JPH0481439B2 - - Google Patents
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- JPH0481439B2 JPH0481439B2 JP60234236A JP23423685A JPH0481439B2 JP H0481439 B2 JPH0481439 B2 JP H0481439B2 JP 60234236 A JP60234236 A JP 60234236A JP 23423685 A JP23423685 A JP 23423685A JP H0481439 B2 JPH0481439 B2 JP H0481439B2
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Description
［発明の技術分野］
本発明は、酸化還元酵素とその基質との反応を
利用して、その酸化還元酵素、基質あるいは、上
記反応に共役する酵素反応の酵素あるいはその基
質を検出するための、検出対象の酵素あるいは基
質と上記酵素反応を形成することのできる基質あ
るいは酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、電子
伝達性化合物、および電子受容性染料形成性化合
物を有し、そして電子伝達性化合物を酸化型ニコ
チンアミド補酵素および／または電子受容性染料
形成性化合物と同一の層内に含有する乾式分析要
素に関する。 ［従来技術］ デヒドロゲナーゼ系酵素と補酵素とを共役反応
系に組合わせた反応は臨床化学分析において広く
用いられている。例えばグリセリンデヒドロゲナ
ーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、
グルタメートデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、α−グリセロフオスフエートデヒ
ドロゲナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲ
ナーゼ等が関与する反応系が、トリグリセリド、
グリセリン、コレステロール、乳酸、グリタメー
ト、グリセリン−３−燐酸、グリコース−６−燐
酸等の基質や、アスパラギン酸アミノトランスフ
エラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフエ
ラーゼ（ALT）、乳酸デヒドロゲナーゼ
（LDH）、アミラーゼ、クレアチンキナーゼ
（CK）等の酵素の定量に用いられており、還元型
酵素の増加または減少の直接測定によつて定量分
析ができる特徴がある。しかし通常用いられる
NADH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド）またはNADPH（ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドフアスフエート）は、吸収極大が
340nｍ付近にあるため、その光学的定量のため
には、紫外域の測光装置が必要となり、機器が高
価なものになる。また紫外域では多種の化合物が
吸収を有するためにそれらの干渉を受け易い。 NADH（またはNADPH）を紫外部吸収により
直接に定量する代りに、NADHの存在下で、電
子伝達性化合物を介して電子受容性化合物を還元
し、可視領域において検出可能な化合物（染料）
を形成する反応系が提案されている。 しかし、酸化型補酵素、電子伝達性化合物、電
子受容性化合物の三者を共存させておくと、時日
の経過とともに反応の感度は著しく悪化する。特
に特公昭53−21677号公報に記載されたような乾
式一体型多層分析要素に上記反応系を組入れると
き、この問題に直面する。 特開昭49−11395号公報では、上三成分のうち
電子伝達性化合物を異なる層に配置することを提
案している。また特開昭59−44658号公報では、
電子伝達剤と色素形成物質とを、互いに実質的に
反応しえないように疎水性物質を親水性分散媒中
に分散するよう方法を開示している。しかし、こ
のように電子伝達性化合物を他の二要素から分離
すると、検出反応の進行は分離された試薬（特に
電子伝達性化合物）の拡散速度で支配されるた
め、反応速度、したがつて検出感度の低下をまね
く。 上記NADH（またはNADPH）検出組成物を乾
式一体型多層分析要素（例えば特公昭53−21677
号公報に記載の自動化学分析用多層分析素子）の
試薬層に適用すると、組成物の染料形成速度は常
温の保存で数週間に1/2以下になることが見出さ
れた。この原因を究明すると、特開昭57−132061
号公報で言及しているような電子受容性化合物の
劣化が原因ではなく、主たる原因は、補酵素
NAD（またはNADP）の劣化にあることがわか
つた。衝撃液中の補酵素の劣化を防ぐ方法として
特開昭59−82398号公報に開示されたようなキレ
ート化剤とアジ化物を併せて添加する方法が知ら
れている。しかし、爆発性および毒性を有するア
ジ化物を用いなければ効果が挙がらず、安全上お
よび公害の点から好ましくない。 ［発明の要旨］ 本発明の目的は、酸化還元酵素とその基質との
反応を利用して、その酸化還元酵素、基質あるい
は、上記反応に共役する酵素反応の酵素あるいは
その基質を検出するための、検出対象の酵素ある
いは基質と上記酵素反応を形成することのできる
基質あるいは酵素、そして酸化型ニコチンアミド
補酵素、電子伝達性化合物および電子受容性染料
形成性化合物を含む検出試薬系を有する乾式分析
要素において、電子伝達性化合物を他の二要素か
ら分離することなく、充分な反応速度を保ちつ
つ、酸化型ニコチンアミド補酵素の保存性を向上
させることである。 本発明は、酸化還元酵素とその基質との反応を
利用して、その酸化還元酵素、基質あるいは、上
記反応に共役する酵素反応の酵素あるいはその基
質を検出するための、検出対象の酵素あるいは基
質と上記酵素反応系を形成することのできる基質
あるいは酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、電
子伝達性化合物、および電子受容性染料形成性化
合物を有し、そして電子伝達性化合物を酸化型ニ
コチンアミド補酵素および／または電子受容性染
料形成性化合物と同一の層内に含有する乾式分析
要素において、 上記酸化型ニコチンアミド補酵素を含有する層
内に、酸性アミノ酸、エチレンジアミン四酢酸、
ヒドロキシポリカルボン酸、およびポリヒドロキ
シカルボン酸からなる群より選ばれるカルボン酸
系補酵素安定剤を含有させたことを特徴とする乾
式分析要素にある。 本発明において、カルボン酸系補酵素安定剤と
は、乾燥状態の酸化型ニコチンアミド補酵素に添
加することにより酸化型ニコチンアミド補酵素の
保存性を向上させる機能を有するカルボン酸を意
味する。 ［発明の詳細な記述］ 本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用する
ことができる。特にデヒドロゲナーゼ酵素系と還
元型補酵素検出系と被検液体がいずれも浸透し得
る固体担体を含む要素に適用することができる。
要素は単一層で構造されてもよく。また試薬層、
反射層、多孔質展開層、光遮蔽層、濾過層、係留
（refistration）層、吸水層、支持体、下塗層およ
び業界公知のその他の層を含む多重層であつたも
よい。かような分析要素には米国特許第3992158
号および同4042335号各明細書に開示のものがあ
る。 支持体を用いる場合、実用的に好ましい構成
は、 (1) 支持体上に試薬層を兼ねる展開層を有するも
の (2) 支持体上に吸水層、その上に試薬層を兼ねる
展開層を有するもの (3) 支持体上に試薬層と展開層を有するもの (4) 支持体上に吸水層、試薬層、展開層をこの順
に有するもの (5) 支持体上に試薬層、反射層または濾過層、展
開層をこの順に有するもの (6) 支持体上に吸水層、試薬層、濾過層、展開層
をこの順に有するもの などである。しかし、光透過性・水不透過性支持
体、吸水層および検出試薬系とカルボン酸系補酵
素安定剤を含有する展開層を順次積層一体化して
なる一体型多層分析要素とすることが好ましい。 本発明の乾式分析要素において少なくとも一層
の試薬層に含まれる検出試薬系には、酸化型ニコ
チンアミド補酵素が含まれる。酸化型ニコチンア
ミド補酵素とは、具体的には、NAD+（ニコチン
アミド・アデニンジヌクレオチド酸化型）または
NADP+（ニコチンアミド・アデニンジヌクレオ
チド・ホスフエート酸化型）を意味する。NAD+
およびNADP+のうちどちらを使用するかは、分
析対象として、あるいは検出試薬として検出反応
に関与する酸化還元酵素の種類に応じて決定され
る。 本発明の乾式分析要素において少なくとも一層
の試薬層に含まれる検出試薬系には、電子伝達性
化合物を含む。本発明において電子伝達性化合物
とは、被検物質の反応により生成した還元型ニコ
チンアミド補酵素（電子供与体）から電子を受け
取つて、後述する電子受容性染料形成性化合物を
還元する可能を有する化合物を意味する。上記電
子伝達性化合物の具体例としては、５−メチルフ
エナジニウム・メチルスルフエートあるいは１−
メトキシ−５−メチルフエナジニウム・メチルス
ルフエート等のＮ−メチルフエナジン・メトサル
フエート類およびジアホラーゼ（ジヒドロリポア
ミドレダクターゼ、EC1.6.4.3.）等を挙げること
ができる。 本発明の乾式分析要素に用いられる検出試薬系
には、さらに電子受容性染料形成性化合物が含ま
れる。電子受容性染料形成性化合物は、上記電子
伝達性化合物により還元され、長波長領域におい
て検出可能な化合物（染料）を形成する物質であ
る。本発明の乾式分析要素において、電子受容性
染料形成性化合物は、テトラゾリウム塩を用いる
ことが好ましい。テトラゾリウム塩の具体例とし
ては、 ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフエニル−2H
−テトラゾリウムクライド］（＝NBT）； ３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ−ニトロ
フエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾリウム
クライド（＝INT）； ３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−
2H−テトラゾリウムブロマイド（＝MTT）； ３，3′−（４，4′−ビフエニレン）−ビス（２，
５−ジフエニル−2H−テトラゾリウムクロライ
ド； ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス（２，５−ジフエニル−2H−テト
ラゾリウムクロライド；および ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス［２，５−ビス（ｐ−ニトロフエ
ニル）−2H−テトラゾリウムクロライドを挙げる
ことができる。 なお、上記酸化型ニコチンアミド補酵素、電子
伝達性化合物および電子受容性染料形成性化合物
を含む反応系の詳細については、 A.L.Babson等によるクリニカ・キミカ・アク
タ［CLINICA CHIMICA ACTA］12巻（1965）
210−215頁； R.J.Gay等によるクリニカル・ケミストリー
［CLINICAL CHEMISTRY］Vol.14、No.８、
1968、740−753頁；および、 R.D.Capps 等によるクリニカル・ケミスト
リーVol.12、No.７、1966、406−413頁；等の文献
に記載されている。 本発明の乾式分析要素に用いられる検出試薬系
は、液体試料中における様々な種類の酸化還元酵
素活性の測定に使用することができる。すなわ
ち、本発明の乾式分析要素は、酸化型ニコチンア
ミド補酵素が電子受容体となる全ての酸化還元酵
素（脱水素酵素）の測定が可能である。上記のよ
うに本発明の乾式分析要素を酸化還元酵素の活性
の測定に使用する場合には、上記検出試薬系に
は、さらに酸化還元酵素が触媒する酸化反応（脱
水素反応）の基質が加えられる。例えば、本発明
の乾式分析要素を乳酸デヒドロゲナーゼ活性測定
用として用いる場合には、上記検出試薬系にさら
に乳酸が含まれる。グルコース−６−燐酸デヒド
ロゲナーゼの場合には、基質としてグリコース−
６−燐酸が添加される。 本発明の乾式分析要素を上記酸化還元酵素が触
媒する酸化反応の基質の液体試料中における濃度
を測定する目的に用いることもできる。この場合
には、この酸化還元酵素が上記検出試薬系に含ま
れる。 さらに、本発明の乾式分析要素は、他の化学反
応を上記検出反応と共役させることにより、上記
以外の酵素活性あるいは物質濃度の測定に用いる
ことも可能である。この場合においても、共役さ
せる化学反応に必要な試薬類が、上記検出試薬系
に含まれる。例えば、酵素共役反応にて脱水素酵
素に共役できるクレアチンキナーゼ活性測定の場
合には、クレアチン燐酸、グルコース、ヘキソキ
ナーゼ等が添加される。 本発明の乾式分析要素は、カルボン酸系補酵素
安定剤を、酸化型ニコチンアミド補酵素と同一の
層内に含有する。前述したように、本発明におい
て、カルボン酸系補酵素安定剤とは、少なくとも
酸化型ニコチンアミド補酵素および電子伝達性化
合物が接触した状態において、添加することによ
り酸化型ニコチンアミド補酵素の保存性を向上さ
せる機能を有するカルボン酸を意味する。上記カ
ルボン酸としては、上記検出反応（他の化学反応
を検出反応と共役させる場合には、この共役反応
を含む）には、実質的に影響を与えることのない
カルボン酸を用いることが好ましい。 本発明において、酸化型ニコチンアミド補酵素
を含有する層内に導入されるカルボン酸系補酵素
安定剤は、酸性アミノ酸、エチレンジアミン四酢
酸（EDTA）、ヒドロキシポリカルボン酸、およ
びポリヒドロキシカルボン酸からなる群より選ば
れる。酸性アミノ酸の例としては、グルタミン酸
およびアスパラギン酸を挙げることができる。ヒ
ドロキシポリカルボン酸の例としては、クエン酸
およびリンゴ酸を挙げることができる。そしてポ
リヒドロキシカルボン酸の例としては、グルコン
酸などのアルドン酸、トリス（ヒドロキシメチ
ル）−メチルグリシン、およびＮ，Ｎ−ビス（２
−ヒドロキシエチル）−グリシンを挙げることが
できる。 本発明の乾式分析要素の検出試薬系とカルボン
酸を含有する層には、親水性ポリマー、緩衝剤あ
るいは光遮蔽性微粒子等を必要に応じて含有させ
ることができる。 本発明の乾式分析要素の検出試薬系とカルボン
酸系補酵素安定剤を含有する層にさらに含有させ
ることができる親水性ポリマーの例としては、澱
粉、セルロース、アガロース、ゼラチンおよびこ
れらの誘導体（例、ヒドロキシメチル化およびヒ
ドロキシプロピル化等）、アクリルアミド重合体、
アクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重
合体、ビニルピロリドン重合体、ビニルピロリド
ンと各種ビニル性モノマーとの共重合体、アクリ
レート重合体およびアクリレートと各種ビニル性
モノマーとの共重合体等を挙げることができる。
上記親水性ポリマーのうちではビニルピロリドン
重合体、アクリルアミド重合体またはセルロース
誘導体が好ましい。 上記親水性ポリマーを、乾式分析要素の検出試
薬系とカルボン酸系補酵素安定剤を含有する展開
層に含有させる場合には、約２ｇ／m2から約15
ｇ／m2の範囲で含有させることが好ましい。上記
含有量のうち特に好ましいのは、約２ｇ／m2から
約10ｇ／m2の範囲である。 本発明の乾式分析要素の検出試薬系とカルボン
酸系補酵素安定剤を含有する層にさらに含有させ
ることができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホ
ウ酸塩、燐酸塩やグツド（Good）の緩衝剤など
の公知の緩衝剤を挙げることができる。これらの
緩衝剤は『蛋白質・酵素の基礎実験法』（掘尾武
一、他著、南江堂、1981）等の公知文献を参考に
して選択し、使用することができる。 本発明の乾式分析要素の検出試薬系を含有する
層には、さらに後述する光遮蔽層に用いられる光
遮蔽性微粒子を含有させることもできる。 検出試薬系を含有する層に上記の検出試薬系、
カルボン酸系補酵素安定剤および必要に応じて加
えられる親水性ポリマー、緩衝剤あるいは光遮蔽
性微粒子等を含有させるに際しては、上記試薬等
を含有する塗布液を展開層の上から塗布または噴
霧し乾燥する方法を用いることができる。 また検出試薬系とカルボン酸系補酵素安定剤を
含有する層が織物、編物、濾紙、不織布およびガ
ラス繊維瀘紙等からなる展開層である場合には、
上記試薬等を含有する溶液に展開層を浸漬したの
ち乾燥する方法を用いることができる。また、一
体型多層分析要素とするため、上記のような展開
層をラミネートにより積層する場合には、上記の
ように浸漬した展開層を乾燥または半乾燥状態で
他の層に積層し一体化する方法を用いることもで
きる。 塗布により形成される層、例えばブラツシユポ
リマー層やミクロビーズ三次元格子状粒子構造体
等からなる層の場合には、この層の塗布液と試薬
等の塗布液を混合して塗布してもよい。 なお、展開層に試薬等を含有させる場合に、い
くつかの試薬毎に異なる方法を用いることもでき
る。また、いくつかの試薬毎に数回に分けて行な
うこともできる。 本発明において、検出試薬系を含む層は、二つ
以上の層から成つてもよい。この場合に、ニコチ
ンアミド補酵素、電子伝達性化合物および電子受
容性染料形成性化合物は、全ての層に均一に含有
されてよい。特に補酵素は支持体から遠い層に、
電子受容性染料形成性化合物は支持体に近い層に
多く分布させることが好ましい。 本発明の乾式分析要素に用いることができる光
透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエ
チレンテレフタレート、ビスフエノールＡのポリ
カルボネート、ポリスチレン、セルロースエステ
ル（例、セルロースジアセテート、セルロースト
リアセテート、セルロースアセテートプロピオネ
ート等）等のポリマーからなる厚さ約50μｍから
約１mm、好ましくは約80μｍから約300μｍの範囲
のフイルム、もしくはシート状の透明支持体を挙
げることができる。 本発明の乾式分析要素に用いることができる光
不透過性または光反射性支持体としては、上記ポ
リマー中に光反射性色材を含有させることにより
容易に作成することができる。また、上記ポリマ
ー等からなる透明支持体表面に光反射性色材を塗
布する、または光反射性色材をからなる粘着テー
プを貼る等によつても容易に作成することができ
る。 これら支持体の表面には必要により下塗層を設
けて、支持体の上に設けられる吸水層あるいは検
出試薬系とカルボン酸系補酵素安定剤を含有する
層と支持体との接着を強固なものにすることがで
きる。また、下塗層の代りに、支持体の表面に物
理的あるいは化学的な活性下処理を施して接着力
の向上を図つてもよい。 本発明の乾式分析要素が一体型多層分析要素で
ある場合には、光透過性・水不透過性支持体の上
に（場合によつては下塗層等の他の層を介して）
吸水層が設けられる。本発明の乾式分析要素に備
えられる吸水層は親水性結合剤よりなる層、すな
わち水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを層形
成成分として利用している層であることが好まし
い。 吸水層の製造に用いることができる親水性ポリ
マーは、一般には水吸収時の膨潤率が30℃で約
150％から約2000％、好ましくは約250％から約
1500％の範囲の天然または合成親水性ポリマーで
ある。そのような親水性ポリマーの例としては、
ゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチ
ン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、
ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、
アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリア
クリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン等をあげることができる。 吸水層の乾燥時の厚さは約1μｍから約100μｍ
の範囲であることが好ましく、より好ましくは約
3μｍから約30μｍの範囲である。また吸水層は実
質的に透明であることが好ましい。さらに吸水層
には、必要に応じて界面活性剤や緩衝剤を含有さ
せることもできる。 上記吸水層の上には、必要に応じて光遮蔽層を
設けることができる。光遮蔽層は、光遮蔽性、ま
たは光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子ま
たは微粉末（以下、単に微粒子という）が少量の
皮膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーに
分散保持されている水透過性または水浸透性の層
である。光遮蔽層は吸水層にて発生した検出可能
な変化（色変化、発色等）を光透過性を有する支
持体側から反射測光する際に、検出試薬系とカル
ボン酸を含有する展開層に点着供給された水性液
体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビ
ンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層または背
景層としても機能する。 光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子の例
としては、二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナ
ターゼ型またはブルカイト型の粒子径が約0.1μｍ
から約1.2μｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微
粒子、アルミニウム微粒子または微小フレーク等
を挙げることができ、光遮蔽性微粒子の例として
は、カーボンブラツク、ガスブラツク、カーボン
ミクロビーズ等を挙げることができ、これらのう
ちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子
が好ましい。特に好ましいのは、アナターゼ型二
酸化チタン微粒子である。 皮膜形成能を有する親水性ポリマーバインダー
の例としては、前述の吸水層の製造に用いられる
親水性ポリマーと同様の親水性ポリマーのほか
に、弱親水性の再生セルロース、セルロースアセ
テート等を挙げることができ、これらのうちでは
ゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド
等が好ましい。なお、ゼラチン、ゼラチン誘導体
は公知の硬化剤（架橋剤）を添加することができ
る。 光遮蔽層は、光遮蔽成微粒子と親水性ポリマー
との水性分散液を公知の方法により吸水層の上に
塗布し乾燥することにより設けることができる。
また、光遮蔽層を設ける代りに、後述するように
検出試薬系とカルボン酸系補酵素安定剤を含有す
る展開層中に光遮蔽性微粒子を含有させてもよ
い。 なお、吸水層の上に、場合によつては光遮蔽層
等の層を介して、展開層を接着し積層するために
接着層を設けてもよい。接着層は水で湿潤してい
るとき、または水を含んで膨潤しているときに展
開層を接着することができ、これにより各層を一
体化できるような親水性ポリマーからなることが
好ましい。接着層の製造に用いることができる親
水性ポリマーの例としては、吸水層の製造に用い
られる親水性ポリマーと同様な親水性ポリマーが
あげられる。これらのうちではゼラチン、ゼラチ
ン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接
着層の乾燥膜厚は一般に約0.5μｍから約20μｍ、
好ましくは約1μｍから約10μｍの範囲である。な
お、接着層は吸水層上以外にも、他の層間の接着
力を向上させるため所望の層上に設けてもよい。
接着層は親水性ポリマーと、必要によつて加えら
れる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、
支持体や吸水層等の上に塗布する方法などにより
設けることができる。 展開層は、液体計量作用を有する展開層である
ことが特に好ましい。液体試料計量作用を有する
展開層とは、その表面に点着供給された液体試料
を、その中に含有している成分を実質的に偏在さ
せることなく、横（水平）方向に単位面積当りほ
ぼ一定量の割合で広げる作用を有するものであ
る。 展開層のマトリツクスを構成する材料として
は、濾紙、不織布、織物生地（例、ブロード、ポ
プリン等の平織等）、編物生地（例、トリコツト
編、ダブルトリコツト編、ミラニーズ編物等）、
ガラス繊維濾紙、ブラツシユポリマーより形成さ
れるメンブランフイルター、あるいはポリマーミ
クロビーズ等からなる三次元格子状構造物等を用
いることが好ましい。これらのうちでは、試薬類
の保持性の点で、織物生地および編物生地に代表
される繊維質層を用いることが特に好ましい。 本発明の乾式分析要素に用いることができる織
物生地または編物生地は水洗等の脱脂処理により
少なくとも糸製造時、織物製造時あるいは編物編
成時に供給または付着した油脂類を実質的に除去
した織物または編物生地が好ましい。 上記織物または編物生地を一体型多層分析要素
の展開層として用いる場合には、さらにその織物
または編物生地に特開昭57−66359号公報に開示
の物理的活性化処理（好ましくはグロー放電処理
またはコロナ放電処理等）を生地の少なくとも片
面に施すか、あるいは特開昭55−164356号、特開
昭57−66359号公報等に開示の親水性ポリマー含
浸処理等の親水化処理またはこれらの処理工程を
逐次実施することにより織物または編物を親水化
し、下側（支持体に近い側）の層との接着力を強
化することができる。 織物または編物生地からなる一体型多層分析要
素の展開層を前述した吸水層または接着層に接
着、積層するには、特開昭55−164356号および特
開昭57−66359号各公報等に開示の方法に従つて
作成することができる。すなわち、吸水層または
接着層の塗布後未乾燥のうちに、または乾燥後の
層に水（または界面活性剤を少量含む水）を実質
的に均一に供給して層を膨潤させ、ついで織物ま
たは編物生地を湿潤または膨潤している層の上に
実質的に均一に軽く圧力をかけながら接着、積層
し一体化する。 また展開層がブラツシユポリマーまたはメンブ
ランフイルターからなる場合には特公昭53−
21677号公報等、ポリマーミクロビーズからなる
三次元格子状構造物である場合には特開昭55−
90859号公報等、濾紙または不織布からなる場合
には特開昭57−148250号公報等にそれぞれ記載の
方法に従つて設けることができる。 前述した吸水層または接着層の親水性ポリマー
バインダーがゼラチンまたはゼラチン誘導体の場
合には、層の塗布後ゼラチン（または誘導体）が
未乾燥のゲル状態の間に上記展開層を構成する材
料（織物または編物生地等）を接着、積層し一体
化する方法を採用することができる。 本発明の乾式分析要素は、検出試薬系とカルボ
ン酸系補酵素安定化剤を含有する層よりなる単一
のシートから構成することも可能である。 本発明の乾式分析要素は、一体型多層分析要素
とした場合には、一辺約15mmから約30mmの正方形
またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特
開昭57−63452号、特開昭54−156079号、実開昭
56−142454号、実開昭58−32350号および特開昭
58−501144号各公報等に開示のスライド枠等に納
めて分析スライドとして用いるのが製造、包装、
輸送、保存および測定操作等の全ての観点で好ま
しい。 本発明の乾式分析要素は、約5μから約30μ
、好ましくは約8μから約15μの水性液体試
料を展開層に点着供給し、必要に応じて約20℃か
ら約45℃の範囲の実質的に一定の温度でインクベ
ーシヨンする。その後、一方の側から（一体型多
層分析要素においては光透過性支持体側から）乾
式分析要素内の色変化、発色等の検出可能な変化
を反射測光し比色法の原理により液体試料中の測
定対象成分を分析する。 ［発明の効果］ 本発明の乾式分析要素において、カルボン酸系
補酵素安定剤が、酸化型ニコチンアミド補酵素、
と同一の層内に存在することにより、酸化型ニコ
チンアミド補酵素の保存性が著しく向上する。 また本発明の乾式分析要素は、酸化型ニコチン
アミド補酵素、電子伝達性化合物および電子受容
性染料形成性化合物を含む検出試薬系を同一の層
内に含有することを実用的に可能にするものであ
るため、検出反応の円滑な進行が妨げられること
がなく、検出精度が優れている。 以下に本発明の実施例及び比較例を示す。 実施例 １ 透明ポリエチレンフタレート支持体（厚さ：
180μｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面
上に下記の組成の塗布液を120μ／m2となるよ
うに塗布、乾燥して乾燥膜厚10μｍの吸水層を形
成した。 吸水層形成用塗布液： ゼラチン 10ｇ 水 2700ｇ オクチルフエノキシ・ポリエトキシエタノール
0.5ｇ 次に、上記吸水層の上に、ポリエステル撚糸ト
リコツト編み展開層（厚さ：250μｍ）を湿式ラ
ミネート法により接着した。 上記展開層に下記の組成の試薬塗布液を塗布乾
燥した。 試薬塗布液の調製： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
0.303ｇ 乳酸リチウム 0.225ｇ 水 10.000ｇ 10％ポリビニルピロリドン 12.500ｇ NAD+ 0.075ｇ ジアホラーゼ 1000ユニツト グルタミン酸 0.350ｇ 上記組成液に、1N水酸化ナトリウム水溶液を
加え、塗布液のPHを8.5に調製し、塗布液量25c.c.
として用いた。 次いで、３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ
−ニトロフエニル）−５−フエニル−2H−テトラ
ゾリウムクロライド（＝1NT）８ｍＭを含む２
％ポリビニルピロリドン溶液を上記展開層に塗布
後、乾燥して本発明に従うLDH（乳酸デエヒドロ
ゲナーゼ）活性測定用乾式分析要素を作成した。 比較例 １ 実施例１において用いた試薬塗布液の代りに下
記の組成の試薬塗布液を用いた以外は、実施例１
と同様にして比較用LDH活性測定用乾式分析要
素を作成した。 試薬塗液の調製： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
0.909ｇ 乳酸リチウム 0.225ｇ 水 10.000ｇ 10％ポリビニルピロリドン 12.500ｇ NAD+ 0.075ｇ ジアホラーゼ 1000ユニツト 上記組成液に、6N塩酸を加え、塗布液のPHを
8.5に調製し、塗布液量25c.c.として用いた。 実施例 ２ 実施例１における試薬塗布液中のグルタミン酸
の量を0.700ｇに変更した以外は、実施例１と同
様にして本発明に従うLDH活性測定用乾式分析
要素を作成した。 実施例 ３ 実施例１における試薬塗布液中のトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンの量を0.909ｇに、
グルタミン酸の量を2.100ｇにそれぞれ変更した
以外は、実施例１と同様にして本発明に従う
LDH活性測定用乾式分析要素を作成した。 実施例 ４ 実施例１における試薬塗布液中のトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンの量を0.909ｇに変
更し、グルタミン酸の代りにクエン酸を1.320ｇ
用いた以外は、実施例１と同様にして本発明に従
うLDH活性測定用乾式分析要素を作成した。 実施例 ５ 実施例１において用いた試薬塗布液の代りに下
記の組成の試薬塗布液を用いた以外は、実施例１
と同様にして本発明に従うLDH活性測定用乾式
分析要素を作成した。 試薬塗布液の調製： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
1.515ｇ 乳酸リチウム 0.225ｇ 水 10.000ｇ 10％ポリビニルピロリドン 12.500ｇ NAD+ 0.075ｇ ジアホラーゼ 1000ユニツト EDTA・2Na塩 2.790ｇ 上記組成液に、6N塩酸を加え、塗布液のPHを
8.5に調製し、塗布液量25c.c.として用いた。 実施例 ６ 実施例１における試薬塗布液中のグルタミン酸
の代りにアスパラギン酸を1.320ｇ用いた以外は、
実施例１と同様にして本発明に従うLDH活性測
定用乾式分析要素を作成した。 実施例 ７ 実施例１における試薬塗布液中のグルタミン酸
の代りにグルコン酸を1.320ｇ用いた以外は、実
施例１と同様にして本発明に従うLDH活性測定
用乾式分析要素を作成した。 NAD+残存量の測定 上記実施例１〜７および比較例のLDH活性測
定用乾式分析要素におけるNAD+の保存性を比較
するために、それぞれの分析要素について、
INT8ｍＭを含む２％ポリビニルピロリドン溶液
の塗布を行なわないものを準備した。これらの分
析要素を減圧乾燥後、45℃のSiO2を用いた乾燥
条件下で４日間保存した。 上記保存後の分析要素についてNAD+残存量の
測定を行なつた。上記残存量は、分析要素中の
DNA+を基質緩衝液（0.2Mトリス、0.1M乳酸リ
チウム、PH8.5）に抽出し、37℃で、LDH液を添
加することにより、NAD+をNADHに変換し、
340nｍにおける吸光度で測定した。測定結果を
用いて、NAD+の残存量を百分率により算出し
た。結果を下記第１表に示す。
利用して、その酸化還元酵素、基質あるいは、上
記反応に共役する酵素反応の酵素あるいはその基
質を検出するための、検出対象の酵素あるいは基
質と上記酵素反応を形成することのできる基質あ
るいは酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、電子
伝達性化合物、および電子受容性染料形成性化合
物を有し、そして電子伝達性化合物を酸化型ニコ
チンアミド補酵素および／または電子受容性染料
形成性化合物と同一の層内に含有する乾式分析要
素に関する。 ［従来技術］ デヒドロゲナーゼ系酵素と補酵素とを共役反応
系に組合わせた反応は臨床化学分析において広く
用いられている。例えばグリセリンデヒドロゲナ
ーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、
グルタメートデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ、α−グリセロフオスフエートデヒ
ドロゲナーゼ、グルコース−６−燐酸デヒドロゲ
ナーゼ等が関与する反応系が、トリグリセリド、
グリセリン、コレステロール、乳酸、グリタメー
ト、グリセリン−３−燐酸、グリコース−６−燐
酸等の基質や、アスパラギン酸アミノトランスフ
エラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフエ
ラーゼ（ALT）、乳酸デヒドロゲナーゼ
（LDH）、アミラーゼ、クレアチンキナーゼ
（CK）等の酵素の定量に用いられており、還元型
酵素の増加または減少の直接測定によつて定量分
析ができる特徴がある。しかし通常用いられる
NADH（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド）またはNADPH（ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドフアスフエート）は、吸収極大が
340nｍ付近にあるため、その光学的定量のため
には、紫外域の測光装置が必要となり、機器が高
価なものになる。また紫外域では多種の化合物が
吸収を有するためにそれらの干渉を受け易い。 NADH（またはNADPH）を紫外部吸収により
直接に定量する代りに、NADHの存在下で、電
子伝達性化合物を介して電子受容性化合物を還元
し、可視領域において検出可能な化合物（染料）
を形成する反応系が提案されている。 しかし、酸化型補酵素、電子伝達性化合物、電
子受容性化合物の三者を共存させておくと、時日
の経過とともに反応の感度は著しく悪化する。特
に特公昭53−21677号公報に記載されたような乾
式一体型多層分析要素に上記反応系を組入れると
き、この問題に直面する。 特開昭49−11395号公報では、上三成分のうち
電子伝達性化合物を異なる層に配置することを提
案している。また特開昭59−44658号公報では、
電子伝達剤と色素形成物質とを、互いに実質的に
反応しえないように疎水性物質を親水性分散媒中
に分散するよう方法を開示している。しかし、こ
のように電子伝達性化合物を他の二要素から分離
すると、検出反応の進行は分離された試薬（特に
電子伝達性化合物）の拡散速度で支配されるた
め、反応速度、したがつて検出感度の低下をまね
く。 上記NADH（またはNADPH）検出組成物を乾
式一体型多層分析要素（例えば特公昭53−21677
号公報に記載の自動化学分析用多層分析素子）の
試薬層に適用すると、組成物の染料形成速度は常
温の保存で数週間に1/2以下になることが見出さ
れた。この原因を究明すると、特開昭57−132061
号公報で言及しているような電子受容性化合物の
劣化が原因ではなく、主たる原因は、補酵素
NAD（またはNADP）の劣化にあることがわか
つた。衝撃液中の補酵素の劣化を防ぐ方法として
特開昭59−82398号公報に開示されたようなキレ
ート化剤とアジ化物を併せて添加する方法が知ら
れている。しかし、爆発性および毒性を有するア
ジ化物を用いなければ効果が挙がらず、安全上お
よび公害の点から好ましくない。 ［発明の要旨］ 本発明の目的は、酸化還元酵素とその基質との
反応を利用して、その酸化還元酵素、基質あるい
は、上記反応に共役する酵素反応の酵素あるいは
その基質を検出するための、検出対象の酵素ある
いは基質と上記酵素反応を形成することのできる
基質あるいは酵素、そして酸化型ニコチンアミド
補酵素、電子伝達性化合物および電子受容性染料
形成性化合物を含む検出試薬系を有する乾式分析
要素において、電子伝達性化合物を他の二要素か
ら分離することなく、充分な反応速度を保ちつ
つ、酸化型ニコチンアミド補酵素の保存性を向上
させることである。 本発明は、酸化還元酵素とその基質との反応を
利用して、その酸化還元酵素、基質あるいは、上
記反応に共役する酵素反応の酵素あるいはその基
質を検出するための、検出対象の酵素あるいは基
質と上記酵素反応系を形成することのできる基質
あるいは酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、電
子伝達性化合物、および電子受容性染料形成性化
合物を有し、そして電子伝達性化合物を酸化型ニ
コチンアミド補酵素および／または電子受容性染
料形成性化合物と同一の層内に含有する乾式分析
要素において、 上記酸化型ニコチンアミド補酵素を含有する層
内に、酸性アミノ酸、エチレンジアミン四酢酸、
ヒドロキシポリカルボン酸、およびポリヒドロキ
シカルボン酸からなる群より選ばれるカルボン酸
系補酵素安定剤を含有させたことを特徴とする乾
式分析要素にある。 本発明において、カルボン酸系補酵素安定剤と
は、乾燥状態の酸化型ニコチンアミド補酵素に添
加することにより酸化型ニコチンアミド補酵素の
保存性を向上させる機能を有するカルボン酸を意
味する。 ［発明の詳細な記述］ 本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用する
ことができる。特にデヒドロゲナーゼ酵素系と還
元型補酵素検出系と被検液体がいずれも浸透し得
る固体担体を含む要素に適用することができる。
要素は単一層で構造されてもよく。また試薬層、
反射層、多孔質展開層、光遮蔽層、濾過層、係留
（refistration）層、吸水層、支持体、下塗層およ
び業界公知のその他の層を含む多重層であつたも
よい。かような分析要素には米国特許第3992158
号および同4042335号各明細書に開示のものがあ
る。 支持体を用いる場合、実用的に好ましい構成
は、 (1) 支持体上に試薬層を兼ねる展開層を有するも
の (2) 支持体上に吸水層、その上に試薬層を兼ねる
展開層を有するもの (3) 支持体上に試薬層と展開層を有するもの (4) 支持体上に吸水層、試薬層、展開層をこの順
に有するもの (5) 支持体上に試薬層、反射層または濾過層、展
開層をこの順に有するもの (6) 支持体上に吸水層、試薬層、濾過層、展開層
をこの順に有するもの などである。しかし、光透過性・水不透過性支持
体、吸水層および検出試薬系とカルボン酸系補酵
素安定剤を含有する展開層を順次積層一体化して
なる一体型多層分析要素とすることが好ましい。 本発明の乾式分析要素において少なくとも一層
の試薬層に含まれる検出試薬系には、酸化型ニコ
チンアミド補酵素が含まれる。酸化型ニコチンア
ミド補酵素とは、具体的には、NAD+（ニコチン
アミド・アデニンジヌクレオチド酸化型）または
NADP+（ニコチンアミド・アデニンジヌクレオ
チド・ホスフエート酸化型）を意味する。NAD+
およびNADP+のうちどちらを使用するかは、分
析対象として、あるいは検出試薬として検出反応
に関与する酸化還元酵素の種類に応じて決定され
る。 本発明の乾式分析要素において少なくとも一層
の試薬層に含まれる検出試薬系には、電子伝達性
化合物を含む。本発明において電子伝達性化合物
とは、被検物質の反応により生成した還元型ニコ
チンアミド補酵素（電子供与体）から電子を受け
取つて、後述する電子受容性染料形成性化合物を
還元する可能を有する化合物を意味する。上記電
子伝達性化合物の具体例としては、５−メチルフ
エナジニウム・メチルスルフエートあるいは１−
メトキシ−５−メチルフエナジニウム・メチルス
ルフエート等のＮ−メチルフエナジン・メトサル
フエート類およびジアホラーゼ（ジヒドロリポア
ミドレダクターゼ、EC1.6.4.3.）等を挙げること
ができる。 本発明の乾式分析要素に用いられる検出試薬系
には、さらに電子受容性染料形成性化合物が含ま
れる。電子受容性染料形成性化合物は、上記電子
伝達性化合物により還元され、長波長領域におい
て検出可能な化合物（染料）を形成する物質であ
る。本発明の乾式分析要素において、電子受容性
染料形成性化合物は、テトラゾリウム塩を用いる
ことが好ましい。テトラゾリウム塩の具体例とし
ては、 ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス［２−（ｐ−ニトロフエニル−2H
−テトラゾリウムクライド］（＝NBT）； ３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ−ニトロ
フエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾリウム
クライド（＝INT）； ３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−
2H−テトラゾリウムブロマイド（＝MTT）； ３，3′−（４，4′−ビフエニレン）−ビス（２，
５−ジフエニル−2H−テトラゾリウムクロライ
ド； ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス（２，５−ジフエニル−2H−テト
ラゾリウムクロライド；および ３，3′−（３，3′−ジメトキシ−４，4′−ビフエ
ニレン）−ビス［２，５−ビス（ｐ−ニトロフエ
ニル）−2H−テトラゾリウムクロライドを挙げる
ことができる。 なお、上記酸化型ニコチンアミド補酵素、電子
伝達性化合物および電子受容性染料形成性化合物
を含む反応系の詳細については、 A.L.Babson等によるクリニカ・キミカ・アク
タ［CLINICA CHIMICA ACTA］12巻（1965）
210−215頁； R.J.Gay等によるクリニカル・ケミストリー
［CLINICAL CHEMISTRY］Vol.14、No.８、
1968、740−753頁；および、 R.D.Capps 等によるクリニカル・ケミスト
リーVol.12、No.７、1966、406−413頁；等の文献
に記載されている。 本発明の乾式分析要素に用いられる検出試薬系
は、液体試料中における様々な種類の酸化還元酵
素活性の測定に使用することができる。すなわ
ち、本発明の乾式分析要素は、酸化型ニコチンア
ミド補酵素が電子受容体となる全ての酸化還元酵
素（脱水素酵素）の測定が可能である。上記のよ
うに本発明の乾式分析要素を酸化還元酵素の活性
の測定に使用する場合には、上記検出試薬系に
は、さらに酸化還元酵素が触媒する酸化反応（脱
水素反応）の基質が加えられる。例えば、本発明
の乾式分析要素を乳酸デヒドロゲナーゼ活性測定
用として用いる場合には、上記検出試薬系にさら
に乳酸が含まれる。グルコース−６−燐酸デヒド
ロゲナーゼの場合には、基質としてグリコース−
６−燐酸が添加される。 本発明の乾式分析要素を上記酸化還元酵素が触
媒する酸化反応の基質の液体試料中における濃度
を測定する目的に用いることもできる。この場合
には、この酸化還元酵素が上記検出試薬系に含ま
れる。 さらに、本発明の乾式分析要素は、他の化学反
応を上記検出反応と共役させることにより、上記
以外の酵素活性あるいは物質濃度の測定に用いる
ことも可能である。この場合においても、共役さ
せる化学反応に必要な試薬類が、上記検出試薬系
に含まれる。例えば、酵素共役反応にて脱水素酵
素に共役できるクレアチンキナーゼ活性測定の場
合には、クレアチン燐酸、グルコース、ヘキソキ
ナーゼ等が添加される。 本発明の乾式分析要素は、カルボン酸系補酵素
安定剤を、酸化型ニコチンアミド補酵素と同一の
層内に含有する。前述したように、本発明におい
て、カルボン酸系補酵素安定剤とは、少なくとも
酸化型ニコチンアミド補酵素および電子伝達性化
合物が接触した状態において、添加することによ
り酸化型ニコチンアミド補酵素の保存性を向上さ
せる機能を有するカルボン酸を意味する。上記カ
ルボン酸としては、上記検出反応（他の化学反応
を検出反応と共役させる場合には、この共役反応
を含む）には、実質的に影響を与えることのない
カルボン酸を用いることが好ましい。 本発明において、酸化型ニコチンアミド補酵素
を含有する層内に導入されるカルボン酸系補酵素
安定剤は、酸性アミノ酸、エチレンジアミン四酢
酸（EDTA）、ヒドロキシポリカルボン酸、およ
びポリヒドロキシカルボン酸からなる群より選ば
れる。酸性アミノ酸の例としては、グルタミン酸
およびアスパラギン酸を挙げることができる。ヒ
ドロキシポリカルボン酸の例としては、クエン酸
およびリンゴ酸を挙げることができる。そしてポ
リヒドロキシカルボン酸の例としては、グルコン
酸などのアルドン酸、トリス（ヒドロキシメチ
ル）−メチルグリシン、およびＮ，Ｎ−ビス（２
−ヒドロキシエチル）−グリシンを挙げることが
できる。 本発明の乾式分析要素の検出試薬系とカルボン
酸を含有する層には、親水性ポリマー、緩衝剤あ
るいは光遮蔽性微粒子等を必要に応じて含有させ
ることができる。 本発明の乾式分析要素の検出試薬系とカルボン
酸系補酵素安定剤を含有する層にさらに含有させ
ることができる親水性ポリマーの例としては、澱
粉、セルロース、アガロース、ゼラチンおよびこ
れらの誘導体（例、ヒドロキシメチル化およびヒ
ドロキシプロピル化等）、アクリルアミド重合体、
アクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重
合体、ビニルピロリドン重合体、ビニルピロリド
ンと各種ビニル性モノマーとの共重合体、アクリ
レート重合体およびアクリレートと各種ビニル性
モノマーとの共重合体等を挙げることができる。
上記親水性ポリマーのうちではビニルピロリドン
重合体、アクリルアミド重合体またはセルロース
誘導体が好ましい。 上記親水性ポリマーを、乾式分析要素の検出試
薬系とカルボン酸系補酵素安定剤を含有する展開
層に含有させる場合には、約２ｇ／m2から約15
ｇ／m2の範囲で含有させることが好ましい。上記
含有量のうち特に好ましいのは、約２ｇ／m2から
約10ｇ／m2の範囲である。 本発明の乾式分析要素の検出試薬系とカルボン
酸系補酵素安定剤を含有する層にさらに含有させ
ることができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホ
ウ酸塩、燐酸塩やグツド（Good）の緩衝剤など
の公知の緩衝剤を挙げることができる。これらの
緩衝剤は『蛋白質・酵素の基礎実験法』（掘尾武
一、他著、南江堂、1981）等の公知文献を参考に
して選択し、使用することができる。 本発明の乾式分析要素の検出試薬系を含有する
層には、さらに後述する光遮蔽層に用いられる光
遮蔽性微粒子を含有させることもできる。 検出試薬系を含有する層に上記の検出試薬系、
カルボン酸系補酵素安定剤および必要に応じて加
えられる親水性ポリマー、緩衝剤あるいは光遮蔽
性微粒子等を含有させるに際しては、上記試薬等
を含有する塗布液を展開層の上から塗布または噴
霧し乾燥する方法を用いることができる。 また検出試薬系とカルボン酸系補酵素安定剤を
含有する層が織物、編物、濾紙、不織布およびガ
ラス繊維瀘紙等からなる展開層である場合には、
上記試薬等を含有する溶液に展開層を浸漬したの
ち乾燥する方法を用いることができる。また、一
体型多層分析要素とするため、上記のような展開
層をラミネートにより積層する場合には、上記の
ように浸漬した展開層を乾燥または半乾燥状態で
他の層に積層し一体化する方法を用いることもで
きる。 塗布により形成される層、例えばブラツシユポ
リマー層やミクロビーズ三次元格子状粒子構造体
等からなる層の場合には、この層の塗布液と試薬
等の塗布液を混合して塗布してもよい。 なお、展開層に試薬等を含有させる場合に、い
くつかの試薬毎に異なる方法を用いることもでき
る。また、いくつかの試薬毎に数回に分けて行な
うこともできる。 本発明において、検出試薬系を含む層は、二つ
以上の層から成つてもよい。この場合に、ニコチ
ンアミド補酵素、電子伝達性化合物および電子受
容性染料形成性化合物は、全ての層に均一に含有
されてよい。特に補酵素は支持体から遠い層に、
電子受容性染料形成性化合物は支持体に近い層に
多く分布させることが好ましい。 本発明の乾式分析要素に用いることができる光
透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエ
チレンテレフタレート、ビスフエノールＡのポリ
カルボネート、ポリスチレン、セルロースエステ
ル（例、セルロースジアセテート、セルロースト
リアセテート、セルロースアセテートプロピオネ
ート等）等のポリマーからなる厚さ約50μｍから
約１mm、好ましくは約80μｍから約300μｍの範囲
のフイルム、もしくはシート状の透明支持体を挙
げることができる。 本発明の乾式分析要素に用いることができる光
不透過性または光反射性支持体としては、上記ポ
リマー中に光反射性色材を含有させることにより
容易に作成することができる。また、上記ポリマ
ー等からなる透明支持体表面に光反射性色材を塗
布する、または光反射性色材をからなる粘着テー
プを貼る等によつても容易に作成することができ
る。 これら支持体の表面には必要により下塗層を設
けて、支持体の上に設けられる吸水層あるいは検
出試薬系とカルボン酸系補酵素安定剤を含有する
層と支持体との接着を強固なものにすることがで
きる。また、下塗層の代りに、支持体の表面に物
理的あるいは化学的な活性下処理を施して接着力
の向上を図つてもよい。 本発明の乾式分析要素が一体型多層分析要素で
ある場合には、光透過性・水不透過性支持体の上
に（場合によつては下塗層等の他の層を介して）
吸水層が設けられる。本発明の乾式分析要素に備
えられる吸水層は親水性結合剤よりなる層、すな
わち水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを層形
成成分として利用している層であることが好まし
い。 吸水層の製造に用いることができる親水性ポリ
マーは、一般には水吸収時の膨潤率が30℃で約
150％から約2000％、好ましくは約250％から約
1500％の範囲の天然または合成親水性ポリマーで
ある。そのような親水性ポリマーの例としては、
ゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチ
ン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、
ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、
アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリア
クリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン等をあげることができる。 吸水層の乾燥時の厚さは約1μｍから約100μｍ
の範囲であることが好ましく、より好ましくは約
3μｍから約30μｍの範囲である。また吸水層は実
質的に透明であることが好ましい。さらに吸水層
には、必要に応じて界面活性剤や緩衝剤を含有さ
せることもできる。 上記吸水層の上には、必要に応じて光遮蔽層を
設けることができる。光遮蔽層は、光遮蔽性、ま
たは光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子ま
たは微粉末（以下、単に微粒子という）が少量の
皮膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーに
分散保持されている水透過性または水浸透性の層
である。光遮蔽層は吸水層にて発生した検出可能
な変化（色変化、発色等）を光透過性を有する支
持体側から反射測光する際に、検出試薬系とカル
ボン酸を含有する展開層に点着供給された水性液
体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビ
ンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層または背
景層としても機能する。 光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子の例
としては、二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナ
ターゼ型またはブルカイト型の粒子径が約0.1μｍ
から約1.2μｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微
粒子、アルミニウム微粒子または微小フレーク等
を挙げることができ、光遮蔽性微粒子の例として
は、カーボンブラツク、ガスブラツク、カーボン
ミクロビーズ等を挙げることができ、これらのう
ちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子
が好ましい。特に好ましいのは、アナターゼ型二
酸化チタン微粒子である。 皮膜形成能を有する親水性ポリマーバインダー
の例としては、前述の吸水層の製造に用いられる
親水性ポリマーと同様の親水性ポリマーのほか
に、弱親水性の再生セルロース、セルロースアセ
テート等を挙げることができ、これらのうちでは
ゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド
等が好ましい。なお、ゼラチン、ゼラチン誘導体
は公知の硬化剤（架橋剤）を添加することができ
る。 光遮蔽層は、光遮蔽成微粒子と親水性ポリマー
との水性分散液を公知の方法により吸水層の上に
塗布し乾燥することにより設けることができる。
また、光遮蔽層を設ける代りに、後述するように
検出試薬系とカルボン酸系補酵素安定剤を含有す
る展開層中に光遮蔽性微粒子を含有させてもよ
い。 なお、吸水層の上に、場合によつては光遮蔽層
等の層を介して、展開層を接着し積層するために
接着層を設けてもよい。接着層は水で湿潤してい
るとき、または水を含んで膨潤しているときに展
開層を接着することができ、これにより各層を一
体化できるような親水性ポリマーからなることが
好ましい。接着層の製造に用いることができる親
水性ポリマーの例としては、吸水層の製造に用い
られる親水性ポリマーと同様な親水性ポリマーが
あげられる。これらのうちではゼラチン、ゼラチ
ン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接
着層の乾燥膜厚は一般に約0.5μｍから約20μｍ、
好ましくは約1μｍから約10μｍの範囲である。な
お、接着層は吸水層上以外にも、他の層間の接着
力を向上させるため所望の層上に設けてもよい。
接着層は親水性ポリマーと、必要によつて加えら
れる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、
支持体や吸水層等の上に塗布する方法などにより
設けることができる。 展開層は、液体計量作用を有する展開層である
ことが特に好ましい。液体試料計量作用を有する
展開層とは、その表面に点着供給された液体試料
を、その中に含有している成分を実質的に偏在さ
せることなく、横（水平）方向に単位面積当りほ
ぼ一定量の割合で広げる作用を有するものであ
る。 展開層のマトリツクスを構成する材料として
は、濾紙、不織布、織物生地（例、ブロード、ポ
プリン等の平織等）、編物生地（例、トリコツト
編、ダブルトリコツト編、ミラニーズ編物等）、
ガラス繊維濾紙、ブラツシユポリマーより形成さ
れるメンブランフイルター、あるいはポリマーミ
クロビーズ等からなる三次元格子状構造物等を用
いることが好ましい。これらのうちでは、試薬類
の保持性の点で、織物生地および編物生地に代表
される繊維質層を用いることが特に好ましい。 本発明の乾式分析要素に用いることができる織
物生地または編物生地は水洗等の脱脂処理により
少なくとも糸製造時、織物製造時あるいは編物編
成時に供給または付着した油脂類を実質的に除去
した織物または編物生地が好ましい。 上記織物または編物生地を一体型多層分析要素
の展開層として用いる場合には、さらにその織物
または編物生地に特開昭57−66359号公報に開示
の物理的活性化処理（好ましくはグロー放電処理
またはコロナ放電処理等）を生地の少なくとも片
面に施すか、あるいは特開昭55−164356号、特開
昭57−66359号公報等に開示の親水性ポリマー含
浸処理等の親水化処理またはこれらの処理工程を
逐次実施することにより織物または編物を親水化
し、下側（支持体に近い側）の層との接着力を強
化することができる。 織物または編物生地からなる一体型多層分析要
素の展開層を前述した吸水層または接着層に接
着、積層するには、特開昭55−164356号および特
開昭57−66359号各公報等に開示の方法に従つて
作成することができる。すなわち、吸水層または
接着層の塗布後未乾燥のうちに、または乾燥後の
層に水（または界面活性剤を少量含む水）を実質
的に均一に供給して層を膨潤させ、ついで織物ま
たは編物生地を湿潤または膨潤している層の上に
実質的に均一に軽く圧力をかけながら接着、積層
し一体化する。 また展開層がブラツシユポリマーまたはメンブ
ランフイルターからなる場合には特公昭53−
21677号公報等、ポリマーミクロビーズからなる
三次元格子状構造物である場合には特開昭55−
90859号公報等、濾紙または不織布からなる場合
には特開昭57−148250号公報等にそれぞれ記載の
方法に従つて設けることができる。 前述した吸水層または接着層の親水性ポリマー
バインダーがゼラチンまたはゼラチン誘導体の場
合には、層の塗布後ゼラチン（または誘導体）が
未乾燥のゲル状態の間に上記展開層を構成する材
料（織物または編物生地等）を接着、積層し一体
化する方法を採用することができる。 本発明の乾式分析要素は、検出試薬系とカルボ
ン酸系補酵素安定化剤を含有する層よりなる単一
のシートから構成することも可能である。 本発明の乾式分析要素は、一体型多層分析要素
とした場合には、一辺約15mmから約30mmの正方形
またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特
開昭57−63452号、特開昭54−156079号、実開昭
56−142454号、実開昭58−32350号および特開昭
58−501144号各公報等に開示のスライド枠等に納
めて分析スライドとして用いるのが製造、包装、
輸送、保存および測定操作等の全ての観点で好ま
しい。 本発明の乾式分析要素は、約5μから約30μ
、好ましくは約8μから約15μの水性液体試
料を展開層に点着供給し、必要に応じて約20℃か
ら約45℃の範囲の実質的に一定の温度でインクベ
ーシヨンする。その後、一方の側から（一体型多
層分析要素においては光透過性支持体側から）乾
式分析要素内の色変化、発色等の検出可能な変化
を反射測光し比色法の原理により液体試料中の測
定対象成分を分析する。 ［発明の効果］ 本発明の乾式分析要素において、カルボン酸系
補酵素安定剤が、酸化型ニコチンアミド補酵素、
と同一の層内に存在することにより、酸化型ニコ
チンアミド補酵素の保存性が著しく向上する。 また本発明の乾式分析要素は、酸化型ニコチン
アミド補酵素、電子伝達性化合物および電子受容
性染料形成性化合物を含む検出試薬系を同一の層
内に含有することを実用的に可能にするものであ
るため、検出反応の円滑な進行が妨げられること
がなく、検出精度が優れている。 以下に本発明の実施例及び比較例を示す。 実施例 １ 透明ポリエチレンフタレート支持体（厚さ：
180μｍ）の表面を親水化処理し、その処理表面
上に下記の組成の塗布液を120μ／m2となるよ
うに塗布、乾燥して乾燥膜厚10μｍの吸水層を形
成した。 吸水層形成用塗布液： ゼラチン 10ｇ 水 2700ｇ オクチルフエノキシ・ポリエトキシエタノール
0.5ｇ 次に、上記吸水層の上に、ポリエステル撚糸ト
リコツト編み展開層（厚さ：250μｍ）を湿式ラ
ミネート法により接着した。 上記展開層に下記の組成の試薬塗布液を塗布乾
燥した。 試薬塗布液の調製： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
0.303ｇ 乳酸リチウム 0.225ｇ 水 10.000ｇ 10％ポリビニルピロリドン 12.500ｇ NAD+ 0.075ｇ ジアホラーゼ 1000ユニツト グルタミン酸 0.350ｇ 上記組成液に、1N水酸化ナトリウム水溶液を
加え、塗布液のPHを8.5に調製し、塗布液量25c.c.
として用いた。 次いで、３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ
−ニトロフエニル）−５−フエニル−2H−テトラ
ゾリウムクロライド（＝1NT）８ｍＭを含む２
％ポリビニルピロリドン溶液を上記展開層に塗布
後、乾燥して本発明に従うLDH（乳酸デエヒドロ
ゲナーゼ）活性測定用乾式分析要素を作成した。 比較例 １ 実施例１において用いた試薬塗布液の代りに下
記の組成の試薬塗布液を用いた以外は、実施例１
と同様にして比較用LDH活性測定用乾式分析要
素を作成した。 試薬塗液の調製： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
0.909ｇ 乳酸リチウム 0.225ｇ 水 10.000ｇ 10％ポリビニルピロリドン 12.500ｇ NAD+ 0.075ｇ ジアホラーゼ 1000ユニツト 上記組成液に、6N塩酸を加え、塗布液のPHを
8.5に調製し、塗布液量25c.c.として用いた。 実施例 ２ 実施例１における試薬塗布液中のグルタミン酸
の量を0.700ｇに変更した以外は、実施例１と同
様にして本発明に従うLDH活性測定用乾式分析
要素を作成した。 実施例 ３ 実施例１における試薬塗布液中のトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンの量を0.909ｇに、
グルタミン酸の量を2.100ｇにそれぞれ変更した
以外は、実施例１と同様にして本発明に従う
LDH活性測定用乾式分析要素を作成した。 実施例 ４ 実施例１における試薬塗布液中のトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンの量を0.909ｇに変
更し、グルタミン酸の代りにクエン酸を1.320ｇ
用いた以外は、実施例１と同様にして本発明に従
うLDH活性測定用乾式分析要素を作成した。 実施例 ５ 実施例１において用いた試薬塗布液の代りに下
記の組成の試薬塗布液を用いた以外は、実施例１
と同様にして本発明に従うLDH活性測定用乾式
分析要素を作成した。 試薬塗布液の調製： トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
1.515ｇ 乳酸リチウム 0.225ｇ 水 10.000ｇ 10％ポリビニルピロリドン 12.500ｇ NAD+ 0.075ｇ ジアホラーゼ 1000ユニツト EDTA・2Na塩 2.790ｇ 上記組成液に、6N塩酸を加え、塗布液のPHを
8.5に調製し、塗布液量25c.c.として用いた。 実施例 ６ 実施例１における試薬塗布液中のグルタミン酸
の代りにアスパラギン酸を1.320ｇ用いた以外は、
実施例１と同様にして本発明に従うLDH活性測
定用乾式分析要素を作成した。 実施例 ７ 実施例１における試薬塗布液中のグルタミン酸
の代りにグルコン酸を1.320ｇ用いた以外は、実
施例１と同様にして本発明に従うLDH活性測定
用乾式分析要素を作成した。 NAD+残存量の測定 上記実施例１〜７および比較例のLDH活性測
定用乾式分析要素におけるNAD+の保存性を比較
するために、それぞれの分析要素について、
INT8ｍＭを含む２％ポリビニルピロリドン溶液
の塗布を行なわないものを準備した。これらの分
析要素を減圧乾燥後、45℃のSiO2を用いた乾燥
条件下で４日間保存した。 上記保存後の分析要素についてNAD+残存量の
測定を行なつた。上記残存量は、分析要素中の
DNA+を基質緩衝液（0.2Mトリス、0.1M乳酸リ
チウム、PH8.5）に抽出し、37℃で、LDH液を添
加することにより、NAD+をNADHに変換し、
340nｍにおける吸光度で測定した。測定結果を
用いて、NAD+の残存量を百分率により算出し
た。結果を下記第１表に示す。
【表】
【表】
実施例８および比較例２
ゼラチン下塗りが施された厚さ180μｍのポリ
エチレンテレフタレート（PET）上に下記の処
方の塗布液を塗布、乾燥した。 ゼラチン ５ｇ／m2 ニトロテトラゾリラウムブルー 0.2ｇ／m2 ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.1ｇ／m2 次に、下記処方で酵素＋補酵素系の塗布を上記
塗布層の上に施した。 ゼラチン 20ｇ／m2 TRITON X100（ロール・アンド・ハースト社
製） 0.2ｇ／m2 NAD ２ｇ／m2 リンゴ酸 1.8ｇ／m2 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
3.2ｇ／m2 ATP 1.1ｇ／m2 MgSO4 0.1ｇ／m2 ジアホラーゼ 4000U／m2 グリセリン−３燐酸デヒドロゲナーゼ 5000U／m2 グリセリンキナーゼ 2800U／m2 次にこの二層積層されたゼラチン層に湿し水と
して30ｇ／m2の割合で水を供給、湿潤させたの
ち、グロー放電で予め親水化したポリエチレンテ
レフタレート紡績糸（50デニール）からなるトリ
コツト編物生地（平均厚さ250μｍ）をあつちや
くラミネートして展開層を設けた。ついで展開層
中で下記の成分被覆量になるようにして、編物展
開層の上から加水分解酵素水溶液を塗布により含
浸し乾燥してトリグイセライド（中性脂肪）定量
用一体型多層分析要素を完成した。 加水分解酵素塗布組成物の成分 リポプロテインリパーゼ 1000U／m2 ポリオキシエチレンアクチルフエニルエーテル
２ｇ／m2 比較例２としてリンゴ酸を塩酸に変更して同モ
ル添加した以外は全て同処方、同工程で分析要素
を作成した。完成した要素を1.5mm×1.5mmの正方
形チツプに裁断し、特開昭57−63452号公報に開
示のプラスチツクマウントに収めて中性脂肪定量
用化学分析スライドを完成した。 このスライドを乾燥状態で−25℃と45℃に一週
間放置した後、中性脂肪濃度の異なるヒト血清を
10μ点着し、37℃で６分間インキユベーシヨン
したのち、540nｍの測定光でPET支持体側から
反射光学濃度を測定した。 前記血清について別にグリセロール−３−燐酸
オシダーゼ法で中性脂肪濃度を決定し、検量線を
作成し、比較例と比較した。 中性脂肪濃度０に対しては７％ヒトアルブミン
溶液を点着して光学濃度を測定した。 第１図は、実施例８により得られた検量線、第
２図は比較例２により得られた検量線である。本
発明の実施例８では、分析要素を45℃に放置して
も定温保存したものとほとんど差がないのに対
し、比較例では45℃に放置すると背景濃度が上昇
し中性脂肪濃度に対する感度が低くなつたことが
わかる。
エチレンテレフタレート（PET）上に下記の処
方の塗布液を塗布、乾燥した。 ゼラチン ５ｇ／m2 ニトロテトラゾリラウムブルー 0.2ｇ／m2 ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.1ｇ／m2 次に、下記処方で酵素＋補酵素系の塗布を上記
塗布層の上に施した。 ゼラチン 20ｇ／m2 TRITON X100（ロール・アンド・ハースト社
製） 0.2ｇ／m2 NAD ２ｇ／m2 リンゴ酸 1.8ｇ／m2 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
3.2ｇ／m2 ATP 1.1ｇ／m2 MgSO4 0.1ｇ／m2 ジアホラーゼ 4000U／m2 グリセリン−３燐酸デヒドロゲナーゼ 5000U／m2 グリセリンキナーゼ 2800U／m2 次にこの二層積層されたゼラチン層に湿し水と
して30ｇ／m2の割合で水を供給、湿潤させたの
ち、グロー放電で予め親水化したポリエチレンテ
レフタレート紡績糸（50デニール）からなるトリ
コツト編物生地（平均厚さ250μｍ）をあつちや
くラミネートして展開層を設けた。ついで展開層
中で下記の成分被覆量になるようにして、編物展
開層の上から加水分解酵素水溶液を塗布により含
浸し乾燥してトリグイセライド（中性脂肪）定量
用一体型多層分析要素を完成した。 加水分解酵素塗布組成物の成分 リポプロテインリパーゼ 1000U／m2 ポリオキシエチレンアクチルフエニルエーテル
２ｇ／m2 比較例２としてリンゴ酸を塩酸に変更して同モ
ル添加した以外は全て同処方、同工程で分析要素
を作成した。完成した要素を1.5mm×1.5mmの正方
形チツプに裁断し、特開昭57−63452号公報に開
示のプラスチツクマウントに収めて中性脂肪定量
用化学分析スライドを完成した。 このスライドを乾燥状態で−25℃と45℃に一週
間放置した後、中性脂肪濃度の異なるヒト血清を
10μ点着し、37℃で６分間インキユベーシヨン
したのち、540nｍの測定光でPET支持体側から
反射光学濃度を測定した。 前記血清について別にグリセロール−３−燐酸
オシダーゼ法で中性脂肪濃度を決定し、検量線を
作成し、比較例と比較した。 中性脂肪濃度０に対しては７％ヒトアルブミン
溶液を点着して光学濃度を測定した。 第１図は、実施例８により得られた検量線、第
２図は比較例２により得られた検量線である。本
発明の実施例８では、分析要素を45℃に放置して
も定温保存したものとほとんど差がないのに対
し、比較例では45℃に放置すると背景濃度が上昇
し中性脂肪濃度に対する感度が低くなつたことが
わかる。
第１図および第２図は、それぞれ実施例８およ
び比較例２で得られた検量線を示す。
び比較例２で得られた検量線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酸化還元酵素とその基質との反応を利用し
て、その酸化還元酵素、基質あるいは、上記反応
に共役する酵素反応の酵素あるいはその基質を検
出するための、検出対象の酵素あるいは基質と上
記酵素反応糸を形成することのできる基質あるい
は酵素、酸化型ニコチンアミド補酵素、電子伝達
性化合物、および電子受容性染料形成性化合物を
有し、そして電子伝達性化合物を酸化型ニコチン
アミド補酵素および／または電子受容性染料形成
性化合物と同一の層内に含有する乾式分析要素に
おいて、 上記酸化型ニコチンアミド補酵素を含有する層
内に、酸性アミノ酸、エチレンジアミン四酢酸、
ヒドロキシポリカルボン酸、およびポリヒドロキ
シカルボン酸からなる群より選ばれるカルボン酸
系補酵素安定剤を含有させたことを特徴とする乾
式分析要素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23423685A JPS6293662A (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | 酸化型補酵素を含有する乾式分析要素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23423685A JPS6293662A (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | 酸化型補酵素を含有する乾式分析要素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6293662A JPS6293662A (ja) | 1987-04-30 |
| JPH0481439B2 true JPH0481439B2 (ja) | 1992-12-24 |
Family
ID=16967821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23423685A Granted JPS6293662A (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | 酸化型補酵素を含有する乾式分析要素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6293662A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4986281B2 (ja) * | 2004-10-05 | 2012-07-25 | 旭化成ファーマ株式会社 | 補酵素の安定化方法およびその組成物 |
| JP6160094B2 (ja) * | 2013-01-29 | 2017-07-12 | 東洋紡株式会社 | ジアホラーゼ組成物 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5988097A (ja) * | 1982-11-12 | 1984-05-21 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | 分析素子 |
-
1985
- 1985-10-18 JP JP23423685A patent/JPS6293662A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6293662A (ja) | 1987-04-30 |
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|---|---|---|---|
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