JPH0572039A - 分光蛍光光度計のスペクトル補正方法及びスペクトル補正機能付分光蛍光光度計 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 分光蛍光光度計の波長特性を励起側について
も蛍光側と同様に広げてスペクトル補正ひいては測定レ
ンジを高精度に広げる。 【構成】 Ｓ１で波長領域λ１（２００〜６００ｎｍ）
の励起側波長特性Ｆｅｘ１（λＥＸ）を光量子計を用い
て求める。Ｓ２で標準光源又は副標準光源を用いて波長
領域λ２（５００〜９００ｎｍ）の蛍光側波長特性Ｆｅ
ｍ２（λＥＭ）を求める。Ｓ３で光学系の全波長領域λ
１，λ２について励起側，蛍光側の波長を一致させつつ
走査する。得られたスペクトルは、励起側，蛍光側両方
の波長特性の積となり、このスペクトル値と既知のＦｅ
ｘ１（λＥＸ），Ｆｅｍ２（λＥＭ）とを比演算して、
λ１の蛍光側波長特性Ｆｅｍ１（λＥＭ）とλ２の励起
側波長特性Ｆｅｘ２（λＥＸ）が求まり、これらの波長
特性からλ１，λ２の励起側，蛍光側の補正関数が求ま
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は試料固有のスペクトル測
定に用いる分光蛍光光度計に係り、特にそのスペクトル
補正の技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】分光蛍光光度計は、光源から放射される
光線が励起側分光器にて波長設定され、その波長設定さ
れた単色光が試料セル内の測定試料を照射，励起し、試
料から発光した蛍光を蛍光側分光器及び蛍光検知器を介
して検出して、蛍光（励起・発光）スペクトルを測定す
る。

【０００３】蛍光スペクトルは、励起光の強度Ｉｅｘ
（λ）と蛍光分子の吸光係数εｅｘ（λ）との積に比例
するため、どの波長に設定しても一定の励起光強度が得
られるような理想的な測定系で蛍光スペクトルを観察す
るのが望ましい。しかし、実際の測定系では励起光強度
Ｉｅｘ（λ）は波長とともに変動し、その変動は光源や
分光器の種類，装置の経年変化等いわゆる装置の個性に
大きく依存する。このことは、励起側だけでなく、蛍光
側においてもその分光器や検知器の感度特性等に個性が
あるため同様のことがいえる。従って、検知器に表れる
蛍光スペクトルは見かけ上のものとなる。真のスペクト
ルを求めるには、上記の装置の個性（装置関数，波長特
性ともいう）を考慮したスペクトル補正を行うことが必
要となる。

【０００４】この種のスペクトル補正の従来技術として
は、例えば特開平２−２５９５３３号公報等に開示され
るようにフォトダイオードを用いてスペクトル補正を行
うもの等種々提案されているが、従来より最も高感度で
信頼できるスペクトル補正技術として評価されているも
のに、木下、御橋編「蛍光測定」（学会出版センタ−）
２章．４「見かけ」の蛍光スペクトルと「真」の蛍光ス
ペクトル（６３頁から７０頁）において論じられている
ように、励起側については光量子計法、蛍光側について
は、光量子計法と標準光源を用いる方法を併用したもの
がある。

【０００５】ここで、上記文献に記載されたスペクトル
補正について説明する。

【０００６】〔励起側の補正〕励起側の補正に用いる光
量子計法は、高濃度のローダミンＢの溶液が６００ｎｍ
までの波長域において充分に高い吸光度を示す性質を利
用する。実際には、ローダミンＢ溶液を三角セルに入れ
試料ホルダーにセットし、蛍光側の分光器の波長を６１
５ｎｍより長波長側に設定し（発光の内部遮蔽効果の影
響を抑えるためである）、励起側分光器の波長を走査し
て光検出器からの信号を記録し励起光強度の波長特性を
求め、これに基づき一定の励起光強度に相当する補正を
行う。

【０００７】〔蛍光側の補正〕蛍光側の補正では、前記
光量子計法と標準光源を用いる方法が併用される。標準
光源を用いる方法は、黒体輻射を基準にして分光出力特
性が正確に求められている標準タングステンランプ若し
くはこのランプをもとに校正された二次標準ランプ（副
標準光源）を用い、ランプの放射光を蛍光側分光器で波
長走査しつつ検知することで、蛍光側の波長特性を求め
る。この標準光源方法は６００ｎｍより長波長側の領域
の蛍光側の波長特性を知る上で現在のところ信頼できる
唯一の方法とされている。

【０００８】そして、６００ｎｍ以下の領域はローダミ
ンＢ溶液を用いた光量子計法でカバーしている。すなわ
ち、まず上記の励起側で用いたローダミンＢの要領で励
起光の分光特性Ｉｅｘ（λ）を求める。次に試料ホルダ
ー位置に光拡散素子をセットして、励起光を導きつつ励
起側と蛍光側の分光器を同じ波長で走査して検出器の出
力Ｈ（λｉ）を計る。このＨ（λｉ）とＩｅｘ（λ）の
比から６００ｎｍ以下の蛍光側の波長特性が求まる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術では、蛍
光側については、ロ−ダミンＢを用いた光量子計法と標
準光源を用いる方法との併用により、通常の分光蛍光光
度計の測定波長域（２００〜９００ｎｍ）に対する光度
計の波長特性を求めることができるが、励起側について
は、ロ−ダミンＢを用いた光量子計法以外、信頼できる
有効な方法がないため、２００〜６００ｎｍの範囲外に
ついては波長特性を求めることができない。従って、装
置全体としてみれば、６００ｎｍ以上の波長域で充分な
スペクトル補正を伴いつつ試料分析を行うことができな
い。

【００１０】本発明は以上の点に鑑みてなされ、その目
的は、分光蛍光光度計において、前述したような励起側
についても蛍光側と同様に例えば６００ｎｍ以上の波長
特性を高精度に、しかも蛍光側の波長特性測定に用いた
既存の標準光源又は副標準光源を利用して求め、測定対
象波長ひいては試料の測定レンジを広げることができる
スペクトル補正技術を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は上記目的を達成
するために、基本的には次のようなスペクトル補正技術
を提案する。

【００１２】すなわち、光源、励起側分光器、蛍光側分
光器、蛍光検知器、蛍光信号値（蛍光スペクトル値）か
ら測定結果を算出する演算器を備えた分光蛍光光度計の
スペクトル補正を行う場合に、所定の波長領域（例えば
６００ｎｍ以上或いはその近くの値以上の波長領域）の
蛍光側光学系の波長特性を標準光源又は副標準光源を利
用して求め、且つ前記所定の波長領域について前記励起
側分光器，蛍光側分光器により励起側，蛍光側の両波長
を一致させながら同時走査して蛍光スペクトルを測定
し、この測定された蛍光スペクトル値と前記標準光源
（又は副標準光源）を利用して求めた前記蛍光側光学系
の波長特性との比演算により前記所定の波長領域におけ
る励起側光学系の波長特性を算出し、以上のようにして
求まる励起側光学系の波長特性及び蛍光側波長特性に基
づきスペクトル補正関数を定める（これを第１の課題解
決手段とする）。

【００１３】さらに、その応用として、上記の第１の課
題解決手段に加えて、光量子計法を併用して上記の所定
の領域以外の波長域（例えば６００ｎｍ以下の波長域）
についての波長特性を求める手段を提案する。

【００１４】すなわち、上記のような分光蛍光光度計の
スペクトル補正を行う場合に、まず、測定範囲の波長領
域λを第１，第２の波長領域λ１，λ２に分けておく
（λ１＜λ２）。ここで、領域λ１，λ２は適宜任意に
選択され、例えば後述の実施例ではλ１が２００〜５０
０ｎｍ、λ２が５００〜９００ｎｍとしてある。そし
て、上記の領域λ１，λ２を前提として、第１の波長領
域λ１の励起側光学系の波長特性Ｆｅｘ１（λＥＸ）を
光量子計法により求める工程イ、第２の波長領域λ２の
蛍光側光学系の波長特性Ｆｅｍ２（λＥＭ）を標準光源
又は副標準光源を利用して求める工程ロ、第１の波長領
域λ１及び第２の波長領域λ２の全波長領域について前
記励起側分光器，蛍光側分光器により励起側，蛍光側の
両波長を一致させながら同時走査して蛍光スペクトルを
測定する工程ハ、前記工程ハで測定された蛍光スペクト
ル値のうち第１の波長領域λ１に対応の測定値Ｆ１（λ
ＥＸ，λＥＭ），第２の波長領域λ２に対応の測定値Ｆ
２（λＥＸ，λＥＭ）を分けて、測定値Ｆ１（λＥＸ，
λＥＭ）と前記工程イで求めた波長特性Ｆｅｘ１（λＥ
Ｘ）との比演算より第１の波長領域λ１の蛍光側光学系
の波長特性Ｆｅｍ１（λＥＭ）を求め、一方、測定値Ｆ
２（λＥＸ，λＥＭ）と前記工程ロで求めた波長特性Ｆ
ｅｍ２（λＥＭ）との比演算により第２の波長領域λ２
の励起側光学系の波長特性Ｆｅｘ２（λＥＸ）とを求め
る工程ニ、前記イ〜ニの工程により求まる各波長特性よ
り第１，第２の波長領域λ１，λ２ごとの励起側，蛍光
側各々のスペクトル補正関数Ｇｅｘ１（λＥＸ）、Ｇｅ
ｍ１（λＥＭ）とＧｅｘ２（λＥＸ），Ｇｅｍ２（λＥ
Ｍ）を求める（これを第２の課題解決手段とする）。

【００１５】さらにその応用として、上記第２の課題解
決手段のようにして求めた各波長領域λ１，λ２ごとの
補正関数、すなわちＧｅｘ１（λＥＸ），Ｇｅｍ１（λ
ＥＭ）とＧｅｘ２（λＥＸ），Ｇｅｍ２（λＥＭ）を記
憶し、実測される蛍光スペクトル値の所属する波長領域
λ１，λ２に応じて上記補正関数Ｇｅｘ１（λＥＸ），
Ｇｅｍ１（λＥＭ）或いはＧｅｘ２（λＥＸ），Ｇｅｍ
２（λＥＭ）のいずれかを読み出して見かけのスペクト
ル値の補正演算を行う手段を備えたスペクトル補正機能
付きの分光蛍光光度計を提案する（これを第３の課題解
決手段とする）。

【００１６】

【作用】第１の課題解決手段の作用…標準光源又は副標
準光源から放射される光を蛍光側光学系の分光器で所定
の波長領域λで走査しつつ蛍光検知器で測定すると、結
果は、標準光源（副標準光源）の波長特性Ｆｃ（λＥ
Ｍ）と蛍光側光学系の波長特性Ｆｅｍ（λＥＭ）との積
となり、Ｆｃ（λＥＭ）が既知であることから比演算に
よりＦｅｍ（λＥＭ）が求まる。また、前記所定の波長
領域λについて励起側，蛍光側の両波長を一致させなが
ら同時走査して得た蛍光スペクトル値をＦ（λＥＸ，λ
ＥＭ）とする。この蛍光スペクトル値Ｆ（λＥＸ，λＥ
Ｍ）には、蛍光側光学系の波長特性Ｆｅｍ（λＥＭ）の
ほかに励起側光学系の波長特性Ｆｅｘ（λＥＸ）が含ま
れ、これを式で表せば、次式で表される。

【００１７】

【数２】 Ｆｅｘ（λＥＸ）×Ｆｅｍ（λＥＭ）＝Ｆ（λＥＸ，λＥＭ） すなわち、Ｆｅｍ（λＥＭ）及びＦ（λＥＸ，λＥＭ）
が既知であることから、上記式を成立させることで、波
長領域λにおける励起側波長特性Ｆｅｘ（λＥＸ）をＦ
（λＥＸ，λＥＭ）とＦｅｍ（λＥＭ）との比演算によ
り算出できる。そして、このような６００ｎｍ以上で信
頼できる標準光源又は副標準光源を用いる方法及び数２
式を用いることで、従来、光量子計法では測定できなか
った６００ｎｍ以上の励起側光学系の波長特性を知り、
ひいてはこの６００ｎｍ以上の励起側波長特性と蛍光側
波長特性に基づき励起側，蛍光側の双方の補正関数Ｇｅ
ｘ（λＥＸ），Ｇｅｍ（λＥＭ）を求めることができる
（通常、補正関数は波長特性の逆数で表される）。

【００１８】第２の課題解決手段の作用…工程イ〜ハで
求めた、第１の波長領域λ１の励起側波長特性Ｆｅｘ１
（λＥＸ）、第２の波長領域λ２の蛍光側波長特性Ｆｅ
ｍ２（λＥＭ）、測定対象の全波長領域λ１，λ２の蛍
光スペクトル値Ｆ１（λＥＸ，λＥＭ），Ｆ２（λＥ
Ｘ，λＥＭ）は全て既存の信頼性の高い方法を用いて求
めることができる。

【００１９】上記の既知の実測データＦｅｘ１（λＥ
Ｘ）、Ｆｅｍ２（λＥＭ）、（λＥＸ，λＥＭ），Ｆ２
（λＥＸ，λＥＭ）と、未知たる第１の波長領域λ１の
蛍光側波長特性Ｆｅｍ１（λＥＭ）及び第２の波長領域
λ２の励起側波長特性Ｆｅｘ２（λＥＸ）とには次式が
成立する。

【００２０】

【数３】λ１について Ｆｅｘ１（λＥＸ）×Ｆｅｍ１
（λＥＭ）＝Ｆ１（λＥＸ，λＥＭ） λ２について Ｆｅｘ２（λＥＸ）×Ｆｅｍ２（λＥ
Ｍ）＝Ｆ２（λＥＸ，λＥＭ） 上記式から、工程ニのように、既知データのＦ１（λＥ
Ｘ，λＥＭ）とＦｅｘ１（λＥＸ）との比演算より第１
の波長領域λ１の蛍光側波長特性Ｆｅｍ１（λＥＭ）を
求め、既知データのＦ２（λＥＸ，λＥＭ）とＦｅｍ２
（λＥＭ）との比演算により第２の波長領域λ２の励起
側光学系の波長特性Ｆｅｘ２（λＥＸ）とが求められ
る。

【００２１】そして、以上の全ての波長特性が求まるこ
とで、第１の波長領域λ１の励起側の補正関数Ｇｅｘ１
（λＥＸ），蛍光側の補正関数Ｇｅｍ１（λＥＭ）及び
第２の波長領域λ２の励起側の補正関数Ｇｅｘ２（λＥ
Ｘ），蛍光側の補正関数Ｇｅｍ２（λＥＭ）を次のよう
にして求めることができる。

【００２２】

【数４】・λ１について、 Ｇｅｘ１（λＥＸ）＝Ｆｅｘ１（λＡ）／Ｆｅｘ１（λＥＸ） Ｇｅｍ１（λＥＭ）＝Ｆｅｍ１（λＡ）／Ｆｅｍ１（λＥＭ） ・λ２について Ｇｅｘ２（λＥＸ）＝Ｆｅｘ２（λＡ）／Ｆｅｘ２（λＥＸ） Ｇｅｍ２（λＥＭ）＝Ｆｅｍ２（λＡ）／Ｆｅｍ２（λＥＭ） λＡ：スペクトルの相対的形状を補正するために、見か
けのスペクトル値のうちの一つを基準として適当に選ん
だものなお、この第２の課題解決手段において述べた要
素のうち、λ２、Ｆｅｘ２（λＥＸ），Ｆｅｍ２（λＥ
Ｍ），Ｇｅｘ２（λＥＸ），Ｇｅｍ２（λＥＸ）のそれ
ぞれが第１の課題解決手段で述べたλ，Ｆｅｘ（λＥ
Ｘ），Ｆｅｍ（λＥＭ），Ｇｅｘ（λＥＸ），Ｇｅｍ
（λＥＸ）に相当する。

【００２３】この課題解決手段によれば、従来の光量子
計法，標準光源（又は副標準光源）を利用した方法に比
べて、従来は２００〜６００ｎｍまでの励起側・蛍光側
のスペクトル補正しかできなかったものを２００〜９０
０ｎｍまでの励起側・蛍光側のスペクトル補正を可能に
する。

【００２４】第３の課題解決手段の作用…上記の第２の
課題解決手段で求めたスペクトル補正関数Ｇｅｘ１（λ
ＥＸ），Ｇｅｍ１（λＥＭ）とＧｅｘ２（λＥＸ），Ｇ
ｅｍ（λＥＭ）をスペクトル測定に用いた波長に応じて
記憶部から読み出すことで、自動的なスペクトルデータ
処理により真のスペクトルを演算できる。

【００２５】

【実施例】本発明の一実施例を図面に基づき説明する。

【００２６】図１は本発明のスペクトル補正の一例を示
すフローチャート、図２はそのスペクトル補正に用いる
装置の波長特性を求めるための説明図、図３は図２に対
応する波形説明図、図４は本発明の適用対象となる分光
蛍光光度計の構成図である。

【００２７】まず、図４により、分光蛍光光度計につい
て説明する。

【００２８】図４において、光源１から放射される光線
は、励起側分光器２に入射する。励起側分光器２の設定
波長は、パルスモ−タ３によって変えられる。パルスモ
−タ３の動作は、コンピュ−タ４の中にあらかじめプロ
グラムされており、インタフェ−ス５を介して制御され
る。所期の励起波長を操作パネル６でキ−インすること
によって、励起側分光器２の波長が設定される。励起側
分光器によって取り出された単色光は、試料セル７内の
測定試料８を照射し、試料８から放射された蛍光は蛍光
側分光器９に入射する。蛍光側分光器９はパルスモ−タ
１０によって駆動されるが、その動作はパルスモ−タ３
と同様に、コンピュ−タ４により制御される。蛍光側分
光器９により選択された波長の蛍光は、検知器１１に入
射し、電気信号に変換される。その電気信号は、アナロ
グ−デジタル変換器１２によってデジタル信号に変えら
れる。一方、励起側分光器２から取り出された単色光の
一部は、光源光量モニタのためビ−ムスプリッタ１３を
介して、モニタ検知器１４に入射し、電気信号に変換さ
れる。この電気信号も、アナログ−デジタル変換器１２
によってデジタル信号に変えられる。検知器１１からの
デジタル信号（Ｓ）と、モニタ検知器１４からのデジタ
ル信号（Ｍ）は、コンピュ−タ４に送られ、比（Ｓ／
Ｍ）が算出され、この比が各波長における蛍光強度とし
て、コンピュ−タ４に記憶される。

【００２９】コンピュータ４には、後述のロ−ダミンＢ
による光量子計１５（図２）を用いて求める第１の波長
領域λ１（λ１は２００〜６００ｎｍ）における励起側
光学系の波長特性（励起側波長特性）、副標準光源（図
３，標準光源により校正された２次ランプ）１６を用い
て求める第２の波長領域λ２（λ２は５００〜９００ｎ
ｍ）の蛍光側光学系の波長特性（蛍光側波長特性）、及
びこれらの波長特性を利用して所定の関係式により第１
の波長領域λ１の蛍光側波長特性，第２の波長領域λ２
の励起側波長特性ひいてはスペクトル補正関数Ｇｅｘ１
（λＥＸ），Ｇｅｍ１（λＥＭ），Ｇｅｘ２（λＥ
Ｘ），Ｇｅｍ２（λＥＭ）を求めるプログラムがコンピ
ュ−タ４内に記憶されている。求められた各波長領域λ
１，λ２の励起側、蛍光側の波長特性及び補正関数は、
コンピュ−タ４内のＲＡＭに記憶され、未知試料の真の
スペクトル測定、算出に使われる。

【００３０】次に、装置の波長特性及びスペクトル補正
関数を求める手順について、図１〜図３を用いて説明す
る。

【００３１】図１のステップＳ１〜Ｓ４に示すように、
波長特性及びスペクトル補正関数を求める手順は、４段
階に大別される。

【００３２】ステップＳ１では、ロ−ダミンＢを用いて
第１の波長領域λ１（本例では２００〜６００ｎｍ）に
ついての励起側波長特性を測定する。これに相当するの
が図２の（ａ）で、ロ−ダミンＢを入れた三角セル（光
量子計）１５を試料セル位置にセットし、蛍光波長を６
４０ｎｍに固定しておく。このときに、励起側分光器２
を波長走査して２００〜６００ｎｍについての励起スペ
クトルを測定すると、結果が図３（ａ）に示すような波
長領域λ１の励起側波長特性Ｆｅｘ１（λＥＸ）とな
り、これをコンピュ−タ４に記憶する。

【００３３】ステップＳ２では、副標準光源１６によ
り、第２の波長領域λ２（本例では５００〜９００ｎ
ｍ）についての蛍光側波長特性を測定する。すなわち図
２の（ｂ）に示すように、副標準光源１６から放射され
る光線を蛍光側分光器９に入射させる。蛍光側分光器９
により５００〜９００ｎｍまで波長走査して蛍光スペク
トルを測定すると、結果は、副標準光源１６の波長特性
Ｆｃ（λＥＭ）と蛍光側光学系の波長特性Ｆｅｍ２（λ
ＥＭ）との積となる。ここで使用する副標準光源１６
は、タングステンランプを用いたもので、その波長特性
は２９９５°Ｋにおける黒体放射の式と一致することが
確かめられているものである。このため、Ｆｃ（λＥ
Ｍ）は既知であり、比演算により図３の（ｂ）に示すよ
うなＦｅｍ２（λＥＭ）を求めることができ、これをコ
ンピュ−タ４内に記憶する。

【００３４】ステップＳ３では、全波長域λ１，λ２に
ついて励起側、蛍光側両波長を、同一波長、同一速度で
走査したスペクトルを測定する。すなわち図２の（ｃ）
に示すように、この場合には試料セル位置に拡散素子１
７をセットする。拡散素子１７それ自体は波長依存性を
持たないため、結果は次式に示すように励起側分光器２
の波長特性と蛍光側分光器９の波長特性の積となる。こ
の測定結果は図３の（ｃ）に示す。

【００３５】

【数５】λ１＜５００ｎｍについて Ｆｅｘ１（λＥ
Ｘ）×Ｆｅｍ１（λＥＭ）＝Ｆ１（λＥＸ，λＥＭ） λ２＞５００ｎｍについて Ｆｅｘ２（λＥＸ）×Ｆｅ
ｍ２（λＥＭ）＝Ｆ２（λＥＸ，λＥＭ） λＥＸ＝λＥＭ 上記の内、Ｆｅｘ１（λＥＸ）とＦｅｍ２（λＥＭ）は
前記の操作により既に求められているため、それらとＦ
１（λＥＸ，λＥＭ），Ｆ２（λＥＸ，λＥＭ）の比演
算によりＦｅｍ１（λＥＭ）とＦｅｘ２（λＥＸ）を求
める。

【００３６】ステップ４では、以上の操作により求めら
れた波長特性から、励起側、蛍光側各々の全波長域λ
１，λ２にわたるスペクトル補正関数Ｇｅｘ１（λＥ
Ｘ）、Ｇｅｍ１（λＥＭ）及びＧｅｘ２（λＥＸ），Ｇ
ｅｍ２（λＥＭ）を求める。

【００３７】これらのスペクトル補正関数は、未知試料
について測定した見かけのスペクトルに乗じることによ
り、真のスペクトルを求めるためのものである。蛍光光
度計で得られたスペクトルは、縦軸が任意単位であり、
ここで補正スペクトルと言っている意味は、強度につい
て絶対単位を与えるものではなく、スペクトルの相対的
な形状を補正すると言うことである。しかし、補正後の
値が補正前のものと大幅に違うことは好ましくないた
め、補正関数の値は１に近くなるように、適当な波長の
値が１となるように規格化する。この場合には、５００
ｎｍの値〔Ｆｅｘ１（５００）、Ｆｅｘ２（５００）、
Ｆｅｍ１（５００）、Ｆｅｍ２（５００）〕で各関数を
規格化し、次の式により補正関数を算出する。

【００３８】

【数６】・λ１（５００ｎｍ以下）について Ｇｅｘ１（λＥＸ）＝Ｆｅｘ１（５００）／Ｆｅｘ１（λＥＸ） Ｇｅｍ１（λＥＭ）＝Ｆｅｍ１（５００）／Ｆｅｍ１（λＥＭ） ・λ２（５００ｎｍ以上）について Ｇｅｘ２（λＥＸ）＝Ｆｅｘ２（５００）／Ｆｅｘ２（λＥＸ） Ｇｅｍ２（λＥＭ）＝Ｆｅｍ２（５００）／Ｆｅｍ２（λＥＭ） 以上のようにして求められたスペクトル補正関数は、コ
ンピュ−タ４内に記憶される。

【００３９】そしてステップ５にて未知試料測定後、次
の式により補正スペクトルを求めるために使用される。

【００４０】

【数７】・λ１について Ｉｃ（λＥＸ、λＥＭ）＝Ｉ
（λＥＸ、λＥＭ）×Ｇｅｘ１（λＥＸ）×Ｇｅｍ１
（λＥＭ） ・λ２について Ｉｃ（λＥＸ、λＥＭ）＝Ｉ（λＥ
Ｘ、λＥＭ）×Ｇｅｘ２（λＥＸ）×Ｇｅｍ２（λＥ
Ｍ） 上式でＩｃは補正スペクトル、Ｉは補正前のスペクトル
である。

【００４１】本実施例によれば、励起側，蛍光側の双方
の波長特性を２００〜９００ｎｍにわたり信頼性の高い
方法により求め、これに基づく励起側及び蛍光側双方の
スペクトル補正関数をそれぞれ波長領域２００〜５００
ｎｍと５００〜９００ｎｍとの領域に分けてきめ細かく
設定して蛍光スペクトル値を精度良く補正演算でき、し
かも、コンピュータのデータ処理により真のスペクトル
を自動的に求める効果がある。

【００４２】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、分光蛍光
光度計の励起側、蛍光側における波長特性ひいてはそれ
に基づくスペクトル補正関数を従来以上に広く求めしか
も信頼性の高い手法を用いて求めることができ、試料の
測定レンジを高精度を保ちつつ広げることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のスペクトル補正の一例を示すフローチ
ャート。

【図２】上記スペクトル補正に用いる装置の波長特性を
求めるための説明図。

【図３】図２に対応する波形説明図。

【図４】本発明の適用対象となる分光蛍光光度計の構成
図。

【符号の説明】

１…光源、２…励起側分光器、３…励起側パルスモー
タ、４…コンピュータ（スペクトル補正手段）、５…イ
ンターフェース、６…操作パネル、７…試料セル、８…
測定試料、９…蛍光側分光器、１０…蛍光側パルスモー
タ、１１…検知器、１２…Ａ／Ｄ変換器、１３…ビーム
スプリッタ、１４…モニタ検知器、１５…光量子計、１
６…副標準光源、１７…拡散素子。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光源、励起側分光器、蛍光側分光器、蛍
   光検知器、蛍光信号値（蛍光スペクトル値）から測定結
   果を算出する演算器を備えた分光蛍光光度計のスペクト
   ル補正を行う場合に、所定の波長領域の蛍光側光学系の
   波長特性を標準光源又は標準光源により校正された光源
   （副標準光源）を利用して求め、且つ前記所定の波長領
   域について前記励起側分光器，蛍光側分光器により励起
   側，蛍光側の両波長を一致させながら同時走査して蛍光
   スペクトルを測定し、この測定された蛍光スペクトル値
   と前記標準光源又は副標準光源を利用して求めた前記蛍
   光側光学系の波長特性との比演算により前記所定の波長
   領域における励起側光学系の波長特性を算出し、この励
   起側光学系の波長特性及び前記蛍光側光学系の波長特性
   に基づきスペクトル補正関数を定めることを特徴とする
   分光蛍光光度計のスペクトル補正方法。
2. 【請求項２】 請求項１において、前記標準光源又は副
   標準光源としてタングステンランプを用い、前記所定の
   波長領域は６００ｎｍより長波長側の領域を含み、前記
   励起側，蛍光側の両波長を一致させながらの同時走査に
   よる蛍光スペクトル測定には光拡散素子を光路上にセッ
   トして行うことを特徴とする分光蛍光光度計のスペクト
   ル補正方法。
3. 【請求項３】 光源、励起側分光器、蛍光側分光器、蛍
   光検知器、蛍光信号値（蛍光スペクトル値）から測定結
   果を算出する演算器を備えた分光蛍光光度計のスペクト
   ル補正を行う場合に、測定範囲の波長領域λを第１波長
   領域λ１，λ２に分け（λ１＜λ２）、 第１の波長領域λ１の励起側光学系の波長特性Ｆｅｘ１
   （λＥＸ）を光量子計法により求める工程イ、 第２の波長領域λ２の蛍光側光学系の波長特性Ｆｅｍ２
   （λＥＭ）を標準光源又は標準光源により校正された光
   源（副標準光源）を利用して求める工程ロ、 第１の波長領域λ１及び第２の波長領域λ２の全波長領
   域について前記励起側分光器，蛍光側分光器により励起
   側，蛍光側の両波長を一致させながら同時走査して蛍光
   スペクトルを測定する工程ハ、 前記工程ハで測定された蛍光スペクトル値のうち第１の
   波長領域λ１に対応の測定値Ｆ１（λＥＸ，λＥＭ），
   第２の波長領域λ２に対応の測定値Ｆ２（λＥＸ，λＥ
   Ｍ）を分けて、測定値Ｆ１（λＥＸ，λＥＭ）と前記工
   程イで求めた波長特性Ｆｅｘ１（λＥＸ）との比演算よ
   り第１の波長領域λ１の蛍光側光学系の波長特性Ｆｅｍ
   １（λＥＭ）を求め、一方、測定値Ｆ２（λＥＸ，λＥ
   Ｍ）と前記工程ロで求めた波長特性Ｆｅｍ２（λＥＭ）
   との比演算により第２の波長領域λ２の励起側光学系の
   波長特性Ｆｅｘ２（λＥＸ）とを求める工程ニ、 前記イ〜ニの工程により求まる各波長特性より第１，第
   ２の波長領域λ１，λ２ごとの励起側，蛍光側各々のス
   ペクトル補正関数Ｇｅｘ１（λＥＸ）、Ｇｅｍ１（λＥ
   Ｍ）とＧｅｘ２（λＥＸ），Ｇｅｍ２（λＥＭ）を求め
   ることを特徴とする分光蛍光光度計のスペクトル補正方
   法。
4. 【請求項４】 請求項３において、前記工程イの光量子
   計の蛍光スクリーンとしてローダミンＢを用い、前記工
   程ロの標準光源又は副標準光源としてタングステンラン
   プを用い、前記第１の波長領域は６００ｎｍ以下で２０
   ０ｎｍ以上の範囲の中から設定し、前記第２の波長領域
   は、前記第１の波長領域以上で９００ｎｍ以下の範囲を
   含む（第１，第２の領域が一部重複してもよい）ように
   設定したことを特徴とする分光蛍光光度計のスペクトル
   補正方法。
5. 【請求項５】 請求項３又は請求項４において、前記工
   程ハでは光拡散素子を光路上にセットしてスペクトル測
   定を行うことを特徴とする分光蛍光光度計のスペクトル
   補正方法。
6. 【請求項６】 光源、励起側分光器、蛍光側分光器、蛍
   光検知器、蛍光信号値（蛍光スペクトル値）から測定結
   果を算出する演算器を備えた分光蛍光光度計において、 励起側光学系及び蛍光側光学系の波長特性に影響される
   見かけの蛍光スペクトル値を補正する手段を有し、この
   スペクトル補正手段は、測定範囲の波長領域λを第１波
   長領域λ１と第２の波長領域λ２とに分けて（λ１＜λ
   ２）、これらの波長領域λ１，λ２ごとに次の関係式で
   予め求めた補正関数Ｇｅｘ１（λＥＸ），Ｇｅｍ１（λ
   ＥＭ）とＧｅｘ２（λＥＸ），Ｇｅｍ２（λＥＭ）を記
   憶し、 【数１】・λ１について Ｆｅｘ１（λＥＸ）×Ｆｅｍ
   １（λＥＭ）＝Ｆ１（λＥＸ，λＥＭ） ・λ２について Ｆｅｘ２（λＥＸ）×Ｆｅｍ２（λＥ
   Ｍ）＝Ｆ２（λＥＸ，λＥＭ） ここで、Ｆｅｘ１（λＥＸ）：光量子計法により求めた
   第１の波長領域λ１の励起側光学系の波長特性 Ｆ１（λＥＸ，λＥＭ）：第１の波長領域λ１において
   励起側波長と蛍光側波長を一致させつつ励起側分光器及
   び蛍光側分光器を同時に波長走査して得られたスペクト
   ル測定値 Ｆｅｍ１（λＥＭ）：Ｆ１（λＥＸ，λＥＭ）とＦｅｘ
   １（λＥＸ，λＥＭ）との比演算より得た第１の波長領
   域λ１の蛍光側光学系の波長特性 Ｆｅｍ２（λＥＸ）：標準光源又は標準光源により校正
   された光源（副標準光源）を用いて求めた第２の波長領
   域λ２の蛍光側光学系の波長特性 Ｆ２（λＥＸ，λＥＭ）：第２の波長領域λ２において
   励起側波長と蛍光側波長を一致させつつ励起側分光器及
   び蛍光側分光器を同時に波長走査して得られたスペクト
   ル測定値 Ｆｅｘ２（λＥＭ）：Ｆ２（λＥＸ，λＥＭ）とＦｅｍ
   ２（λＥＸ，λＥＭ）との比演算より得た第２波長領域
   λ２の励起側光学系の波長特性 ・λ１について、 Ｇｅｘ１（λＥＸ）＝Ｆｅｘ１（λＡ）／Ｆｅｘ１（λＥＸ） Ｇｅｍ１（λＥＭ）＝Ｆｅｍ１（λＡ）／Ｆｅｍ１（λＥＭ） ・λ２について Ｇｅｘ２（λＥＸ）＝Ｆｅｘ２（λＡ）／Ｆｅｘ２（λＥＸ） Ｇｅｍ２（λＥＭ）＝Ｆｅｍ２（λＡ）／Ｆｅｍ２（λＥＭ） ここで、Ｇｅｘ１（λＥＸ）：λ１の励起側光学系の補
   正スペクトル関数 Ｇｅｍ１（λＥＭ）：λ１の蛍光側光学系の補正スペク
   トル関数 Ｇｅｘ２（λＥＸ）：λ２の励起側光学系の補正スペク
   トル関数 Ｇｅｍ２（λＥＭ）：λ２の蛍光側光学系の補正スペク
   トル関数 λＡ：スペクトルの相対的形状を補正するために、見か
   けのスペクトル値のうちの一つを基準として適当に選ん
   だもの 前記記憶したλ１，λ２のいずれかの補正スペクトル関
   数を実測される蛍光スペクトル値の測定波長領域λ１，
   λ２に応じて読み出して見かけのスペクトル値の補正演
   算を行うよう設定したことを特徴とするスペクトル補正
   機能付き分光蛍光光度計。