腹水化し、培養物または腹水中にラフオーラ小体
に反応する単クローン性抗体を蓄積させ、該培養
物または腹水から該単クローン性抗体を採取する
ことによつて得られる。
者の心筋ホモジネートまたはそれから抽出したラ
フオーラ小体で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の
脾細胞と哺乳動物の骨随腫細胞と融合させ、得ら
れるハイブリドーマ細胞株からラフオーラ小体に
反応するハイブリドーマ細胞株を選び、該細胞株
を培地に培養するか、哺乳動物の腹腔に投与して
腹水化し、培養物または腹水中にラフオーラ小体
に反応する単クローン性抗体を蓄積させ、該培養
物または腹水から該単クローン性抗体を採取する
ことによつて得られる。
免疫する哺乳動物および骨随腫細胞の哺乳動物
としては、マウス、ラツト、ウシ、ウマなどがあ
げられる。
としては、マウス、ラツト、ウシ、ウマなどがあ
げられる。
哺乳動物としてマウスを用いた、本発明の単ク
ローン性抗体の具体的製造法を以下に示す。
ローン性抗体の具体的製造法を以下に示す。
(1) 免疫動物脾細胞の調製
マウスをラフオーラ病患者心筋ホモジネートあ
るはそれから抽出した異常グリコーゲンで免疫し
て、そのマウスから脾細胞を調製する。
るはそれから抽出した異常グリコーゲンで免疫し
て、そのマウスから脾細胞を調製する。
ラフオーラ病患者の心筋ホモジネート異常グリ
コーゲンは参考例１の方法に従つて調製する。
コーゲンは参考例１の方法に従つて調製する。
免疫の方法は、８〜10週令のBALB／ｃマウ
スの皮下あるいは、静脈内あるいは腹腔内に、適
当なアジユバント〔例えば、フロインドの完全な
アジユバント（Complete Freund’ｓ
Adjuvant）あるいは、水酸化アルミニウムゲル
と百日咳菌ワクチンなど〕とともに、ラフオーラ
病患者心筋ホモジネートあるいはそれから抽出し
た異常グリコーゲンを10〜100μg／匹投与する。
以後１〜２週間おきに初回免疫に使つたと同じ抗
原を同量２〜５回投与する。
スの皮下あるいは、静脈内あるいは腹腔内に、適
当なアジユバント〔例えば、フロインドの完全な
アジユバント（Complete Freund’ｓ
Adjuvant）あるいは、水酸化アルミニウムゲル
と百日咳菌ワクチンなど〕とともに、ラフオーラ
病患者心筋ホモジネートあるいはそれから抽出し
た異常グリコーゲンを10〜100μg／匹投与する。
以後１〜２週間おきに初回免疫に使つたと同じ抗
原を同量２〜５回投与する。
各免疫後４〜７日目に、眼底静脈叢より採血
し、血清中の異常グリコーゲンに対する抗体価を
調べる。
し、血清中の異常グリコーゲンに対する抗体価を
調べる。
抗体価の測定法は、固相酵素免疫測定法（酵素
免疫測定法：医学書院刊 1978年）により下記の
とおり行う。
免疫測定法：医学書院刊 1978年）により下記の
とおり行う。
96穴のEIA用プレート〔Flow Laboratories社
製〕に異常グリコーゲンまたは正常グリコーゲン
の10〜50μg／mlリン酸バツフアー・セライン
（PBS：リン酸二ナトリウム1.83ｇ、リン酸−カ
リウム0.21ｇ、食塩7.65ｇ、蒸留水１、PH7.2）
溶液を50μ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置し
て抗原をプレートにコートする。次いで１％牛血
清アルブミン（BSA）−PBSを200μ／穴分注
し、プレート底面上の結合性残基をBSAでブロ
ツクする。上記プレートをPBSでよく洗浄後、
第１抗体として、段階希釈した試料（マウス血
清、ハイブリドーマ培養上清、精製抗体）を50μ
／穴分注し、４℃で一晩または、室温で３〜４
時間放置する。PBSで６回洗浄した後、第２抗
体として、ウサギ抗マウスイムノグロブリン−ペ
ルオキシダーゼ結合物〔DAKO社製〕の400倍希
釈液を100μ／穴分注し、室温で２時間放置す
る。PBSで洗浄後、ABTS基質液〔２，2′−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）二アンモニウム550mgを0.1Mクエン酸緩
衝液（PH4.2）１に溶かした溶液に、使用直前
に過酸化水素1μ／mlを加えた溶液〕を用い、
発色をOD415onの吸光度で測定する。
製〕に異常グリコーゲンまたは正常グリコーゲン
の10〜50μg／mlリン酸バツフアー・セライン
（PBS：リン酸二ナトリウム1.83ｇ、リン酸−カ
リウム0.21ｇ、食塩7.65ｇ、蒸留水１、PH7.2）
溶液を50μ／穴ずつ分注し、４℃で一晩放置し
て抗原をプレートにコートする。次いで１％牛血
清アルブミン（BSA）−PBSを200μ／穴分注
し、プレート底面上の結合性残基をBSAでブロ
ツクする。上記プレートをPBSでよく洗浄後、
第１抗体として、段階希釈した試料（マウス血
清、ハイブリドーマ培養上清、精製抗体）を50μ
／穴分注し、４℃で一晩または、室温で３〜４
時間放置する。PBSで６回洗浄した後、第２抗
体として、ウサギ抗マウスイムノグロブリン−ペ
ルオキシダーゼ結合物〔DAKO社製〕の400倍希
釈液を100μ／穴分注し、室温で２時間放置す
る。PBSで洗浄後、ABTS基質液〔２，2′−アジ
ノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）二アンモニウム550mgを0.1Mクエン酸緩
衝液（PH4.2）１に溶かした溶液に、使用直前
に過酸化水素1μ／mlを加えた溶液〕を用い、
発色をOD415onの吸光度で測定する。
異常グリコーゲンに対する抗体価が、正常マウ
ス血清の103倍以上（415nmでのOD値）になつた
マウスを免疫化動物細胞の供給源として使う。
ス血清の103倍以上（415nmでのOD値）になつた
マウスを免疫化動物細胞の供給源として使う。
細胞融合に供するために、免疫マウスに融合処
理の３〜４日前に、ラフオーラ病患者の心筋のホ
モジネートあるいはそれから抽出した異常グリコ
ーゲンを10〜200μｇ／匹を腹腔内に投与し、追
加免疫後、脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
理の３〜４日前に、ラフオーラ病患者の心筋のホ
モジネートあるいはそれから抽出した異常グリコ
ーゲンを10〜200μｇ／匹を腹腔内に投与し、追
加免疫後、脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
(2) 骨随腫細胞の調製
骨随腫細胞としては、マウスから得られた株化
細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐
性マウス（BALB／ｃ由来）骨随腫細胞株P3−
X63Ag8−U1（P3−U1）〔カレント・トピツク
ス・イン・ミクロバイオロジイ・アンド・イムノ
ロジイ（Current Topics in Microbiology and
Immunology）81，１〜７（1978）〕、P3−NSI／
１−Ag41（NS−１）〔ヨーロピアン・ジヤーナ
ル・オブ・イムノロジイ（European J.
Immunology），６，511〜519（1976）〕、SP2／０
−Ag14（SP−２）〔ネイチヤー（Nature），276，
269〜270（1978）〕、P3−X63−Ag8653（653）〔ジ
ヤーナル・オブ・イムノロジイ（J.
Immunology），123，1548〜1550（1979）〕、P3−
X63−Ag8（X63）〔ネイチヤー（Nature），256，
495〜497（1975）〕などが用いられる。
細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐
性マウス（BALB／ｃ由来）骨随腫細胞株P3−
X63Ag8−U1（P3−U1）〔カレント・トピツク
ス・イン・ミクロバイオロジイ・アンド・イムノ
ロジイ（Current Topics in Microbiology and
Immunology）81，１〜７（1978）〕、P3−NSI／
１−Ag41（NS−１）〔ヨーロピアン・ジヤーナ
ル・オブ・イムノロジイ（European J.
Immunology），６，511〜519（1976）〕、SP2／０
−Ag14（SP−２）〔ネイチヤー（Nature），276，
269〜270（1978）〕、P3−X63−Ag8653（653）〔ジ
ヤーナル・オブ・イムノロジイ（J.
Immunology），123，1548〜1550（1979）〕、P3−
X63−Ag8（X63）〔ネイチヤー（Nature），256，
495〜497（1975）〕などが用いられる。
これの細胞株は、８−アザグアニン培地
〔RPMI−1640培地にグルタミン（1.5mM）、２−
メルカプトエタノール（５×10-5M）、ジエンタ
マイシン（10μｇ／ml）および牛胎児血清
（FCS）（10％）を加えた正常培地に、さらに８−
アザグアニン（15μｇ／ml）を加えた培地〕で、
継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に
継代し、融合当日２×107以上の細胞数を確保す
る。
〔RPMI−1640培地にグルタミン（1.5mM）、２−
メルカプトエタノール（５×10-5M）、ジエンタ
マイシン（10μｇ／ml）および牛胎児血清
（FCS）（10％）を加えた正常培地に、さらに８−
アザグアニン（15μｇ／ml）を加えた培地〕で、
継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に
継代し、融合当日２×107以上の細胞数を確保す
る。
(3) 細胞融合
(1)で免疫したマウスに10〜200μｇ／匹のラフ
オーラ病患者心筋ホモジネートあるいは異常グリ
コーゲンを腹腔内に投与し、３〜４日後に脾臓を
摘出し、脾細胞を調製する。この脾細胞と(2)で得
られる骨随腫細胞株をMEM培地（日水製薬社
製）または、PBSでよく洗浄し、細胞数が、脾
細胞：骨随腫細胞＝５〜10：１になるように混合
し、遠心分離にかける。上清を捨て、沈澱した細
胞群をほぐした後、撹拌しながらポリエチレング
リコール（PEG1000〜4000）１〜４ｇ、MEM培
地１〜４ml、ジメチルスルホキシド
（Dimethylsulfoxide）0.5〜1.0mlの混液0.1〜1.0
ml／108脾細胞を加え、0.5〜10分後にMEM培地
0.5〜３mlを加える。その後0.5〜２分毎にMEM
培地0.5〜３mlを数回加えた後、MEM培地を30〜
60ml加える。
オーラ病患者心筋ホモジネートあるいは異常グリ
コーゲンを腹腔内に投与し、３〜４日後に脾臓を
摘出し、脾細胞を調製する。この脾細胞と(2)で得
られる骨随腫細胞株をMEM培地（日水製薬社
製）または、PBSでよく洗浄し、細胞数が、脾
細胞：骨随腫細胞＝５〜10：１になるように混合
し、遠心分離にかける。上清を捨て、沈澱した細
胞群をほぐした後、撹拌しながらポリエチレング
リコール（PEG1000〜4000）１〜４ｇ、MEM培
地１〜４ml、ジメチルスルホキシド
（Dimethylsulfoxide）0.5〜1.0mlの混液0.1〜1.0
ml／108脾細胞を加え、0.5〜10分後にMEM培地
0.5〜３mlを加える。その後0.5〜２分毎にMEM
培地0.5〜３mlを数回加えた後、MEM培地を30〜
60ml加える。
遠心後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐし
た後、正常培地50〜200mlを加え、メスピペツト
でゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を培養
用プレートに半容量／穴ずつ分注し、３〜７％
CO2インキユベーター中、35〜40℃で10〜30時間
培養する。培養プレートに半容量／穴のHAT培
地〔正常培地にヒポキサンチン（10-5〜10-3M）、
チミジン（10-6〜10-4M）およびアミノプテリン
（10-8〜10-7M）を加えた培地〕を加え、さらに
10〜30時間培養する。以後１〜３日間10〜30時間
目ごとに、培養上清半容量を捨て、新たに同量の
HAT培地を加え、CO2インキユベーター中、35
〜40℃で10〜14日間培養する。
た後、正常培地50〜200mlを加え、メスピペツト
でゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を培養
用プレートに半容量／穴ずつ分注し、３〜７％
CO2インキユベーター中、35〜40℃で10〜30時間
培養する。培養プレートに半容量／穴のHAT培
地〔正常培地にヒポキサンチン（10-5〜10-3M）、
チミジン（10-6〜10-4M）およびアミノプテリン
（10-8〜10-7M）を加えた培地〕を加え、さらに
10〜30時間培養する。以後１〜３日間10〜30時間
目ごとに、培養上清半容量を捨て、新たに同量の
HAT培地を加え、CO2インキユベーター中、35
〜40℃で10〜14日間培養する。
コロニー状に生育してきた融合細胞の認められ
る穴について、上清半容量を捨て、HT培地
（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）
を同量加え、以後１〜３日間10〜30時間目ごとに
HT培地への変換を行う。
る穴について、上清半容量を捨て、HT培地
（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）
を同量加え、以後１〜３日間10〜30時間目ごとに
HT培地への変換を行う。
HT培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部
をとり上記の酵素免疫測定法により、抗異常グリ
コーゲン抗体価を測定する。
をとり上記の酵素免疫測定法により、抗異常グリ
コーゲン抗体価を測定する。
抗体価の認められた穴について、限界希釈法に
よりクローニングを２〜４回繰り返し、安定して
抗体価の認められたものを、抗異常グリコーゲン
単クローン性抗体産生ハイブリドーマ株として選
択する。
よりクローニングを２〜４回繰り返し、安定して
抗体価の認められたものを、抗異常グリコーゲン
単クローン性抗体産生ハイブリドーマ株として選
択する。
(4) 単クローン性抗体の調製
プリスタン（２，６，10，14−テトラメチルペ
ンタデカン）処理した８〜10週令BALB／ｃ系
マウスに(3)で得られた抗異常グリコーゲン単クロ
ーン性抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４×
105〜7個／匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイ
ブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水
を採取し、遠心分離して固形分を除去後、50％硫
安、40％硫安塩析し、PBS（PH7.2）で１〜２日間
透析する。この透析画分を粗精製単クローン性抗
体として精製、定量用に供することができる。
ンタデカン）処理した８〜10週令BALB／ｃ系
マウスに(3)で得られた抗異常グリコーゲン単クロ
ーン性抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４×
105〜7個／匹を腹腔内注射する。10〜21日でハイ
ブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水
を採取し、遠心分離して固形分を除去後、50％硫
安、40％硫安塩析し、PBS（PH7.2）で１〜２日間
透析する。この透析画分を粗精製単クローン性抗
体として精製、定量用に供することができる。
さらに精製が必要な場合には、DEAE−セフア
ロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはセ
フアクリルＳ−300カラムなどに通塔し、活性画
分（IgG、IgMあるいはIgA画分）を集める。
ロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはセ
フアクリルＳ−300カラムなどに通塔し、活性画
分（IgG、IgMあるいはIgA画分）を集める。
抗体のイソタイプ、サブクラスの決定は
Ouchterlony法（免疫学実験入門、生物化学実験
法15、学会出版センター刊、p.74，1981年）によ
つて行う。
Ouchterlony法（免疫学実験入門、生物化学実験
法15、学会出版センター刊、p.74，1981年）によ
つて行う。
蛋白量の定量は、フオーリン法および280nmの
吸光度より算出する。
吸光度より算出する。
本発明の単クローン性抗体を生産するハイブリ
ドーマ細胞株KM−279は英国 European
Collection of Animal Cell Culture（ECACC）
に1986年７月３日付でECACC No.86070304とし
て寄託してある。
ドーマ細胞株KM−279は英国 European
Collection of Animal Cell Culture（ECACC）
に1986年７月３日付でECACC No.86070304とし
て寄託してある。
実施例 １
(1) 免疫マウス脾細胞の調製
８週令のBALB／ｃ雌マウス（静岡県実験動
物農業協同組合）にアジユバンドとして水酸化ア
ルミニウムゲル２mg／匹および百日咳菌死菌ワク
チン（千葉県血清研究所）１×109細胞／匹と抗
原としてラフオーラ病患者心筋ホモジネートある
いはそれから抽出した異常グリコーゲン100μ
ｇ／匹を腹腔内投与し免疫した。
物農業協同組合）にアジユバンドとして水酸化ア
ルミニウムゲル２mg／匹および百日咳菌死菌ワク
チン（千葉県血清研究所）１×109細胞／匹と抗
原としてラフオーラ病患者心筋ホモジネートある
いはそれから抽出した異常グリコーゲン100μ
ｇ／匹を腹腔内投与し免疫した。
以後、１ないし２週間おきに、ラフオーラ病患
者心筋ホモジネートあるいはそれから抽出した異
常グリコーゲン100μｇ／匹を腹腔内に投与し、
２回目以降の免疫をかけた。３回目の免疫以降、
免疫の５〜７日後に眼底静脈叢より採血し、血清
中の抗−異常グリコーゲン抗体価を固相法による
酵素免疫測定法で調べた。血清中の異常グリコー
ゲンに対する抗体価が正常マウス血清の103倍以
上のマウスに、更に異常グリコーゲン100μｇ／
mlを腹腔内投与して追加免疫し、３日後このマウ
スから脾細胞を調製して細胞融合に用いた。
者心筋ホモジネートあるいはそれから抽出した異
常グリコーゲン100μｇ／匹を腹腔内に投与し、
２回目以降の免疫をかけた。３回目の免疫以降、
免疫の５〜７日後に眼底静脈叢より採血し、血清
中の抗−異常グリコーゲン抗体価を固相法による
酵素免疫測定法で調べた。血清中の異常グリコー
ゲンに対する抗体価が正常マウス血清の103倍以
上のマウスに、更に異常グリコーゲン100μｇ／
mlを腹腔内投与して追加免疫し、３日後このマウ
スから脾細胞を調製して細胞融合に用いた。
(2) マウス骨随腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨随腫細胞P3−
U1を正常培地〔RPMI−1640にグルタミン
1.5mM、２−メルカプトエタノール５×10-5M、
ジエンタマイシン10μｇ／mlおよび牛胎児血清0.1
ml／mlを加えた培地〕に培養（37℃、CO25％通
気）し、４日後に２×107以上の細胞を得る。
U1を正常培地〔RPMI−1640にグルタミン
1.5mM、２−メルカプトエタノール５×10-5M、
ジエンタマイシン10μｇ／mlおよび牛胎児血清0.1
ml／mlを加えた培地〕に培養（37℃、CO25％通
気）し、４日後に２×107以上の細胞を得る。
(3) ハイブリドーマの作製
MEM（日水製薬社製）でよく洗浄した免疫マ
ウス脾細胞１×108個とマウス骨随腫細胞２×107
個とを混合し、1200rpmで５分間遠心分離にかけ
る。
ウス脾細胞１×108個とマウス骨随腫細胞２×107
個とを混合し、1200rpmで５分間遠心分離にかけ
る。
沈澱として得られた脾細胞とP3−U1の混合し
た細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら37℃、
ポリエチレングリコール−1000（PEG−1000）２
ｇ、MEM培地２mlおよびDMSO0.7mlの混液0.5
mlを加え、１分後にMEM1mlを加えた。その後
MEM1mlを１分毎に５回加えた後、MEMを全容
量が50mlとなるよう加える。900rpmで遠心分離
後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、
HAT培地〔上記正常培地にヒポキサンチン
10-4M、チミジン1.5×10-5M、およびアミノプ
テリン４×10-7Mを加えた培地〕100mlを加え、
10mlメスピペツトでゆるやかに細胞を懸濁する。
た細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら37℃、
ポリエチレングリコール−1000（PEG−1000）２
ｇ、MEM培地２mlおよびDMSO0.7mlの混液0.5
mlを加え、１分後にMEM1mlを加えた。その後
MEM1mlを１分毎に５回加えた後、MEMを全容
量が50mlとなるよう加える。900rpmで遠心分離
後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、
HAT培地〔上記正常培地にヒポキサンチン
10-4M、チミジン1.5×10-5M、およびアミノプ
テリン４×10-7Mを加えた培地〕100mlを加え、
10mlメスピペツトでゆるやかに細胞を懸濁する。
懸濁液を96穴培養用プレート〔falcon，ベクト
ン・デイツキンソン社製〕に200μｇ／穴ずつ分
注し、５％CO2インキユベーター中37℃で、10〜
14日間培養する。
ン・デイツキンソン社製〕に200μｇ／穴ずつ分
注し、５％CO2インキユベーター中37℃で、10〜
14日間培養する。
コロニー状に成育してきた融合細胞のみられる
穴について、上清100μを捨て、HT培地〔上記
HAT培地よりアミノプテリンを除いた培地〕を
100μ加え、37℃で培養する。以後２日間同様
にHT培地への交換を行い、培養を続け４日後、
培養上清の一部を採取し、抗異常グリコーゲン抗
体価を上記の固相酵素免疫測定法により測定す
る。
穴について、上清100μを捨て、HT培地〔上記
HAT培地よりアミノプテリンを除いた培地〕を
100μ加え、37℃で培養する。以後２日間同様
にHT培地への交換を行い、培養を続け４日後、
培養上清の一部を採取し、抗異常グリコーゲン抗
体価を上記の固相酵素免疫測定法により測定す
る。
抗体価の認められた穴については、限界希釈法
によりクローニングを２回繰り返し、安定して抗
体価の認められたクローンを抗異常グリコーゲン
単クローン性抗体産生ハイブリドーマ株として、
KM−279を選択する。
によりクローニングを２回繰り返し、安定して抗
体価の認められたクローンを抗異常グリコーゲン
単クローン性抗体産生ハイブリドーマ株として、
KM−279を選択する。
(4) 単クローン性抗体の精製
プリスタン処理〔２，６，10，14−テトラメチ
ルペンタデカン0.5ml／匹を腹腔内投与し、１〜
２週間飼育する。〕した８週令ヌードマウス
（BALB／ｃ nu-／nu-）雌マウスに上記で得ら
れたハイブリドーマ株各４×106細胞／匹を腹腔
内注射する。10〜21日後にハイブリドーマ株は腹
水癌化する。10〜21日後に腹水のたまつたマウス
から腹水（４〜10ml／匹）を採取し、遠心分離し
て固形分を除去した。上清を50％硫安塩析、40％
硫安塩析し、PBS（PH7.2）で２日間透析する。こ
れを粗精製単クローン性抗体とする。粗精製単ク
ローン性抗体をDEAE−セフアロースカラムに通
塔後、溶出し、IgG画分を集め、精製単クローン
性抗体とする。
ルペンタデカン0.5ml／匹を腹腔内投与し、１〜
２週間飼育する。〕した８週令ヌードマウス
（BALB／ｃ nu-／nu-）雌マウスに上記で得ら
れたハイブリドーマ株各４×106細胞／匹を腹腔
内注射する。10〜21日後にハイブリドーマ株は腹
水癌化する。10〜21日後に腹水のたまつたマウス
から腹水（４〜10ml／匹）を採取し、遠心分離し
て固形分を除去した。上清を50％硫安塩析、40％
硫安塩析し、PBS（PH7.2）で２日間透析する。こ
れを粗精製単クローン性抗体とする。粗精製単ク
ローン性抗体をDEAE−セフアロースカラムに通
塔後、溶出し、IgG画分を集め、精製単クローン
性抗体とする。
ラフオーラ病、糖原病型の病理診断は通常の
免疫組織学的手法により行うことができる。具体
例は実施例２に示す。
免疫組織学的手法により行うことができる。具体
例は実施例２に示す。
(5) 単クローン性抗体の抗原特異性
固相酵素免疫測定法により、精製単クローン性
抗体の特異性を検討した。抗原としては、ラフオ
ーラ病心筋由来異常グリコーゲン（参考例１）、
正常グリコーゲン（半井化学社製）、牛血清アル
ブミン（シグマ社製）を用いた。
抗体の特異性を検討した。抗原としては、ラフオ
ーラ病心筋由来異常グリコーゲン（参考例１）、
正常グリコーゲン（半井化学社製）、牛血清アル
ブミン（シグマ社製）を用いた。
その結果を第１表に示した。
第１表 KM−279の反応特異性 抗 原 反応性OD415on
異常グリコーゲン 0.990
抗体グリコーゲン 0.007牛血清アルブミン 0.008
実施例 ２
ミクロトームで5μmにスライスしたラフオーラ
病あるいは糖原病型患者由来の心筋や皮膚のホ
ルマリン固定パラフイン包埋組織切片を、卵白ア
ルブミンでコートしたスライドグラスに固定し、
キシレンで脱パラフイン後、アルコール−水で段
階的に親水化した。レジン水で５分間すすぎ、
0.3％H2O2を含むメタノール中で室温30分間静置
し、内因性ペルオキシダーゼをブロツクした。次
に切片を20分間PBSで洗浄後、希釈したウマ正
常血清中で室温20分間静置した。切片から過剰の
血清を吸い取り、第１抗体（抗−異常グリコーゲ
ン単クローン性抗体KM−297、20μｇ／ml）と30
分間反応させた。洗浄後、希釈ビオチン化抗体
（ビオチン化ウサギ抗IgG抗体）を30分間反応さ
せ、さらに洗浄後、アビジン−ビオチン−ペルオ
キシダーゼ複合体（ベクター社製）を30分間反応
させた。よく洗浄後、ペルオキシダーゼ基質
〔0.02％H2O2を含む0.1Mトリス−塩酸バツフアー
（PH7.2）で調製した0.1％ジアミノベンジジンテ
トラヒドロクロライド（diaminobenziidine
tetrahydrochloride）〕を２分間反応させ、氷冷
中で反応を停止した。ヘマトキシレン染色後、ア
ルコール−水およびキシレンで脱水後、カナダバ
ルサムで固定し、検鏡した。
病あるいは糖原病型患者由来の心筋や皮膚のホ
ルマリン固定パラフイン包埋組織切片を、卵白ア
ルブミンでコートしたスライドグラスに固定し、
キシレンで脱パラフイン後、アルコール−水で段
階的に親水化した。レジン水で５分間すすぎ、
0.3％H2O2を含むメタノール中で室温30分間静置
し、内因性ペルオキシダーゼをブロツクした。次
に切片を20分間PBSで洗浄後、希釈したウマ正
常血清中で室温20分間静置した。切片から過剰の
血清を吸い取り、第１抗体（抗−異常グリコーゲ
ン単クローン性抗体KM−297、20μｇ／ml）と30
分間反応させた。洗浄後、希釈ビオチン化抗体
（ビオチン化ウサギ抗IgG抗体）を30分間反応さ
せ、さらに洗浄後、アビジン−ビオチン−ペルオ
キシダーゼ複合体（ベクター社製）を30分間反応
させた。よく洗浄後、ペルオキシダーゼ基質
〔0.02％H2O2を含む0.1Mトリス−塩酸バツフアー
（PH7.2）で調製した0.1％ジアミノベンジジンテ
トラヒドロクロライド（diaminobenziidine
tetrahydrochloride）〕を２分間反応させ、氷冷
中で反応を停止した。ヘマトキシレン染色後、ア
ルコール−水およびキシレンで脱水後、カナダバ
ルサムで固定し、検鏡した。
その結果、ラフオーラ病、糖原病型患者由来
の心筋や皮膚では、広汎に、異常グリコーゲンの
沈着像（ラフオーラ小体）が観察された。
の心筋や皮膚では、広汎に、異常グリコーゲンの
沈着像（ラフオーラ小体）が観察された。
一方、健常人の心筋や皮膚切片は、同様の処理
をほどこしても、全く染色像は認められなかつ
た。
をほどこしても、全く染色像は認められなかつ
た。
参考例 １
ラフオーラ病患者由来の心筋５〜10ｇを細切
し、最終濃度が10％になるように20％トリクロル
酢酸溶液を加えながらすりつぶしてから、ホモゲ
ナイザーで均質化する。ホモジネートを3000rpm
で10分間遠心分離し、その上清をとり、２倍量の
99.5％エタノールおよび1/30容量の飽和塩化カリ
ウム液を加えてよく撹拌する。
し、最終濃度が10％になるように20％トリクロル
酢酸溶液を加えながらすりつぶしてから、ホモゲ
ナイザーで均質化する。ホモジネートを3000rpm
で10分間遠心分離し、その上清をとり、２倍量の
99.5％エタノールおよび1/30容量の飽和塩化カリ
ウム液を加えてよく撹拌する。
再び3000rpmで10分間遠心分離し、沈澱画分を
とる。この沈澱画分をレジン水に溶解する。エタ
ノール、飽和塩化カリウムによる沈澱操作を３回
くり返したものを、異常グリコーゲンとして用い
た。
とる。この沈澱画分をレジン水に溶解する。エタ
ノール、飽和塩化カリウムによる沈澱操作を３回
くり返したものを、異常グリコーゲンとして用い
た。
発明の効果
本発明によれば、ラフオーラ病または糖原病
型の検出に有用な単クローン性抗体が提供され
る。
型の検出に有用な単クローン性抗体が提供され
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ラフオーラ小体に反応する単クローン性抗
体。 ２ IgCクラスに属する特許請求の範囲第１項記
載の単クローン性抗体。 ３ ラフオーラ病患者の心筋ホモジネートまたは
それから抽出したラフオーラ小体で哺乳動物を免
疫し、該免疫動物の脾細胞と哺乳動物の骨随腫細
胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞株
からラフオーラ小体に反応するハイブリドーマ細
胞株を選び、該細胞株を培地に培養するか、哺乳
動物の腹腔に投与して腹水化し、培養物または腹
水中にラフオーラ小体に反応する単クローン性抗
体を蓄積させ、該培養物または腹水から該単クロ
ーン性抗体を採取することによつて得られる特許
請求の範囲第１項記載の単クローン性抗体。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61163414A JPS6319562A (ja) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | 抗ラフオ−ラ小体単クロ−ン性抗体 |
| CA000541610A CA1294905C (en) | 1986-07-11 | 1987-07-08 | Anti-lafora body monoclonal antibody |
| DE87306182T DE3787416T2 (de) | 1986-07-11 | 1987-07-13 | Monoklonaler Antikörper gegen Laforakörper. |
| US07/072,293 US4962032A (en) | 1986-07-11 | 1987-07-13 | Anti-lafora body monoclonal antibody |
| EP87306182A EP0252768B1 (en) | 1986-07-11 | 1987-07-13 | Anti-lafora body monoclonal antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61163414A JPS6319562A (ja) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | 抗ラフオ−ラ小体単クロ−ン性抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6319562A JPS6319562A (ja) | 1988-01-27 |
| JPH0570435B2 true JPH0570435B2 (ja) | 1993-10-05 |
Family
ID=15773441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61163414A Granted JPS6319562A (ja) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | 抗ラフオ−ラ小体単クロ−ン性抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4962032A (ja) |
| EP (1) | EP0252768B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6319562A (ja) |
| CA (1) | CA1294905C (ja) |
| DE (1) | DE3787416T2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7129049B2 (en) * | 2003-12-22 | 2006-10-31 | Regents Of The University Of Minnesota | Method of detecting equine glycogen storage disease IV |
| AU2017286811A1 (en) | 2016-06-17 | 2018-11-22 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of gys1 expression |
-
1986
- 1986-07-11 JP JP61163414A patent/JPS6319562A/ja active Granted
-
1987
- 1987-07-08 CA CA000541610A patent/CA1294905C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-13 EP EP87306182A patent/EP0252768B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-13 DE DE87306182T patent/DE3787416T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-07-13 US US07/072,293 patent/US4962032A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6319562A (ja) | 1988-01-27 |
| US4962032A (en) | 1990-10-09 |
| DE3787416D1 (de) | 1993-10-21 |
| EP0252768A3 (en) | 1989-08-23 |
| CA1294905C (en) | 1992-01-28 |
| EP0252768A2 (en) | 1988-01-13 |
| DE3787416T2 (de) | 1994-03-17 |
| EP0252768B1 (en) | 1993-09-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |