JPS63119694A - 酸化型補酵素含有乾式分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酸化型補酵素含有乾式多層分析要素及びその
製造方法に関するものである。

［従来技術］ デヒドロゲナーゼ系酵素と補酵素とを共役反応系に組合
わせた反応は臨床化学分析において広く用いられている
０例えばグリセリンデヒドロゲナーゼ、コレステロール
デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコール
デヒドロゲナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、ア
ルデヒドデヒドロゲナーゼ、α−グリセロフォスフェー
トデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲ
ナーゼ等が関与する反応系が、トリグリセリド、グリセ
リン、コレステロール、乳酸、グルタメート、グリセリ
ン−３−燐酸、グルコース−６−燐酸等の基質や、アス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラ
ニンアミントランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、乳酸デヒド
ロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アミラーゼ、グレアチンキナー
ゼ（ＣＫ）等の酵素の定量に用いられており、還元型補
酵素の増加または減少の直接測定によって定量分析がで
きる特徴がある。しかし通常用いられるＮＡＤＨにコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド）またはＮＡＤＰＨに
コチンアミドアデニンンジヌクレオチドフォスフェート
）は、吸収極大が３４０ｎｍ付近にあるため、その光学
的定量のためには、紫外域の測光装置が必要となり、機
器が高価なものになる。また紫外域では多種の化合物が
吸収を有するためにそれらの干渉を受は易い。

ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）を紫外部吸収により直接
に定量する代りに、ＮＡＤＨの存在下で、電子伝達性化
合物を介して電子受容性化合物を還元し、可視領域にお
いて検出可撓な化合物（染料）を形成する反応系が提案
されている。

しかし、酸化型補酵素、電子伝達性化合物、電子受容性
化合物の二者を共存させておくと、日時の経過とともに
反応の感度は著しく悪化する。特に特公昭５３−２１６
７７号公報、特開昭５５−１６４３５６号公報、特開昭
６０−２２２７６９号公報に記載されたような乾式一体
型多層分析要素に上記反応系を組入れるとき、この問題
に直面する。

特開昭４９−１１３９５号公報では、上記三成分のうち
電子伝達性化合物を異なる層に配ｔすることを提案して
いる。また特開昭５９−４４６５８号公報では、電子伝
達剤と色素形成物質とを、互いに実質的に反応しえない
ように疎水性物質を親水性分散媒中に分散する方法を開
示している。

特開昭５９−８８０９６号公報では、上記三成分のうち
電子伝達性化合物と色；に形成性前駆物質（電子受容性
化合物で、前記の色素形成物質と同じ）とを互いに実質
的に反応しえないように、前記特開昭４９−１１３９５
号公報におけると同様に別異の層に配置すると１両名を
別々の粒子として同一の層に配置することを提案してい
る。しかし、このように電子伝達性化合物を他の二要；
ｋから分離すると、検出反応の進行は分離された試薬（
特に電子伝達性化合物）の拡散速度で支配されるため、
反応速度、したがって検出感度の低下をまねく。

上記ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）検出組成物を乾式一
体型多層分析要素（例えば特公昭５３−２１６７７号公
報、特開昭５５−１６４３５６号公報、特開昭６０−２
２２７６９号公報に記載の自動化学分析用多層分析素子
）の試薬層に適用すると、組成物の染料形成速度は常温
の保存で数週間以内に展以下になることが見出された。

この原因を究明すると、特開昭５７−１３２０６１号公
報で言及しているような電子受容性化合物の劣化が原因
ではなく、主たる原因は、補酵；）：　Ｎ　Ａ　Ｄ（ま
たはＮＡＤＰ）の劣化にあることがわかった。緩衝液中
の補酵素の劣化を防ぐ方法として特開昭５９−８２３９
８号公報に開示されたような午レート化剤とアジ化物を
併せて添加する方法が知られている。しかし、爆発性お
よびＪ性を有するアジ化物を用いなければ効果が挙がら
ず、安全上および公害の点から好ましくない。

補酵素ＮＡＤ　（又はＮＡＤＰ）の保存時の劣化を防止
するためには、補酵素を含む試薬層は塗設時を含めて中
性近傍のｐＨ値が好ましいことが知られている。また、
ジアホラーゼはｐＨ約６．０未満は失活することが知ら
れている。一方で、脱水素酵素が関与する反応において
は、アルカリ性ｐＨ（Ｉ’ｍが好ましいことも知られて
いる。しかし。

これらの相反するｐＨ条件を同時に満たす乾式分析要素
又は一体型多層分析要素は従来提案されていない。

［発明の要旨］ 本発明の目的は、酸化型ニコチンアミド補酵素、電子伝
達性化合物および電子受容性染料形成性化合物を含む検
出試薬系を有する乾式分析要素において、電子伝達性化
合物を他の二要素から分離することなく、充分な反応速
度を保ちつつ、酸化型ニコチンアミド補酵素の保存性を
向上させることである。

本発明は、検出試薬系として酸化型ニコチンアミド補酵
素、電子伝達性化合物および電子受容性染料形成性化合
物を有し、そして電子伝達性化合物を酸化型ニコチンア
ミド補酵素および／または電子受容性染料形成性化合物
と同一の層内に含有する乾式多層分析要素において、 電子伝達性化合物を酸イ喝型ニコチンアミド補酵素、電
子受容性染料形成性化合物を保存時中性付近に保ち、別
層に緩衝剤であるアルカリ成分を配置することで保存性
を向上させた一体型乾式分析要素にある。

［発明の詳細な記述］ 本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することがで
きる。特にデヒドロゲナーゼ酵素系と還元型補酵素検出
系と被検液体がいずれも浸透し得る固体担体を含む要素
に適用することができる。

要素は単一層で構成されてもよく、また試薬層、反射層
、多孔質展開層、光遮蔽層、濾過層、検出層（ｒｅｇｉ
ｓｔｒａｔｉｏｎ　１ａ７ｅｒ）　、吸水層、支持体、
下塗層および業界公知のその他の層を含む多重層であっ
てもよい、かような分析要素には特公昭５３−２１６７
７号公報、特開昭５１−４０１９１号公報、特開昭５５
−１６４３５６号公報、特開昭６０−２２２７６９号公
報に開示のものがある。

支持体を用いる場合、実用的に好ましい構成は。

（１）支持体上に試薬層を兼ねる展開層を有するもの （２）支持体上に吸水層、その上に試薬層を兼ねる展開
層を有するもの （３）支持体上に試薬層と展開層を有するもの（４）支
持体上に吸水層、試薬層、展開層をこのｊ晒に有するも
の （５）支持体上に試薬層、反射層または諸過層、展開層
をこの順に有するもの （６）支持体上に吸水層、試薬層、濾過層、展開層をこ
の順に有するもの などである。

本発明の乾式分析要素において少なくとも一層の試薬層
に含まれる検出試薬系には、酸化型ニコチンアミド補酵
素が含まれる。酸化型ニコチンアミド補酵素とは、具体
的には、ＮＡＤ＋　にコチンアミド・アデニンジヌクレ
オチド酸化型）またはＮＡＤＰ÷　にコチンアミド・ア
デニンジヌクレオチド・ホスフェート酸化型）を意味す
る。

ＮＡＤ◆およびＮＡＤＰ＋のうちどちらを使用するかは
、分析対象として、あるいは検出試薬として検出反応に
関与する酸化還元酵素の種類に応じて決定される。

本発明の乾式分析要素において少なくとも一層の試薬層
に含まれる検出試薬系には、電子伝達性化合物を含む０
本発明において電子伝達性化合物とは、被検物質の反応
により生成した還元型ニコチンアミド補酵素（電子供与
体）から電子を受は取って、後述する電子受容性染料形
成性化合物を還元する機部を有する化合物を意味する。

上記電子伝達性化合物の具体例としては、５−メチルツ
ェナジニウム・メチルスルフェートあるいはｌ−メトキ
シ−５−メチルツェナジニウム・メチルスルフェート等
のＮ−メチルフェナジン争メトサルフェート類およびジ
アホラーゼ（ジヒドロリボアミドレダクターゼ、　Ｅ　
Ｃ１，６，４，３，）等を挙げることができる。

本発明の乾式分析要素に用いられる検出試薬系には、さ
らに電子受容性染料形成性化合物が含まれる。電子受容
性染料形成性化合物は、上記電子伝達性化合物により還
元され、長波長領域において検出可能な化合物（染料）
を形成する物質である０本発明の乾式分析要素において
、電子受容性染料形成性化合物は、テトラゾリウム塩を
用いることが好ましい、テトラゾリウム塩の具体例とし
ては、 ３．３′−（３，３’−ジメトキシ−４゜４′−ビフェ
ニレン）−ビス［２−（Ｐ−ニトロフェニル−２Ｈ−テ
トラゾリウムクライト］（＝ＮＥＴ）。

３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−二トロフェニ
ル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド
（＝ＩＮＴ）。

３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２Ｈ−テ
トラゾリウムブロマイド（＝ＭＴＴ）　；３．３’−（
４，４’−ビフェニレン）−ビス（２，５−ジフェニル
−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド； ３．３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４′−ビフェ
ニレン）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾ
リウムクロライド：および３．３′−（３，３°−ジメ
トキシ−４，４′−ビフェニレン）−ビス［２，５−ビ
ス（Ｐ−二トロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムクロ
ライドを挙げることができる。

なお、上記酸化型ニコチンアミド補酵素、電子伝達性化
合物および電子受容性染料形成性化合物を含む反応系の
詳細については、 Ａ、　Ｌ、　Ｂａｂｇｏｎ等によるクリ二カ・キミカ―
アクタ［０ＬＩＮＩＣＡ　（ＨＩＭＩＧＡ　ＡＣ丁Ａ］
　１２巻（１９６５）２１０−２１５頁； Ｒ，Ｊ、　Ｇａ７等によるクリニカル・ケミストリー［
ＧＬＩＮＩＣＡＬ　　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹＩ　　Ｖｏｌ
、１４、　Ｎｏ、　　８　　、　１９６８゜７４０−７
５３頁：および。

Ｒ，［１，Ｃａｐｐｓ　ｕ等によるクリニカル・ケミス
トリー、Ｖｏｌ、１２．　Ｎｏ、　７　、　１９６６、
　４０６−４１３頁；等の文献に記載されている。

本発明では、測定すべき物質の酸化還元酵素を少なくと
も一層に含めることにより液体試料中における濃度を、
測定する目的に用いることができる。木発りｊは、乾式
分析要素は酸化還元酵素（脱水素酵素）と反応し酸化型
ニコチンアミド補酵素が電子受容体となる全ての物質の
測定が可１ｂである。例えばグリセリンを測定する場合
にはグリセリンデヒドロゲナーゼ、そして乳酸を測定す
る場合はラクテートデヒドロゲナーゼを添加することで
それぞれの測定が可能である。

本発明の乾式分析要素に用いられる検出試薬系は、液体
試料中における様々な種類の酸化還元酵素活性の測定に
使用することもできる。すなわち、本発明の乾式分析要
素は、酸化型ニコチンアミド補酵素が電子受容体となる
全ての酸化還元酵素（脱水素酵二ｋ）の測定が可能であ
る。Ｌ記のように本発明の乾式分析要素を酸化還元酵素
の活性の測定に使用する場合には、上記検出試薬系には
、さらに酸化還元酵素が触媒する酸化反応（脱水素反応
）のノ！質が加えられる０例えば１本発明の乾式分析要
素を乳酸デヒドロゲナーゼ活性測定用として用いる場合
には、上記検出試薬系にさらに乳酸が含まれる。グルコ
ース−６−燐酸デヒドロゲナーゼの場合には、基質とし
てグルコース−６−燐酸が添加される。

本発明の乾式分析要素に用いることができる光透過性Φ
水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリス
チレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテ
ート、セルローストリアセテート、セルロースアセテー
トプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０
ｇｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０＃Ｌｍから約３０
０ｇｍの範囲のフィルム、もしくはシート状の透明支持
体を挙げることができる。

本発明に用いる吸水層、試薬層、濾過層、反射層に用い
られる親水性ポリマーは、一般には、水吸収昨の膨潤率
が３０℃で約１．５〜２０、好ましくは約２．５〜１５
の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのよ
うな親水性ポリマーの例としては、ゼラチン（例、アル
カリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン
等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン等）、ア
ガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール
、ポリビニルピロリドン等を挙げることができる。さら
に必要に応じて、界面活性剤（カチオン性、両性または
非イオン性の界面活性剤）を含有させることもできる。

光遮蔽層は、皮膜形成俺を有する親水性ポリマーをバイ
ンダーとして、光反射性微粒子が分散されている水浸透
性の層であることが好ましい、光反射性微粒子は、試薬
層（または給水Ｆ３）に生じた検出可ス侶な変化（色変
化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反射測光
する際に、展開層に点着供給された水性液体の色、特に
試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等を遮蔽す
るとともに光反射層または背景層としても機部する。

光反射性を有する微粒子の例としては、二酸化チタン微
粒子、硫酸バリウム微粒子が好ましい。

本発明において、必要に応じ展開層中にも上記のごとき
光遮蔽性微粒子を含有させてもよい。

吸水層、光遮蔽層、濾過層、試薬層等の層の上には、展
開層を接着し積層するための接着層を設けてもよいａｖ
ｉ着層は木で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤
したときに展開層を接着することができるような親水性
ポリマーからなることが好ましい、接着層に用いること
ができる親水性ポリマーの例としては、吸水層に用いら
れると同様な親水性ポリマーが挙げられる。これらのう
ちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド
等が好ましい、接着層の乾燥膜厚は一般に約０．５鉢ｍ
〜約２０ルｍ、好ましくは約１ルｍ〜約ｌＯルｍの範囲
である。なお、接着層は検出層り以外にも、他の層間の
接着力を向トさせるため所望の層上に設けてもよい、接
着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられる界面
活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、試薬層等の上に
塗布する方法などにより設けることができる。

展開層とは、その表面に点着供給された液体試料を、そ
の中に含有している成分を実質的に偏在させることなく
、横（水平）方向に単位面積当りほぼ一定量の割合で広
げる作用を有するものである。

展開層のマトリックスを構成する材料としては、＋１！
紙、不織布、織物生地（例、ブロード、ボブリン等のモ
織等）、編物生地（例、トリコット編、ダブルトリコッ
ト編、ミラニーズ編等）、ガラスミｍ波紙、プラッシュ
ポリマーより形成されるメンブランフィルタ−１あるい
はポリマーミクロビーズ等からなる三次元格子状構造物
等を用いることが好ましい。これらのうちでは、試薬類
の保持性の点で、織物生地および編物生地に代表される
繊維質層を用いることが特に好ましい。

上記織物または編物生地を一体型多層分析要素の展開層
として用いる場合には、さらにその織物または編物生地
に特開昭５７−６６３５９号公報に開示の物理的活性化
処理（好ましくはグロー放電処理またはコロナ放電処理
等）を生地の少なくとも片面に施すか、あるいは特開昭
５５−１６４３５６号、特開昭５７−６６３５９号公報
等に開示の親水性ポリマー含浸処理等の親水化処理また
はこれらの処理工程を逐次実施することにより織物また
は編物を親木化し、下側（支持体に近い側）の層との接
着力を強化することができる。

織物または編物生地からなる一体型多層分析要素の展開
層を前述した吸水層または接着層に接着、積層するには
、特開昭５５−１６４３５６　！＝）および特開昭５７
−６６３５９号各公報等に開示の方法に従って作成する
ことができる。すなわち、吸水層または接着層の塗布後
未乾燥のうちに、または乾燥後の層に水（または界面活
性剤を少量含む木）を実質的に均一に供給して層を膨潤
させ、ついで織物または編物生地を湿潤または膨潤して
いる層の上に実質的に均一に軽く圧力をかけながら接着
、積層し一体化する。

また展開層がプラッシュポリマーまたはメンブランフィ
ルタ−からなる場合には特公昭５３−２１６７７号公報
等、ポリマーミクロビーズからなる三次元格子状構造物
である場合には特開昭５５−９０８５９時公報等、濾紙
または不織布からなる場合には特開昭５７−１４８２５
０号公報等にそれぞれ記載の方法に従って設けることが
できる。

展開層の他に、試薬層、吸水層１反射層、接着層等にも
界面活性剤を含有させることができる。

その例としてノニオン性界面活性剤がある。ノニオン性
界面活性剤の具体例として、ｐ−オクチルフェノキシポ
リエトキシエタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリエト
キシエタノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル
、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ｐ−
ノニルフェノキシポリグリシドール、オクチルグルコシ
ド等がある。ノニオン性界面活性剤を展開層に含有させ
ることにより水性液体試料の展開作用（メータリング作
用）がより良好になる。ノニオン性界面活性剤を試薬層
または吸水層に含有させることにより分析操作時に水性
液体試料中の木が試薬層または吸水層に実質的に一様に
吸収され易くなり、また展開層との液体接触が迅速にか
つ実質的に一様になる。

アナライトがボリマーバイソダーの均一な塗布層を通過
しがたい場合（例、親油性アナライト、高分子アナライ
ト）、多孔性展開層に検出用試薬成分の一部、特に分解
酵素を含有させることが好ましい。

展開層に含有されるアルカリ性緩衝剤またはアルカリ剤
としては、２−アミノ−２メチル−１゜３−プロパンジ
オール、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジ
オール、ジェタノールアミン、エタノールアミン、２−
アミノ−２−メチル−嶌−プロパンジオール、トリス（
ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリメチルアミン等
が挙げられる。このほかに用いうる緩衝剤としては［」
本化学会編「化学便覧　基礎編」　（東京、丸善輛、１
９６６年発行）　１３１２−１３２０頁　Ｒ，Ｍ、Ｇ、
Ｄａｗｓｏｎｅｔ　ａ１編ｒＤａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉａ
ｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｊ第２版（Ｏｘ
ｆｏｒｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　１９６９年発行）　　４７６−　５０８頁、　
ｒ　ＢｉａｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　５．４６７頁以降（
１９６６年）、ｒＡｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅ
膳１ｓｔｒｙ　Ｊ胆４３００−３１０頁（１９８０）等
に記載のｐＨ緩衝剤系がある。多孔性展開層には水性液
体試料を多孔性展開層において展開しすぎないように制
御する目的で、親水性ポリマーおよび／または界面活性
剤を含有させることが好ましい。

用いうる親水性ポリマーの例としてポリビニルピロリド
ン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリ
アクリル酸、親水性セルロール誘導体等がある。親水性
セルロース誘導体は炭素原子数１〜３の低級アルキル基
、または炭素原子数１から４のヒドロキシ基置換低級ア
ルキル基により水酸基の一部または全部がエーテル化さ
れたセルロースエーテル類である。セルロースエーテル
の例として水溶性であるメチルセルロース、エチルセル
ロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロ
ースが挙げられる。これらのなかで好ましい親水性ポリ
マーはポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、
および水溶性セルロースエーテル類が好ましい、親水性
ポリマーは２種以上を併用することができる。親水性ポ
リマーの多孔性展開層における含有量は多孔性展開層１
ｒｒｒ′当り約０．５ｇ〜約１５ｇ、好ましくは約０．
７ｇ〜約１０ｇの範囲である 界面活性剤としてはノニオン性、カチオン性、アニオン
性、または両性の界面活性剤の中から適宜に選択して用
いることができる。これらのうちでは、一般的にはノニ
オン性界面活性剤が好ましい。ノニオン性界面活性剤は
多価アルコールエステルエチレンオキシド付加物（縮合
物）、ポリエチレングリコール七ノエステル、ポリエチ
レングリコールジエステル、高４級アルコールエチレン
オキシド付加物（縮合物）、アルキルフェノールエチレ
ンオキシド付加物（ｌｉｉ合物）および高級脂肪酸等が
ある。これらのノニオン性界面活性剤は２種以上を組合
せて用いることができる。ノニオン性界面活性剤を親水
性セルロース誘導体と組合せて用いる場合にはＨＬＢ値
ｌｏ以上のものが好ましい。

多孔性展開層におけるノニオン性界面活性剤の含有量は
１ｍ’当り約０．１〜約３ｇ、好ましくは約０．２〜〜
約２ｇの範囲である。

多層分析要素にはこれら以外にも層を設けることができ
る。支持体と試薬層の間には吸水層を設けることができ
る。吸水層は水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを主
成分とする層であって、吸水層の界面に到達または浸透
した水性液体試料の水を吸収できる層であり、全血試料
を用いる場合には水性液体成分である結晶の試薬層への
浸透を促進する作用を有する。吸水層に用いられる親水
性ポリマーはｌｎ７述の試薬層に用いるもののなかから
選択すればよい、一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘
導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコールを用
いるのが好ましく、これらのうちではゼラチン（脱イオ
ンゼラチン）が最も好ましい。

吸水層の乾燥時の厚さは、約３ｐｍ〜約Ｚｏ。

ＪＬｍ、好ましくは約５牌ｍ〜約３０ルｍの範囲、被覆
量では約３ｇ／ｒｒｆ〜約ｔ　ｏ　Ｏｇ／ｍ’、好まし
くは約５ｇ／ｒｒｆ′〜約３０　ｇ／ｒｒｆの範囲であ
る。吸水層には後述するｐＨ緩衝剤、公知の塩基性ポリ
マー等を含有させて使用時（分析操作実施時）のｐＨを
調節することができる。

展開層と試薬層の間にはまた光遮蔽層（または光反射層
）を設けることもできる。光遮蔽層は吸水層に用いられ
るのと同様な親水性ポリマーバインダーまたは架橋され
た親水性ポリマーバインダーに二酸化チタン、硫酸バリ
ウム等の光反射性微粒子を分散含有させることによって
試薬層側から入射してきた光を反射する層であり、これ
によって展開層中の血液等の水性液体試料の色を遮蔽し
て安定なバックグラウンドを与える層である。この光遮
蔽層には一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘導体、ポ
リアクリルアミド、ポリビニルアルコール等を用いるの
が好ましく、これらのうちではゼラチン（脱イオンゼラ
チン）が最も好ましい、光遮蔽層に用いられる親水性ポ
リマーは公知の架橋剤（硬化剤）を用いて適宜に架橋硬
化された反射層とすることができる。光遮蔽層の乾燥時
の厚さは、約５１Ｌｍ〜約５０ｇｍ、好ましくは約７終
ｍ〜約３０ルｍの範囲、被覆量では約５ｇ／ｒｎ′〜約
５０ｇ／ｒｒＩ′、好ましくは約７ｇ／ｒｒＩ′〜約３
０ｇ／ｌｒｆの範囲である。

光遮蔽層の上には展開層を強固に接着一体化する目的で
ゼラチンに代表される吸水層に用いられるのと同様な親
水性ポリマーからなる公知の接着層を設けることができ
る。接着層の乾燥時の厚さは約０．５ｇｍ〜約５ｐｍの
範囲である。

本発明の多層分析要素は、前述の諸特許明細書に記載の
公知の方法によって調製することができる。

本発明の方法においては、アルカリ性ｐＨ緩衝剤（また
はアルカリ剤）と、必要により併用される親水性ポリマ
ーを前記呈色試薬組成物を実質的に溶解せず、かつ呈色
試薬層の親水性ポリマーバインダーを実質的に膨潤させ
ない有機溶媒に、溶解または分散させて多孔性展開層に
加えるところに特徴がある。

有機溶媒はこのような条件を満たすものであればよいが
、一般的には沸点が１００℃以下の極性溶媒がよく、例
えば、脂肪族アルコール（例、メタノール、エタノール
、プロパツール、ブタノール、インプロピルアルコール
）、ジアルキルケト／（例、アセトン）、ジアルキルエ
ーテル（例、ジメチルエーテル）、脂肪族環状エーテル
（例、テトラヒドロフラン、ジオキサン）等が適当であ
る。これらのなかでは脂肪族アルコールが好ましく、作
業環境等も考慮すると、エタノール、プロパツール、ブ
タノール、イソプロピルアルコール等の人体の毒性の小
さいアルコールが特に望ましい。溶液または分散液の濃
度は含有をＢ易に行なうことができかつ多孔性展開層に
均一に浸透させうる範囲でなるべ高濃度にするのがよく
、これはアルカリ性ｐＨ緩衝剤（またはアルカリ剤）と
、必要により併用される親水性ポリマーの種類等にもよ
るが、例えば約０．２％〜約１０％、好ましくは約０．
３％〜約７％の範囲が適当である。溶液の調製方法は常
法によればよい、呈色試薬組成物の展開層へのマイグレ
ーションが実質的に生じない範囲で有機溶媒に木を混合
して用いることができる。

展開層に界面活性剤を含有せしめる場合には、ｐＨ緩衝
剤（必要により親水性ポリマーも併用する）と界面活性
剤の混合溶液にしてもよく、別々の溶液にして別個に含
有させてもよい。

ｐＨ緩衝剤の多孔性展開層への含有は該展開層を積層し
た後に行なうのがよい、展開層がミクロフィルター、編
物あるいは織物などの構造体の場合には、先に含有させ
てから積層することもできるがその場合には含有量のコ
ントロールが難しいという問題点がある。従って、展開
層を試薬層の上に（直接、または接着層等を介して）設
けた後にｐＨ緩衝剤と展開層中に含有させるのが、分析
精度および製造コストの点で有利である。含有は、例え
ば多孔性展開層の上から公知の方法により均一に塗布あ
るいは噴霧すればよい。

乾燥は風乾あるいは減圧乾燥等によって行なえばよい。

本発明の乾式分析要素は、一体型多層分析要素とした場
合には、−通約１５ｍｍから約３０　ｍ　ｍの正方形ま
たはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特開昭５７
−６３４５２号、特開昭５４−１５６０７９号、実開昭
５６−１４２４５４号、実開閉５８−３２３５０号およ
び特開昭５８−５０１１４４号各公報等に開示のスライ
ド枠等に納めて分析スライドとして用いるのが製造、包
装、輸送、保存および測定操作等の全ての観点で好まし
い。

本発明の乾式分析要素は、約５ル立から約３０終り、好
ましくは約８牌文から約１５座愛の水性液体試料を展開
層に点着供吸し、必要に応じて約２０℃から約４５℃の
範囲の実質的に一定の温度でインクベーションする。そ
の後、一方の側から（一体型多層分析要素においては光
透過性支持体側から）乾式分析要素内の色変化、発色等
の検出可イ歳な変化を反射測光し比色法の原理により液
体試料中の測定対象成分を分析する。

［９，明の効果］ 本発明の乾式分析要素において、酸化型ニコチンアミド
補酵素、電子伝達性化合物および電子受容性染料形成性
化合物を含む検出試薬層と緩衝剤として用いられるアル
カリ成分を別層に配置することにより、酸化型ニコチン
アミド補酵素の保存性が著しく向上することと、保存時
のカブリ生成を著しく防ぐことで１分析結果の再現性検
出精度を向上させるものである。

以下に本発明の実施例及び比較例を示す。

［実施例１］ ゼラチン下塗りの施された厚さ１８０　ｐｍの無色透１
１ポリエチレンテレフタレー）　（ＰＥＴ）フィルム上
に下記被覆量になるように中性脂肪検出用呈色試薬層を
水溶液を用いて塗布し、乾燥して設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　　１７　ｇ７ｍ？ノニルフ
ェノキシ ポリエトキシエタノール （モ均１５オキシエチレン含有）　７５　ｍｇ／　ｒｎ
’ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　１．５ｇ／ゴ硫酸マ
グネシウム　　　　　１．２ｇ／ｒｎ’ＮＡＤ　　　　
　　　　　　　２８０ｍｇ／ｒｒｒＩ３．３゛、−（３
，３’−ジメトキシ−４，４“−ビフェニレン）−ビス
［２−（ｐ−ニトロフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム
１ ジクロリド　　　　　　　　５５０鳳ｇ／ゴクエン酸ナ
トリウム　　　　３．７ｇ／ｍジアホラーゼ （ＥＣ１，６，４，３）　　　　　　　６０００　Ｕ　
／ゴグリセロールキナーゼ （ＥＣ２，７，１，３０）　　　　　　　１８００　Ｕ
　／ゴグリセロールー３燐酸 デヒドロゲナーゼ　　１ｏ０００ｔＪ／ゴ（ＥＣ１，１
，９９，５） この液にＩＮ水酸化ナトリウム水溶液を滴下しｐＨ６，
８に調整した。呈色試薬層の上に下記の被覆量になるよ
うにして光遮蔽層を水分散液を用いて塗布し乾燥した。

アルカリ処理ゼラチン　　　５　、０　ｇ／ｒｒ？ルチ
ル型二酸化チタン　　　　２８　ｇ／ｍ’ノニルフェノ
キシ ポリエトキシエタノール （平均１５オキシエチレン含有）１００ｍｇ／ｒｒＩ′
次に光遮蔽層の上に下記の被覆量になるようにして接着
層を水溶液を用いて塗布し乾燥して設けた。

アルカリ処理ゼラチン　　　２．７ｇ／ｍ″ノニルフェ
ノキシ ポリエトキシエタノール （平均１５オキシエチレン含有）２７０層ｇ／ｍ’次に
接着層の上に３０　ｇ／ｒｎ′の割合で水を湿し木とし
て供給し、湿潤させたのち、グロー放電処理で親水化し
たポリエチレンテレフタレート紡績糸（太さ５０デニー
ル）からなるニット編物生地（平均厚さ２５０ＪＬｍ）
を圧着ラミネートして展開層を設けた。

この上に下記の組成のアルカリ剤含有エタノール分散液
をｌｒｎ’当り２００ｍＭの割合で塗布し乾燥し中性脂
肪定量分析用一体型多層分析要素を完成した。

エタノール　　　　　　　　　　５００　ｍ　１ポリビ
ニルピロリドン （平均分子量３６万）　　　　　　　２０ｇ／ｒｒｌ’
ノニルフェノキシ ポリエトキシエタノール （平均４０オキシエチレン含有）　　　５ｇ／ｄ２−ア
ミノ−１−メチル− ｉ、３−プロパンジオール　　　９ｇ／ｍ’次にアルカ
リ物質含有分散液のエタノールのかわりに同量の木を用
いたアルカリ剤含有水溶液を用いた他は実施例１と同様
にして、比較分析要素（１）を作成した。

また、アルカリ剤含有エタノール分散液に２−アミノ−
２−メチル１，３−プロパンジオールを加えなかった他
は実施例１と同様にして比較分析要素（２）を作成した
。

完成した要素を１．５ｍｍＸ　１．５ｍｍの正方形チッ
プに裁断し、特開昭５７−６３４５２号公報に開示のプ
ラスチックマウントに収めて中性脂肪定量用化学分析ス
ライドおよび比較用中性脂肪定量用化学分析スライド（
１）、（２）を完成した。

三種のスライドを乾燥状態で一２５℃と４５℃に一週間
放ｔした後、中性脂肪濃度の異なるヒト血清を１０４１
点着し、３７℃で６分間インキュベーションしたのち、
５４０ｎｍの１）１定光でＰＥＴ支持体側から反射光学
濃度を測定した。

前記血清について別にグリセロール−３−燐酸オキシダ
ーゼ法で中性脂肪濃度を決定し、検量線を作成し、比較
例と比較した。

中性脂肪濃度０に対しては７％ヒトアルブミン溶液を点
着して光学濃度を測定した。

第１表 血清中の 中性脂肪　　実施例１　比較例１　　比較例２濃度（ｍ
ｇ／ｄｉ） ０　　０．１７８１０．１８００．２９５１０．５０３
０．３２６１０．５１５６５　　０．３０５１０．３０
７０．４１１１０．６０３０．４３８１０．５２０３８
１　　０．８３５１０．８５００．９６２／１．０３０
０．９９１１０．９４０５２５　　１．０４５／１．０
Ｇ１１．１０２／１．０８１１．１１２１０．９３２（
−２５℃／　４５℃） 本発明に従う中性脂肪定量用一体型多層分析要素は、４
５℃での強制経時劣化１週間後においても、バックグラ
ウンド着色光学濃度の増加は無視できる　少量であり、
かつ中性脂肪含有量の広範囲（正常値の上限の約３．３
倍までの範囲）で。

発色光学濃度の減少がなく、大きな勾配の検量線が得ら
れので定量分析精度が高いことがわかる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、検出試薬系として、脱水素酵素、酸化型ニコチンア
   ミド補酵素、電子伝達性化合物および電子受容性染料形
   成性化合物を含有する乾式多層分析要素において、 アルカリ性ｐＨ緩衝剤またはアルカリ剤が前記補酵素と
   前記染料形成性化合物の二者が含まれている層とは別異
   の層に含有されていることを特徴とする分析要素。 ２、前記アルカリ剤またはアルカリ性ｐＨ緩衝剤が、分
   析操作時に要素内のｐＨ値を７．５〜１０．０の範囲内
   に維持しうるものであることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の分析要素。 ３、前記電子受容性染料形成性化合物がテトラゾリウム
   塩であることを特徴とする特許請求の範囲第１項または
   第２項記載の分析要素。 ４、検出試薬系として、脱水素酵素、酸化型ニコチンア
   ミド補酵素、電子伝達性化合物および電子受容性染料形
   成性化合物を含有する乾式多層分析要素を製造するに当
   り、 前記補酵素と前記染料形成性化合物を含有する親水性ポ
   リマーバインダー層を光透過性水不透過性支持体の上に
   設け、 次いで前記親水性ポリマーバインダー層を実質的に膨潤
   させない有機溶媒に溶解または分散させたアルカリ剤ま
   たはアルカリ性ｐＨ緩衝剤を前記親水性ポリマーバイン
   ダー層より上の層に塗布することによりアルカリ性ｐＨ
   緩衝剤またはアルカリ剤を含有する層を設けることを特
   徴とする乾式多層分析要素の製造方法。 ５、前記補酵素と前記染料形成性化合物を含有する親水
   性ポリマーバインダー層をｐＨ６．０〜７．０の範囲内
   の塗布用液を用いて塗布する方法を利用して形成するこ
   と特徴とする特許請求の範囲第４項記載の乾式多層分析
   要素の製造方法。