JPS6341496A - 抗腫瘍性を有する核酸系高分子抗生物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 帝業上の利用分野 本発明は、生理的活性、特に抗腫瘍活性を有する新規な
核酸系高分子抗生物質に関する。

発明の技術的背景 本発明者は、さきにアクチノマジュラ属に属する微生物
が生産する抗腫瘍活性及び抗菌活性などの生理的活性を
示す核酸系高分子抗生物質（ＳＮ−０７物質と称せられ
る）を開発したが（特願昭５９−２６３８８９号、特開
昭６１−１４１８９５号）、その後さらに検討した結果
、同様にアクチノマジュラ属に属する微生物により生産
され、かつ上記５Ｎ−０７物質よりも分子量の著しく大
きい高分子物質も同様に優れた生理的活性特に抗腫瘍活
性を示すことを見出し、本発明をなすに至った。

全日が解決しようとする課題 したがって、本発明は、アクチノマジュラ属に属する微
生物を利用して、特に優れた抗腫瘍活性を有する、分子
量の著しく大きな核酸系高分子抗生物質を提供すること
を課題とする。

以下本発明の詳細な説明する。

発明の構成 本発明に係る核酸系高分子抗生物質は、デオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）３５乃至・１５重千％、リボ核酸（ＲＮＡ
）６乃至１２重量％、塘（全還元糖）１５乃至１７重量
％及びアミノ酸２．５重量％以下を構成成分として含有
し、特に下記点で特徴付けられる。

■分子量がセファロースＣＬ−４Ｂを用いたゲル濾過法
により、０，０５モルトリス塩酸緩衝液中で分子間会合
を生じて約１０万〜約１００万（蛋白買換ｎ）を示す。

■紫外線吸収スペクトルにおける光学トヒ度（０，Ｄ、
、吸光度〕の２６０ｎｍ／　５０５ｎｍが１０〜１２（
１００μｇ／ｍ６水；溶（夜中で）である。

因に、さきに示した５Ｎ−０７物質の上記による分子量
は、６０，０００〜６４，０００であり、光学書度の２
６０ｎｍ／　５０５ｒ＋ｍは１５〜２０であることから
、本発明に係る物資（以下本物質と称する）は上記５Ｎ
−０７物質とは別異な物質であるということができる。

また、本物質は、ハイドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー分析では５Ｎ−０７物質より遅れて溶出すること
からみても、５Ｎ−０７物質とはその構造の点でも相違
しているものと言える。

課題を解決するための手段 本物質の構成成分であるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は
、シュナイダ（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）法に基づくジフェ
ニルアミン反応により定量したものであり、リボ核酸（
ＲＮＡ）はシュナイダ法に基づくオルシノール反応によ
り定量したものである。また、糖はフェノール硫酸法に
より全還元糖として、及びアミノ酸はアミノ酸分析計に
よる分析値としてそれぞれ測定したものである。

なお、アミノ酸分析計によって本物質にはアミノ↑唐は
検出されない。

本物質の中性水溶ン夜中での紫外部吸収スペクトルは第
１図に示すとおりであって、２５６−２５８ｎｍ及び５
０５．５４０ｎｍに吸収を有する。

Ａ２６（１／Ａ３０５＝１０．５　（平均ＸＯ〜１２）
また、本物質の光外部吸収スペクトルは第２図に示すと
おりであって、３４００．２９５０．２３５０．１９８
０．１７００．１６５０．１０７５．９３０．６７０及
び５２０ｃｍ−’に吸収を有する。

次に、本物質の調製について説明する。

本物質はアクチノマジュラ属（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒ
ａ）に属する微生物を培養することにより調製し得るも
のであって、ここで利用する上記微生物の菌株（ＳＮ−
０７株と称する）は工業技術院微生物技術研究所に漱工
研菌寄第７８９０号（ＦＥＩ？月Ｐ−７８９０）に寄託
されていて、その閑学的性質は特願昭５９−２６３８８
９号の明細書（特開昭６１−１４１８９５号公報）に詳
しく記載されている。

なお、上記菌株５Ｎ−０７はアクチノマジュラ・ロセオ
ヴィオラセア（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ　ｒｏｓｅｏ
ｖｉｏｌａｃｅａ）に属するが、その性質が変化し易く
、人工的変異処理で容易に変異し得るので、いずれの変
異株であっても本物質の生産化を有する菌株はすべてｆ
ｌｌ用し得るものである。

上記菌株５Ｎ−０７を利用して本物質を調製するには、
該菌株を、通常微生物が利用し得る栄養源を含有する培
地中で培養する。

培地としては、例えば、グルコース、グリセリン、デン
プン、デキストリン、オートミール、マルトース、シュ
クロース、その他の糖類、及び油脂類等を炭素源として
含み、大豆粉、綿実粕、肉エキス、酵母エキス、ペプト
ン、コーンステイープリカー、落花生粉、カゼイン、ア
ンモニウム塩、硝酸、尿素等を窒素源として含み、その
他必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸
塩等の無機塩類を添加したものを用い得る。

培養方法としては、−ｉに行なわれる放線菌の培養方法
と同様に好気的条件下での液体深部培養が通している。

また、培養条件としては、２５〜３７℃、好ましくは２
８〜３４℃の温度で振とう培養もしくは通気攪拌培養を
行うとよ（，５〜８日の培養で目的とする本物質を高濃
度で得られる。

因に、培養物中の本物質の検出には、大腸菌の薬剤高感
受性変異株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ　ｃｏ口ＢＥ　１）
８６）を用いるペーパーディスク平板法又はヒーラ（Ｈ
ｅｌａ）細胞による細胞培養法によって行う。

上記培養により得られた培養物から本物質を採取するに
当っては、塩析、溶剤抽出、吸着剤による処理、イオン
交換処理、ゲル濾過法等を適用して抽出及び精製を行う
。

例えば、培養物を濾過もしくは遠心分離などにより菌体
固形分を分離して得られた濾液を１〜３μのカートリッ
ジフィルターを用いて清澄化し、この液を分子量分画６
０００〜１０，０００のＵＦ膜を用いて透過液電気電導
率が３μｓ／ｃｍ以下になるまで透析を行う　（通常１
２〜２４時間を要する）。

次いで得られた透析物を再び１μのカートリッジフィル
ターに通して不溶物を除去した後、その清澄液をジエチ
ルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セルロースあるいはセフ
ァデックス等の弱塩基性イオン交換樹脂に吸着せしめ、
この吸着物を食塩のような中性塩乃至リン酸緩衝液等を
用いて溶出する。

次いで、必要に応じて水に対して透析し、更に、フェニ
ルセファロースＣＬ−４Ｂのような疎水クロマトグラフ
ィー、または、バイオゲルＩＩＴのようなハイドロキシ
アパタイトクロマトグラフィー、あるいはセファロース
ＣＬ−４Ｂ、　ＣＬ−２８等のようなゲル濾過クロマト
グラフィーで処理することにより高純度な本物質を得る
ことができる。

上述したように、培養物について上記各処理を組合せて
精製した本物質を凍結乾燥すると赤桃色無定形粉末とし
て得られる。

因に、このようにして得られた本物質が単一物質である
ことは、セファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフ
ィーでの対称的な溶出像、超遠心分析（２０℃で５０．
００Ｏｒｐｍ　、　３０分間）による沈降パターンでの
単一ピーク、及びイオン交換型ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム
による高速液体クロマトグラフィーでの単一ピークによ
り立証し得る。

本物質を酸（例えば０．５Ｎ−ＨＣＩ）或は酵素（例え
ばｐｔ−ヌクレアーゼ）で分解処理後、得られるクロモ
フォア部分をクロロホルムに転溶させると、上記酸分解
物からはＣａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎｏｎｅが、また、上
記酵素分解物からは、本物質の生理的活性本体と思われ
るクロモフォアとしてＣａｒｍｉｎｏｎｙｃｉｎ　Ｉを
構成成分として含む抗生物質を得た。

因に、ここでいうクロモフォアとはＣａｒｍｉｎｏｍｙ
ｃｉｎ　Ｕ（別名ＲｕｂｅｏｍｙｃｉｎＡ）及びＣａｒ
ｍｉｎｏｍｙｃｉｎ　ｍ（別名Ｒｕｂｅｏ＋ｍｙｃｉｎ
Ａ、）に類似した物質であるが、液体クロマトグラフィ
ー、ｍＮクロマトグラフィー並びにＮＭＲ分析によると
上記Ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ　ｎ及び■とは異なるも
のである。なお、クロモフォアの構造は未だ確定されて
いない。

次に、本物質の有用性についての生理的活性について説
明する。

光里Ωｉ里血 本物質は分子１）０万〜１００万を有する巨大分子の高
次構造から成っていることから、前述した５Ｎ−０７物
質に比べて安定性が高く、またクロモフォアの含有量（
Ａ　２６０／　Ａ　５０５　＝　１０〜１２）も高い。

したがって、本物質は表１に示すとおり、重量当りのＡ
３０５が増加していて、抗腫瘍活性の生理活性も５Ｎ−
０７物質に比べて優れている。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。

実施例 本例は本発明に係る核酸系貰分子物質の調製方法を示し
たものである。

■培養工程 乾燥オートミール１５ｇ２グリセリン１５ｇ１乾燥酵母
５ｇ、リン酸−カリウム３ｇ、リン酸二ナトリウム７ｇ
、硫酸鉄１ｇ及び硫酸マグネシウム０．５ｇを含有する
液体培地（ｐＨ７，５に調整）１）を、５０ｍ１容の試
験管に１５ｍ　ｌ充分注し、常法に従って滅菌した。

上記各培地に、５Ｎ−０７株（ＦＥＲＭ　Ｐ−７８９０
）の寒天培地上の胞子をそれぞれ接種して２７℃で４〜
７日間振とう培養して、第１種菌を得た。次いで、上記
と同様の組成の液体培地１００ｍ　ｉｔを５００ｍ　ｊ
！容フラスコに注入したものをに、上記第１種菌を接種
し、３０℃で２〜３日間振とう培養を行って第２種菌を
得た。

次に、この第２種菌４００ｍ　ｌを、３ＯＮ容ジャーフ
ァーメンタ−に前記組成の液体培地を２０７入れて滅菌
したものに接種し、温度３２’Ｃ，通気ｆｆ１２０ｚ／
分及び撹拌機回転数３００〜５００ｒｐｍの条件下に６
日間培養を行った。

培養により産生じた物質の活性の検定はエシェリヒア・
コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＢＥ　
１）８６株の寒天平板培養により生育阻止をもって判定
した。

■抽出及び精製工程 上記培養終了後、得られた培養液２０βを遠心分離に付
して菌体を除去し、その上清液を１μのカートリッジフ
ィルターを用いてさらに清澄化して清澄液１５１を得た
。次いで、この清澄液を分子量分画６０００膜（旭化成
社製、フォローファイバー）を用いて脱塩し、透過液の
電導率が３μＳ／ｃｍ以下になるまで摸作を行った。濃
縮液２１が得られた。

この透析？、３縮液を再び１μのカートリッジフィルタ
ーに通して不溶物を除いて、・ｈ澄液を得た。

この゛清澄１夜を、予め０．０５モルリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）で平衡化しておいた４００ｍ　ｌサイズのジ
エチルアミノエチルセファデックスＡ−２５カラムに負
荷して活性画分を吸着させ、上記リン酸緩衝液で十分洗
浄した後、！ｙｋ街液中の塩化カリウム濃度を０モルか
ら徐々に１モル高めることにより活性画分の溶出を行っ
た。

得られた活性溶出液２．５ｊ！に対して８０％フェノー
ルを等量加えてよ（混和し、上層の水相部を分取し、こ
れにエタノールを注加しながら沈澱物を生成させた。

この沈澱を集めて０．０５モルリン酸緩衝液１）に溶解
し、２モルの硫酸アンモニウムを含む上記リン酸緩衝液
１０Ｊに対して４℃で透析を行った。

次いで、得られた透析物を、上記硫酸アンモニウムを含
むリン５２８１街液で平衡化した１００ｃａ　ｌサイズ
のフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラムに負荷して活
性画分を吸着させ、該緩衝液中の硫酸アンモニウムを２
モル濃度から徐々に減少させることにより活性画分の溶
出を行った。活性を示す溶出液０、！Ｍを蒸留水５１に
対して４℃で１６時間透析を行った。透析内液を２５ｍ
　ｆｔまで濃縮して径２．５ｃｍ、長さ１０５ｃｍサイ
ズのセファロースＣＬ−４Ｂカラムに負荷し、０．０５
モルリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）でゲル濾過を行い、２
種の活性画分Ａ２０ｍｊ！と活性画分８１５ｍ１を得た
。これらの活性画分はいずれも赤桃色を呈する粉末とし
て回収し、画分Ａを６５ｍｇ及び画分Ｂを１５ｎｇをそ
れぞれ得た。

両分Ａの分子量はｌＯ万〜１００万であって、Ａ２６０
／　Ａ３０５＝１）．０を示し、画分Ｂの分子量は５〜
６万であって、Ａ２６０／Ａ３０５＝１９．５を示した
。

すなわち、画分Ａは本発明に係る核酸系高分子物質であ
り、画分Ｂは５Ｎ−０７物質である。なお、画分Ａと画
分Ｂを得るに当って、上記ゲル濾過に代えてハイドロキ
シアパタイトクロマトグラフィーによっても両者を別個
に単離することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る物質の紫外部吸収スペクトルを示
し、第２図は同じく赤外部吸収スペクトルを示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）３５乃至４５重量％
   、リボ核酸（ＲＮＡ）６乃至１２重量％、糖（全還元糖
   ）１５乃至１７重量％及びアミノ酸２．５重量％以下を
   構成成分として含有し、下記の性質を示すことを特徴と
   する核酸系高分子物質； ［１］分子量：セフアロースＣＬ−４Ｂを用いたゲル濾
   過法により、０．０５モルトリス塩酸 緩衝液中で分子間会合を生じて約１０万 乃至約１００万（蛋白質換算）の分子量 を示す。 ［２］溶解性と色調：水に易溶であるが、メタノール、
   エタノール、ブタノール、プロ パノール、アセトン及びエーテル等 の有機溶剤に不溶、中性水溶液中で 赤桃色及びアルカリ水溶液中で青紫 色を呈し、酸性水溶液中では沈澱を 生ずる、 ［３］旋光度：０．５％水溶液の〔α〕＾２＾５＿Ｄ＝
   ＋７６°［４］外部吸収スペクトル：添付の第１図に示
   すとおり、 ［５］赤外部吸収スペクトル：添付の第２図に示すとお
   り、 ［６］呈色反応： ニンヒドリン反応　陽性 ブリツクス反応　陰性 エルソン・モルガン反応　陰性 ホーリーローリー反応　陰性 ジフェニルアミン反応　陽性 オルシノール反応　陽性 アンスロン反応　陽性 フェノール硫酸反応　陽性 過マンガン酸カリウム反応　陽性 ［７］分解点：＞２３５℃。