JPH0578314B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0578314B2 JPH0578314B2 JP61265090A JP26509086A JPH0578314B2 JP H0578314 B2 JPH0578314 B2 JP H0578314B2 JP 61265090 A JP61265090 A JP 61265090A JP 26509086 A JP26509086 A JP 26509086A JP H0578314 B2 JPH0578314 B2 JP H0578314B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- layer
- oxidized
- dry
- coenzyme
- detection reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、血液、血清などの水性液体試料中の
アナライト（被検物質）の分析に有利に使用され
る酸化型補酵素含有乾式分析要素に関するもので
ある。 ［従来の技術］ 脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ系酵素）と酸化
型ニコチンアミド補酵素とを共役反応系に組合わ
せた検出反応は、臨床化学分析において広く用い
られている。例えば、グリセリンデヒドロゲナー
ゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒ
ドロゲナヒゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グ
ルタメートデヒドゲナーゼ、アルデヒドデヒドロ
ゲナーゼ、α−グリセロフオスフエートデヒドロ
ゲナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナー
ゼ等が関与する反応系が、トリグリセリド、グリ
セリン、コレステロール、乳酸、グルタメート、
グリセリン−３−燐酸、グルコース−６−燐酸等
の基質や、アスパラギン酸アミノトランスフエラ
ーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフエラー
ゼ（ALT）、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、ア
ミラーゼ、クレアチンナーゼ（CK）等の酵素の
定量に用いられている。この検出反応系では、生
成する還元型補酵素の量の直接測定によつて酵素
の定量分析ができる点に特徴がある。しかし、生
成する還元型補酵素として通常用いられるニコチ
ンアミド補酵素であるNADH（ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド）またはNADPH（ニコチ
ンアミドアデニンンジヌクレオチドフオスフエー
ト）は、その吸収極大波長が340nm付近にあるた
め、光学的定量のためには、紫外光域の光の測光
装置が必要となり、機器が高価なものになる。ま
た、紫外光域ではNADHやNADPH以外の多種
の化合物が吸収を有するために光学的定量に際し
てはそれらの化合物の吸収に干渉を受け易いとの
問題がある。 上記の理由から、NADH（又はNADPH）を紫
外光域の吸収により直接定量する代りに、
NADHの存在下で、電子伝達性化合物を介して
電子受容性化合物を還元し、可視領域において検
出可能な化合物（染料）を形成する反応系を利用
する検出反応が提案されている。 しかし、この検出反応系において、酸化型補酵
素、電子伝達性化合物、電子受容性化合物の三者
を共存させておくと、日時の経過とともに反応の
感度が著しく悪化するとの問題がある。特に、特
公昭53−21677号公報、特開昭55−164356号公報、
特開昭60−222769号公報に記載されたような乾式
一体型多層分析要素に上記反応系を組入れると
き、この点が大きな問題となる。 特開昭49−11395号公報では、上記三成分のう
ち電子伝達性化合物を、異なる層に配置すること
を提案している。また、特開昭59−44658号公報
では、電子伝達剤と色素形成物質とを、互いに実
質的に反応しえないように疎水性物質を親水性分
散媒中に分散する方法を開示している。特開昭59
−88096号公報では、上記三成分のうち電子伝達
性化合物と色素形成性前駆物質（電子受容性化合
物で、前記の色素形成物質と同じ）とを互いに実
質的に反応しえないように、前記特開昭49−
11395号公報におけると同様に別異の層に配置す
ること、または両者を別々の粒子として同一の層
に配置することを提案している。しかし、このよ
うに電子伝達性化合物を他の二試薬から分離する
と、検出反応の進行は、分離された試薬（特に電
子伝達性化合物）の拡散速度で支配されるため、
反応速度の低下、したがつて検出感度の低下をま
ねくとの問題がある。 上記NADH（またはNADPH）検出組成物を乾
式一体型多層分析要素（例えば特公昭53−21677
号公報、特開昭55−164356号公報、特開昭60−
222769号公報に記載の自動化学分析用多層分析素
子）の試薬層に適用すると、組成物の染料形成速
度は常温の保存で数週間以内に1/2以下になるこ
とが見出された、この原因を究明すると、特開昭
57−132061号公報で言及しているような電子受容
性化合物の劣化が原因ではなく、主たる原因は、
酸化型補酵素のNAD（またはNADP）の劣化に
あることがわかつた。緩衝役中の補酵素の劣化を
防ぐ方法とて、特開昭59−82398号公報に開示さ
れたようなキレート化剤とアジ化物を併せて添加
する方法が知られている。しかし、爆発性と毒性
を有するアジ化物を用いなければ効果が上がら
ず、安全上および公害の点から好ましくない。 酸化型補酵素NAD（又はNADP）の保存時の
劣化を防止するためには、補酵素を含む試薬層は
塗設時を含めて中性近傍のPH値が好ましいことが
知られている。一方で、脱水素酵素が関与する反
応においては、アルカリ性PH値が好ましいことも
知られている。 しかしながら、上記の保存安定性の低下、検出
感度の低下、安全面の問題の全てを解決した酸化
型補酵素含有乾式分析要素は、これまでに提案さ
れていない。 ［発明の要旨］ 本発明の目的は、脱水素酵素、酸化型ニコチン
アミド補酵素、電子伝達性化合物および電子受容
性染料形成性化合物であるテトラゾリウム塩を含
有する酸化型補酵素含有乾式分析要素であつて、
前記の保存安定性の低下、検出感度の低下、安全
面の問題の全てを解決もしくは改良した酸化型補
酵素含有乾式分析要素を提供することにある。 本発明は、光透過性水不透過性支持体の上に、
脱水素酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、電子
伝達性化合物および電子受容性テトラゾリウム塩
を含有する検出試薬含有層を有する酸化型補酵素
含有乾式分析要素において、上記検出試薬含有層
の上側もしくは下側にアルカリ性PH緩衝剤と親水
性ポリマーバインダーとを含むPH調整層が、被検
液が乾式多層分析要素に点着された際に該分析要
素内のPH値を7.5〜10.0の範囲内に調整できるよ
うに備えられていることを特徴とする酸化型補酵
素含有乾式分析要素にある。 なお、PH調整層は検出試薬含有層の上側に設け
られ、多孔性展開層としても機能する多孔性の層
であることが好ましい。 ［発明の詳細な記述］ 本発明の乾式分析要素においては、まず光透過
性水不透過性支持体の上に、脱水素酵素、酸化型
ニコチンアミド補酵素、電子伝達性化合物および
電子受容性テトラゾリウム塩を含有する検出試薬
含有層が備えられている。 光透過性水不透過性支持体の例としては、ポリ
エチレンテレフタレート、ビスフエノールＡのポ
リカルボネート、ポリスチレン、セルロースエス
テル（例、セルロースジアセテート、セルロース
トリアセテート、セルロースアセテートプロピオ
ネート等）等のポリマーからなる厚さ約50μmか
ら約１mm、好ましくは約80μmから約30μmの範囲
のフイルム、もしくはシート状の透明支持体を挙
げることができる。 本発明の検出試薬含有層は、上記のような光透
過性水不透過性支持体上に直接設けてもよく、あ
るいは親水性ポリマーからなる吸水層を介して設
けてもよい。 吸水層の形成に用いられる親水性ポリマーは、
一般には、水吸収時の膨潤率が30℃で約1.5〜20、
好ましくは約2.5〜15の範囲の天然または合成親
水性ポリマーである。そのような親水性ポリマー
の例としては、ゼラチン（例、アルカリ処理ゼラ
チン、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、
ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン等）、ア
ガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン等を挙げることが
できる。吸水層には、必要により、界面活性剤
（カチオン性、両性または非イオン性の界面活性
剤）を含有させることもできる。 本発明の検出試薬含有層は通常、上記の四種の
検出試薬（脱水素酵素、酸化型ニコチンアミド補
酵素、電子伝達性化合物、および電子受容性テト
ラゾリウム塩）が親水性バインダーに分散された
層として形成される。 本発明の乾式分析要素では、酸化型ニコチンア
ミド補酵素が電子受容体となる全ての酸化還元酵
素（脱水素酵素：デヒドロゲナーゼ系酵素）が関
与する反応系の定量測定が可能である。従つて、
定量測定対象物質（アナライト）が脱水素酵素の
基質に該当する物質であれば、そのアナライトに
対応する脱水素酵素を用いることにより、目的の
アナライトの定量が可能となる。 一方、アナライトが脱水素酵素である場合に
は、乾式分析要素には、関与する脱水素反応の基
質が加えられる。例えば、本発明の乾式分析要素
を乳酸デヒドロゲナーゼ活性測定用として用いる
場合には、乳酸を分析要素内に含有させておく必
要がある。アナライトがグルコース−６−燐酸デ
ヒドロゲナーゼである場合には、基質としてグル
コース−６−燐酸が添加される。 酸化型ニコチンアミド補酵素は、具体的には、
NAD＋（ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチ
ド酸化型）、またはNADP＋（ニコチンアミド・
アデニンジヌクレオチド・ホスフエート酸化型）
を意味する。NAD＋およびNADP＋の内どちら
を使用するかは、シナライトとして、あるいは検
出試薬として検出反応に関与する酸化還元酵素の
種類に応じて決定される。 本発明において電子伝達性化合物とは、アナラ
イトとの反応により生成する還元型ニコチンアミ
ド補酵素（電子供与体）から電子を受け取つて、
後述する電子受容性テトラゾリウム塩（電子受容
性染料形成化合物）を還元する機能を有する化合
物を意味する。電子伝達性化合物の具体例として
は、５−メチルフエナジニウム・メチルスルフエ
ートあるいは１−メトキシ−５−メチルフエナジ
ニウム・メチルスルフエート等のＮ−メチルフエ
ナジン・メトサルフエート類およびジアホラーゼ
（ジヒドロリポアミドレダクターゼ、EC1.6.4.3.）
等を挙げることができる。 本発明の乾式分析要素において、電子受容性染
料形成性化合物として用いられにテトラゾリウム
塩の具体例としては、 ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフエニル−2H
−テトラゾリウムクライド］（＝NBT）； ３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ−ニトロ
フエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾリウム
クロライド（＝INT）； ３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−
2H−テトラゾリウムブロマイド（＝MTT）； ３，3′−（４，4′−ビフエニレン）−ビス（２，
５−ジフエニル−2H−テトラゾリウムクロライ
ド； ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン（−ビス（２，５−ジフエニル−2H−テ
トラゾリウムクロライド；および ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス［２，５−ビス（ｐ−ニトロフエ
ニル）−2H−テトラゾリウムクロライドを挙げる
ことができる。 なお、上記酸化型ニコチンシミド補酵素、電子
伝達性化合物および電子受容性染料形成性化合物
を含む反応系の詳細については、 A.L.Babson等によるクリニカ・キミカ・アク
タ［CLINICA CHIMICA ACTA］12巻（1965）
210−215頁； R.J.Gay等によるクリニカル・ケミストリー
［CLINICAL CHEMISTRY］Vol.14，No.８，
1968，740−753頁；および、 R.D.Capps 等によるクリニカル・ケミスト
リー、Vol.12，No.７，1966、406−413頁；等の文
献に記載されている。 検出試薬含有層の上には、本発明のPH調整層が
形成される。このPH調整層は、アルカリ性PH緩衝
剤と親水性ポリマーバインダーとを含む層であつ
て、被検液が多層分析要素に点着された際に該分
析要素内のPH値を7.5〜10.0の範囲内に調整でき
るように、アルカリ性PH緩衝剤の種類および量を
選んで調製される。ただし、PH調整層は、被検役
の展開層としても機能するように設けることが好
ましい。 PH調製層は、検出試薬含有層の上に直接設けて
もよいが、公知の光遮蔽層（反射層）、接着層あ
るいは前述のな吸水層などのような補助層を検出
試薬含有層の上に一層まは複数層設けた上に形成
してもよい。 例えば、光遮蔽層は通常、皮膜形成能を有する
親水性ポリマーをバインダーとして、光反射性微
粒子が分散されている水浸透性の層として形成さ
れる。光反射性微粒子は、検出試薬含有層（また
はその隣接層）において生じた検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側
から反射測光する際に、分析要素に点着供給され
た被検液の色、特に試料が全血である場合のヘモ
グロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層ま
たは背景層としても機能する。光反射性を有する
微粒子の例としては、二酸化チタン微粒子、硫酸
バリウム微粒子を挙げることができる。なお、光
遮蔽性微粒子は後述する展開層に含有させてもよ
い。 接着層は通常、水で湿潤しているとき、または
水を含んで膨潤したときに展開層を接着すること
ができるような親水性ポリマーから形成される。
接着層に用いることができる親水性ポリマーの例
としては、吸水層に用いられるものと同様な親水
性ポリマーが挙げられる。これらのうちではゼラ
チン、ゼラチン誘導体、ポリシクリルアミド等が
好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約0.5μm〜
約20μm、好ましくは約1μm〜約10μmの範囲であ
る。接着層は親水性ポリマーと、必要によつて加
えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法
で、試薬層等の上に塗布する方法などにより設け
ることができる。 本発明の特徴的な層であるPH調整層は、前述の
ように展開層としても機能するように設けること
が好ましい。 乾式分析要素における展開層（多孔性展開層、
液体試料展開層、あるいはメータリング層ともい
う）は、その表面に点着供給された液体試料を、
その中に含有している成分を実質的に偏在させる
ことなく、横（水平）方向に単位面積当りほぼ一
定量の割合で広げる作用を有するものであり、既
に多くの乾式分析要素の構成層として用いられて
いる。 展開層のマトリツクスを構成する材料として
は、濾紙、不織布、織物生地（例、ブロード、ポ
プリン等の平織等）、編物生地（例、トリコツト
編、ダブルトリコツト編、ミラニーズ編等）、ガ
ラス繊維濾紙、ブラツシユポリマーより形成され
るメンブランフイルター、あるいはポリマーミク
ロビーズ等からなる三次元格子状構造物等を挙げ
ることができる。これらのうちでは、試薬類の保
持性の点で、織物生地および編物生地に代表され
る繊維質層を用いることが好ましい。 上記織物または編物生地を本発明の乾式分析要
素の展開層材料として用いる場合には、さらにそ
の織物または編物生地に特開昭57−66359号公報
に開示の物理的活性化処理（好ましくはグロー放
電処理またはコロナ放電処理等）を生地の少なく
とも片面に施すか、あるいは特開昭55−164356
号、特開昭57−66359号公報等に開示の親水性ポ
リマー含浸処理等の親水性処理またはこれらの処
理行程を逐次実施することにより織物または編物
を親水化し、下側（支持体に近い側）の層との接
着力を強化することができる。 織物または編物生地からなる一体型多層分析要
素の展開層を前述した吸水層または接着層に接
着、積層するには、特開昭55−164356号および特
開昭57−66359号公報等に開示の方法が利用でき
る。すなわち、吸水層または接着層の塗布後未乾
燥のうちに、または乾燥後の層に水）または界面
活性在を少量含む水）を実質的に均一に供給して
層を膨潤させ、ついで織物または編物生地を湿潤
または膨潤している層の上に実質的に均一に軽く
圧力をかけながら接着、積層し一体化する方法で
ある。 また展開層がブラツシユポリマーまたはメンブ
ランフイルターからなる場合には特開昭53−
21677号公報等、ポリマーミクロビーズからなる
三次元格子状構造物である場合には特開昭55−
90859号公報等、濾紙または不織布からなる場合
には特開昭57−148250号公報等にそれぞれ記載の
方法に従つて設けることができる。 多孔性展開層をPH調整層として用いる場合に
は、前述のように展開層にアルカリ性PH緩衝剤を
含有させる。アルカリ性PH緩衝剤の例としては、
２−アミノ−２メチル−１，３−プロパンジオー
ル、２−アミノ−２−エチル−１，２−プロパン
ジオール、ジエタノールアミン、エタノールアミ
ン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパンジオ
ール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、トリメチルアミン等が挙げられる。このほう
に用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学
便覧 基礎編」（東京、丸善(株)、1966年発行）
1312−1320頁、R.M.C.Dawson et al 編「Data
for Biochemical Research」第２版、（Oxford
at the Clarendon Press、1969年発行）476−
508頁、「Biochemistry」５，467頁以降（1966
年）、「Analytical Biochemistry」104300−310
頁（1980）等に記載のPH緩衝剤系がある。 展開層をPH調整層として用いる場合には、展開
層に親水性ポリマーを含有させる。用いうる親水
性ポリマーの例としてポリビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリ
アクリル酸、親水性セルロース誘導体等がある。
これらのPH調整層の形成に用いられる親水性ポリ
マーは、前述の検出試薬含有層形成用に用いられ
る親水性ポリマーとは別の溶解挙動（例えば、ア
ルコールなどの極性機溶媒に良く溶解する性質を
有すること）などを示すものであることが好まし
い。親水性セルロース誘導体は炭素原子数１〜３
の低級アルキル基、または炭素原子数１から４の
ヒドロキシ基置換低級アルキル基により水酸基の
一部または全部がエーテル化されたセルロースエ
ーテル類である。セルロースエーテルの例として
水溶性であるメチルセルロース、エチルセルロー
ス、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチ
ルセルロースが挙げられる。好ましい親水性ポリ
マーはポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、及び水溶性セルロースエーテル類が好まし
い。親水性ポリマーは二種以上を併用することが
できる。親水性ポリマーの展開層中の含有量は展
開層１m2当り約0.5〜15g、好ましくは約0.7〜10g
の範囲である。 展開層は通常、界面活性剤を含有する。界面活
性剤としてはノニオン性、カチオン性、アニオン
性、または両性の界面活性剤の中から適宜に選択
して用いることができる。これらのうちでは、一
般的にはノニオン性界面活性剤が好ましい。ノニ
オン性界面活性剤は多価アルコールエステルメチ
レンオキシド付加物（縮合物）、ポリエチレング
リコールモノエステル、ポリエチレングリコール
ジエステル、高級アルコールエチレンオキシド付
加物（縮合物）、アルキルフエノールエチレンオ
キシド付加物（縮合物）および高級脂肪酸等があ
る。これらのノニオン性界面活性剤は二種以上を
組合せて用いることができる。ノニオン性界面活
性剤を親水性セルロース誘導体と組合せて用いる
場合にはHLB値10以上のものが好ましい。 展開層におけるノニオン性界面活性剤の含有量
は１m2当り約0.1〜3g、好ましくは約0.2〜2gの範
囲である。 アナライトがポリマーバインダーの均一な塗布
層を通過しがたい場合（例、親油性アナライト、
高分子アナライト）、多孔性展開層にそのアナラ
イトの分解酵素を含有させることが好ましい。 なお、PH調整層として機能する展開層に、アル
カリ性PH緩衝剤を含有させるためには、検出試薬
含有層を構成する親水性ポリマーと前記検出試薬
組成物とを実質的に溶解せず、また膨潤させるこ
ともなく、一方、アルカリ性PH緩衝剤とPH調整層
の親水性ポリマーを溶解もしくは分散し、一方、
検出試薬層の親水性ポリマーバインダーを実質的
に膨潤させない有機溶媒に、アルカリ性PH緩衝剤
とPH調整層用の親水性ポリマーを溶解または分散
させて、展開層のマトリツクス材料に含浸させる
方法を利用ことが好ましい。すなわち、PH調整層
形成用の溶媒が、下層の検出試薬含有層を溶解も
しくは膨潤させると、アルカリ性PH緩衝剤が検出
試薬含有層中に混入することがあり、この場合に
は、保存安定性や感度の優れた乾式分析要素を得
ることができなくなる。 有機溶媒はこのような条件を満たすものであれ
ばよいが、一般的には沸点が100℃以下の極性有
機溶媒がよく、例えば脂肪族アルコール（例、メ
タノール、エタノール、プロパノール、ブタノー
ル、イソプロピルアルコール）、ジアルキルケト
ン（例、アセトン）、ジアルキルエーテル（例、
ジメチルエーテル）、脂肪族環状エーテル（例、
テトラヒドロフラン、ジオキサン）等が適当であ
る。これらのなかでは脂肪族アルコールが好まし
く、作業環境等も考慮すると、エタノール、プロ
パノール、ブタノール、イソプロピルアルコール
等の人体の毒性の小さいアルコールが特に望まし
い。溶液または分散液の濃度は含有を容易に行な
うことができ、かつ展開層に均一に浸透させうる
範囲でなるべく高濃度にするのがよく、その濃度
はアルカリ性PH緩衝剤と親水性ポリマーの種類等
にもよるが、例えば、約0.2％〜約10％、好まし
くは約0.3％〜約７％の範囲が適当である。溶液
の調製方法は常法により行なうことができる。 アルカリ性PH緩衝剤と親水性ポリマーとは展開
層に一緒に含浸させてもよく、あるいは別々に含
浸させてもよい。 また、展開層に界面活性剤を含有せしめる場合
には、アルカリ性PH緩衝剤および／または親水性
ポリマーと界面活性剤との混合溶液にしてもよ
く、別々の溶液に別個に含有させてもよい。 アルカリPH緩衝剤の多孔性展開層への含浸は該
展開層を積層した後に行なうのがよい。展開層が
ミクロフイルター、編物あるいは織物などの構造
体の場合には、先に含有させてから積層すること
もできるがその場合には含有量のコントロールが
難しいという問題点がある。従つて、展開層を試
薬層の上に（直接、または接着層等を介して）設
けた後、アルカリ性PH緩衝剤を展開層中に含有
（含浸）させるのが、分析精度および製造コスト
の点で有利である。含浸は、例えば公知の展開層
の上から均一に塗布あるいは噴霧する方法を利用
することができる。含浸後の感想は風乾あるいは
減圧乾燥等によつて行なえばよい。 なお、上記では、本発明のPH調整層を展開層と
しても機能させるように形成する方法を記載した
が、先に説明した検出試薬含有層の上に、均一層
としてのPH調整層を設けた上に、通常の展開層を
設けてもよいことは勿論である。 あるいは、PH調整層は、同様な方法を利用して
検出試薬含有層の下側に設けてもよい。 本発明の乾式分析要素は、一体型多層分析要素
とした場合には、一辺約15mmから約30mmの正方形
またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特
開昭57−63452号、特開昭54−156079号、実開昭
56−142454号、実開昭58−32350号又は特開昭58
−501144号各公報等に開示のスライド枠等に納め
て分析スライドとして用いるのが製造、包装、輸
送、保存、測定操作等の全ての観点で好ましい。 本発明の乾式分析要素は、約5μから約30μ
、好ましくは約8μから約15μの水性液体試
料を展開層に点着供吸し、必要に応じて約20℃か
ら約45℃の範囲の実質的に一定の温度でインクベ
ーシヨンする。その後、一方の側から（一体型多
層分析要素においては光透過性支持体側から）乾
式分析要素内の色変化、発色等の検出可能な変化
を反射測光し比色法の原理により液体試料中の測
定対象成分を分析する。 ［発明の効果］ 本発明の乾式分析要素においては、酸化型ニコ
チンアミド補酵素、電子伝達性化合物および電子
受容性染料形成性テトラゾリウム塩を含む検出試
料層と、アルカリ性PH緩衝剤成を、被検液の点着
前には接触が発生しないように別層に配置し、一
方、被検液の点着後はそれらが速やかに接触し
て、目的の酵素反応に適したPH環境が形成される
ようにしたことにより、酸化型ニコチンアミド補
酵素の保存性が著しく向上することと、保存時の
カブリ（着色）生成を著しく防ぐことで、分析結
果の再現性や、検出精度が顕著に向上する。 以下に本発明の実施例及び比較例を示す。 ［実施例１］ ゼラチン下塗りの施された厚さ180μmの無色透
明ポリエチレンテレフタレート（PET）フイル
ム上に下記被覆量になるように中性脂肪検出用呈
色試薬層を水溶液を用いて塗布し、乾燥して設け
た。 アルカリ処理ゼラチン 17g／m2 ノニルフエノキシ ポリエトキシエタノール （平均15オキシエチレン含有） 75mg／m2 ATP 1.5g／m2 硫酸マグネシウム 1.2g／m2 NAD 280mg／m2 ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′− ビフエニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロ フエニル）−2H−テトラゾリウム］ ジクロリド 550mg／m2 クエン酸ナトリウム 3.7g／m2 ジアホラーゼ （EC 1.6.4.3） 6000U／m2 グリセロールキナーゼ （EC 2.7.1.30） 1800U／m2 グリセロール−３燐酸 デヒドロゲナーゼ 10000U／m2 （EC 1.1.99.5） この液にIN水酸化ナトリウム水溶液を滴下し
PH6.8に調整した。 上記試薬層の上に、下記塗布量になるようにし
て光遮蔽層を水分散液を用いて塗布、乾燥した。 アルカリ処理ゼラチン 5.0g／m2 ルチル型二酸化チタン 28g／m2 ノニルフエノキシ ポリエトキシエタノール （平均15オキシエチレン含有） 100mg／m2 次に、光遮蔽層の上に下記の塗布量になるよう
にして接着層を水溶液を用いて塗布し、乾燥して
設けた。 アルカリ処理ゼラチン 2.7g／m2 ノニルフエノキシ ポリエトキシエタノール （平均15オキシエチレン含有）270mg／m2 次に、接着層の上に30g／m2の割合で水を湿し
水として供給し、湿潤させたのち、グロー放電処
理で親水化したポリエチレンテレフタレート紡績
糸（太さ50デニール）からなるニツト編物生地
（平均厚さ250μm）を圧着ラミネートして展開層
を設けた。 この展開層の上に下記の組成のアルカリ剤と親
水性ポリマーとを含有するエタノール分散液を、
１m2当り200mlの割合で塗布乾燥し、中性脂肪定
量分析用一体型多層分析要素を完成した。 エタノール 500ml ポリビニルピロリドン （平均分子量36万） 20g／m2 ノニルフエノキシ ポリエトキシエタノール （平均40オキシエチレン含有） 5g／m2 ２−アミノ−１−メチル− １，３−プロパンジオール 9g／m2 ［比較例 １］ アルカリ性PH緩衝剤（２−アミノ−１−メチル
−１，３−プロパンジオール）含有分散液の溶媒
をエタノールから同量の水を替えたアルカリ性PH
緩衝剤含有水溶液を用いた他は実施例１と同様に
して、比較分析要素(1)を作成した。 ［比較例 ２］ アルカリ性PH緩衝剤含有エタノール分散液に２
−アミノ−２−メチル１，３−プロパンジオール
を加えなかつた他は、実施例１と同様にして、比
較分析要素(2)を作成した。 ［分析要素の評価］ 完成した要素を15mm×15mmの正方形チツプに裁
断し、特開昭57−63452号公報に開示のプラスチ
ツクマウントに収めて中性脂肪定量用化学分析ス
ライドおよび比較用中性脂肪定量用化学分析スラ
イド(1)，(2)を完成した。 三種のスライドを乾燥状態で−25℃と45℃に一
週間放置した後、中性脂肪濃度の異なるヒト血清
を10μ点着したところ、この分析要素内のPH値
は8.4〜8.6（表面PH電極での測定値）の範囲にあ
つた。これを次いで、37℃で６分間インキユベー
シヨンしたのち、540nmの測定光でPET支持体
側から反射光学濃度を測定した。 前記血清について別にグリセロール−３−燐酸
オキシダーゼ法で中性脂肪濃度を決定し、検量線
を作成し、比較例と比較した。 中性脂肪濃度０に対しては７％ヒトアルブミン
溶液を点着して光学濃度を測定した。
アナライト（被検物質）の分析に有利に使用され
る酸化型補酵素含有乾式分析要素に関するもので
ある。 ［従来の技術］ 脱水素酵素（デヒドロゲナーゼ系酵素）と酸化
型ニコチンアミド補酵素とを共役反応系に組合わ
せた検出反応は、臨床化学分析において広く用い
られている。例えば、グリセリンデヒドロゲナー
ゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒ
ドロゲナヒゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グ
ルタメートデヒドゲナーゼ、アルデヒドデヒドロ
ゲナーゼ、α−グリセロフオスフエートデヒドロ
ゲナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲナー
ゼ等が関与する反応系が、トリグリセリド、グリ
セリン、コレステロール、乳酸、グルタメート、
グリセリン−３−燐酸、グルコース−６−燐酸等
の基質や、アスパラギン酸アミノトランスフエラ
ーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフエラー
ゼ（ALT）、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、ア
ミラーゼ、クレアチンナーゼ（CK）等の酵素の
定量に用いられている。この検出反応系では、生
成する還元型補酵素の量の直接測定によつて酵素
の定量分析ができる点に特徴がある。しかし、生
成する還元型補酵素として通常用いられるニコチ
ンアミド補酵素であるNADH（ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド）またはNADPH（ニコチ
ンアミドアデニンンジヌクレオチドフオスフエー
ト）は、その吸収極大波長が340nm付近にあるた
め、光学的定量のためには、紫外光域の光の測光
装置が必要となり、機器が高価なものになる。ま
た、紫外光域ではNADHやNADPH以外の多種
の化合物が吸収を有するために光学的定量に際し
てはそれらの化合物の吸収に干渉を受け易いとの
問題がある。 上記の理由から、NADH（又はNADPH）を紫
外光域の吸収により直接定量する代りに、
NADHの存在下で、電子伝達性化合物を介して
電子受容性化合物を還元し、可視領域において検
出可能な化合物（染料）を形成する反応系を利用
する検出反応が提案されている。 しかし、この検出反応系において、酸化型補酵
素、電子伝達性化合物、電子受容性化合物の三者
を共存させておくと、日時の経過とともに反応の
感度が著しく悪化するとの問題がある。特に、特
公昭53−21677号公報、特開昭55−164356号公報、
特開昭60−222769号公報に記載されたような乾式
一体型多層分析要素に上記反応系を組入れると
き、この点が大きな問題となる。 特開昭49−11395号公報では、上記三成分のう
ち電子伝達性化合物を、異なる層に配置すること
を提案している。また、特開昭59−44658号公報
では、電子伝達剤と色素形成物質とを、互いに実
質的に反応しえないように疎水性物質を親水性分
散媒中に分散する方法を開示している。特開昭59
−88096号公報では、上記三成分のうち電子伝達
性化合物と色素形成性前駆物質（電子受容性化合
物で、前記の色素形成物質と同じ）とを互いに実
質的に反応しえないように、前記特開昭49−
11395号公報におけると同様に別異の層に配置す
ること、または両者を別々の粒子として同一の層
に配置することを提案している。しかし、このよ
うに電子伝達性化合物を他の二試薬から分離する
と、検出反応の進行は、分離された試薬（特に電
子伝達性化合物）の拡散速度で支配されるため、
反応速度の低下、したがつて検出感度の低下をま
ねくとの問題がある。 上記NADH（またはNADPH）検出組成物を乾
式一体型多層分析要素（例えば特公昭53−21677
号公報、特開昭55−164356号公報、特開昭60−
222769号公報に記載の自動化学分析用多層分析素
子）の試薬層に適用すると、組成物の染料形成速
度は常温の保存で数週間以内に1/2以下になるこ
とが見出された、この原因を究明すると、特開昭
57−132061号公報で言及しているような電子受容
性化合物の劣化が原因ではなく、主たる原因は、
酸化型補酵素のNAD（またはNADP）の劣化に
あることがわかつた。緩衝役中の補酵素の劣化を
防ぐ方法とて、特開昭59−82398号公報に開示さ
れたようなキレート化剤とアジ化物を併せて添加
する方法が知られている。しかし、爆発性と毒性
を有するアジ化物を用いなければ効果が上がら
ず、安全上および公害の点から好ましくない。 酸化型補酵素NAD（又はNADP）の保存時の
劣化を防止するためには、補酵素を含む試薬層は
塗設時を含めて中性近傍のPH値が好ましいことが
知られている。一方で、脱水素酵素が関与する反
応においては、アルカリ性PH値が好ましいことも
知られている。 しかしながら、上記の保存安定性の低下、検出
感度の低下、安全面の問題の全てを解決した酸化
型補酵素含有乾式分析要素は、これまでに提案さ
れていない。 ［発明の要旨］ 本発明の目的は、脱水素酵素、酸化型ニコチン
アミド補酵素、電子伝達性化合物および電子受容
性染料形成性化合物であるテトラゾリウム塩を含
有する酸化型補酵素含有乾式分析要素であつて、
前記の保存安定性の低下、検出感度の低下、安全
面の問題の全てを解決もしくは改良した酸化型補
酵素含有乾式分析要素を提供することにある。 本発明は、光透過性水不透過性支持体の上に、
脱水素酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、電子
伝達性化合物および電子受容性テトラゾリウム塩
を含有する検出試薬含有層を有する酸化型補酵素
含有乾式分析要素において、上記検出試薬含有層
の上側もしくは下側にアルカリ性PH緩衝剤と親水
性ポリマーバインダーとを含むPH調整層が、被検
液が乾式多層分析要素に点着された際に該分析要
素内のPH値を7.5〜10.0の範囲内に調整できるよ
うに備えられていることを特徴とする酸化型補酵
素含有乾式分析要素にある。 なお、PH調整層は検出試薬含有層の上側に設け
られ、多孔性展開層としても機能する多孔性の層
であることが好ましい。 ［発明の詳細な記述］ 本発明の乾式分析要素においては、まず光透過
性水不透過性支持体の上に、脱水素酵素、酸化型
ニコチンアミド補酵素、電子伝達性化合物および
電子受容性テトラゾリウム塩を含有する検出試薬
含有層が備えられている。 光透過性水不透過性支持体の例としては、ポリ
エチレンテレフタレート、ビスフエノールＡのポ
リカルボネート、ポリスチレン、セルロースエス
テル（例、セルロースジアセテート、セルロース
トリアセテート、セルロースアセテートプロピオ
ネート等）等のポリマーからなる厚さ約50μmか
ら約１mm、好ましくは約80μmから約30μmの範囲
のフイルム、もしくはシート状の透明支持体を挙
げることができる。 本発明の検出試薬含有層は、上記のような光透
過性水不透過性支持体上に直接設けてもよく、あ
るいは親水性ポリマーからなる吸水層を介して設
けてもよい。 吸水層の形成に用いられる親水性ポリマーは、
一般には、水吸収時の膨潤率が30℃で約1.5〜20、
好ましくは約2.5〜15の範囲の天然または合成親
水性ポリマーである。そのような親水性ポリマー
の例としては、ゼラチン（例、アルカリ処理ゼラ
チン、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、
ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン等）、ア
ガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン等を挙げることが
できる。吸水層には、必要により、界面活性剤
（カチオン性、両性または非イオン性の界面活性
剤）を含有させることもできる。 本発明の検出試薬含有層は通常、上記の四種の
検出試薬（脱水素酵素、酸化型ニコチンアミド補
酵素、電子伝達性化合物、および電子受容性テト
ラゾリウム塩）が親水性バインダーに分散された
層として形成される。 本発明の乾式分析要素では、酸化型ニコチンア
ミド補酵素が電子受容体となる全ての酸化還元酵
素（脱水素酵素：デヒドロゲナーゼ系酵素）が関
与する反応系の定量測定が可能である。従つて、
定量測定対象物質（アナライト）が脱水素酵素の
基質に該当する物質であれば、そのアナライトに
対応する脱水素酵素を用いることにより、目的の
アナライトの定量が可能となる。 一方、アナライトが脱水素酵素である場合に
は、乾式分析要素には、関与する脱水素反応の基
質が加えられる。例えば、本発明の乾式分析要素
を乳酸デヒドロゲナーゼ活性測定用として用いる
場合には、乳酸を分析要素内に含有させておく必
要がある。アナライトがグルコース−６−燐酸デ
ヒドロゲナーゼである場合には、基質としてグル
コース−６−燐酸が添加される。 酸化型ニコチンアミド補酵素は、具体的には、
NAD＋（ニコチンアミド・アデニンジヌクレオチ
ド酸化型）、またはNADP＋（ニコチンアミド・
アデニンジヌクレオチド・ホスフエート酸化型）
を意味する。NAD＋およびNADP＋の内どちら
を使用するかは、シナライトとして、あるいは検
出試薬として検出反応に関与する酸化還元酵素の
種類に応じて決定される。 本発明において電子伝達性化合物とは、アナラ
イトとの反応により生成する還元型ニコチンアミ
ド補酵素（電子供与体）から電子を受け取つて、
後述する電子受容性テトラゾリウム塩（電子受容
性染料形成化合物）を還元する機能を有する化合
物を意味する。電子伝達性化合物の具体例として
は、５−メチルフエナジニウム・メチルスルフエ
ートあるいは１−メトキシ−５−メチルフエナジ
ニウム・メチルスルフエート等のＮ−メチルフエ
ナジン・メトサルフエート類およびジアホラーゼ
（ジヒドロリポアミドレダクターゼ、EC1.6.4.3.）
等を挙げることができる。 本発明の乾式分析要素において、電子受容性染
料形成性化合物として用いられにテトラゾリウム
塩の具体例としては、 ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフエニル−2H
−テトラゾリウムクライド］（＝NBT）； ３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ−ニトロ
フエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾリウム
クロライド（＝INT）； ３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−
2H−テトラゾリウムブロマイド（＝MTT）； ３，3′−（４，4′−ビフエニレン）−ビス（２，
５−ジフエニル−2H−テトラゾリウムクロライ
ド； ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン（−ビス（２，５−ジフエニル−2H−テ
トラゾリウムクロライド；および ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス［２，５−ビス（ｐ−ニトロフエ
ニル）−2H−テトラゾリウムクロライドを挙げる
ことができる。 なお、上記酸化型ニコチンシミド補酵素、電子
伝達性化合物および電子受容性染料形成性化合物
を含む反応系の詳細については、 A.L.Babson等によるクリニカ・キミカ・アク
タ［CLINICA CHIMICA ACTA］12巻（1965）
210−215頁； R.J.Gay等によるクリニカル・ケミストリー
［CLINICAL CHEMISTRY］Vol.14，No.８，
1968，740−753頁；および、 R.D.Capps 等によるクリニカル・ケミスト
リー、Vol.12，No.７，1966、406−413頁；等の文
献に記載されている。 検出試薬含有層の上には、本発明のPH調整層が
形成される。このPH調整層は、アルカリ性PH緩衝
剤と親水性ポリマーバインダーとを含む層であつ
て、被検液が多層分析要素に点着された際に該分
析要素内のPH値を7.5〜10.0の範囲内に調整でき
るように、アルカリ性PH緩衝剤の種類および量を
選んで調製される。ただし、PH調整層は、被検役
の展開層としても機能するように設けることが好
ましい。 PH調製層は、検出試薬含有層の上に直接設けて
もよいが、公知の光遮蔽層（反射層）、接着層あ
るいは前述のな吸水層などのような補助層を検出
試薬含有層の上に一層まは複数層設けた上に形成
してもよい。 例えば、光遮蔽層は通常、皮膜形成能を有する
親水性ポリマーをバインダーとして、光反射性微
粒子が分散されている水浸透性の層として形成さ
れる。光反射性微粒子は、検出試薬含有層（また
はその隣接層）において生じた検出可能な変化
（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側
から反射測光する際に、分析要素に点着供給され
た被検液の色、特に試料が全血である場合のヘモ
グロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層ま
たは背景層としても機能する。光反射性を有する
微粒子の例としては、二酸化チタン微粒子、硫酸
バリウム微粒子を挙げることができる。なお、光
遮蔽性微粒子は後述する展開層に含有させてもよ
い。 接着層は通常、水で湿潤しているとき、または
水を含んで膨潤したときに展開層を接着すること
ができるような親水性ポリマーから形成される。
接着層に用いることができる親水性ポリマーの例
としては、吸水層に用いられるものと同様な親水
性ポリマーが挙げられる。これらのうちではゼラ
チン、ゼラチン誘導体、ポリシクリルアミド等が
好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約0.5μm〜
約20μm、好ましくは約1μm〜約10μmの範囲であ
る。接着層は親水性ポリマーと、必要によつて加
えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法
で、試薬層等の上に塗布する方法などにより設け
ることができる。 本発明の特徴的な層であるPH調整層は、前述の
ように展開層としても機能するように設けること
が好ましい。 乾式分析要素における展開層（多孔性展開層、
液体試料展開層、あるいはメータリング層ともい
う）は、その表面に点着供給された液体試料を、
その中に含有している成分を実質的に偏在させる
ことなく、横（水平）方向に単位面積当りほぼ一
定量の割合で広げる作用を有するものであり、既
に多くの乾式分析要素の構成層として用いられて
いる。 展開層のマトリツクスを構成する材料として
は、濾紙、不織布、織物生地（例、ブロード、ポ
プリン等の平織等）、編物生地（例、トリコツト
編、ダブルトリコツト編、ミラニーズ編等）、ガ
ラス繊維濾紙、ブラツシユポリマーより形成され
るメンブランフイルター、あるいはポリマーミク
ロビーズ等からなる三次元格子状構造物等を挙げ
ることができる。これらのうちでは、試薬類の保
持性の点で、織物生地および編物生地に代表され
る繊維質層を用いることが好ましい。 上記織物または編物生地を本発明の乾式分析要
素の展開層材料として用いる場合には、さらにそ
の織物または編物生地に特開昭57−66359号公報
に開示の物理的活性化処理（好ましくはグロー放
電処理またはコロナ放電処理等）を生地の少なく
とも片面に施すか、あるいは特開昭55−164356
号、特開昭57−66359号公報等に開示の親水性ポ
リマー含浸処理等の親水性処理またはこれらの処
理行程を逐次実施することにより織物または編物
を親水化し、下側（支持体に近い側）の層との接
着力を強化することができる。 織物または編物生地からなる一体型多層分析要
素の展開層を前述した吸水層または接着層に接
着、積層するには、特開昭55−164356号および特
開昭57−66359号公報等に開示の方法が利用でき
る。すなわち、吸水層または接着層の塗布後未乾
燥のうちに、または乾燥後の層に水）または界面
活性在を少量含む水）を実質的に均一に供給して
層を膨潤させ、ついで織物または編物生地を湿潤
または膨潤している層の上に実質的に均一に軽く
圧力をかけながら接着、積層し一体化する方法で
ある。 また展開層がブラツシユポリマーまたはメンブ
ランフイルターからなる場合には特開昭53−
21677号公報等、ポリマーミクロビーズからなる
三次元格子状構造物である場合には特開昭55−
90859号公報等、濾紙または不織布からなる場合
には特開昭57−148250号公報等にそれぞれ記載の
方法に従つて設けることができる。 多孔性展開層をPH調整層として用いる場合に
は、前述のように展開層にアルカリ性PH緩衝剤を
含有させる。アルカリ性PH緩衝剤の例としては、
２−アミノ−２メチル−１，３−プロパンジオー
ル、２−アミノ−２−エチル−１，２−プロパン
ジオール、ジエタノールアミン、エタノールアミ
ン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパンジオ
ール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、トリメチルアミン等が挙げられる。このほう
に用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学
便覧 基礎編」（東京、丸善(株)、1966年発行）
1312−1320頁、R.M.C.Dawson et al 編「Data
for Biochemical Research」第２版、（Oxford
at the Clarendon Press、1969年発行）476−
508頁、「Biochemistry」５，467頁以降（1966
年）、「Analytical Biochemistry」104300−310
頁（1980）等に記載のPH緩衝剤系がある。 展開層をPH調整層として用いる場合には、展開
層に親水性ポリマーを含有させる。用いうる親水
性ポリマーの例としてポリビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリ
アクリル酸、親水性セルロース誘導体等がある。
これらのPH調整層の形成に用いられる親水性ポリ
マーは、前述の検出試薬含有層形成用に用いられ
る親水性ポリマーとは別の溶解挙動（例えば、ア
ルコールなどの極性機溶媒に良く溶解する性質を
有すること）などを示すものであることが好まし
い。親水性セルロース誘導体は炭素原子数１〜３
の低級アルキル基、または炭素原子数１から４の
ヒドロキシ基置換低級アルキル基により水酸基の
一部または全部がエーテル化されたセルロースエ
ーテル類である。セルロースエーテルの例として
水溶性であるメチルセルロース、エチルセルロー
ス、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチ
ルセルロースが挙げられる。好ましい親水性ポリ
マーはポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、及び水溶性セルロースエーテル類が好まし
い。親水性ポリマーは二種以上を併用することが
できる。親水性ポリマーの展開層中の含有量は展
開層１m2当り約0.5〜15g、好ましくは約0.7〜10g
の範囲である。 展開層は通常、界面活性剤を含有する。界面活
性剤としてはノニオン性、カチオン性、アニオン
性、または両性の界面活性剤の中から適宜に選択
して用いることができる。これらのうちでは、一
般的にはノニオン性界面活性剤が好ましい。ノニ
オン性界面活性剤は多価アルコールエステルメチ
レンオキシド付加物（縮合物）、ポリエチレング
リコールモノエステル、ポリエチレングリコール
ジエステル、高級アルコールエチレンオキシド付
加物（縮合物）、アルキルフエノールエチレンオ
キシド付加物（縮合物）および高級脂肪酸等があ
る。これらのノニオン性界面活性剤は二種以上を
組合せて用いることができる。ノニオン性界面活
性剤を親水性セルロース誘導体と組合せて用いる
場合にはHLB値10以上のものが好ましい。 展開層におけるノニオン性界面活性剤の含有量
は１m2当り約0.1〜3g、好ましくは約0.2〜2gの範
囲である。 アナライトがポリマーバインダーの均一な塗布
層を通過しがたい場合（例、親油性アナライト、
高分子アナライト）、多孔性展開層にそのアナラ
イトの分解酵素を含有させることが好ましい。 なお、PH調整層として機能する展開層に、アル
カリ性PH緩衝剤を含有させるためには、検出試薬
含有層を構成する親水性ポリマーと前記検出試薬
組成物とを実質的に溶解せず、また膨潤させるこ
ともなく、一方、アルカリ性PH緩衝剤とPH調整層
の親水性ポリマーを溶解もしくは分散し、一方、
検出試薬層の親水性ポリマーバインダーを実質的
に膨潤させない有機溶媒に、アルカリ性PH緩衝剤
とPH調整層用の親水性ポリマーを溶解または分散
させて、展開層のマトリツクス材料に含浸させる
方法を利用ことが好ましい。すなわち、PH調整層
形成用の溶媒が、下層の検出試薬含有層を溶解も
しくは膨潤させると、アルカリ性PH緩衝剤が検出
試薬含有層中に混入することがあり、この場合に
は、保存安定性や感度の優れた乾式分析要素を得
ることができなくなる。 有機溶媒はこのような条件を満たすものであれ
ばよいが、一般的には沸点が100℃以下の極性有
機溶媒がよく、例えば脂肪族アルコール（例、メ
タノール、エタノール、プロパノール、ブタノー
ル、イソプロピルアルコール）、ジアルキルケト
ン（例、アセトン）、ジアルキルエーテル（例、
ジメチルエーテル）、脂肪族環状エーテル（例、
テトラヒドロフラン、ジオキサン）等が適当であ
る。これらのなかでは脂肪族アルコールが好まし
く、作業環境等も考慮すると、エタノール、プロ
パノール、ブタノール、イソプロピルアルコール
等の人体の毒性の小さいアルコールが特に望まし
い。溶液または分散液の濃度は含有を容易に行な
うことができ、かつ展開層に均一に浸透させうる
範囲でなるべく高濃度にするのがよく、その濃度
はアルカリ性PH緩衝剤と親水性ポリマーの種類等
にもよるが、例えば、約0.2％〜約10％、好まし
くは約0.3％〜約７％の範囲が適当である。溶液
の調製方法は常法により行なうことができる。 アルカリ性PH緩衝剤と親水性ポリマーとは展開
層に一緒に含浸させてもよく、あるいは別々に含
浸させてもよい。 また、展開層に界面活性剤を含有せしめる場合
には、アルカリ性PH緩衝剤および／または親水性
ポリマーと界面活性剤との混合溶液にしてもよ
く、別々の溶液に別個に含有させてもよい。 アルカリPH緩衝剤の多孔性展開層への含浸は該
展開層を積層した後に行なうのがよい。展開層が
ミクロフイルター、編物あるいは織物などの構造
体の場合には、先に含有させてから積層すること
もできるがその場合には含有量のコントロールが
難しいという問題点がある。従つて、展開層を試
薬層の上に（直接、または接着層等を介して）設
けた後、アルカリ性PH緩衝剤を展開層中に含有
（含浸）させるのが、分析精度および製造コスト
の点で有利である。含浸は、例えば公知の展開層
の上から均一に塗布あるいは噴霧する方法を利用
することができる。含浸後の感想は風乾あるいは
減圧乾燥等によつて行なえばよい。 なお、上記では、本発明のPH調整層を展開層と
しても機能させるように形成する方法を記載した
が、先に説明した検出試薬含有層の上に、均一層
としてのPH調整層を設けた上に、通常の展開層を
設けてもよいことは勿論である。 あるいは、PH調整層は、同様な方法を利用して
検出試薬含有層の下側に設けてもよい。 本発明の乾式分析要素は、一体型多層分析要素
とした場合には、一辺約15mmから約30mmの正方形
またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特
開昭57−63452号、特開昭54−156079号、実開昭
56−142454号、実開昭58−32350号又は特開昭58
−501144号各公報等に開示のスライド枠等に納め
て分析スライドとして用いるのが製造、包装、輸
送、保存、測定操作等の全ての観点で好ましい。 本発明の乾式分析要素は、約5μから約30μ
、好ましくは約8μから約15μの水性液体試
料を展開層に点着供吸し、必要に応じて約20℃か
ら約45℃の範囲の実質的に一定の温度でインクベ
ーシヨンする。その後、一方の側から（一体型多
層分析要素においては光透過性支持体側から）乾
式分析要素内の色変化、発色等の検出可能な変化
を反射測光し比色法の原理により液体試料中の測
定対象成分を分析する。 ［発明の効果］ 本発明の乾式分析要素においては、酸化型ニコ
チンアミド補酵素、電子伝達性化合物および電子
受容性染料形成性テトラゾリウム塩を含む検出試
料層と、アルカリ性PH緩衝剤成を、被検液の点着
前には接触が発生しないように別層に配置し、一
方、被検液の点着後はそれらが速やかに接触し
て、目的の酵素反応に適したPH環境が形成される
ようにしたことにより、酸化型ニコチンアミド補
酵素の保存性が著しく向上することと、保存時の
カブリ（着色）生成を著しく防ぐことで、分析結
果の再現性や、検出精度が顕著に向上する。 以下に本発明の実施例及び比較例を示す。 ［実施例１］ ゼラチン下塗りの施された厚さ180μmの無色透
明ポリエチレンテレフタレート（PET）フイル
ム上に下記被覆量になるように中性脂肪検出用呈
色試薬層を水溶液を用いて塗布し、乾燥して設け
た。 アルカリ処理ゼラチン 17g／m2 ノニルフエノキシ ポリエトキシエタノール （平均15オキシエチレン含有） 75mg／m2 ATP 1.5g／m2 硫酸マグネシウム 1.2g／m2 NAD 280mg／m2 ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′− ビフエニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロ フエニル）−2H−テトラゾリウム］ ジクロリド 550mg／m2 クエン酸ナトリウム 3.7g／m2 ジアホラーゼ （EC 1.6.4.3） 6000U／m2 グリセロールキナーゼ （EC 2.7.1.30） 1800U／m2 グリセロール−３燐酸 デヒドロゲナーゼ 10000U／m2 （EC 1.1.99.5） この液にIN水酸化ナトリウム水溶液を滴下し
PH6.8に調整した。 上記試薬層の上に、下記塗布量になるようにし
て光遮蔽層を水分散液を用いて塗布、乾燥した。 アルカリ処理ゼラチン 5.0g／m2 ルチル型二酸化チタン 28g／m2 ノニルフエノキシ ポリエトキシエタノール （平均15オキシエチレン含有） 100mg／m2 次に、光遮蔽層の上に下記の塗布量になるよう
にして接着層を水溶液を用いて塗布し、乾燥して
設けた。 アルカリ処理ゼラチン 2.7g／m2 ノニルフエノキシ ポリエトキシエタノール （平均15オキシエチレン含有）270mg／m2 次に、接着層の上に30g／m2の割合で水を湿し
水として供給し、湿潤させたのち、グロー放電処
理で親水化したポリエチレンテレフタレート紡績
糸（太さ50デニール）からなるニツト編物生地
（平均厚さ250μm）を圧着ラミネートして展開層
を設けた。 この展開層の上に下記の組成のアルカリ剤と親
水性ポリマーとを含有するエタノール分散液を、
１m2当り200mlの割合で塗布乾燥し、中性脂肪定
量分析用一体型多層分析要素を完成した。 エタノール 500ml ポリビニルピロリドン （平均分子量36万） 20g／m2 ノニルフエノキシ ポリエトキシエタノール （平均40オキシエチレン含有） 5g／m2 ２−アミノ−１−メチル− １，３−プロパンジオール 9g／m2 ［比較例 １］ アルカリ性PH緩衝剤（２−アミノ−１−メチル
−１，３−プロパンジオール）含有分散液の溶媒
をエタノールから同量の水を替えたアルカリ性PH
緩衝剤含有水溶液を用いた他は実施例１と同様に
して、比較分析要素(1)を作成した。 ［比較例 ２］ アルカリ性PH緩衝剤含有エタノール分散液に２
−アミノ−２−メチル１，３−プロパンジオール
を加えなかつた他は、実施例１と同様にして、比
較分析要素(2)を作成した。 ［分析要素の評価］ 完成した要素を15mm×15mmの正方形チツプに裁
断し、特開昭57−63452号公報に開示のプラスチ
ツクマウントに収めて中性脂肪定量用化学分析ス
ライドおよび比較用中性脂肪定量用化学分析スラ
イド(1)，(2)を完成した。 三種のスライドを乾燥状態で−25℃と45℃に一
週間放置した後、中性脂肪濃度の異なるヒト血清
を10μ点着したところ、この分析要素内のPH値
は8.4〜8.6（表面PH電極での測定値）の範囲にあ
つた。これを次いで、37℃で６分間インキユベー
シヨンしたのち、540nmの測定光でPET支持体
側から反射光学濃度を測定した。 前記血清について別にグリセロール−３−燐酸
オキシダーゼ法で中性脂肪濃度を決定し、検量線
を作成し、比較例と比較した。 中性脂肪濃度０に対しては７％ヒトアルブミン
溶液を点着して光学濃度を測定した。
【表】
【表】
本発明に従う実施例１の中性脂肪定量用一体型
多層分析要素は、45℃での強制経時劣化処理１週
間後においても、比較例２，３の一体型多層分析
要素（これらでは、アルカリ性PH緩衝剤が塗布時
に検出試薬層していた）に比べて、バツクグラウ
ンド着色光学濃度の増加は無視できる少量であ
り、かつ中性脂肪含有量の広範囲（正常値の上限
の約3.3倍までの範囲）で、発色光学濃度の減少
殆どがなく、大きな勾配の検量線が得られ、定量
分析精度が高いことがわかる。
多層分析要素は、45℃での強制経時劣化処理１週
間後においても、比較例２，３の一体型多層分析
要素（これらでは、アルカリ性PH緩衝剤が塗布時
に検出試薬層していた）に比べて、バツクグラウ
ンド着色光学濃度の増加は無視できる少量であ
り、かつ中性脂肪含有量の広範囲（正常値の上限
の約3.3倍までの範囲）で、発色光学濃度の減少
殆どがなく、大きな勾配の検量線が得られ、定量
分析精度が高いことがわかる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 光透過性水不透過性支持体の上に、脱水素酵
素、酸化型ニコチンアミド補酵素、電子伝達性化
合物および電子受容性テトラゾリウム塩を含有す
る検出試薬含有層を有する酸化型補酵素含有乾式
分析要素において、 上記検出試薬含有層の上側もしくは下側にアル
カリ性PH緩衝剤と親水性ポリマーバインダーとを
含むPH調整層が、被検液が乾式多層分析要素に点
着された際に該分析要素内のPH値7.5〜10.0の範
囲内に調整できるように備えられていることを特
徴とする酸化型補酵素含有乾式分析要素。 ２ 上記PH調整層が検出試薬含有層の上側に設け
られ、多孔性展開層としても機能する多孔性の層
である特許請求の範囲第１項記載の酸化型酵素含
有乾式分析要素。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26509086A JPS63119694A (ja) | 1986-11-06 | 1986-11-06 | 酸化型補酵素含有乾式分析要素 |
| EP87114791A EP0264079B1 (en) | 1986-10-09 | 1987-10-09 | Integral multilayer analytical element |
| DE8787114791T DE3783851T2 (de) | 1986-10-09 | 1987-10-09 | Integrales, mehrschichtiges element fuer analyse. |
| US07/107,674 US5063153A (en) | 1986-10-09 | 1987-10-09 | Integral multilayer analytical element |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26509086A JPS63119694A (ja) | 1986-11-06 | 1986-11-06 | 酸化型補酵素含有乾式分析要素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63119694A JPS63119694A (ja) | 1988-05-24 |
| JPH0578314B2 true JPH0578314B2 (ja) | 1993-10-28 |
Family
ID=17412458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26509086A Granted JPS63119694A (ja) | 1986-10-09 | 1986-11-06 | 酸化型補酵素含有乾式分析要素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63119694A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2614124B2 (ja) * | 1989-12-08 | 1997-05-28 | 富士写真フイルム株式会社 | 一体型多層分析要素 |
| JP5812672B2 (ja) * | 2011-04-28 | 2015-11-17 | アークレイ株式会社 | 乳酸脱水素酵素測定用試験片 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5991896A (ja) * | 1982-11-18 | 1984-05-26 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | 還元型補酵素検出用多層分析素子 |
| US4555484A (en) * | 1983-07-25 | 1985-11-26 | Eastman Kodak Company | Analytical element and method for alkaline phosphatase assay |
-
1986
- 1986-11-06 JP JP26509086A patent/JPS63119694A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63119694A (ja) | 1988-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4587100A (en) | Multilayer analytical element for the detection of hydrogen peroxide | |
| EP0382207A2 (en) | Analytical element for whole blood | |
| US5063153A (en) | Integral multilayer analytical element | |
| EP0226465B1 (en) | Integral multilayer analytical element | |
| JPH0550275B2 (ja) | ||
| EP0244825B1 (en) | Dry-type analytical element for cholesterol | |
| US4939085A (en) | Oxidized coenzyme-containing dry analytical element | |
| EP0322882B1 (en) | Integral multilayer analytical element | |
| JPH054031B2 (ja) | ||
| US4876207A (en) | Compositions for the detection of high levels of hydrogen peroxide | |
| EP0278496A1 (en) | Integral multilayer analysis element | |
| JPH0578314B2 (ja) | ||
| JP3167508B2 (ja) | 無機燐定量用試薬及び乾式分析要素 | |
| JP3704550B2 (ja) | 乾式測定試験素子 | |
| EP1162451B1 (en) | Dry measuring test device | |
| JP4003993B2 (ja) | 乾式分析要素の製造方法及び乾式分析要素 | |
| JP2513509B2 (ja) | 尿素分析用試薬組成物及びそれを含む一体型多層分析要素 | |
| US6905653B1 (en) | Ion activity measuring device and method for producing the same | |
| JPS63163164A (ja) | 多層分析素子 | |
| JPH0481439B2 (ja) | ||
| USH622H (en) | Analytical element for measuring activity of creatine kinase | |
| JPH0579319B2 (ja) | ||
| JPH0578318B2 (ja) | ||
| JPH0671440B2 (ja) | 乾式コレステロ−ル分析要素 | |
| JPS6394993A (ja) | 酸化型補酵素を含有する乾式分析要素 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |