JPH066067B2 - モノクロナ−ル抗体およびその製造方法 - Google Patents

モノクロナ−ル抗体およびその製造方法

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JPH066067B2
JPH066067B2 JP57188085A JP18808582A JPH066067B2 JP H066067 B2 JPH066067 B2 JP H066067B2 JP 57188085 A JP57188085 A JP 57188085A JP 18808582 A JP18808582 A JP 18808582A JP H066067 B2 JPH066067 B2 JP H066067B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はモノクローナル抗体およびその製造方法に関す
る。
抗体は医学診断上、例えば血液型の判定、および生物学
的実験において長期にわたり使用されている。一方、抗
体のもつ複雑性と多様性とから単一抗体を得ることが難
しく、この結果抗体の有用性が限定されている。抗体は
複合蛋白質あるいは蛋白質が主となる分子であり、それ
は動物を異物から防御する免疫機構により産生される。
医学的使用目的をもった抗体は通常、動物の免疫機構を
刺激するような異物を動物に注入した後、末梢血清また
は腹水から抗体分画を分離して得る。ここで得た分画は
注入した異物に対する特異抗体ばかりでなく該動物によ
って産生された様々な他の抗体も含有することになる
が、公知の手段によって特異抗体も分離することはおお
むね可能でありうる。しかしながら、特定の異物に対す
る抗体が分離しえたとしても該抗体は、実際、異物やそ
の関連物質の種々の抗原決定基と反応しうる数種の抗体
の混合物である。したがってある種の抗体分子は特異性
が高く、いくつかの各抗体分子は特定の異物のみまたは
その一部のみを認識しうるほど特異性が高いが、その一
方で、他の抗体分子は選択性が欠如し目的とする異物の
みならず他の異物をも認識してしまう。全ての関連する
抗体を分離することが通例において事実上不可能である
ことより、たとえ最大の注意をもってして精製した抗体
分画でも２つ以上の物質と反応しうる。
ここ数年来、均一かつ高い特異性を有する抗体産生を可
能とするモノクローナル抗体の産生技術が開発されてい
る。Kohler，Ｇ．およびMilsteinＣ：（１９７５年）
Nature ２５６巻４９５−４９７頁。一般に上記抗体は
蛋白分画または他の異物をもって動物を免疫し、該動物
より抗体産生細胞を得る。この抗体産生細胞と骨髄腫細
胞株、例えば腫瘍細胞と細胞融合させて混成細胞を形成
させ、単離しモノクローンとして培養することで得る。
ここで得たモノクローン性混成細胞は、生体外で培養す
ることも、宿主動物内で腫瘍として生育することも可能
である。各抗体産生細胞は均一かつ独特の抗体を産生す
るので、モノクローンとしての混成細胞の培養は均一の
抗体を産生し、しかもこの抗体は生体外で混成細胞を培
養して得た培養液、或は腫瘍を有する宿主動物の細胞、
血清や腹水より調製しうる。
抗体産生細胞と腫瘍細胞との融合による混成細胞クロー
ンの全てが、期待する異物或は抗原（抗体と反応する物
質）に対し特異的であるとは限らない。何故なら混成細
胞の多くは、接種された動物が産生した他の異物と反応
しうる抗体をそのまま産生しうるからである。異る細胞
が産生する抗体は同一分子の異る抗原決定基と反応しう
ることから、目的とする抗原に対する抗体でさえも由来
するクローン間で異っているといえる。それ故、各クロ
ーンにおいて生じる抗体或は抗体含有培養液、血清、腹
水などを得て、さらに標的抗原との反応性や、もし認め
られるなら他物質との反応性から、そのものの特異性を
試験する必要があるといえる。各クローン由来の抗体を
特徴づける必要性はモノクローナル抗体産生における複
雑性を増加させるが、多様な均一抗体が得られれば、こ
れらは研究者にとって体細胞の構造と発育を実測するう
えで極めて適確な手段をもたらすといえる。
均一かつ特異性の高いモノクローナル抗体を利用できる
ことは、診断、試験、治療手段としての抗体の価値を顕
著に増加させる。腫瘍およびウイルス検出に対するモノ
クローナル抗体の使用は、米国特許第4,172,124号およ
び同第4,196,265号明細書にすでに開示されている。
モノクローナル抗体は、細胞が身体の種々な組織を形成
する異った体細胞種へと分化する経路と過程を研究する
のに特に適している。細胞分化は複雑なテーマであり、
さらに該過程の知識は、その途についたばかりである。
特定の細胞種に特異的であり、かつ数種のモノクローナ
ル抗体により認識されうる蛋白質類は、細胞発育と分化
の研究に対し的確な指標として役立つ。特定の蛋白質に
対し特異性を有すモノクローナル抗体は、細胞内での公
知の蛋白質の存在の認識のみならず今日まで未知の物質
の発見に利用されうる。理論的には、種々の蛋白質等の
完全な局在性を明確にするべく身体内の全高分子に対し
てのモノクローナル抗体の入手が最終的には可能であり
うる。
細胞分化の分野での主題は、活発に増殖する幹細胞に由
来し、成熟細胞型で非増殖性の細胞の研究にある。該細
胞の多くの例は、末梢血中に見い出しうる。骨髄中で赤
血球細胞および白血球は、幹細胞より発生し、さらに両
者は、通常血流中では、成熟細胞であり非増殖性であ
る。体細胞の誤分化から、骨髄腫および白血病等の血球
がかかわるガンを含むガンが発生しうるが、モノクロー
ナル抗体は、該細胞中に存在する蛋白質を決定し、ガン
の分化と派生をより詳細に追求するのに有用である。本
発明の第一目的は、ヒトトランスフェリンレセプター
（受容体）と結合しトランスフェリンの細胞への結合を
阻止しかつ細胞の増殖能を妨ぐモノクローナル抗体を産
生する混成細胞の調製と培養にあり、長期目標として
は、該抗体を生体内で、増殖性疾病の細胞増殖の制御特
にはガンの治療に使用することにある。
ヒトトランスフェリンに特異性を有するモノクローナル
抗体を調製する。マウスにヒトトランスフェリンレセプ
ター糖蛋白質を接種後、脾臓細胞かリンパ節細胞を該マ
ウスより調製し、これをマウス腫瘍細胞と融合させる。
融合細胞の単一培養を起し、その後モノクローンより調
製した抗体につき所望する性状を有する抗体の産生能を
もつ単一培養を選択すべく、ヒトトランスフェリンレセ
プターとの反応性、およびトランスフェリン結合の阻止
能が試験される。このモノクローナル抗体は、ヒトの細
胞、特にはガン細胞の消滅あるいは増殖の制御に有用で
ある。
分裂細胞特には増殖性腫瘍細胞の表面に見い出されるヒ
トトランスフェリンレセプターに特異性を有するモノク
ローナル抗体を調製する。トランスフェリンレセプター
糖蛋白質は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
の移動度から算出した単量体の分子量約95,000を有し通
常ジスルフィド結合を介した二量体で存在するものとし
て特徴づけられる。Omaryら、（１９８０年）Nature２
８６巻８８１−８９１頁；Juddら、（１９８０年）J.Ex
p.Med.１５２巻１４３０−１４３５頁；Trowbridgeおよ
びOmary.（１９８１年）Proc.Nat,Acad.Sci.U.S.A.７８
巻３０３９−３０４３頁；Sutherlandら（１９８１年）
Proc.Nat,Acad.Sci.U.S.A.７８巻４５１５−４５１９
頁。
増血細胞表面に存在する糖蛋白質と反応する抗体を産生
する目的で精製ヒトトランスフェリンレセプター糖蛋白
質を動物に接種する。精製レセプターが好ましいが、ヒ
トトランスフェリンレセプター糖蛋白質あるいは、無傷
ヒト細胞を含む交叉反応物質を含有するいかなる免疫原
もまた代用として使用されうる。接種の為に選択する動
物は特に重要ではないが、動物の系統は良く判明してい
るネズミ科、すなわちラット、マウスその他の使用が好
ましい。さらには、種々のネズミ科動物由来の腫瘍細胞
もまた良く特徴づけられた培養系として有効である。し
かるにマウスを本特許明細書で論述する抗体産生動物に
選択した。しかしながら、本発明は、ネズミ科動物から
獲得した抗体に限定されるものでないことを理解すべき
である。
BALB/CマウスにTrowbridgeおよびOmaryが先１９８１年
に開示した如くにCCRF-CEM細胞から分離し完全フロイン
ト補助液（完全フロイントアジュバント）と混合された
精製ヒトトランスフェリンレセプター５０μｇを皮下注
射にて接種する、さらに６週間後該マウスは、生理食塩
水に溶解した少なくとも５０μｇの精製レセプターの静
脈内投与による増強法による接種を受ける。第二次接種
の４日後、死亡させた動物より脾臓を摘出する。脾臓細
胞の懸濁液を調製しさらに得られた細胞懸濁液を無蛋白
質のダルベコ変法イーグル培地を用いて２回、８００×
ｇにおける遠心分離操作で洗浄する。
脾臓より得た抗体産生細胞は、単独にては複製すること
がなく、培養不可能であるから、生体内外において単独
に培養可能な細胞と融合させる。この操作で得た混成細
胞の遺伝的および代謝過程は各々の親細胞の特徴を有し
ており、さらに混成細胞のあるものは単独に複製する能
力および抗体産生親細胞の特徴をもちうる。ある種の腫
瘍細胞、特に骨髄腫細胞は、抗体産生培養系と好都合に
融合しうる。この場合、腫瘍細胞並びに抗体産生細胞
は、起源細胞の遺伝的、生化学的性質が適合した生育可
能な混成細胞を産生する可能性を高める為に同一動物由
来である必然性はないが同一であることが望ましいとい
える。多くの骨髄腫細胞が、特徴づけられており、本特
許明細書では、マウス由来、抗体非産生の骨髄腫細胞系
であるＳ１９４５．ＸＸＯ．ＢＵ．1(Trowbridge,J,Ex
p.Med.１４８巻，３１３−３２３（１９７８年）を混成
細胞の調製に用いる。なお本細胞系のサンプルがSalk研
究所細胞配布センターに寄託されている。ここで使用し
うる他の腫瘍細胞系は、たとえばＰ３，Ｙ３，ＳＰ２／
Ｏ，ＭＰＣ−１１およびその誘導系だが、これに限定さ
れることなく他の腫瘍細胞系も含まれることも了解すべ
きである。抗体を産生しえない骨髄腫系を選択すること
は、生じた混成細胞が脾臓或は、リンパ節細胞起源の抗
体鎖を産生するのみでありうるため有利であるといえ
る。このことは、副反応を起しうる無関係な抗体産生の
惹起を抑えるべきところで、抗体を治療目的例えば細胞
増殖の制御に使用する場合に特に重要なことである。
骨髄腫細胞は１０％マウス血清を補充したダルベコ変法
イーグル培地で維持する。１０7個の骨髄腫細胞および
ヒトトランスフェリンレセプターで免疫したマウス由来
の１０8個の細胞を融合させるべくポリエチレングリコ
ール１５００の４５％（Ｖ／Ｖ）溶液に再懸濁する。こ
のときの手法は、前述のTrowbridge（１９８７年）のも
のに従う。混成した細胞は、ハイポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン（ＨＡＴ）培養液中で淘汰させる。
このときの全生育細胞がマウス脾臓由来細胞と骨髄腫細
胞との混成の成功を示唆し、さらには、マウスに接種す
るために使用した精製トランスフェリンレセプターを単
離したCCRF-CEM細胞に対する抗体産生の有無は、Willia
msらがCells１２巻６６３頁（１９７７年）で記述した
抗体結合分析法によって試験する。混成細胞はFalconミ
クロプレート中で限界希釈法によりクローン化するる。
クローン化した混成細胞は、CottonらがEur.J.Immunol.
３巻１３６頁（１９７３年）で記述した如くに公知の組
織培養法によって生体外で生育しうる。また別法とし
て、その細胞は、生体内では組織適合動物或は無胸腺の
ヌードマウス体内において腫瘍として生育させうる。産
生された抗体は、例えばGerhardらがProc.Natl,Acad.Sc
i.７５巻１５１０−１５１４頁（１９７８年）で記述し
た公知の手段を用いて生体外培養液や動物血清或は、腹
水から回収しうる。ある場合には、培養細胞或は腫瘍細
胞から直接的に抗体を得ることが有利でありうる。
各クローン由来の抗体のCCRF-CEMに対する特異性は前記
Williamsの手法によって試験され、さらにCCRF-CEM細胞
に特異抗体を産生するクローンが選択される。その後CC
RF-CEM細胞結合性の抗体について、ペルオキシダーゼ法
によって前もって125Ｉで表面を標識したCCRF-CEM細胞
のNonidetＰ−４０による分解物からヒトトランスフェ
リンを沈降させるか否かの判定によりレセプターとの反
応性が試験される。ここでの方法はTrowbridgeおよびOm
ary（１９８１）により前記したものに従いかつ標準的
手法である。その後、抗体がトランスフェリンの結合を
阻止するか否かを以下の方法にて試験される。CCRF-CEM
細胞（５×１０5個）をモノクローナル抗体を含有する
５０μの組織培養液上清と４℃にて４５分間インキュ
ベーションする。細胞は、その後未結合の抗体を除去す
べく３回遠心分離される。その後洗浄された細胞は、0.
15Ｍ塩化ナトリウムを含有する100μの0.01Ｍリン酸
緩衝液(PH7.2)中の125Ｉ−標識トランスフェリン（比放
射能１μCi／μｇを有する標識トランスフェリン約１×
１０6cpm）と４℃にて４５分間インキュベーションされ
る。その後、細胞は３度洗浄され、さらに抗体とインキ
ュベートした細胞へ結合した放射能を抗体を含有しない
組織培養液とインキュベートした対照の細胞のそれと比
較される。本分析法にて細胞へ結合した125１−標識ト
ランスフェリンの減少量に基づき、トランスフェリン結
合阻止能を有するモノクローナル抗体が選択される。
有用な混成細胞クローンが調製されたならば該細胞系を
もはや抗体を産生しない種々の細胞から過成長を回避す
べく再クローン化することが通常好都合である。該混成
細胞は、各親細胞の遺伝物質を全てではないが相当量含
有していることから、該混成細胞の全特徴は公知ではな
い。混成細胞クローンでは本来の遺伝的欠乏或はその後
の染色体の欠損のため、しばしば数代の継代培養後に
は、複製能或は特異抗体の産生能を失いうる。したがっ
て、初代混成直後に、目的の混成細胞クローンは、抗体
産生混成細胞の機能系の有効性を確保すべく再クローン
化されることが重要である。４２／６と同定された細胞
系培養並びにその誘導系はトランスフェリンの結合を阻
止しトランスフェリンレセプター糖蛋白質に特異性を有
するモノクローナル抗体を産生する。該４２／６細胞系
は、１２３０１パークロウンドライブ、ロックビル，メ
リーランド州２０８５２の米国組織培養コレクション(A
TCC)において寄託されかつ受入番号ＨＢ−８０９４が付
与されている。
MorrisらがEur.J.Inmunol.５巻．２７４−２８１頁（１
９７４年）で記述した方法に従った微量抗体結合分析
は、４２／６モノクローナル抗体のヒトCCRF-CEM白血病
細胞との全般的な反応性を証明する。前述した免疫沈澱
研究および阻止分析は、４２／６モノクローナル抗体が
ヒトトランスフェリンレセプターと反応しさらにトラン
スフェリンの結合を阻止することを証明する。
以下の２つの実施例は、４２／６モノクローナル抗体が
CCRF-CEM細胞上のトランスフェリンレセプターへのトラ
ンスフェリンの結合を阻止し、さらには本抗体が例えば
生体外においてこれら腫瘍細胞の増殖を制御しうること
を証明する。
実施例１ CCRF-CEM細胞は、0.01Ｍリン酸緩衝液(PBS)pH7.2で緩衝
化された0.15Ｍ塩化ナトリウム中で洗浄される。各サン
プルが５０μの溶液中５×１０5細胞を含むようＰＢ
Ｓに再懸濁され、さらに１０％の馬血清を補充され種々
の希釈度の４２／６モノクローナル抗体を含有する５０
μのダルベコ変法イーグル培地が添加される。対照群
としては、細胞をＰＢＳのみあるいは１５μｇの未標識
トランスフェリンを含有するＰＢＳに懸濁する。全サン
プルは４℃で４５分間インキュベーションされる。その
後遠心分離にて集められた細胞は、１５mMNaNおよび0.1
％牛血清アルブミンを含むＰＢＳで３度洗浄される。洗
浄された該細胞は１００μの１：２００に希釈された
125１−標識ヒトトランスフェリン（４００μｇ／ｍ
；１μCi／μｇ）のＰＢＳ液と４℃に４５分間インキ
ュベーションされる、その後３回以上洗浄され、結合放
射能はガンマー計数管にて計数される。結果を表Ｉに示
す。
未標識トランスフェリンとインキュベーションした細胞
での対照実験系は、先だったトランスフェリン結合部位
の占有が後から結合するトランスフェリン量を減少させ
ることを示現する。種々の４２／６モノクローナル抗体
とインキュベーションした細胞での試験系では、抗体が
あたかもトランスフェリンの如くにトランスフェリン結
合部位への接近を妨害することで後から結合しうるトラ
ンスフェリン量を減少させることを示現する。
実施例２ ヒトＴ白血病細胞系CCRF-CEMは、１ｍ当りで、２×１
０4の細胞を含むべく１０％馬血清を補充されたRPMI 16
40組織培養液に調製される。全培養液は種々の４２／６
モノクローナル抗体量を含有するダルベゴ変法イーグル
培地で５０％にされる。細胞増殖は、Coulter計数装置
によりそれぞれ２つの培養シャーレについて細胞数を計
数して監視する。結果は以下の第IIに要約する。
上記結果は、４２／６モノクローナル抗体がトランスフ
ェリンレセプター糖蛋白質を保持する細胞の成長を十分
に抑制することを証明する。実施例１の結果をかんがみ
るに、モノクローナル抗体による細胞の増殖抑制はトラ
ンスフェリンレセプター部位の閉塞によるといえる。
抗体処理した細胞の細胞周期をCrossmanおよびTobeyが
（１９７４年）Science １８４巻，１２９７−１２９
８頁に記述したミトラマイシン染色法により分析する
と、高濃度の抗体で処理された細胞は細胞周期のＳ期に
集積されていることが示されることから抗体が細胞のＤ
ＮＡ合成能を妨害することを示唆している。
ヒトトランスフェリンレセプターがある種ガン性腫瘍で
発現していることから、４２／６抗体を種々のガンの診
断法に応用しうる。トランスフェリンレセプターは、末
梢血管細胞においては通常発現されないことから、ラジ
オイムノアッセイ法による分析結果として血流中にトラ
ンスフェリンレセプター糖蛋白質含有細胞の存在は、ガ
ン細胞の存在を指示するといえる。モノクローナル抗体
の特異性の高さ故に、ガンが従来の手法で検出される以
前に特定のガン細胞は、放射能で標識された抗体と複合
体を形成したラジオオートグラフィーにより検出されう
る。抗トランスフェリンレセプター抗体を使用した免疫
螢光法は、腫瘍生検においてガン細胞の起源および型の
決定に有用である。125１で標識したトランスフェリン
レセプター糖蛋白質特異的モノクローナル抗体は、Levi
neらがScierce２０６巻８４６頁（１９７９年）で記述
したごとくＸ線イメージングにより転移を検出するのに
使用されうる。
抗トランスフェリンレセプターモノクローナル抗体の治
療への応用には、ある種の抗体が補体を介する溶解作用
により腫瘍細胞を破壊する目的で使用される通常の免疫
療法およびメソトレキセートあるいはリチン毒素のよう
な細胞毒をモノクローナル抗体で搬送し腫瘍細胞を破壊
する免疫療法が含まれる（例えば、TrowbridgeおよびDo
mingo（１９８１年）Nature印刷中）。特には、トラン
スフェリンのレセプターへの結合を妨げるモノクローナ
ル抗体は、細胞の鉄分を欠乏させるか、あるいは、他の
制御機構によってヒト腫瘍細胞の増殖を妨げるべき治療
効果量が動物に投与されうる。該４２／６抗体はまた腫
瘍細胞をＳ期細胞周期に静止させるのに有効でありその
結果、該細胞の他の化学療法薬類に対する感受性を高め
る。所望されうる４２／６モノクローナル抗体の可能性
のある他の使用法は、遺伝性血色素症のごとき鉄貯蔵症
並びに移植片対宿主反応のごとき病態の治療である。
本発明の範囲を逸脱することなく当業者は、明らかに本
技術を変更しうる。例えば、抗体の産生はトランスフェ
リンレセプター糖蛋白質を含む他のヒト細胞系、あるい
は造血細胞全体や単離されたヒトトランスフェリンレセ
プター糖蛋白質よりむしろ細胞膜片あるいは細胞膜由来
の物質を宿主動物に接種することでも行いうる。
本発明はヒトトランスフェリンレセプターに関して記述
されているが、この方法は、非ヒトトランスフェリンレ
セプターあるいは鉄血症の検出並びに細胞増殖の抑制に
有用な抗体産生に等しく応用できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトトランスフェリンレセプター糖蛋白質
    を認識し、かつトランスフェリンのレセプター糖蛋白質
    への結合を妨げるモノクローナル抗体の製造方法であっ
    て、 前記トランスフェリンレセプター糖蛋白質を含有する物
    質を動物に接種する、 前記動物より抗体産生細胞を獲得する、 前記抗体産生細胞と腫瘍細胞を融合させて混成細胞を製
    造する、 ヒトトランスフェリンレセプター糖蛋白質に結合してト
    ランスフェリンの前記糖蛋白質への結合を妨げる抗体を
    産生する混成細胞を選択する、 前記選択された混成細胞のクローンを調製する、および それにより産生された抗体を収集する、 の各工程からなる方法。
  2. 【請求項２】前記抗体産生細胞は、ＢＡＬＢ／Ｃマウス
    脾臓細胞である特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記トランスフェリンレセプター糖蛋白質
    は、ヒト造血細胞およびヒト造血細胞膜物質より調製さ
    れたものである特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記ヒト造血細胞細胞系はＣＣＲＦ−ＣＥ
    Ｍである特許請求の範囲第３項に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記腫瘍細胞は非抗体産生の骨髄腫細胞
    系、Ｓ１９４／５．ＸＸＯ．ＢＵ．１．である特許請求
    の範囲第１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記クローンは、宿主動物で増殖され、さ
    らに前記抗体は、宿主動物の血清並びに宿主動物腹水を
    含む一群より調製される特許請求の範囲第１項に記載の
    方法。
  7. 【請求項７】ヒトトランスフェリンレセプター糖蛋白質
    を認識し、かつトランスフェリンのレセプター糖蛋白質
    への結合を妨げるモノクローナル抗体。
  8. 【請求項８】ＨＢ−８０９４混成細胞およびその抗体産
    生再クローンより成る一群から選択された培養物より得
    られる特許請求の範囲第８項に記載のモノクローナル抗
    体。
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