JPH0573399B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明はペプチド結合加水分解酵素活性測定用
試薬キツトに関するものである。 本発明の対象となる酵素とはペプチド結合加水
分解酵素であり、例えばロイシンアミノペプチダ
ーゼ、γ−グルタミルトランスペプチターゼ、シ
スチンアミノペプチダーゼの様な各種（アミノ）
ペプチダーゼやトリプシン、α−キモトリプシ
ン、プラスミン、トロンビン、カリクレイン、ウ
ロキナーゼ、エンドトキシン、第Xa因子、コラ
ゲナーゼ、エラスターゼ、カテプシンの様な各種
プロテアーゼ等が挙げられる。体液中のこれら各
種加水分解酵素活性の測定は有用な診断情報を与
えるものとして臨床的意義が高い。 （従来の技術） 従来のこれらの加水分解酵素の測定法として
は、例えばγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
（γ−GTP）活性測定によく利用されているアミ
ノ化合物をメタ過ヨード酸により適当なカプラー
と酸化縮合させ比色定量をする方法（例えば高林
利行他、臨床病理（補）29、p538（1979））、ある
いはロイシンアミノペプチダーゼ（LAP）活性
測定でみられるアミノ化合物を亜硝酸塩でジアゾ
化して適当なカプラーとカツプリングさせ、その
後比色定量する方法（例えばJ.A.Goldbarg、
Cancer、p283（1958））などの化学的な方法に
よる比色定量法がある。ところが化学的酸化剤
（例えばフエリシアン化カリ、メタ過ヨード酸）
や亜硝酸塩を用いるジアゾカツプリング法を用い
る化学的な方法では目的とする酵素活性は、目的
とする酵素の反応条件と検出して利用される酸化
反応やジアゾカツプリング反応条件が異なること
や、検出反応として利用される酸化剤やジアゾ化
剤が目的とする酵素を阻害する点などにより、検
出反応と同時同一の反応条件下で検出することが
出来ない為に操作段階が多く、測定時間も長く、
全体に測定が繁雑となる。又フエリシアン化カリ
ウムの様な有害な薬品を使用する点や塩酸酸性下
でのジアゾ化反応の様に苛酷な反応条件が必要な
点で問題がある。 また最近、酵素法（特開昭59−88099号）が提
案されている。つまりLAP又はγ−GTPの基質
としてアニリン誘導体を用いて酵素の働きで遊離
したアニリン化合物をカツプラーの存在下、ラツ
カーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、チロシナ
ーゼ等の酸化酵素で発色させ、その吸光度の変化
により加水分解酵素活性を求めるものであり、従
来の化学法のもつ初速度測定が出来ない欠点をな
くした測定法で、酵素活性測定法として優れてい
る。しかし、この方法では基質、カツプラー、酸
化酵素を含む反応液の安定性が悪い。またその為
に使用出来るカツプラー、基質、酸化酵素に制限
があり、実用出来る範囲が狭いものにならざるを
得なかつた。例えばカツプラーや基質としては保
存安定性の劣化を防ぐ為に比較的酸化反応の低い
化合物が選らばれなければならない。その結果測
定に必要な感度が十分得られない欠点がある。又
使用される酸化酵素も比較的酸化縮合反応能の低
いものを使用しないとカツプラーの劣化を生じさ
せる為に酸化反応能の高い酸化酵素が使用出来な
いという制約もあつた。 （問題を解決する為の手段） 本発明者等はかかる従来の欠点を解消し、温和
な反応条件下で操作性、簡便性の優れた正確度の
高い、しかも保存安定性の良い初速度法が可能な
酵素活性測定法を見い出すべく種々鋭意検討した
結果、本発明に到達した。すなわち本発明は下記
一般式〔〕で表わされる基質およびカプラーを
含み、さらにPHが５以下であるか、またはキレー
ト剤を含むか、またはPHが５以下であつて、さら
にキレート剤を含む第一試薬と下記〔〕で表さ
れる基質からペプチド結合加水分解酵素の反応に
より生じた遊離アニリン誘導体をカプラーと酸化
縮合させて新たな吸収をもつ酸化縮合物を形成さ
せる酸化酵素を含む第二試薬からなることを特徴
とするペプチド結合加水分解酵素活性測定用試薬
キツトである。

【化】 （式中、Xmは同じか又は異なつたアミノ酸がｍ
個結合したペプチド残基を示し、Ｃ末端のアミノ
酸は芳香族基に結合したアミノ基とアミド係合を
形成している。Ａは上記ペプチド残基のＮ末端を
保護する基又は水素原子を示す。ｍ＝１〜10であ
る。Ｚは水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル
基、低級アルコキシル基、アミノ基、水酸基、カ
ルボキシル基、スルホン酸基、置換アミノ基を示
し、ｎ＝１〜５である。複数のＺは同じでも異な
つていてもよく、又置換基−NH−のオルト位と
メタ位で環を形成する基であつてもよい。） 本発明では一般式〔〕で表わされる基質がペ
プチド結合加水分解酵素反応の結果、下記一般式
〔〕で表わされる遊離アニリン誘導体を生じ、
この遊離アニリン誘導体をカプラーの共存下、酸
化酵素と作用させて酸化縮合物を得、その分光学
的な吸光度の変化を測定するか、又は酸化酵素に
より消費される酸素を酸素電極等で測定すること
により、ペプチド結合加水分解酵素活性を測定す
ることができる。

【化】 （式中、Ｚは水素原子、ハロゲン原子、低級アル
キル基、低級アルコキシル基、アミノ基、水酸
基、カルボキシル基、スルホン酸基、置換アミノ
基を示し、ｎ＝１〜５である。複数のＺは同じで
も異なつていてもよく、また置換基−NH₂のオ
ルト位とメタ位で環を形成する基であつてもよ
い。） 本発明の第一試薬は一般式〔〕で表わされる
基質およびカプラーを含み、さらにPH５以下であ
るか又はキレート剤を含むか、又はPH５以下であ
つて、かつキレート剤を含む。キレート剤を含ま
ず、かつPHが５を越えると、調製直後の吸光度が
高く実用不可能であるか、調製時は使用可能であ
つても保存中に試薬ブランクが上昇する。 一般式〔〕で表わされる基質とは先に説明し
た遊離アニリン誘導体〔〕を構成成分としても
つ化合物であり、かつ各種ペプチダーゼ、各種プ
ロテアーゼの様なペプチド結合加水分解酵素が作
用する基質であれば、いかなるものでも良い。例
えば基質〔〕の基Ａ−Xmとしては、ロイシン
アミオペプチダーゼの基質となるＬ−ロイシル
基、γ−グルタミルトランスペプチダーゼの基質
となるγ−Ｌ−グルタミル基、シスチンアミノペ
プチダーゼの基質となるＳ−ベンジル−Ｌ−シス
テニル基、Ｘ−プロリル−ジペプチジル−アミノ
ペプチダーゼの基質となるグリシル−Ｌ−プロリ
ル基、トロンビンの基質となる Bz−Phe−Val−Arg−（Bz：ベンゾイル基） Tos−Gly−Pro−Arg−（Tos：トシル基） Boc−Val−Pro−Arg−（Boc：ｔ−ブトキシ
カルボニル基） Ｈ−Ｄ−Pro−Arg−、Ｈ−Ｄ−Phe−Pip−
Arg− プラスミンの基質となる Tos−Gly−Pro−Arg− Boc−Gly−Lys−Lys− Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys− Boc−Val−Leu−Lys− ウロキナーゼの基質となる Bz−Val−Gly−Arg− Pyro−Gly−Gly−Arg− Glutaryl−Gly−Arg− カリクレインの基質となる Bz−Pro−Phe−Arg− Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg− Ｚ−Phe−Arg−（Ｚ：カーボベンゾイル基） Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Arg− Pro−Phe−Arg− 第Xa因子の基質となる Bz−Ile−Gly−Gly−Arg− Boc−Ile−Gly−Glu−Arg− エンドトキシンの検出に利用される基質となる Boc−Leu− Boc−Val−Leu− Boc−Ser− Boc−Val−Ser− Bz−Leu− Bz−Val−Leu− Bz−Ser− Bz−Val−Ser− 等があげられる。 次に使用されるカプラーとしては、一般式
〔〕で示される化合物を基質として用い、ペプ
チド結合加水分解酵素反応の結果、生じた遊離ア
ニリン誘導体〔〕で表わされる化合物と酸化縮
合して新たな吸収をもつ化合物を形成するもので
あれば、いかなるものでもよい。例えばｐ−キシ
レノール、ｐ−クロロフエノール３，５−ジクロ
ロフエノールスルホン酸、３−ハイドロキシ−
２，４，６−トリヨード安息香酸の様なフエノー
ル誘導体やＮ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−
ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トル
イジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）
−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、
３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
エチル）−アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチ
ルフエニル）−N′−サクシニルエチレンジアミ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフエニル）−
N′−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−
Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（β−メチルスルホンアミドエチル）−ｍ
−トルイジンの様なアニリン誘導体や１−ナフト
ール−２−スルホン酸の様なナルトール誘導体等
が挙げられる。次に遊離アニリン誘導体〔〕と
しては各種ペプチダーゼや各種プロテアーゼの様
な各種加水分解酵素が作用して化合物〔〕を遊
離してくる様な上記加水分解酵素の基質〔〕と
なる化合物の構成成分である化合物〔〕であれ
ばいかなる化合物でも良い。例えば４−アミノ−
Ｎ−エチル−Ｎ−（β−メタンスルホンアミドエ
チル）−ｍ−トルイジン、４−アミノ−３−メチ
ル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−Ｎ−エチルア
ニリン、ｐ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル
アニリン、２−アミノ−５−ジエチルアミノトル
エン、ｐ−モルフオリノアニリン、ｐ−Ｎ，Ｎ−
ジスルホプロピルアミノアニリン、ｐ−Ｎ，Ｎ−
ジエチルアミノアニリン、β−ナフチルアミン、
α−ナフチルアミン、３−カルボキシ−４−ヒド
ロキシアニリン、３−カルボキシ−４−Ｎ，Ｎ−
ジ−ｎ−プロピルアミノアニリン等の化合物が挙
げられる。 本発明に用いるキレート剤としては、一般的な
金属キレート化剤が使用され、金属イオンを補促
して不活性化できるものである限り、その種類は
問わないが、代表的なものとしてはエチレンジア
ミン四酢酸並びにその塩が例示される。 本発明の第二試薬は酸化酸素を含む。 本発明において使用する酸化酵素としては、反
応において少なくとも酸素を消費して新たな吸収
を示す酸化縮合物を生成する酸化酵素であれば特
に限定しない。このような酵素としては例えばラ
ツカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、ポリフエノ
ールオキシダーゼ、チロシナーゼ、アスコルビン
酸オキシダーゼ、アミノフエノールオキシダーゼ
などが挙げられる。その起源としては例えばラツ
カーゼとしてはウルシやコリオラス（Coriolus）
属産生のもの（特開昭58−47489号公報）があり、
またビリルビンオキシダーゼとしてはミロセシウ
ム（Myrothecium）属由来（Agric.Biol.Chem.、
45、2383（1981））のものがあり、またアスコルビ
ン酸オキシダーゼとしてはカボチヤやキユウリ由
来のもの（特開昭56−88793号公報）が挙げられ
る。 本発明の第一試薬および第二試薬には、測定す
る酵素の種類に応じて必要な物質例えばアミノ酸
やペプチド等が含まれている。測定する酵素が例
えばγ−グルタミルトランスペプチダーゼの場合
には、第一試薬または第二試薬にはグリシルグリ
シンが適当量含まれている。 本発明の試薬キツトは一般式〔〕で表わされ
る基質およびカプラーを含み、さらにPH５以下で
あるか、又はキレート剤を含むか、又はPH５以下
であつてキレート剤を含む試薬を第一試薬とし、
酸化酵素を含む試薬を第二試薬とする。 第一試薬がカプラーを含有せずに、第二試薬が
カプラーを含有するとプランク値が向上して好ま
しくない。また第一試薬がカプラーを含んでいて
もPHが５を越え、かつキレート剤を含有していな
いとブランク値の上昇がみられる。 本発明のペプチド結合加水分解酵素活性測定用
試薬キツトは上記第一試薬と上記第二試薬とから
なり、プロテアーゼ活性を測定するには、例えば
血清あるいは尿等の被検液に第二試薬を加え、約
37℃に予備加温し、続いて第一試薬を加えるか又
は第一試薬を添加後に第二試薬を加えてもよい。
また第一試薬と第二試薬を同時に被検液に加えて
もよい。さらに本発明の第一試薬に第二試薬と被
検液を加えてもよい。 上記試薬を作用させる条件としては特に限定は
ないが、被検液中の加水分解酵素が作用する条件
のPHを保つ緩衝液を使用することが多い。通常は
PH5.0〜10.0に保つ様な緩衝液が用いられる。 次に酸化酵素の使用量は加水分解酵素反応を追
跡するに十分な量であれば特に限定はない。例え
ば反応液１ml当り0.1〜100単位もあれば十分であ
る。カプラーの濃度としては遊離してくるアニリ
ン誘導体〔〕に対して等モル以上を用いればよ
く、場合によつては上限として目的とする加水分
解酵素活性を阻害しない程度の量となる。 次に基質濃度としては目的とする加水分解酵素
活性を十分に発揮させる濃度であればよく、場合
によつては上限として加水分解酵素が基質阻害を
受けない程度の量となる。次に金属キレート剤の
濃度としては特に制限はないが通常は0.1〜1000
ｍＭ程度であれば十分である。次に基質及びカプ
ラー又は酸化酵素及びカプラーを含む試薬をPH
5.0以下に保つ方法は、それを構成する成分の安
定性に影響を与えないものであればいかなる組
成、方法でもよい。 反応温度としては通常臨床化学分析に利用され
る温度、例えば20〜50℃の範囲で行えば良い。 本発明では酸化酵素を作用させた後の定量を生
成してくる酸化縮合物の分光学的な吸光度の変化
を測定するか、又は酸化酵素により消費される酸
素を酸素電極等で測定するかして対応する加水分
解酵素活性を求める。 （発明の効果） 本発明の試薬キツトを用いると温和な条件下で
操作性、簡便性に優れた正確度の高い、しかも保
存安定性の良い初速度法が可能な化合物〔〕を
基質とするペプチド結合加水分解酵素活性の定量
が可能となり、臨床検査の診断分野にとつて極め
て有意義なものとなる。 （実施例） 以下実施例により本発明を説明する。 実施例 １ 下記試薬組成を有し、試薬構成が第１表で示さ
れる試薬キツトNo.１〜７を用いて、試薬ブランク
及びγ−グルタミルトランスフエラーゼ（γ−
GTP）活性を測定し、その結果を第２表に示す。 Ａ 試薬組成 酸化酵素；ラツカーゼ（自家製）（終濃度）
5u／ml 基質；Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ジエチルアミ
ノアニリド（和光純薬製） ５ｍＭ Gly−Gly；グリシルグリシン（半井化学薬品
製） 100ｍＭ カプラー；ジエチルアニリン（和光純薬製）
１ｍＭ キレート剤；EDTA−2Na 緩衝液；トリス−HCl緩衝液（PH7.5） 100ｍ
Ｍ

【表】

【表】 Ｂ 測定法 サンプル50μに第１表の試薬R₂を2.0ml加
え、37℃で予備加温し、続いて試薬R₁を0.5ml
加えた後、波長745mmでの１分間当りの吸光度
の増加を測定し、γ−GTP活性（△OD／
min）とする。又サンプルの代わりに水50μ
を加えて上記と同様試薬R₁試薬R₂を加え、波
長745mmで吸光度を測定したものをブランク値
とする。

【表】 第２表から明らかなように試薬キツトNo.１、
２は調製直後の吸光度が高くて実用不可能、No.
３、４は調製時は使用可能であるが、保存中に
試薬ブランクが上昇し、γ−GTP活性値も低
値を示し試薬の劣化を示している。しかしNo.
５、６、７は問題なく使用可能である。 実施例 ２ 下記試薬組成をもつγ−GTP測定用使用キツ
トを用い、既知濃度の検体を分析した結果を第１
図に示す。 Ａ 試薬組成 R₂ 0.1Mトリス−塩酸緩衝液 （PH7.5） グリシルグリシン 100ｍＭ ラツカーゼ 5u／ml R₁ HCl 10ｍＭ EDTA−2Na １ｍＭ Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ジエチル ５ｍＭ アミノアニリド ジエチルアニリン １ｍＭ Ｂ 測定法 既知検体50μに試薬R₂を2.0ml加え、37℃で
予備加温し、次いで試薬R₁0.5ml加えた後、波
長745mlで反応の直線部の１分間当りの吸光度
の変化を測定する。 実施例 ３ 下記試薬組成を有し、試薬構成が第３表で示さ
れる試薬キツト９〜11を用いて、試薬ブランク及
びロイシンアミドペプチダーゼ（LAP）活性を
測定した。その結果を第４表に示す。 Ａ 試薬組成 酸化酵素：ビリルビンオキシダーゼ 10U／ml 基質：Ｌ−ロイシル−ｐ−ジエチルアミノアニ
リド ５ｍＭ カプラー：Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロ
ピル）−ｍ−アニシジン １ｍＭ キレート剤：EDTA−2Na 緩衝液：トリス−HC1緩衝液 PH7.5 100ｍＭ またはリン酸緩衝液 PH4.7 10ｍＭ

【表】 Ｂ 測定法 サンプル50μに第３表の試薬R₂を2.0ml加
え、37℃を予備加温し、続いて試薬R₁を0.5ml
加えた後、波長750nｍでの１分間当たりの吸
光度の増加を測定し、LAP活性（ΔOD／分）
とする。上記と同様な操作を行い、750nｍで
吸光度を測定したものをブランク値とする。

【表】 第４表から明らかなように、キツトNo.９は実用
不可能であるが、キツトNo.10、11は使用可能であ
つた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の試薬キツトを用い、γ−
GTPを測定した場合の検量線を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記式〔〕で表される基質およびカプラー
   を含み、さらにPHが５以下であるか、またはキレ
   ート剤を含むか、またはPHが５以下であつて、さ
   らにキレート剤を含む第一試薬と下記〔〕で表
   される基質からペプチド結合加水分解酵素の反応
   により生じた遊離アニリン誘導体をカプラーと酸
   化縮合させて新たな吸収をもつ酸化縮合物を形成
   させる酸化酵素を含む第二試薬からなることを特
   徴とするペプチド結合分解酵素活性測定用試薬キ
   ツト。 【化】 （式中、Xmは同じか又は異なつたアミノ酸がｍ
   個結合したペプチド残基を示し、Ｃ末端のアミノ
   酸は芳香族基に結合したアミノ基とアミド結合し
   ている。Ａは上記ペプチド残基のＮ末端を保護す
   る基又は水素原子を示す。ｍ＝１〜10である。Ｚ
   は水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低
   級アルコキシル基、アミノ基、水酸基、カルボキ
   シル基、スルホン酸基、置換アミノ基を示し、ｎ
   ＝１〜５である。複数のＺは同じでも異なつてい
   てもよく、又置換基−NH−のオルト位とメタ位
   で環を形成する基であつてもよい。）