JPH0580980B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、抗原−抗体反応に基づく免疫反応
を、微粒子による散乱光の位相情報を利用して測
定する方法および装置に関する。

〔従来の技術〕

免疫物質、ホルモン、医薬品、免疫調節等生体
内微量成分の検出法として免疫反応の特異的選択
反応を利用した免疫分析法がある。この免疫分析
法には大別して酸素や放射性アイソトープを標識
物質として用いる標識免疫分析法と、抗原・抗体
複合対を直接測定する非標識免疫分析法との２つ
の方法があり、前者の標識免疫分析法としては、
ラジオイムノアツセイ（RIA）、エンザイムイム
ノアツセイ（EIA）、フルオロイムノアツセイ
（FIA）等がよく知られている。また、後者の非
標識免疫分析法としては、免疫電気泳動法、免疫
拡散法、沈降法等があり、例えば「臨床検査法提
要」（金井泉原著、金井正光編著、金原出版や、
「臨床検査」Vol、22，No.５（1978）、第471〜487
頁に詳しく説明されている。

更に、非標識免疫分析法の１つとして、
「Immuno−chemistry」，Vol.12，No.４（1975）、
第349〜351頁には、抗体または抗原を表面に固定
させた微粒子を被測定液中の抗原または抗体と反
応させ、凝集粒子の大きさに比例して減少するブ
ラウン運動の指標となる平均拡散定数を、レーザ
光の散乱光のスペクトル幅の変化から求めること
により抗原または抗体を定量分析する方法が開示
されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上述した標識免疫分析法にあつ
ては、高感度であるが、測定に長時間を要するう
えに標識試薬が高価であるため、検査コストが高
くなるという問題があり、また特にRIAにおいて
はアイソトープの取扱いや廃棄物処理等において
種々の制限があるという問題がある。

また、非標識免疫分析法として、抗体または抗
原を固定した微粒子を用いないものにあつては、
簡便ではあるが、感度、定量性、再現性の点で精
密測定としては不十分であると共に、測定時間が
長くなるという問題がある。

更に、上述した抗体または抗原を固定した微粒
子を用いるものにあつては、標識試薬を用いない
利点はあるが、微粒子のブラウン運動によるドツ
プラ効果によつて入射光のスペクトルが広がるの
を分光計を用いて検出しているため、装置が大形
で高価となる問題があると共に、分光計を機械的
に駆動する際に誤差が生じ、感度および再現性が
悪くなるという問題がある。

このような従来の問題点を解決するため、発明
者は直線偏光された光が微粒子により散乱を受け
ると、散乱光の偏光状態が抗原−抗体反応と密接
な関係にあることを利用して、その散乱光を入射
光の偏光面に対して直交する偏光面を有する検光
子を介して検知し、その検知出力に基づいて抗原
−抗体反応を測定する方法を提案した。

この方法によれば、高価な標識試薬や高価でか
つ大形な分光計を用いずに、高い精度および再現
性を以つて順次の試料の速度を能率良く行うこと
ができ、しかも測定時間の短縮、抗原−抗体反応
測定の自動化が可能であると共に抗原−抗体反応
について多くの有用な情報を得ることができると
いう利点がある。

しかしながら、発明者による種々の実験によれ
ば、上記の方法には次のような問題点があること
が判明した。すなわち、測定感度を上げるために
濃度を上げて散乱粒子数を増やすと多重散乱が起
こり、これがため抗原−抗体反応が起こらなくて
も入射光と直交する偏光成分が検知されて免疫反
応を正確に測定することができなくなる。

この発明は、このような問題点に着目してなさ
れたもので、高価な標識試薬や高価でかつ大形な
分光計を用いずに、高い精度および再現性を以つ
て順次の試料の測定を正確かつ能率良く行うこと
ができ、しかも測定時間の短縮、抗原−抗体反応
測定の自動化が可能な免疫反応の測定方法および
このような方法を実施する装置を提供することを
目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的を達成するため、この発明の免疫反応
測定方法は、少なくとも抗原および抗体を含む反
応液に直線偏光された光を投射し、その入射光の
抗原−抗体反応により生成される微粒子による散
乱光または反応液に加えた抗体または抗原を固定
した微粒子の抗原−抗体反応によつて生じる散乱
光の前記入射光の偏光方向と異なる偏光方向の成
分と、前記入射光の一部を分離して偏光方向を前
記入射光の偏光方向と異なる方向に回転して位相
を所定の変調周波数で変調した位相変調光との混
合光を検知し、その検知出力を前記変調周波数に
基づいて信号処理して抗原−抗体反応を測定する
ことを特徴とするものである。

更に、この発明は、少なくとも抗原および抗体
を含む反応液に光を投射し、抗原−抗体反応によ
り生成される凝集微粒子による散乱光または反応
液に加えた抗体または抗原を固定した微粒子の抗
原−抗体反応によつて生じる凝集微粒子による散
乱光に基づいて抗原−抗体反応を測定する装置に
おいて、 前記抗原−抗体反応を行う反応液を収容するセ
ルと、 このセルに直線偏光された光を入射させる光源
装置と、 前記セルの入射光の一部を分離し、その分離し
た光の偏光面を90°回転させて位相を所定の変調
周波数で変調する位相変調装置と、 この位相変調装置からの光と前記セルからの前
方散乱光との混合光を、前記入射光の偏光面と直
交する偏光面を有する検光子を介して受光する光
検出装置と、 この光検出装置の出力信号を、前記位相変調装
置における変調周波数に基づいて信号処理し、そ
の出力信号に基づいて抗原−抵抗反応を測定する
手段とを備えることを特徴とするものである。

〔作用〕

反応液を収容するセルに直線偏光した光を入射
させると、その光は反応液中の微粒子により散乱
され、その散乱光の偏光状態は微粒子の凝集状態
に応じて変化することになる。互いに凝集してい
ない微粒子は球形であるため、散乱光は入射光と
同じ面内に直線偏光している。これに対し、抗原
−抗体反応が起こり、微粒子が互いに凝集する
と、粒子塊は球形とはならなくなるから光学的に
異方性を呈することになり、散乱光は入射光とは
異なる偏光成分をもち、かつ位相にゆらぎを生じ
ない。散乱光が一回散乱光のみであれば、これを
入射光の偏光面と異なる、例えば直交する偏光面
を有する検光子を介して光検出器で受光すれば、
光検出器には凝集した粒子塊の散乱光のみが入射
し、しかもその出力は反応液中の微粒子の凝集状
態すなわち抗原−抗体反応の状態に応じて変化す
るもので、その出力に基づいて免疫反応を測定す
ることができる。

しかしながら、特に抗体または抗原を固定した
微粒子を用いる場合において、例えば測定感度を
上げるために粒子濃度を高めると多重散乱光が発
生する。この多重散乱光は、その位相が微粒子が
球形、すなわち凝集しない場合でもランダムに変
化する。このため上述したように、凝集粒子によ
る一回散乱光を入射光と直交する偏光面を有する
検光子を介して光検出器で受光するようにして
も、非凝集粒子による多重散乱光を検知してしま
い、これがため精度の高い測定ができなくなる。

この発明では、非凝集粒子による多重散乱光の
位相がランダムに変化するのに着目し、セルへの
入射光の一部を分離して偏光方向を入射光の偏光
方向と異なる方向に回転して位相変調し、この位
相変調した光をセルからの散乱光に加えて検光子
を介して光検出器で受光し、その出力を位相変調
した光の変調周波数に基づいて信号処理すること
により、凝集粒子による一回散乱光成分を分離し
て検出する。

ここで、光検出器の受光面での入射光の電界強
度Ｅは、 Ｅ＝E₁cos〔ωt＋φ₁〕＋E₂cos 〔ωt＋φ(t)〕＋E₃cos〔ωt＋ acosω₀ｔ＋φ₃〕 ……(1) となる。なお、E₁cos〔ωt＋φ₁〕は凝集粒子によ
り一回散乱光の電界強度を表し、φ₁は位相定数
を表し、E₂cos〔ωt＋φ(t)〕は非凝集粒子による
多重散乱光の電界強度を表し、φ(t)はそのランダ
ムな位相成分を表し、E₃cos〔ωt＋acosω₀ｔ＋φ₃〕
は入射光をacosω₀ｔで位相変調した光の電界強
度を表し、φ₃は一般にはφ₁と異なる位相定数を
表す。

２乗検波特性を持つた光検出器の出力信号E²
は次のように表される。E² ＝｛₁〔＋₁〕＋₂〔＋(
t)〕＋₃〔＋₀＋₃〕｝² ＝１／２E₁ ²＋１／２E₂ ²＋１／２E₃ ²＋E₁E₂（
〔＋₁〕）（〔＋(t)〕） ＋E₁E₃（〔＋₁〕）（〔＋
₀＋₃〕） ＋E₂E₃（〔＋(t)〕）（〔＋
₀＋₃〕）……(2) 上記(2)式において、周波数nω₀（ｎは自然数）
で変動する成分を持つのは第５項のみであり、こ
の第５項はベツセル関数を用いて次のように書き
換えることができる。

E₁E₃（〔＋₁〕）（〔
＋₀＋₃〕） ＝E₁E₃１／２（cos〔ωt＋φ₁＋φ₃〕＋co
s〔φ₁−φ₃〕） ｛J₀(a)＋_∞ 〓ⁿ⁼¹ ２（−１）ⁿJ_2o(a)cos2nω₀ｔ｝ −E₁E₃１／２（sin〔2ωt＋φ₁＋φ₃〕−s
in〔φ₁−φ₃〕） ｛_∞ 〓 〓^n-1 ２（−１）ⁿ⁺¹J_2o-1(a)cos〔（2n−１）ω₀ｔ〕｝…
…(3) 上記(3)式で周波数（2n−１）ω₀で変動する成
分の振幅は、 E₁E₃sin（φ₁−φ₃）J_2o-1(a) ……(4) である。また、周波数2nω₀で変動する成分の振
幅は、 E₁E₃cos（φ₁−φ₃）J_2o(a) ……(5) である。したがつて、実際に光検出器の出力信号
を角周波数ω₀，2ω₀，3ω₀，4ω₀，……つまり
mω₀（ｍは自然数）で変動する成分検出すると、
凝集粒子の一回散乱光を検出することができる。

〔実施例〕

第１図はこの発明による免疫反応測定装置の一
実施例の構成を示すものである。この実施例で
は、コヒーレント光を放射する光源１として波長
632.8nmのHe−Neガスレーザを用いる。コヒー
レント光を放射する光源１としては、このような
ガスレーザの他に半導体レーザのような固体レー
ザを用いることもできる。光源１から放射される
レーザ光束２は、例えばグラントムソンプリズム
より成る偏光子３に通して直線偏光とした後、ハ
ーフミラー４により光束５と光束６とに分離し、
その一方の光束５を集光レンズ７を経て透明なセ
ル８に投射する。

セル８中には、表面に抗体または抗原を固定し
た球状の微粒子、例えば表面に免疫グロブリンＧ
（IgG）を固定したポリスチレンラテツクス粒子
を分散させた緩衝液に、抗原または抗体を含む被
検液を加えて作成した抗原−抗体反応液９を収容
する。したがつて、セル８中で抗原−抗体反応が
起こり、微粒子間に相互作用が生じると、微粒子
が相互に付着するため、散乱光の偏光状態が変化
する。このセル８中の微粒子による前方散乱光
を、一対のスリツト１０ａ，１０ｂ、ハーフミラ
ー１１および入射側に設けた偏光子３の偏光面と
直交する偏光面を有する検光子１２を経て光電子
増倍管より成る光検出器１３に入射させる。

また、ハーフミラー４によつて分離した他方の
光束６は、反射ミラー１４で反射させた後、1/2
波長板１５を通してその偏光面を90°回転させて
検光子１２の偏光面と一致させ、その光を位相変
調器１６により発振器１７からの変調周波数ω₀
で位相変調してcos〔ωt＋acosω₀ｔ＋φ₃〕で変動
する直線偏光を作り、これを反射ミラー１８，ハ
ーフミラー１１および検光子１２を経て光検出器
１３に入射させる。

光検出器１３の出力信号は同期検波器１９に供
給し、ここで発振器１７からの周波数ω₀をもつ
た参照信号により同期検波し、その出力を表示装
置２０に表示させる。この実施例では、光検出器
１３の出力信号を周波数ω₀または2ω₀で同期検波
する。なお、位相変調器１６における変調振幅ａ
は、最大感度を得るために上記(4)，(5)式が最大値
をとるように調整する。

上記構成において、同期検波器１９の出力は凝
集粒子の一回散乱光、したがつて粒子の凝集状態
すなわち抗原濃度にのみ依存することになる。し
たがつて、抗原濃度既知の試料について予め検量
線を求めておけば、未知試料における同期検波器
１９の出力から抗原濃度を正確かつ高精度で求め
ることができる。しかも、上記(4)，(5)式から明ら
かなように、光検出器１３の出力はE₁とE₃との
積になるので、E₃を大きくとれば同期検波出力
を増幅することができる。また、散乱粒子数を増
やしても非凝集粒子による多重散乱光の影響がな
いので、粒子濃度を高めることによつて光検出器
１３の感度を増大させて高感度の測定を行うこと
ができる。

第２図ＡおよびＢは第１図に示した位相変調器
１６の二つの例を示すものである。位相変調器１
６は、ポツケルス効果を利用したもので、結晶構
造の物質に電界を印加することにより結晶の屈折
率を変化させて透過光の位相を変調するものであ
る。第２図Ａにおいては、光が透過する結晶構造
の光学部材２１に、光路を挟むように一対の電極
２２ａ，２２ｂを設け、これら電極間に発振器１
７からの周波数ω₀の電界を印加するようにした
ものである。また、第２図Ｂにおいては、光学部
材２１の入射側および出射側端面に一対の透明電
極２３ａ，２３ｂを設け、これら電極間に同様に
電界を印加するようにしたものである。

なお、この発明は上述した実施例にのみ限定さ
れるものではなく、幾多の変更または変形が可能
である。例えば、上述した説明では免疫グロブリ
ンＧ（IgG）について例示したが、免疫ベンブリ
ンＡ（IgA）、IgM，IgD，IgE、オーストラリア
抗原、梅毒抗原、インシユリンなどの抗原−抗体
反応によつて凝集を生ずるすべての物質の測定に
適用することができる。また、上述した実施例で
は、微粒子の表面に抗体を固定して、被検体中の
抗原を検出するようにしたが、微粒子の表面に抗
原を固定し、被検体の抗体を検出することもでき
る。更に、上述した実施例では、微粒子としてポ
リスチレンラテツクス粒子を用いたが他の有機物
粒子や、金属、ガラスなどの無機物粒子を用いる
こともできる。また、上述した実施例では抗原−
抗体反応液の中に、最初から微粒子を存在させた
が、このような微粒子を用いずに、抗原−抗体反
応の結果として生ずる微粒子状生成物による散乱
光を利用することもできる。このような抗原−抗
体反応の実施例としては、抗原としてヒト絨毛ゴ
ナドトロピン（抗HCG）を用い、抗体として抗
ヒト絨毛ゴナドトロピン（抗HCG）を用いる反
応があり、この反応により生成される抗原−抗体
複合体は微粒子として扱うことができる。更に、
抗原そのものを粒子として用いることもできる。
このような抗原−抗体反応としては、抗原として
カンデイダ・アルビカンス（酵母）を用い、抗体
として抗カンデイダ・アルビカンスを用いる例
や、他に血球、細胞、微生物などを粒子として用
いることもできる。

また、上述した実施例では、抗原−抗体反応液
をセルに収容して測定を行うバツチ方向とした
が、抗原−抗体反応液を連続的に流しながら測定
を行うフロー方式とすることも勿論可能である。
更に、抗源としてコヒーレントな光を放射するレ
ーザ光源を用いたが、インコヒーレントな光を放
射する光源を用いることもできる。また、セルへ
の入射光として直線偏光以外のものを用いること
もできる。

〔発明の効果〕

以上述べたように、この発明によれば直線偏光
された光を反応液に入射させると共にその入射光
の一部を分離して偏光方向を入射光の偏光方向と
異なる方向に回転して位相変調し、反応液での散
乱光の入射光と異なる偏光成分と、位相変調した
光とを検知して、その検知出力を位相変調の周波
数に基づいて信号処理するようにしたので、非凝
集粒子による多重散乱光の影響を有効に除去する
ことができる。したがつて、常に正確でかつ高精
度の測定を行うことができると共に、粒子濃度を
高くして高感度の測定を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明による免疫反応測定装置の一
実施例の構成を示す線図、第２図ＡおよびＢは第
１図に示す位相変調器の二つの例の構成を示す斜
視図である。 １……光源、３……偏光子、４，１１……ハー
フミラー、７……集光レンズ、８……セル、９…
…反応液、１０ａ，１０ｂ……スリツト、１２…
…検光子、１３……光検出器、１４，１８……反
射ミラー、１５……1/2波長板、１６……位相変
調器、１７……発振器、１９……同期検波器、２
０……表示装置。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも抗原および抗体を含む反応液に直
   線偏光された光を投射し、その入射光の抗原−抗
   体反応により生成される微粒子による散乱光また
   は反応液に加えた抗体または抗原を固定した微粒
   子の抗原−抗体反応によつて生じる散乱光の前記
   入射光の偏光方向と異なる偏光方向の成分と、前
   記入射光の一部を分離して偏光方向を前記入射光
   の偏光方向と異なる方向に回転して位相を所定の
   変調周波数で変調した位相変調光との混合光を検
   知し、その検知出力を前記変調周波数に基づいて
   信号処理して抗原−抗体反応を測定することを特
   徴とする光の位相変調を利用した免疫反応の測定
   方法。 ２ 少なくとも抗原および抗体を含む反応液に光
   を投射し、抗原−抗体反応により生成される凝集
   微粒子による散乱光または反応液に加えた抗体ま
   たは抗原を固定した微粒子の抗原−抗体反応によ
   つて生じる凝集微粒子による散乱光に基づいて抗
   原−抗体反応を測定する装置において、 前記抗原−抗体反応を行う反応液を収容するセ
   ルと、 このセルに直線偏光された光を入射させる光源
   装置と、 前記セルの入射光の一部を分離し、その分離し
   た光の偏光面を90°回転させて位相を所定の変調
   周波数で変調する位相変調装置と、 この位相変調装置からの光と前記セルからの前
   方散乱光との混合光を、前記入射光の偏光面と直
   交する偏光面を有する検光子を介して受光する光
   検出装置と、 この光検出装置の出力信号を、前記位相変調装
   置における変調周波数に基づいて信号処理し、そ
   の出力信号に基づいて抗原−抗体反応を測定する
   手段とを具えることを特徴とする光の位相変調を
   利用した免疫反応の測定装置。