JPH0584075A - プトレツシンｎ−メチルトランスフエラーゼ、プトレツシンｎ−メチルトランスフエラーゼをコードする組換えｄｎａ分子、およびニコチン含量が変化したトランスジエニツクタバコ植物 - Google Patents
プトレツシンｎ−メチルトランスフエラーゼ、プトレツシンｎ−メチルトランスフエラーゼをコードする組換えｄｎａ分子、およびニコチン含量が変化したトランスジエニツクタバコ植物Info
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- JPH0584075A JPH0584075A JP3326531A JP32653191A JPH0584075A JP H0584075 A JPH0584075 A JP H0584075A JP 3326531 A JP3326531 A JP 3326531A JP 32653191 A JP32653191 A JP 32653191A JP H0584075 A JPH0584075 A JP H0584075A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 この発明は、高度に精製されたタバコプトレ
ッシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、その
精製法、およびＰＭＴ ＤＮＡ配列の製造法を提供する
ものである。 【構成】 精製法は、タバコ植物抽出液をアニオン交換
媒体に添加する工程を有し、添加温度および抽出液のｐ
Ｈと組成は、ＰＭＴがアニオン交換媒体によって保持さ
れるような条件である。次にＰＭＴを、有効量のポリア
ミンを含有する溶離緩衝液で、アニオン交換媒体から溶
離する。またＰＭＴをコードするセンス組換えＤＮＡ分
子とアンチセンス組換えＤＮＡ分子、これらの組換えＤ
ＮＡ分子を含有するベクター、およびこれらのＤＮＡ分
子またはベクターで形質転換されたトランスジェニクタ
バコ細胞とトランスジェニックタバコ植物を提供するも
のである。
ッシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）、その
精製法、およびＰＭＴ ＤＮＡ配列の製造法を提供する
ものである。 【構成】 精製法は、タバコ植物抽出液をアニオン交換
媒体に添加する工程を有し、添加温度および抽出液のｐ
Ｈと組成は、ＰＭＴがアニオン交換媒体によって保持さ
れるような条件である。次にＰＭＴを、有効量のポリア
ミンを含有する溶離緩衝液で、アニオン交換媒体から溶
離する。またＰＭＴをコードするセンス組換えＤＮＡ分
子とアンチセンス組換えＤＮＡ分子、これらの組換えＤ
ＮＡ分子を含有するベクター、およびこれらのＤＮＡ分
子またはベクターで形質転換されたトランスジェニクタ
バコ細胞とトランスジェニックタバコ植物を提供するも
のである。
Description
【０００１】この発明は、高度に精製されたプトレッシ
ンＮ−メチルトランスフェラーゼ、その新規の精製方
法、およびそのアンチセンス遺伝子およびセンス遺伝子
に関する。特にこの発明は、ニコチンレベルを遺伝的に
変化させたトランスジェニックタバコ植物を創製するた
めのセンスおよびアンチセンスのプトレッシンＮ−メチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の使用に関する。このよう
なトランスジェニック植物は、タバコ産業に用いる乾燥
タバコ葉を製造するのに有用である。
ンＮ−メチルトランスフェラーゼ、その新規の精製方
法、およびそのアンチセンス遺伝子およびセンス遺伝子
に関する。特にこの発明は、ニコチンレベルを遺伝的に
変化させたトランスジェニックタバコ植物を創製するた
めのセンスおよびアンチセンスのプトレッシンＮ−メチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子の使用に関する。このよう
なトランスジェニック植物は、タバコ産業に用いる乾燥
タバコ葉を製造するのに有用である。
【０００２】タバコからニコチンを除くために各種の方
法が採用されている。しかしこれらの方法のほとんど
が、ニコチンに対して充分に選択的でない。これらの方
法はタバコから他の成分を除去するのでタバコの風味と
香気に不利な影響を与える。その上に、このような方法
は、一般に複雑で費用が高い。
法が採用されている。しかしこれらの方法のほとんど
が、ニコチンに対して充分に選択的でない。これらの方
法はタバコから他の成分を除去するのでタバコの風味と
香気に不利な影響を与える。その上に、このような方法
は、一般に複雑で費用が高い。
【０００３】ニコチンと生化学的に合成される化合物
は、一般に一連の生化学反応によって形成され、各反応
は異なる酵素によって触媒される。所定の化合物をもた
らす特定の反応系列が一つの経路として知られている。
経路の作動とその最終生成物の産生を阻害する１方法
は、その経路で必要な酵素量を減らすことである。経路
の他の酵素に比べてその酵素の数度が、通常、経路の作
動においてその酵素を律速的にするよう充分に低い場
合、酵素の数度が減少すると、最終生成物の産生量が低
くなる。酵素の相対的数度が、通常、律速的でない場合
は、細胞中のその数度は、経路の産生量を減少させるた
めには、酵素を律速的にするように充分に低下させねば
ならない。同様に酵素の相対的な数度が律速的である場
合、その数度の増大によってその経路の最終産生物の産
生量が増大する。
は、一般に一連の生化学反応によって形成され、各反応
は異なる酵素によって触媒される。所定の化合物をもた
らす特定の反応系列が一つの経路として知られている。
経路の作動とその最終生成物の産生を阻害する１方法
は、その経路で必要な酵素量を減らすことである。経路
の他の酵素に比べてその酵素の数度が、通常、経路の作
動においてその酵素を律速的にするよう充分に低い場
合、酵素の数度が減少すると、最終生成物の産生量が低
くなる。酵素の相対的数度が、通常、律速的でない場合
は、細胞中のその数度は、経路の産生量を減少させるた
めには、酵素を律速的にするように充分に低下させねば
ならない。同様に酵素の相対的な数度が律速的である場
合、その数度の増大によってその経路の最終産生物の産
生量が増大する。
【０００４】ニコチンは最初にタバコ植物の根で形成さ
れ、次に葉に輸送され、葉の貯蔵される（Tso 、Physio
logy and Biochemistry of Tobacco Plants 、２３３〜
２３４頁、Dowden Hutchinson & Ross、米国、ペンシル
ヴェニア州、ストラウズバーグ、１９７２年）。ニコチ
ン分子は、二つの複素環、ピリジン部分およびピロリジ
ン部分で構成され、その各々は別個の生化学経路から誘
導される。ニコチンのピリジン部分はニコチン酸から誘
導される。ニコチンのピロリジン部分は、プトレッシン
からＮ−メチルプトレッシンに至り、次いでＮ−メチル
ピロリンに至る経路によって提供される。ニコチン生合
成時の必須の工程は、プトレッシンからＮ−メチルプト
レッシンを生成する工程である（Goodwin とMercer、In
troduction to Plant Biochemistry、４８８〜４９１
頁、Pergamon Press、米国、ニューヨーク、１９８３
年）。
れ、次に葉に輸送され、葉の貯蔵される（Tso 、Physio
logy and Biochemistry of Tobacco Plants 、２３３〜
２３４頁、Dowden Hutchinson & Ross、米国、ペンシル
ヴェニア州、ストラウズバーグ、１９７２年）。ニコチ
ン分子は、二つの複素環、ピリジン部分およびピロリジ
ン部分で構成され、その各々は別個の生化学経路から誘
導される。ニコチンのピリジン部分はニコチン酸から誘
導される。ニコチンのピロリジン部分は、プトレッシン
からＮ−メチルプトレッシンに至り、次いでＮ−メチル
ピロリンに至る経路によって提供される。ニコチン生合
成時の必須の工程は、プトレッシンからＮ−メチルプト
レッシンを生成する工程である（Goodwin とMercer、In
troduction to Plant Biochemistry、４８８〜４９１
頁、Pergamon Press、米国、ニューヨーク、１９８３
年）。
【０００５】プトレッシンのＮ−メチルプトレッシンへ
の変換反応は、メチル基供与体として働くＳ−アデノシ
ルメチンを用いて行われ、酵素であるプトレッシンＮ−
メチルトランスフェラーゼ（“ＰＭＴ”）によって触媒
される。ＰＭＴは、タバコ内でのニコチン合成用のＮ−
メチルピロリンを供給する経路で律速酵素のようである
（Feth等、“Regulation in Tobacco Callus of Enzyme
Activities of the Nicotine Pathway ”、planta、１
６８巻、４０２〜４０７頁、１９８６年；Wagner等、
“The Regulation of Enzyme Activities of the Nicot
ine Pathway in Tobacco”、Physiol，Plant 、６８
巻、６６７〜６７２頁、１９８６年）。
の変換反応は、メチル基供与体として働くＳ−アデノシ
ルメチンを用いて行われ、酵素であるプトレッシンＮ−
メチルトランスフェラーゼ（“ＰＭＴ”）によって触媒
される。ＰＭＴは、タバコ内でのニコチン合成用のＮ−
メチルピロリンを供給する経路で律速酵素のようである
（Feth等、“Regulation in Tobacco Callus of Enzyme
Activities of the Nicotine Pathway ”、planta、１
６８巻、４０２〜４０７頁、１９８６年；Wagner等、
“The Regulation of Enzyme Activities of the Nicot
ine Pathway in Tobacco”、Physiol，Plant 、６８
巻、６６７〜６７２頁、１９８６年）。
【０００６】比較的に粗製のＰＭＴ製剤（３０倍の精製
度）について限定的な特性決定がなされている（Mizusa
ki等、“Phytochemical Studies on Tobacco Alkaloids
XIV. The Occurrence and Properties of Putrescine
N-Methyltransferase in Tobacco Plants ”，Plant ce
ll Physiol. 、１２巻、６３３〜６４０頁、１９７１
年）。その製剤に至る精製工程は、最初の抽出液からの
硫酸アンモニウム沈澱法とゲル濾過クロマトグラフィに
限定した。
度）について限定的な特性決定がなされている（Mizusa
ki等、“Phytochemical Studies on Tobacco Alkaloids
XIV. The Occurrence and Properties of Putrescine
N-Methyltransferase in Tobacco Plants ”，Plant ce
ll Physiol. 、１２巻、６３３〜６４０頁、１９７１
年）。その製剤に至る精製工程は、最初の抽出液からの
硫酸アンモニウム沈澱法とゲル濾過クロマトグラフィに
限定した。
【０００７】植物によって通常得られるよりも有意に低
いレベルの酵素（またはその他のタンパク質）を特徴と
する植物を、アンチセンスＲＮＡ法によって作ることが
できる。通常、標的酵素をコードする遺伝子の転写をす
ると一本鎖ｍＲＮＡが生成し、そのＲＮＡは次にリボソ
ームによって翻訳されて標的酵素が得られる。アンチセ
ンスＲＮＡ分子は、そのヌクレオチド配列が標的ｍＲＮ
Ａ分子のある部分に対して相補的なＲＮＡ分子である。
したがってアンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ分
子と相補的塩基対合を行い（雑種形成）、その標的ｍＲ
ＮＡ分子を翻訳に利用できないようにして一層分解し易
くし、または両方を行う。したがって、標的ｍＲＮＡが
コードする特異的酵素を産生する細胞の性能が阻害され
る。
いレベルの酵素（またはその他のタンパク質）を特徴と
する植物を、アンチセンスＲＮＡ法によって作ることが
できる。通常、標的酵素をコードする遺伝子の転写をす
ると一本鎖ｍＲＮＡが生成し、そのＲＮＡは次にリボソ
ームによって翻訳されて標的酵素が得られる。アンチセ
ンスＲＮＡ分子は、そのヌクレオチド配列が標的ｍＲＮ
Ａ分子のある部分に対して相補的なＲＮＡ分子である。
したがってアンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ分
子と相補的塩基対合を行い（雑種形成）、その標的ｍＲ
ＮＡ分子を翻訳に利用できないようにして一層分解し易
くし、または両方を行う。したがって、標的ｍＲＮＡが
コードする特異的酵素を産生する細胞の性能が阻害され
る。
【０００８】アンチセンス法は、いくつもの研究で採用
され、特異的な酵素が通常の量より低いことを特徴とす
るトランスジェニック植物が創製されている。例えば、
低レベルのカルコンシンターゼ（花の色素の生合成経路
の酵素）を含有する植物が、カルコンシンターゼのアン
チセンス遺伝子をタバコとペチュニアのゲノムに挿入す
ることによって生産されている。これらのトランスジェ
ニックタバコ植物とトランスジェニックペチュニア植物
は、通常の着色よりうすい色の花を産生する（Van der
Krol等、“An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in
Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation”、
Nature、３３３巻、８６６〜８６９頁、１９８８年）。
またアンチセンスＲＮＡ法は、トマト類に、ポリガラク
ツロナーゼ酵素が産生するのを阻害するために採用され
て成功しており（Smith 等、“Antisense RNA Inhibiti
on of Polygalacturonase Gene Expression in Transge
nic Tomatoes”、Nature、３３４巻、７２４〜７２６
頁、１９８８年；Sheehy等、“Reduction of Polygalac
turonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RN
A”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８５巻、８８０５
〜８８０９頁、１９８８年）、およびタバコに、リブロ
ースビスリン酸カルボキシラーゼ酵素の小さなサブユニ
ットを産生するのを阻害するのに成功している（Roderm
el等、“Nuclear-organelle Interactions：Nuclear An
tisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carbox
ylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants
”、Cell、５５巻、６７３〜６８１頁、１９８８
年）。あるいは、所定の酵素の通常量より多いことを特
徴とするトランスジェニック植物を、センス（すなわち
通常の）配向のその酵素の遺伝子で植物を形質転換する
ことによって創製することができる。
され、特異的な酵素が通常の量より低いことを特徴とす
るトランスジェニック植物が創製されている。例えば、
低レベルのカルコンシンターゼ（花の色素の生合成経路
の酵素）を含有する植物が、カルコンシンターゼのアン
チセンス遺伝子をタバコとペチュニアのゲノムに挿入す
ることによって生産されている。これらのトランスジェ
ニックタバコ植物とトランスジェニックペチュニア植物
は、通常の着色よりうすい色の花を産生する（Van der
Krol等、“An Anti-Sense Chalcone Synthase Gene in
Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation”、
Nature、３３３巻、８６６〜８６９頁、１９８８年）。
またアンチセンスＲＮＡ法は、トマト類に、ポリガラク
ツロナーゼ酵素が産生するのを阻害するために採用され
て成功しており（Smith 等、“Antisense RNA Inhibiti
on of Polygalacturonase Gene Expression in Transge
nic Tomatoes”、Nature、３３４巻、７２４〜７２６
頁、１９８８年；Sheehy等、“Reduction of Polygalac
turonase Activity in Tomato Fruit by Antisense RN
A”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８５巻、８８０５
〜８８０９頁、１９８８年）、およびタバコに、リブロ
ースビスリン酸カルボキシラーゼ酵素の小さなサブユニ
ットを産生するのを阻害するのに成功している（Roderm
el等、“Nuclear-organelle Interactions：Nuclear An
tisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carbox
ylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants
”、Cell、５５巻、６７３〜６８１頁、１９８８
年）。あるいは、所定の酵素の通常量より多いことを特
徴とするトランスジェニック植物を、センス（すなわち
通常の）配向のその酵素の遺伝子で植物を形質転換する
ことによって創製することができる。
【０００９】ＰＭＴのレベルを変化させることによっ
て、タバコ植物のニコチンレベルを上下させるタバコ植
物の遺伝子工学はまだ可能になっていない。その理由
は、ＰＭＴ酵素を予め精製することなしにＰＭＴ遺伝子
をクローン化をする方法が知られておらず、またＰＭＴ
酵素の精製法はこの発明以前に知られていなかったから
である。
て、タバコ植物のニコチンレベルを上下させるタバコ植
物の遺伝子工学はまだ可能になっていない。その理由
は、ＰＭＴ酵素を予め精製することなしにＰＭＴ遺伝子
をクローン化をする方法が知られておらず、またＰＭＴ
酵素の精製法はこの発明以前に知られていなかったから
である。
【００１０】この発明は、第１に、高度に精製されたプ
トレッシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（“ＰＭ
Ｔ”）と、この酵素の新規な精製法を提供するものであ
る。
トレッシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（“ＰＭ
Ｔ”）と、この酵素の新規な精製法を提供するものであ
る。
【００１１】この発明の精製法は、タバコ植物抽出液を
アニオン交換媒体に添加する工程を有し、添加温度およ
び抽出液のｐＨと組成は、ＰＭＴがアニオン交換媒体に
よって保持されるような条件である。次にＰＭＴを、有
効量のポリアミンを含有する溶離緩衝液で、アニオン交
換媒体から溶離する。また溶離温度および溶離緩衝液の
ｐＨと化学組成は、ポリアミンがなければ、ＰＭＴがア
ニオン交換媒体によって保持されるような条件である。
アニオン交換媒体に添加する工程を有し、添加温度およ
び抽出液のｐＨと組成は、ＰＭＴがアニオン交換媒体に
よって保持されるような条件である。次にＰＭＴを、有
効量のポリアミンを含有する溶離緩衝液で、アニオン交
換媒体から溶離する。また溶離温度および溶離緩衝液の
ｐＨと化学組成は、ポリアミンがなければ、ＰＭＴがア
ニオン交換媒体によって保持されるような条件である。
【００１２】好ましい態様において、アニオン交換媒体
の溶出液を、アニオン交換媒体の溶離緩衝液の存在下、
ＰＭＴに対して親和性を有するクロマトグラフィ媒体に
直接添加し、次に、結合された物質を溶離する。最も好
ましくは、アニオン交換カラムからの出口がω−アミノ
ヘキシルアガロースカラムの入口に接続され、後者のカ
ラムにアニオン交換カラムからの希薄ＰＭＴが集めら
れ、次いでより濃縮された形態でＰＭＴが溶出される。
の溶出液を、アニオン交換媒体の溶離緩衝液の存在下、
ＰＭＴに対して親和性を有するクロマトグラフィ媒体に
直接添加し、次に、結合された物質を溶離する。最も好
ましくは、アニオン交換カラムからの出口がω−アミノ
ヘキシルアガロースカラムの入口に接続され、後者のカ
ラムにアニオン交換カラムからの希薄ＰＭＴが集めら
れ、次いでより濃縮された形態でＰＭＴが溶出される。
【００１３】この発明のＰＭＴは、分子量が約５５〜６
５キロダルトン、未変性の等電点が約５．０〜６．０の
ｐＨ、プトレッシンについてのＫｍ値が約３００μＭ〜
５００μＭ、およびＳ−アデノシルメチオニンについて
のＫｍ値が約１００μＭ〜１５０μＭである。好ましい
態様では、ＰＭＴは、配列表に配列番号１、配列番号２
および配列番号３として規定されているアミノ酸配列か
ら選択される１７のアミノ酸の配列をもっている。
５キロダルトン、未変性の等電点が約５．０〜６．０の
ｐＨ、プトレッシンについてのＫｍ値が約３００μＭ〜
５００μＭ、およびＳ−アデノシルメチオニンについて
のＫｍ値が約１００μＭ〜１５０μＭである。好ましい
態様では、ＰＭＴは、配列表に配列番号１、配列番号２
および配列番号３として規定されているアミノ酸配列か
ら選択される１７のアミノ酸の配列をもっている。
【００１４】またこの発明は、プトレッシンＮ−メチル
トランスフェラーゼをコードするセンス組換えＤＮＡ分
子とアンチセンス組換えＤＮＡ分子、これらの組換えＤ
ＮＡ分子を含有するベクター、およびこれらのＤＮＡ分
子またはベクターで形質転換されたトランスジェニック
タバコ細胞とトランスジェニックタバコ植物を提供する
ものである。この発明のトランスジェニックタバコ細胞
とトランスジェニックタバコ植物は、未形質転換の対照
のタバコ細胞とタバコ植物よりニコチン含量が低いかま
たは高いことを特徴としている。
トランスフェラーゼをコードするセンス組換えＤＮＡ分
子とアンチセンス組換えＤＮＡ分子、これらの組換えＤ
ＮＡ分子を含有するベクター、およびこれらのＤＮＡ分
子またはベクターで形質転換されたトランスジェニック
タバコ細胞とトランスジェニックタバコ植物を提供する
ものである。この発明のトランスジェニックタバコ細胞
とトランスジェニックタバコ植物は、未形質転換の対照
のタバコ細胞とタバコ植物よりニコチン含量が低いかま
たは高いことを特徴としている。
【００１５】ＰＭＴの精製 ＰＭＴ精製に用いる出発物質はタバコの根で構成されて
いる。その根は水耕栽培されたタバコ植物から収穫する
ことが好ましい。水耕栽培法は、高度に制御された再現
性のある条件下で植物を成長させることが容易であり、
清浄で無傷の状態で、広がった糸状根系を効率よく収穫
することができる。
いる。その根は水耕栽培されたタバコ植物から収穫する
ことが好ましい。水耕栽培法は、高度に制御された再現
性のある条件下で植物を成長させることが容易であり、
清浄で無傷の状態で、広がった糸状根系を効率よく収穫
することができる。
【００１６】タバコの種子は、湿潤した植物鉢植え混合
物の表面もしくはその近傍で発芽させることができる。
最も好ましい条件は約８０°Ｆの温度と６０％の相対湿
度である。種子が発芽してから約２週間後、実生苗を間
引きし（除去し）、残留実生苗が高さが約６インチで約
６枚の葉が生成する時期まで、妨害されずに成長するの
に充分な余白を残す。実生苗が、約６インチの高さに到
達したとき、一般に、根系と鉢植え物質のペレットはそ
のままで、適切な養分溶液が入れられ、この養分溶液の
通気（酸化）手段を備えた水耕装置に移植される。また
この水耕栽培装置は、溶解された養分を補充するように
設備されていなければならず、かつ充分に成長したタバ
コ植物を収納するのに充分な大きさでなければならな
い。
物の表面もしくはその近傍で発芽させることができる。
最も好ましい条件は約８０°Ｆの温度と６０％の相対湿
度である。種子が発芽してから約２週間後、実生苗を間
引きし（除去し）、残留実生苗が高さが約６インチで約
６枚の葉が生成する時期まで、妨害されずに成長するの
に充分な余白を残す。実生苗が、約６インチの高さに到
達したとき、一般に、根系と鉢植え物質のペレットはそ
のままで、適切な養分溶液が入れられ、この養分溶液の
通気（酸化）手段を備えた水耕装置に移植される。また
この水耕栽培装置は、溶解された養分を補充するように
設備されていなければならず、かつ充分に成長したタバ
コ植物を収納するのに充分な大きさでなければならな
い。
【００１７】頭状花の除去（摘花）は商業的タバコ栽培
における標準の慣行であるが、根の成長を増大して葉の
ニコチン含量を増大することは、当該技術分野では公知
である。それ故に、ＰＭＴの精製用の出発物質として使
用される植物は、通常、成長の適当な段階で摘花され
る。植付けと摘花の適切な間隔は、とりわけ、植物の品
種、光の強度、日長、土壌と空気の温度、土壌水分およ
び無機栄養を含むいくつもの因子によってきまる。しか
し、一般に根は摘花してから３〜７日後に収穫される。
所定の組合せの生育条件下で栽培される所定のタバコ品
種の摘花の最適時期は、当該技術分野の熟練者ならば容
易に決定することができる。
における標準の慣行であるが、根の成長を増大して葉の
ニコチン含量を増大することは、当該技術分野では公知
である。それ故に、ＰＭＴの精製用の出発物質として使
用される植物は、通常、成長の適当な段階で摘花され
る。植付けと摘花の適切な間隔は、とりわけ、植物の品
種、光の強度、日長、土壌と空気の温度、土壌水分およ
び無機栄養を含むいくつもの因子によってきまる。しか
し、一般に根は摘花してから３〜７日後に収穫される。
所定の組合せの生育条件下で栽培される所定のタバコ品
種の摘花の最適時期は、当該技術分野の熟練者ならば容
易に決定することができる。
【００１８】収穫された根は冷水で洗浄することが好ま
しく、次に残留水をブフナー漏斗で吸引して除去する。
次に洗浄した根は、収穫して直ちに、使用されるかまた
は−８０℃に凍結される。凍結された根は、使用するま
で約−８０℃で貯蔵される。
しく、次に残留水をブフナー漏斗で吸引して除去する。
次に洗浄した根は、収穫して直ちに、使用されるかまた
は−８０℃に凍結される。凍結された根は、使用するま
で約−８０℃で貯蔵される。
【００１９】一般的なＰＭＴ精製法では、抽出緩衝液１
ｌ当り約４００〜６００ｇの凍結根組織を高速混合器で
ホモジナイズする。抽出緩衝液は、一般に、一つ以上の
緩衝剤、一つ以上の還元剤、一つ以上の重金属キレート
化剤、一つ以上の水活性変性剤、および一つ以上のプロ
テアーゼ阻害剤それぞれの有効量を含有している。また
抽出緩衝液は、一つ以上のフェノール系化合物吸着剤の
有効量を含有している方が好ましい。これらの薬剤の有
効量は、使用される特定の薬剤によって決まる。しかし
使用量は、一般に、植物タンパク質の精製中に使用され
る一般的な量から選択される。したがって、薬剤とその
有効量の選択は、通常の研究者の技能の範囲内にある。
ｌ当り約４００〜６００ｇの凍結根組織を高速混合器で
ホモジナイズする。抽出緩衝液は、一般に、一つ以上の
緩衝剤、一つ以上の還元剤、一つ以上の重金属キレート
化剤、一つ以上の水活性変性剤、および一つ以上のプロ
テアーゼ阻害剤それぞれの有効量を含有している。また
抽出緩衝液は、一つ以上のフェノール系化合物吸着剤の
有効量を含有している方が好ましい。これらの薬剤の有
効量は、使用される特定の薬剤によって決まる。しかし
使用量は、一般に、植物タンパク質の精製中に使用され
る一般的な量から選択される。したがって、薬剤とその
有効量の選択は、通常の研究者の技能の範囲内にある。
【００２０】抽出緩衝液のｐＨは、約７．２〜８．３の
範囲になければならないが、好ましくは約７．５であ
る。所望のｐＨで有効なｐＨ緩衝能を与える解離定数
（ｐＫａ）を有する水溶性化合物が使用される。また好
ましい緩衝剤は紫外線を事実上透過する。適切な緩衝剤
には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（“Tr
is”）、イミダゾール、リン酸塩、Ｎ−モルホリノプロ
パンスルホン酸（“ＭＯＰＳ”）、Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
（“ＴＥＳ”）、トリエタノールアミン、およびＮ−ト
リス（ヒドロキシメチル）−メチル−グリシン（“Tric
ine ”）が含まれる。トリス緩衝剤が好ましい。
範囲になければならないが、好ましくは約７．５であ
る。所望のｐＨで有効なｐＨ緩衝能を与える解離定数
（ｐＫａ）を有する水溶性化合物が使用される。また好
ましい緩衝剤は紫外線を事実上透過する。適切な緩衝剤
には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（“Tr
is”）、イミダゾール、リン酸塩、Ｎ−モルホリノプロ
パンスルホン酸（“ＭＯＰＳ”）、Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸
（“ＴＥＳ”）、トリエタノールアミン、およびＮ−ト
リス（ヒドロキシメチル）−メチル−グリシン（“Tric
ine ”）が含まれる。トリス緩衝剤が好ましい。
【００２１】タンパク質のスルフヒドリル基の起りうる
酸化反応と、植物のフェノール化合物の起りうる酸化反
応とを阻害して反応性遊離ラジカルの生成を阻害するた
めに、還元剤を抽出緩衝液中に添加する。これら両方の
反応はＰＭＴを不活性化することがある。適切な還元剤
には、ジチオトレイトール（“ＤＴＴ”）、ジチオエリ
トリトール、２−メルカプトエタノール、チオグリコー
ル酸塩、グルタチオン、システイン、およびアスコルビ
ン酸塩が含まれる。ＤＴＴとアスコルビン酸塩が好まし
い。
酸化反応と、植物のフェノール化合物の起りうる酸化反
応とを阻害して反応性遊離ラジカルの生成を阻害するた
めに、還元剤を抽出緩衝液中に添加する。これら両方の
反応はＰＭＴを不活性化することがある。適切な還元剤
には、ジチオトレイトール（“ＤＴＴ”）、ジチオエリ
トリトール、２−メルカプトエタノール、チオグリコー
ル酸塩、グルタチオン、システイン、およびアスコルビ
ン酸塩が含まれる。ＤＴＴとアスコルビン酸塩が好まし
い。
【００２２】重金属キレート化剤は、プロテアーゼ類の
活性化、および重金属との直接相互作用によるかまたは
フェノール化合物を酸化してＰＭＴを不活性化する種に
する反応の重金属による促進によって起りうるＰＭＴの
不活性化を防止するために、抽出緩衝液に添加される。
好ましい重金属キレート化剤としては、エチレンジアミ
ン四酢酸（“ＥＤＴＡ”）があるが、他の通常のキレー
ト化剤例えばエチレングリコールビス（β−アミノエチ
ルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′四酢酸（“ＥＧＴ
Ａ”）およびクエン酸塩も使うことができる。
活性化、および重金属との直接相互作用によるかまたは
フェノール化合物を酸化してＰＭＴを不活性化する種に
する反応の重金属による促進によって起りうるＰＭＴの
不活性化を防止するために、抽出緩衝液に添加される。
好ましい重金属キレート化剤としては、エチレンジアミ
ン四酢酸（“ＥＤＴＡ”）があるが、他の通常のキレー
ト化剤例えばエチレングリコールビス（β−アミノエチ
ルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′四酢酸（“ＥＧＴ
Ａ”）およびクエン酸塩も使うことができる。
【００２３】水活性変性剤は、ＰＭＴを不活性化させ
る、起りうる変性とその外の一層微少な配座の変化に対
してＰＭＴを安定化するために、抽出緩衝液に添加され
る。このような水活性変性剤は、非イオン性の親水性化
合物であり、これらが添加される水溶液の水活性を低下
させる。グリセリン、エチレングリコールおよび低分子
量のポリエチレングリコール（例えば“ＰＥＧ４０
０”）が好ましいが、グルコース、スクロース、フルク
トースおよびソルビトールが、水活性変性剤として有用
な他の化合物の例である。
る、起りうる変性とその外の一層微少な配座の変化に対
してＰＭＴを安定化するために、抽出緩衝液に添加され
る。このような水活性変性剤は、非イオン性の親水性化
合物であり、これらが添加される水溶液の水活性を低下
させる。グリセリン、エチレングリコールおよび低分子
量のポリエチレングリコール（例えば“ＰＥＧ４０
０”）が好ましいが、グルコース、スクロース、フルク
トースおよびソルビトールが、水活性変性剤として有用
な他の化合物の例である。
【００２４】プロテアーゼ阻害剤は、組織を均質化中に
放出されるタンパク質分解酵素によるタンパク質切断に
よるＰＭＴの起りうる不活性化を防止するために、一般
に抽出緩衝液に添加される。有用なプロテアーゼ阻害剤
には、フェニルメチルスルホニルフルオリド（“ＰＭＳ
Ｆ”）、ロイペプチン、アプロチニン、キモスタチンお
よびペプスタチンが含まれている。ＰＭＳＦとロイペプ
チンが好ましい。
放出されるタンパク質分解酵素によるタンパク質切断に
よるＰＭＴの起りうる不活性化を防止するために、一般
に抽出緩衝液に添加される。有用なプロテアーゼ阻害剤
には、フェニルメチルスルホニルフルオリド（“ＰＭＳ
Ｆ”）、ロイペプチン、アプロチニン、キモスタチンお
よびペプスタチンが含まれている。ＰＭＳＦとロイペプ
チンが好ましい。
【００２５】フェノール系化合物の吸着剤は、存在して
いると、植物細胞が破壊されると酸化されて、ＰＭＴを
不活性化もしくは沈澱させるフェノール系植物化合物を
除くために、抽出緩衝液に添加することが好ましい。一
般に、フェノール系化合物を吸着するために、不溶性の
ポリビニルピロリドン（“ＰＶＰＰ”）とアンバーライ
トＸＡＤ−４を抽出緩衝液中に懸濁させる。ＰＭＴ酵素
の活性に対して有意な害を与えることなしに、フェノー
ル系化合物を除去するかまたは不活性化する他の物質に
は、ＰＶＰＰもしくはアンバーライトＸＡＤ−４とこれ
らのものの代わりに使えるものが含まれる。
いると、植物細胞が破壊されると酸化されて、ＰＭＴを
不活性化もしくは沈澱させるフェノール系植物化合物を
除くために、抽出緩衝液に添加することが好ましい。一
般に、フェノール系化合物を吸着するために、不溶性の
ポリビニルピロリドン（“ＰＶＰＰ”）とアンバーライ
トＸＡＤ−４を抽出緩衝液中に懸濁させる。ＰＭＴ酵素
の活性に対して有意な害を与えることなしに、フェノー
ル系化合物を除去するかまたは不活性化する他の物質に
は、ＰＶＰＰもしくはアンバーライトＸＡＤ−４とこれ
らのものの代わりに使えるものが含まれる。
【００２６】根組織を添加する前に、抽出緩衝液は約−
１５℃〜−２０℃に冷却され、凍結スラリーを生成させ
る。均一化の工程中、ホモジネートの温度は約３〜５℃
以上に上昇させてはならない。
１５℃〜−２０℃に冷却され、凍結スラリーを生成させ
る。均一化の工程中、ホモジネートの温度は約３〜５℃
以上に上昇させてはならない。
【００２７】当該技術分野の通常の熟練者には分かって
いるように、上記の方法に用いられる根組織の量は変え
ることができるが、使用される組織のおおよその重量は
測定しなければならず、それに応じて、使用される他の
成分の量が調節される。
いるように、上記の方法に用いられる根組織の量は変え
ることができるが、使用される組織のおおよその重量は
測定しなければならず、それに応じて、使用される他の
成分の量が調節される。
【００２８】均一化処理の後、不溶性物質（吸着された
フェノール化合物を含有するＰＶＰＰを含む）は、ホモ
ジネートから除去するのが好ましい。この除去は、好ま
しくは、約１００００〜２００００×ｇに設定された冷
凍遠心機で、約４℃で約３０〜９０分間沈降させること
によって行われる。不溶性物質を沈降させた後、可溶性
抽出液（すなわち上澄み液）をデカントする。可溶性抽
出液の最終のタンパク質濃度は一般に約２．５〜３．５
ｍｇ／ｍｌである。
フェノール化合物を含有するＰＶＰＰを含む）は、ホモ
ジネートから除去するのが好ましい。この除去は、好ま
しくは、約１００００〜２００００×ｇに設定された冷
凍遠心機で、約４℃で約３０〜９０分間沈降させること
によって行われる。不溶性物質を沈降させた後、可溶性
抽出液（すなわち上澄み液）をデカントする。可溶性抽
出液の最終のタンパク質濃度は一般に約２．５〜３．５
ｍｇ／ｍｌである。
【００２９】可溶性抽出液を硫酸アンモニウムで分画
し、標準の方法（Scopes、Protein Purification Princ
iples and Practice、４８〜５２頁、Springer-Verlag
、米国、ニューヨーク、１９８２年）にしたがって、
４０％〜６５％硫酸アンモニウムの画分（沈澱）を、可
溶性抽出液から集める。次にその画分を、根の重量１ｇ
当り約０．１〜０．４ｍｌの溶解緩衝液に溶解する。
し、標準の方法（Scopes、Protein Purification Princ
iples and Practice、４８〜５２頁、Springer-Verlag
、米国、ニューヨーク、１９８２年）にしたがって、
４０％〜６５％硫酸アンモニウムの画分（沈澱）を、可
溶性抽出液から集める。次にその画分を、根の重量１ｇ
当り約０．１〜０．４ｍｌの溶解緩衝液に溶解する。
【００３０】４０％〜６５％硫酸アンモニウムの画分を
溶解するのに好ましい緩衝液は、有効量の、緩衝剤、重
金属キレート化剤、還元剤、水活性変性剤およびプロテ
アーゼ阻害剤を含有している。最も好ましい溶解緩衝剤
は、トリス緩衝剤（ｐＨが約７．５）（約１０〜２０ｍ
Ｍ）、ＥＤＴＡ（約１〜１０ｍＭ）、グリセリン（約１
０〜３０％）、ＤＴＴ（約１〜１０ｍＭ）、ＰＭＳＦ
（約０．２〜１０．０ｍｇ／ｌ）、およびロイペプチン
（約０．２〜１０．０ｍｇ／ｌ）を含有している。これ
らの緩衝成分は、抽出緩衝液中の類似の成分に対する上
記の目的のために含有させてある。当該技術分野の熟練
者は、これらの成分は類似の機能を有する他のもので取
換えることができることを知っているであろう。
溶解するのに好ましい緩衝液は、有効量の、緩衝剤、重
金属キレート化剤、還元剤、水活性変性剤およびプロテ
アーゼ阻害剤を含有している。最も好ましい溶解緩衝剤
は、トリス緩衝剤（ｐＨが約７．５）（約１０〜２０ｍ
Ｍ）、ＥＤＴＡ（約１〜１０ｍＭ）、グリセリン（約１
０〜３０％）、ＤＴＴ（約１〜１０ｍＭ）、ＰＭＳＦ
（約０．２〜１０．０ｍｇ／ｌ）、およびロイペプチン
（約０．２〜１０．０ｍｇ／ｌ）を含有している。これ
らの緩衝成分は、抽出緩衝液中の類似の成分に対する上
記の目的のために含有させてある。当該技術分野の熟練
者は、これらの成分は類似の機能を有する他のもので取
換えることができることを知っているであろう。
【００３１】前記の硫酸アンモニウム画分を、次いで標
準の方法、例えば透析もしくはふるいクロマトグラフィ
で脱塩し、次いで脱塩された画分を、下記のようにして
アニオン交換クロマトグラフィに直接かける。しかし好
ましい態様では、硫酸アンモニウム画分は最初に、疎水
性相互作用クロマトグラフィにかける。
準の方法、例えば透析もしくはふるいクロマトグラフィ
で脱塩し、次いで脱塩された画分を、下記のようにして
アニオン交換クロマトグラフィに直接かける。しかし好
ましい態様では、硫酸アンモニウム画分は最初に、疎水
性相互作用クロマトグラフィにかける。
【００３２】溶解された硫酸アンモニウム画分を疎水性
相互作用クロマトグラフィにかける前に、塩を添加し
て、ＰＭＴが疎水性相互作用媒体と結合するのを保証す
るのに充分高い塩濃度を与える。添加する塩の好ましい
濃度は１．５Ｎである。添加される好ましい塩はNaClで
ある。他の有用な塩は硫酸アンモニウムである。
相互作用クロマトグラフィにかける前に、塩を添加し
て、ＰＭＴが疎水性相互作用媒体と結合するのを保証す
るのに充分高い塩濃度を与える。添加する塩の好ましい
濃度は１．５Ｎである。添加される好ましい塩はNaClで
ある。他の有用な塩は硫酸アンモニウムである。
【００３３】好ましい疎水性相互作用媒体は、大きさが
クロマトグラフィに適し、共有結合したフェニル基を有
する、ほぼ球形粒子の架橋アガロースゲルで構成されて
いる。このようなフェニルアガロースは、“フェニル−
セファロースＣＬ−４Ｂ”として市販されている（Phar
macia-LKB ，Inc.、米国、ニュージャージー州、ピスカ
タウエイ、カタログ番号：１７−０８１０−０１）。
クロマトグラフィに適し、共有結合したフェニル基を有
する、ほぼ球形粒子の架橋アガロースゲルで構成されて
いる。このようなフェニルアガロースは、“フェニル−
セファロースＣＬ−４Ｂ”として市販されている（Phar
macia-LKB ，Inc.、米国、ニュージャージー州、ピスカ
タウエイ、カタログ番号：１７−０８１０−０１）。
【００３４】水和フェニルアガロースを、標準の方法を
用いて適切なクロマトグラフィのカラムに充填し、ｐＨ
が約７．２〜８．３好ましくは約７．５の高塩平衡化緩
衝液で、約４〜８℃にて平衡化する。好ましい高塩平衡
化緩衝液は、有効量の、緩衝剤、重金属キレート化剤、
水活性変性剤および還元剤、ならびに約１．５〜２．０
Ｍの濃度の塩を含有している。最も好ましい高塩平衡化
緩衝溶液は、約１０ｍＭのトリス（ｐＨは約７．５）、
約１．５ＭのNaCl、約１ｍＭのＥＤＴＡ、約２ｍＭのＤ
ＴＴおよび約２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリンを含有して
いる。
用いて適切なクロマトグラフィのカラムに充填し、ｐＨ
が約７．２〜８．３好ましくは約７．５の高塩平衡化緩
衝液で、約４〜８℃にて平衡化する。好ましい高塩平衡
化緩衝液は、有効量の、緩衝剤、重金属キレート化剤、
水活性変性剤および還元剤、ならびに約１．５〜２．０
Ｍの濃度の塩を含有している。最も好ましい高塩平衡化
緩衝溶液は、約１０ｍＭのトリス（ｐＨは約７．５）、
約１．５ＭのNaCl、約１ｍＭのＥＤＴＡ、約２ｍＭのＤ
ＴＴおよび約２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリンを含有して
いる。
【００３５】塩で調節された可溶性抽出液の試料（フェ
ニルアガロースの充填カラム容積１ｍｌ当り約０．５〜
２．０ｍｌの抽出液）を、平衡化されたフェニルアガロ
ースカラムに注入し、溶出液にタンパク質性物質が特に
含有されなくなるまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄す
る。緩衝剤が紫外光を透過するならば、上記の状態は約
２８０ｎｍの波長の紫外光の吸光度を測定することによ
って決定される。一般に、フェニルアガロースカラム
を、約５〜７倍カラム容積の平衡化緩衝液で洗浄する。
ＰＭＴは、疎水性相互作用媒体に結合して残留する。
ニルアガロースの充填カラム容積１ｍｌ当り約０．５〜
２．０ｍｌの抽出液）を、平衡化されたフェニルアガロ
ースカラムに注入し、溶出液にタンパク質性物質が特に
含有されなくなるまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄す
る。緩衝剤が紫外光を透過するならば、上記の状態は約
２８０ｎｍの波長の紫外光の吸光度を測定することによ
って決定される。一般に、フェニルアガロースカラム
を、約５〜７倍カラム容積の平衡化緩衝液で洗浄する。
ＰＭＴは、疎水性相互作用媒体に結合して残留する。
【００３６】フェニルアガロースマトリックスに依然と
して吸着されているタンパク質（ＰＭＴを含む）は、次
に４〜８℃にて、負荷塩濃度が（好ましくは約１．５
Ｍ）から約０．０Ｍまで減少する線状塩勾配液を含有す
る、カラムの約４〜６倍容積の溶離緩衝液を用いて溶離
し、次にカラムの２〜３倍容積の追加の塩なし溶離緩衝
液で溶離する。好ましくは、溶離緩衝液は、トリス（約
１０ｍＭ）（ｐＨは約７．５）、ＤＴＴ（約２ｍＭ）お
よびＥＤＴＡ（約１ｍＭ）とグリセリン（約２０％Ｖ／
Ｖ）を含有している。
して吸着されているタンパク質（ＰＭＴを含む）は、次
に４〜８℃にて、負荷塩濃度が（好ましくは約１．５
Ｍ）から約０．０Ｍまで減少する線状塩勾配液を含有す
る、カラムの約４〜６倍容積の溶離緩衝液を用いて溶離
し、次にカラムの２〜３倍容積の追加の塩なし溶離緩衝
液で溶離する。好ましくは、溶離緩衝液は、トリス（約
１０ｍＭ）（ｐＨは約７．５）、ＤＴＴ（約２ｍＭ）お
よびＥＤＴＡ（約１ｍＭ）とグリセリン（約２０％Ｖ／
Ｖ）を含有している。
【００３７】約０．０１〜０．０３倍カラム容積の画分
を集め、以下のようにしてＰＭＴ活性を、２８０ｎｍの
波長光の吸光度について検定した。一般に集めた溶出液
画分は、約１〜２倍のカラム容積と、約０．４〜２．５
ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度をもっている。
を集め、以下のようにしてＰＭＴ活性を、２８０ｎｍの
波長光の吸光度について検定した。一般に集めた溶出液
画分は、約１〜２倍のカラム容積と、約０．４〜２．５
ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度をもっている。
【００３８】好ましいNaCl以外の塩も、前記の緩衝液に
用いることができることは理解されるであろう。かよう
な塩には、塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムが含ま
れる。
用いることができることは理解されるであろう。かよう
な塩には、塩化カリウムおよび硫酸アンモニウムが含ま
れる。
【００３９】この発明の精製方法の重要な工程は、下記
のようにして実施される新規なアニオン交換クロマトグ
ラフィの工程である。この工程を実施するには、カラム
に添加されるタバコ植物抽出液（例えば、好ましくはフ
ェニルアガロース溶出液）は、抽出液中のＰＭＴがアニ
オン交換媒体に結合するようなｐＨと化学組成でなけれ
ばならない。すなわち、抽出液は、ｐＨが約７．２〜
８．３で、約０．０〜１０ｍＭ塩を含有していなければ
ならず、好ましくはさらに以下のものすなわち、約５〜
１０ｍＭの緩衝剤、約１〜１０ｍＭの還元剤、約１０〜
３０％（Ｖ／Ｖ）の水活性変性剤、および約１〜５ｍＭ
の重金属キレート化剤を含有すべきである。最も好まし
くは、タバコ植物抽出液は、１０ｍＭのトリス／HCl
（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡお
よび２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリンを含有している。
のようにして実施される新規なアニオン交換クロマトグ
ラフィの工程である。この工程を実施するには、カラム
に添加されるタバコ植物抽出液（例えば、好ましくはフ
ェニルアガロース溶出液）は、抽出液中のＰＭＴがアニ
オン交換媒体に結合するようなｐＨと化学組成でなけれ
ばならない。すなわち、抽出液は、ｐＨが約７．２〜
８．３で、約０．０〜１０ｍＭ塩を含有していなければ
ならず、好ましくはさらに以下のものすなわち、約５〜
１０ｍＭの緩衝剤、約１〜１０ｍＭの還元剤、約１０〜
３０％（Ｖ／Ｖ）の水活性変性剤、および約１〜５ｍＭ
の重金属キレート化剤を含有すべきである。最も好まし
くは、タバコ植物抽出液は、１０ｍＭのトリス／HCl
（ｐＨ７．５）、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡお
よび２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリンを含有している。
【００４０】当該技術分野の熟練者には、勿論、タバコ
植物抽出液のｐＨと塩濃度を、上記の数値から一斉に変
化させて、ＰＭＴが依然としてアニオン交換媒体と結合
する負荷状態にすることができることは明らかであろ
う。特に、塩濃度を増加すると一般に、タンパク質のア
ニオン交換媒体に対する結合性が減少し、またｐＨを上
昇させると、一般にタンパク質のアニオン交換媒体に対
する結合性が増大する。それ故に当該技術分野の熟練者
は、ＰＭＴがアニオン交換媒体と結合する、上記以外の
塩濃度とｐＨの各種の組合せを容易に決定することがで
きるであろう。可能なｐＨ／塩濃度の組合せの唯一の制
約は、ｐＨが、ＰＭＴを変性し不活性化するほどに高く
ないということである。一般に、ＰＭＴは、約９以上の
ｐＨに有意な時間暴露すべきではない。
植物抽出液のｐＨと塩濃度を、上記の数値から一斉に変
化させて、ＰＭＴが依然としてアニオン交換媒体と結合
する負荷状態にすることができることは明らかであろ
う。特に、塩濃度を増加すると一般に、タンパク質のア
ニオン交換媒体に対する結合性が減少し、またｐＨを上
昇させると、一般にタンパク質のアニオン交換媒体に対
する結合性が増大する。それ故に当該技術分野の熟練者
は、ＰＭＴがアニオン交換媒体と結合する、上記以外の
塩濃度とｐＨの各種の組合せを容易に決定することがで
きるであろう。可能なｐＨ／塩濃度の組合せの唯一の制
約は、ｐＨが、ＰＭＴを変性し不活性化するほどに高く
ないということである。一般に、ＰＭＴは、約９以上の
ｐＨに有意な時間暴露すべきではない。
【００４１】上記のことから、アニオン交換媒体に添加
されるタバコの根の抽出液が硫酸アンモニウムによる画
分か、または上記の疎水性相互作用クロマトグラフィの
工程からの溶出液の場合、その抽出液は、適当な緩衝液
に脱塩しなければならないことは明らかである。この脱
塩は標準の方法で達成される。例えば、ゲル濾過クロマ
トグラフィ（例えばセファデックスＧ−２５を用いる）
または透析が、公知の方法を用いて利用できる。このよ
うな脱塩は透析で行うのが好ましい。
されるタバコの根の抽出液が硫酸アンモニウムによる画
分か、または上記の疎水性相互作用クロマトグラフィの
工程からの溶出液の場合、その抽出液は、適当な緩衝液
に脱塩しなければならないことは明らかである。この脱
塩は標準の方法で達成される。例えば、ゲル濾過クロマ
トグラフィ（例えばセファデックスＧ−２５を用いる）
または透析が、公知の方法を用いて利用できる。このよ
うな脱塩は透析で行うのが好ましい。
【００４２】好ましい方法では、前記の疎水性相互作用
クロマトグラフィ工程から集めた溶出液（または他の高
温タバコ根抽出液）は、集めた溶出液もしくは抽出液１
ｍｌ当り約１５〜２５ｍｌの透析緩衝液に対して、約４
〜８℃にて約８〜２０時間、透析される。透析緩衝液は
撹拌する方が好ましい。１００００ＫＤカットオフの透
析膜が好ましい。透析緩衝液の化学組成とｐＨは、透析
画分中のＰＭＴが、前記のようにアニオン交換媒体で保
持されるように選択される。
クロマトグラフィ工程から集めた溶出液（または他の高
温タバコ根抽出液）は、集めた溶出液もしくは抽出液１
ｍｌ当り約１５〜２５ｍｌの透析緩衝液に対して、約４
〜８℃にて約８〜２０時間、透析される。透析緩衝液は
撹拌する方が好ましい。１００００ＫＤカットオフの透
析膜が好ましい。透析緩衝液の化学組成とｐＨは、透析
画分中のＰＭＴが、前記のようにアニオン交換媒体で保
持されるように選択される。
【００４３】アニオン交換媒体は、一つ以上の機能性の
アニオン交換部分を有し、クロマトグラフィに適した大
きさの比較的硬質の粒子（例えば架橋されたアガロー
ス）で構成されていなければならない。かようなアニオ
ン交換部分は、ジエチルアミノエチル、ポリエチレンイ
ミン、第三級アミノ、第四級アミノ、ｐ−アミノベンジ
ルおよびジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノ
エチルからなる群から選択される。このような媒体は市
販されている。ジエチルアミノエチル（“ＤＥＡＥ”）
部分を持っているアニオン交換媒体が好ましい。ＤＥＡ
Ｅ−アガロース（“DEAE-Sepharose，Fast Flow ”、Ph
armacia-LKB ，Inc.、米国、ニュージャージー州、ピス
カタウエイ、カタログ番号：１７−０７０９−０１）が
最も好ましい。
アニオン交換部分を有し、クロマトグラフィに適した大
きさの比較的硬質の粒子（例えば架橋されたアガロー
ス）で構成されていなければならない。かようなアニオ
ン交換部分は、ジエチルアミノエチル、ポリエチレンイ
ミン、第三級アミノ、第四級アミノ、ｐ−アミノベンジ
ルおよびジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノ
エチルからなる群から選択される。このような媒体は市
販されている。ジエチルアミノエチル（“ＤＥＡＥ”）
部分を持っているアニオン交換媒体が好ましい。ＤＥＡ
Ｅ−アガロース（“DEAE-Sepharose，Fast Flow ”、Ph
armacia-LKB ，Inc.、米国、ニュージャージー州、ピス
カタウエイ、カタログ番号：１７−０７０９−０１）が
最も好ましい。
【００４４】アニオン交換媒体は、標準方法によって、
平衡化緩衝液のｐＨと塩の状態に平衡化される。
平衡化緩衝液のｐＨと塩の状態に平衡化される。
【００４５】平衡化されたアニオン交換媒体は、次い
で、底部に、媒体を保持する手段（例えば半融ガラスデ
ィスク）と出口管とを有するカラム（すなわち中空管）
に標準の方法で充填する。次にカラムの頂部にふたを
し、入口管に接続する。次いで、好ましくは平衡化緩衝
液をカラムに通過させ、通過液のｐＨと伝導率を監視し
て、媒体が適正に平衡化されていることを保証しなけれ
ばならない。
で、底部に、媒体を保持する手段（例えば半融ガラスデ
ィスク）と出口管とを有するカラム（すなわち中空管）
に標準の方法で充填する。次にカラムの頂部にふたを
し、入口管に接続する。次いで、好ましくは平衡化緩衝
液をカラムに通過させ、通過液のｐＨと伝導率を監視し
て、媒体が適正に平衡化されていることを保証しなけれ
ばならない。
【００４６】カラムは、添加されるタバコ植物抽出液中
のタンパク質が、すべて結合した場合、媒体の容量のわ
ずかに約５０％を占めるのに充分なアニオン交換媒体を
含有していなければならない。例えば添加されるタバコ
植物抽出液が上記の透析されたフェニルアガロース溶出
液の場合、カラムには、透析されたフェニルアガロース
溶出液１ｍｌ当り約０．０４〜０．１０ｍｌ（充填カラ
ム容積）のＤＥＡＥ−アガロースが入っていなければな
らない。
のタンパク質が、すべて結合した場合、媒体の容量のわ
ずかに約５０％を占めるのに充分なアニオン交換媒体を
含有していなければならない。例えば添加されるタバコ
植物抽出液が上記の透析されたフェニルアガロース溶出
液の場合、カラムには、透析されたフェニルアガロース
溶出液１ｍｌ当り約０．０４〜０．１０ｍｌ（充填カラ
ム容積）のＤＥＡＥ−アガロースが入っていなければな
らない。
【００４７】好ましくは、カラムに媒体を充填し、タバ
コ植物抽出液を添加するときと同じ温度で媒体を平衡化
する。カラムが、タバコ植物抽出液を添加するときの温
度より暖かい温度で洗浄もしくは溶離する場合、アニオ
ン交換マトリックスを含有するスラリーは、カラムに充
填する前に脱ガスを行う。
コ植物抽出液を添加するときと同じ温度で媒体を平衡化
する。カラムが、タバコ植物抽出液を添加するときの温
度より暖かい温度で洗浄もしくは溶離する場合、アニオ
ン交換マトリックスを含有するスラリーは、カラムに充
填する前に脱ガスを行う。
【００４８】アニオン交換媒体に添加されるタバコ植物
抽出液について先に述べたように、アニオン交換媒体の
平衡化緩衝液は、ＰＭＴが媒体によって保持されるよう
なｐＨと化学組成をもっていなければならない。同様
に、当該技術分野の熟練者は適切なｐＨ／化学組成の組
合せを容易に決定することができる。好ましい平衡化緩
衝液には、特に塩は全く添加されておらずｐＨは約７．
２〜８．３であり最も好ましいのは７．５である。より
好ましい平衡化緩衝液は、有効量の、緩衝剤、重金属キ
レート化剤、還元剤および水活性変性剤を含有してい
る。最も好ましい平衡化緩衝液は、１０ｍＭのトリス／
HCl （ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴ
Ｔおよび２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリンを含有してい
る。
抽出液について先に述べたように、アニオン交換媒体の
平衡化緩衝液は、ＰＭＴが媒体によって保持されるよう
なｐＨと化学組成をもっていなければならない。同様
に、当該技術分野の熟練者は適切なｐＨ／化学組成の組
合せを容易に決定することができる。好ましい平衡化緩
衝液には、特に塩は全く添加されておらずｐＨは約７．
２〜８．３であり最も好ましいのは７．５である。より
好ましい平衡化緩衝液は、有効量の、緩衝剤、重金属キ
レート化剤、還元剤および水活性変性剤を含有してい
る。最も好ましい平衡化緩衝液は、１０ｍＭのトリス／
HCl （ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＤＴ
Ｔおよび２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリンを含有してい
る。
【００４９】タバコ植物抽出液、平衡化緩衝液およびア
ニオン交換媒体はすべて、平衡化、負荷およびカラムの
洗浄の前および実施中、温度が好ましくは約２〜１０℃
であり、最も好ましくは約４〜８℃である。
ニオン交換媒体はすべて、平衡化、負荷およびカラムの
洗浄の前および実施中、温度が好ましくは約２〜１０℃
であり、最も好ましくは約４〜８℃である。
【００５０】タバコ植物抽出液は、約０．１〜０．３倍
容積／分の流量で添加される。タバコ植物抽出液を添加
して通過した流体は、事実上ＰＭＴを含有していないの
で廃棄される。次にカラムは、タンパク質性物質の溶出
が低レベルで安定化するまで平衡化緩衝液で洗浄する。
その平衡化緩衝液が２８０ｎｍで吸光する緩衝剤を含有
していない場合は、カラムを、２８０ｎｍ波長の紫外光
の吸光度が低レベルで安定化するまで溶離緩衝液で洗浄
する。一般に、アニオン交換媒体は、５〜１０倍容積
の、１０ｍＭ NaCl 含有平衡化緩衝液で洗浄し、次いで
別の３〜１０倍容積の、NaClなしの平衡化緩衝液で洗浄
する。ＰＭＴは上記洗浄工程中アニオン交換媒体に保持
されている。
容積／分の流量で添加される。タバコ植物抽出液を添加
して通過した流体は、事実上ＰＭＴを含有していないの
で廃棄される。次にカラムは、タンパク質性物質の溶出
が低レベルで安定化するまで平衡化緩衝液で洗浄する。
その平衡化緩衝液が２８０ｎｍで吸光する緩衝剤を含有
していない場合は、カラムを、２８０ｎｍ波長の紫外光
の吸光度が低レベルで安定化するまで溶離緩衝液で洗浄
する。一般に、アニオン交換媒体は、５〜１０倍容積
の、１０ｍＭ NaCl 含有平衡化緩衝液で洗浄し、次いで
別の３〜１０倍容積の、NaClなしの平衡化緩衝液で洗浄
する。ＰＭＴは上記洗浄工程中アニオン交換媒体に保持
されている。
【００５１】洗浄後、ＰＭＴは、有効量のポリアミンを
含有する溶離緩衝液で、アニオン交換媒体から溶離され
るが、溶離温度、および溶離緩衝液のｐＨと化学組成
は、ポリアミンがなければＰＭＴがアニオン交換媒体に
保持される条件である。
含有する溶離緩衝液で、アニオン交換媒体から溶離され
るが、溶離温度、および溶離緩衝液のｐＨと化学組成
は、ポリアミンがなければＰＭＴがアニオン交換媒体に
保持される条件である。
【００５２】溶離緩衝液中のポリアミンは、プトレッシ
ン、Ｎ−メチルプトレッシン、スペルミン、スペルミジ
ン、アグマチン、カダベリンおよびその混合物からなる
群から選択される。プトレッシンが好ましいポリアミン
である。ポリアミンは、溶離緩衝液中、約０．５〜５０
ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、最も好ましくは約５ｍ
Ｍの濃度で存在していなければならない。
ン、Ｎ−メチルプトレッシン、スペルミン、スペルミジ
ン、アグマチン、カダベリンおよびその混合物からなる
群から選択される。プトレッシンが好ましいポリアミン
である。ポリアミンは、溶離緩衝液中、約０．５〜５０
ｍＭ、好ましくは１〜１０ｍＭ、最も好ましくは約５ｍ
Ｍの濃度で存在していなければならない。
【００５３】溶離緩衝液はさらに、有効量の、緩衝剤、
重金属キレート化剤、還元剤および水活性変性剤を含有
していることが好ましい。これらの成分は、抽出緩衝液
について先に述べたものと同じである。有効量のこれら
成分は、当該技術分野の熟練者によって、余分の試験を
せずに測定することができる。溶離緩衝液のｐＨは、約
７．２〜８．３、好ましくは約７．５でなければならな
い。アニオン交換媒体の平衡化緩衝液にポリアミンを補
充すると、適切な溶離緩衝液になる。適切な溶離緩衝液
は、１０ｍＭのトリス／HCl （ｐＨ７．５）、１ｍＭの
ＥＤＴＡ、２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリン、２ｍＭのＤ
ＴＴ、および５ｍＭのプトレッシン（１，４−ジアミノ
ブタン）（Sigma ChemicalCo.、米国、ミズリー州、セ
ントルイス、カタログ番号：Ｐ７５０５）を含有してい
る。
重金属キレート化剤、還元剤および水活性変性剤を含有
していることが好ましい。これらの成分は、抽出緩衝液
について先に述べたものと同じである。有効量のこれら
成分は、当該技術分野の熟練者によって、余分の試験を
せずに測定することができる。溶離緩衝液のｐＨは、約
７．２〜８．３、好ましくは約７．５でなければならな
い。アニオン交換媒体の平衡化緩衝液にポリアミンを補
充すると、適切な溶離緩衝液になる。適切な溶離緩衝液
は、１０ｍＭのトリス／HCl （ｐＨ７．５）、１ｍＭの
ＥＤＴＡ、２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリン、２ｍＭのＤ
ＴＴ、および５ｍＭのプトレッシン（１，４−ジアミノ
ブタン）（Sigma ChemicalCo.、米国、ミズリー州、セ
ントルイス、カタログ番号：Ｐ７５０５）を含有してい
る。
【００５４】アニオン交換カラムからのＰＭＴの溶離
は、約１８〜２６℃（すなわち室温）で行うのが好まし
い。溶離緩衝液とアニオン交換カラムは、溶離が開始さ
れる前に、選択された溶離温度でなければならない。
は、約１８〜２６℃（すなわち室温）で行うのが好まし
い。溶離緩衝液とアニオン交換カラムは、溶離が開始さ
れる前に、選択された溶離温度でなければならない。
【００５５】ＰＭＴをカラムから溶離するには、溶離緩
衝液を、約０．０２〜０．１０倍のカラム容積／分の流
量で添加し、画分はカラムの底部から集める。また溶出
液は単一の溶出液プールに集められる。最も好ましい溶
離方法では、約１倍容積の溶離緩衝液がカラムに添加さ
れ、次に流動を停止させる。アニオン交換媒体は、溶離
緩衝液の１部と約１〜６時間、好ましくは約１時間接触
したままにしておく。次いで溶離緩衝液の添加を再開す
る。
衝液を、約０．０２〜０．１０倍のカラム容積／分の流
量で添加し、画分はカラムの底部から集める。また溶出
液は単一の溶出液プールに集められる。最も好ましい溶
離方法では、約１倍容積の溶離緩衝液がカラムに添加さ
れ、次に流動を停止させる。アニオン交換媒体は、溶離
緩衝液の１部と約１〜６時間、好ましくは約１時間接触
したままにしておく。次いで溶離緩衝液の添加を再開す
る。
【００５６】ＰＭＴはアニオン交換媒体から極めてゆっ
くりと溶出させる。一般に、アニオン交換媒体は、約４
０〜７０倍容積の溶離緩衝液で溶離され、最も好ましく
は、少なくとも５０倍容積の溶離緩衝液で溶離される。
ＰＭＴの溶離状態を監視するために、溶離された画分の
ＰＭＴ活性が下記のようにして検定される。
くりと溶出させる。一般に、アニオン交換媒体は、約４
０〜７０倍容積の溶離緩衝液で溶離され、最も好ましく
は、少なくとも５０倍容積の溶離緩衝液で溶離される。
ＰＭＴの溶離状態を監視するために、溶離された画分の
ＰＭＴ活性が下記のようにして検定される。
【００５７】ＰＭＴは比較的希薄な状態で比較的大容積
で回収されるので、アニオン交換溶出液を濃縮すること
が望ましい。その溶出液は、例えばアニオン交換媒体の
溶離緩衝液の存在下、ＰＭＴに対して親和性を有するク
ロマトグラフィ媒体に添加され、そのクロマトグラフィ
媒体から、結合物質を、良好な収率で比較的濃縮した形
態で溶出することができる。あるいは、ＰＭＴは沈澱さ
せてもよい。この発明の好ましい方法では、溶離中、ア
ニオン交換カラムの出口は濃縮カラムの入口に接続され
ている。このようにして、溶離されたＰＭＴはアニオン
交換カラムから流出して直接に濃縮カラムに入り、そこ
で吸着される。ＰＭＴのアニオン交換カラムからの溶離
が完了した後、そのカラムの出口を濃縮カラムからはず
し、ＰＭＴを濃縮カラムから溶離する。
で回収されるので、アニオン交換溶出液を濃縮すること
が望ましい。その溶出液は、例えばアニオン交換媒体の
溶離緩衝液の存在下、ＰＭＴに対して親和性を有するク
ロマトグラフィ媒体に添加され、そのクロマトグラフィ
媒体から、結合物質を、良好な収率で比較的濃縮した形
態で溶出することができる。あるいは、ＰＭＴは沈澱さ
せてもよい。この発明の好ましい方法では、溶離中、ア
ニオン交換カラムの出口は濃縮カラムの入口に接続され
ている。このようにして、溶離されたＰＭＴはアニオン
交換カラムから流出して直接に濃縮カラムに入り、そこ
で吸着される。ＰＭＴのアニオン交換カラムからの溶離
が完了した後、そのカラムの出口を濃縮カラムからはず
し、ＰＭＴを濃縮カラムから溶離する。
【００５８】好ましい濃縮カラムは、ω−アミノヘキシ
ルアガロース（“ω−アミノヘキシル−セファロース４
Ｂ”、Sigma Chemical Co.、米国、ミズリー州、セント
ルイス、カタログ番号：Ａ８８９４）（“ＡＨＳ”）
を、アニオン交換カラムの１０〜３０％のカラム容積で
利用する。ＰＭＴは、比較的高い濃度の塩、好ましくは
１．５Ｍ NaCl を含有する溶離緩衝液で、このカラムか
ら溶離される。溶離緩衝液は、好ましくは、さらに、有
効量の、緩衝剤、重金属キレート化剤、還元剤、および
水活性変性剤を含有している。最も好ましい溶離緩衝液
は、１．５ＭのNaCl、１０ｍＭのトリス／HCl （ｐＨ
７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％（Ｖ／Ｖ）のグリ
セリンおよび２ｍＭのＤＴＴを含有している。濃縮カラ
ムは、４〜８℃で負荷され溶離されるのが好ましい。
ルアガロース（“ω−アミノヘキシル−セファロース４
Ｂ”、Sigma Chemical Co.、米国、ミズリー州、セント
ルイス、カタログ番号：Ａ８８９４）（“ＡＨＳ”）
を、アニオン交換カラムの１０〜３０％のカラム容積で
利用する。ＰＭＴは、比較的高い濃度の塩、好ましくは
１．５Ｍ NaCl を含有する溶離緩衝液で、このカラムか
ら溶離される。溶離緩衝液は、好ましくは、さらに、有
効量の、緩衝剤、重金属キレート化剤、還元剤、および
水活性変性剤を含有している。最も好ましい溶離緩衝液
は、１．５ＭのNaCl、１０ｍＭのトリス／HCl （ｐＨ
７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２０％（Ｖ／Ｖ）のグリ
セリンおよび２ｍＭのＤＴＴを含有している。濃縮カラ
ムは、４〜８℃で負荷され溶離されるのが好ましい。
【００５９】濃縮カラムからの最初の４〜８倍容積の溶
出液が、ＰＭＴの活性の大部分を含有している。その画
分は、好ましくは限外濾過装置（AmiconCorp.米国、マ
サチューセッツ州、ダンバースが市販している“セント
リコン３０”など）でさらに濃縮される。限外濾過を行
った後、試料は一般に約０．０４〜０．７０ｍｇ／ｍｌ
のタンパク質濃度をもっている。いくつものかような濃
度カラムからの一般にＰＭＴを含有している画分を集め
てさらに濃縮する。
出液が、ＰＭＴの活性の大部分を含有している。その画
分は、好ましくは限外濾過装置（AmiconCorp.米国、マ
サチューセッツ州、ダンバースが市販している“セント
リコン３０”など）でさらに濃縮される。限外濾過を行
った後、試料は一般に約０．０４〜０．７０ｍｇ／ｍｌ
のタンパク質濃度をもっている。いくつものかような濃
度カラムからの一般にＰＭＴを含有している画分を集め
てさらに濃縮する。
【００６０】アニオン交換と試料濃縮の工程の後に得ら
れたＰＭＴはさらに分取規模の等電点焦点化電気泳動法
で精製される。等電点焦点化電気泳動法では、試料の混
合物を、安定化したｐＨ勾配液中に置き、次いでこの勾
配液に電圧を印加する。各タンパク質種は、そのたんぱ
く種の正味の電荷が零のｐＨ勾配液の点にむかって電気
泳動的に移動する。タンパク質の正味の電荷が零の場合
のｐＨは、そのタンパク質の等電点と呼称される。
れたＰＭＴはさらに分取規模の等電点焦点化電気泳動法
で精製される。等電点焦点化電気泳動法では、試料の混
合物を、安定化したｐＨ勾配液中に置き、次いでこの勾
配液に電圧を印加する。各タンパク質種は、そのたんぱ
く種の正味の電荷が零のｐＨ勾配液の点にむかって電気
泳動的に移動する。タンパク質の正味の電荷が零の場合
のｐＨは、そのタンパク質の等電点と呼称される。
【００６１】スクロース溶液類とポリアクリルアミドゲ
ル類を含む各種のｐＨ勾配液安定化媒体を使用すること
ができる。同様に、ｐＨ勾配液を分画して、等電点焦点
化電気泳動法の後タンパク質を回収する各種の方法を採
用することができる。ｐＨ勾配液分画法は、勾配液安定
化媒体と適合性であるように選択しなければならない。
ル類を含む各種のｐＨ勾配液安定化媒体を使用すること
ができる。同様に、ｐＨ勾配液を分画して、等電点焦点
化電気泳動法の後タンパク質を回収する各種の方法を採
用することができる。ｐＨ勾配液分画法は、勾配液安定
化媒体と適合性であるように選択しなければならない。
【００６２】好ましいｐＨ勾配液安定化媒体は、ガラス
管に入れたスクロース溶液（密度勾配液）である。最も
好ましくは、スクロース密度勾配液は、ｐＨが約５〜約
６の範囲にあるｐＨ勾配液を含有している。好ましい勾
配液分画法では、活栓を通じて液体の流量が正確に制御
される。集められた画分は、ｐＨとＰＭＴ活性について
試験される。等電点焦点化電気泳動法の装置、化学薬品
およびプロトコールはいくつもの商業的企業から入手で
きる。
管に入れたスクロース溶液（密度勾配液）である。最も
好ましくは、スクロース密度勾配液は、ｐＨが約５〜約
６の範囲にあるｐＨ勾配液を含有している。好ましい勾
配液分画法では、活栓を通じて液体の流量が正確に制御
される。集められた画分は、ｐＨとＰＭＴ活性について
試験される。等電点焦点化電気泳動法の装置、化学薬品
およびプロトコールはいくつもの商業的企業から入手で
きる。
【００６３】この発明の方法で単離されたＰＭＴは他の
タバコタンパク質を実質的に含有せず、ＰＭＴは製剤中
の支配的なタンパク質である。製剤中の少数の汚染タバ
コタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動法（“ＳＤＳ−ＰＡＧＥ”）によっ
て、標準の方法にしたがって分離される。このようにし
て、アミノ酸配列分析用に充分純粋なＰＭＴが得られ
る。
タバコタンパク質を実質的に含有せず、ＰＭＴは製剤中
の支配的なタンパク質である。製剤中の少数の汚染タバ
コタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリル
アミドゲル電気泳動法（“ＳＤＳ−ＰＡＧＥ”）によっ
て、標準の方法にしたがって分離される。このようにし
て、アミノ酸配列分析用に充分純粋なＰＭＴが得られ
る。
【００６４】ＰＭＴの特性決定 タバコＰＭＴは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約
５５〜６５キロダルトンの分子量を有し、等電点焦点化
電気泳動法で測定した場合、ｐＨが約５．０〜６．０の
未変性の等電点を有することが特徴である。
５５〜６５キロダルトンの分子量を有し、等電点焦点化
電気泳動法で測定した場合、ｐＨが約５．０〜６．０の
未変性の等電点を有することが特徴である。
【００６５】さらに、タバコＰＭＴは、Ｓ−アデノシル
メチオニンのメチル基をプトレッシンのδ−アミノ基へ
転移させる反応を触媒する性能、およびプトレッシンに
対する高い基質特異性を特徴としている。
メチオニンのメチル基をプトレッシンのδ−アミノ基へ
転移させる反応を触媒する性能、およびプトレッシンに
対する高い基質特異性を特徴としている。
【００６６】ミカエリス・メンテン定数（Ｋｍ）は、初
期の反応速度が、最大反応速度の１／２に等しくなると
きの基質濃度として定義される。Ｋｍ値は、同じ反応を
触媒する別個の酵素種については広く変化する。したが
ってＫｍの測定値は酵素に対して有用な“同定マーカ
ー”である。軽度に精製されたタバコＰＭＴは、プトレ
ッシンについてのＫｍ値が約３００〜５００μＭである
ことを特徴としている。この発明の高度に精製されたタ
バコＰＭＴは、Ｓ−アデノシルメチオニンについてのＫ
ｍ値が約１００〜１５０μＭであることを特徴としてい
る。
期の反応速度が、最大反応速度の１／２に等しくなると
きの基質濃度として定義される。Ｋｍ値は、同じ反応を
触媒する別個の酵素種については広く変化する。したが
ってＫｍの測定値は酵素に対して有用な“同定マーカ
ー”である。軽度に精製されたタバコＰＭＴは、プトレ
ッシンについてのＫｍ値が約３００〜５００μＭである
ことを特徴としている。この発明の高度に精製されたタ
バコＰＭＴは、Ｓ−アデノシルメチオニンについてのＫ
ｍ値が約１００〜１５０μＭであることを特徴としてい
る。
【００６７】ＰＭＴの部分アミノ酸配列の決定 アミノ酸配列の分析の準備として、標準のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ法を用いて、アニオン交換、試料の濃縮および等電
点焦点化電気泳動法の工程の後に残留している少数の汚
染タンパク質類からＰＭＴを分離する。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ法についての詳細なプロトコールは、Laemmli 、“Cl
eavage of Structural Proteins Duringthe Assembly o
f the Head of Bacteriophage Ｔ４”、Nature、２２
７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年、および電気泳動
法装置のメーカーから提供されるマニュアルに見られ
る。公知の方法によって、個々のタンパク質を含有する
バンドを、薄いシートもしくは膜に電気泳動的に転移さ
せ（電気ブロットさせ）、それに保持させ視覚化する。
公知の一つの方法では、タンパク質のバンドを、ポリヨ
ウ化（４−ビニル−Ｎ−メチルピリジニウム）のような
疎水性ポリカチオンでコートされたガラス微小繊維のシ
ートに電気ブロットさせ、次にフルオレサミンのような
非アニオン性薬剤によって視覚化する。他の方法は、タ
ンパク質を、ポリ二フッ化ビニリデンの膜の上に（“Im
mobilon −Ｐ”、Millipore 、米国、マサチューセッツ
州、ベッドフォード）、電気ブロットさせ、アミドブラ
ックのようなアニオン染料で、バンドを視覚化する方法
である（Bauw等、“Alterationsin the Phenotype of P
lant Cells Studied by NH2-Terminal Amino Acid Sequ
ence Analysis of Proteins Electroblotted from Two-
Dimensional Gel-Separated Total Extracts ”、Proc.
Nat.Acad. Sci. USA、８４巻、４８０６〜４８１０頁、
１９８７年；A Practical Guide to Protein and Pepti
de Purificationfor Microse-quencing、Paul T. Matsu
daira編集、Academic Press、米国、ニューヨーク、１
９８９年）。
ＧＥ法を用いて、アニオン交換、試料の濃縮および等電
点焦点化電気泳動法の工程の後に残留している少数の汚
染タンパク質類からＰＭＴを分離する。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ法についての詳細なプロトコールは、Laemmli 、“Cl
eavage of Structural Proteins Duringthe Assembly o
f the Head of Bacteriophage Ｔ４”、Nature、２２
７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年、および電気泳動
法装置のメーカーから提供されるマニュアルに見られ
る。公知の方法によって、個々のタンパク質を含有する
バンドを、薄いシートもしくは膜に電気泳動的に転移さ
せ（電気ブロットさせ）、それに保持させ視覚化する。
公知の一つの方法では、タンパク質のバンドを、ポリヨ
ウ化（４−ビニル−Ｎ−メチルピリジニウム）のような
疎水性ポリカチオンでコートされたガラス微小繊維のシ
ートに電気ブロットさせ、次にフルオレサミンのような
非アニオン性薬剤によって視覚化する。他の方法は、タ
ンパク質を、ポリ二フッ化ビニリデンの膜の上に（“Im
mobilon −Ｐ”、Millipore 、米国、マサチューセッツ
州、ベッドフォード）、電気ブロットさせ、アミドブラ
ックのようなアニオン染料で、バンドを視覚化する方法
である（Bauw等、“Alterationsin the Phenotype of P
lant Cells Studied by NH2-Terminal Amino Acid Sequ
ence Analysis of Proteins Electroblotted from Two-
Dimensional Gel-Separated Total Extracts ”、Proc.
Nat.Acad. Sci. USA、８４巻、４８０６〜４８１０頁、
１９８７年；A Practical Guide to Protein and Pepti
de Purificationfor Microse-quencing、Paul T. Matsu
daira編集、Academic Press、米国、ニューヨーク、１
９８９年）。
【００６８】単離されたタンパク質を、電気泳動ゲルか
ら転移させ、転移させたタンパク質を視覚化する上記方
法が好ましい。しかし、電気泳動法で単離されたタンパ
ク質を配列分析用に準備するのに用いられる材料と方法
の変化は、この発明から除外されないということは、当
該技術分野の熟練者にとって明らかなことであろう。
ら転移させ、転移させたタンパク質を視覚化する上記方
法が好ましい。しかし、電気泳動法で単離されたタンパ
ク質を配列分析用に準備するのに用いられる材料と方法
の変化は、この発明から除外されないということは、当
該技術分野の熟練者にとって明らかなことであろう。
【００６９】バンドを構成する精製ＰＭＴは、見掛けの
分子量（すなわち約６０ＫＤ）で同定される。タンパク
質のバンドを電気泳動ゲルから膜に移転させ、移転させ
たバンドを視覚化した後、精製ＰＭＴの個々のバンドを
有する膜片を、隣接するタンパク質のバンドによる汚染
を避けて正確に切取る。
分子量（すなわち約６０ＫＤ）で同定される。タンパク
質のバンドを電気泳動ゲルから膜に移転させ、移転させ
たバンドを視覚化した後、精製ＰＭＴの個々のバンドを
有する膜片を、隣接するタンパク質のバンドによる汚染
を避けて正確に切取る。
【００７０】タンパク質バンド（上記のようにして単離
された）を構成する精製タバコＰＭＴについて、標準の
自動測定法によってアミノ未端配列を分析する。タバコ
ＰＭＴタンパク質は、配列番号１、配列番号２および配
列番号３から選択されるアミノ酸配列を含有している。
された）を構成する精製タバコＰＭＴについて、標準の
自動測定法によってアミノ未端配列を分析する。タバコ
ＰＭＴタンパク質は、配列番号１、配列番号２および配
列番号３から選択されるアミノ酸配列を含有している。
【００７１】配列番号１は、“ａ１”バンド（図５）か
らの配列であり配列番号２は“ａ２”バンド（図５）か
らの配列である。配列番号３は、配列番号１と配列番号
２の共通配列である。
らの配列であり配列番号２は“ａ２”バンド（図５）か
らの配列である。配列番号３は、配列番号１と配列番号
２の共通配列である。
【００７２】密接している精製タンパク質のバンドから
の配列が高度に相同性なことは、複合形のタバコＰＭＴ
タンパク質が存在していることを示唆している。このよ
うな複合形のタバコＰＭＴタンパク質は、単一の遺伝子
産物の翻訳後の修飾から、または複合形ＰＭＴの遺伝子
から生成する。
の配列が高度に相同性なことは、複合形のタバコＰＭＴ
タンパク質が存在していることを示唆している。このよ
うな複合形のタバコＰＭＴタンパク質は、単一の遺伝子
産物の翻訳後の修飾から、または複合形ＰＭＴの遺伝子
から生成する。
【００７３】ＰＭＴ ＤＮＡ配列のクローン化 この発明のＰＭＴタンパク質の部分アミノ酸配列（配列
番号１、配列番号２、配列番号３）は、次のようなオリ
ゴヌクレオチドのセットを設計するのに用いられる。す
なわちそのオリゴヌクレオチドの一つ以上が、タバコ根
ｃＤＮＡライブラリー中のＰＭＴ配列と選択的に雑種を
形成する。この選択的な雑種形成は、ＰＭＴタンパク質
の一部もしくは全体をコードする配列を含有するｃＤＮ
Ａクローンを同定するのに用いられる。アミノ酸配列か
らのオリゴヌクレオチドプローブの設計についての説明
は、Sambrook等、Molecular Cloning-A Laboratory Man
ual 、Cold Spring Harbor Press、１９８９年の１１章
に記載されている。
番号１、配列番号２、配列番号３）は、次のようなオリ
ゴヌクレオチドのセットを設計するのに用いられる。す
なわちそのオリゴヌクレオチドの一つ以上が、タバコ根
ｃＤＮＡライブラリー中のＰＭＴ配列と選択的に雑種を
形成する。この選択的な雑種形成は、ＰＭＴタンパク質
の一部もしくは全体をコードする配列を含有するｃＤＮ
Ａクローンを同定するのに用いられる。アミノ酸配列か
らのオリゴヌクレオチドプローブの設計についての説明
は、Sambrook等、Molecular Cloning-A Laboratory Man
ual 、Cold Spring Harbor Press、１９８９年の１１章
に記載されている。
【００７４】かようなオリゴヌクレオチドプローブの合
成は、市販の自動装置で日常実施されている。
成は、市販の自動装置で日常実施されている。
【００７５】ｃＤＮＡライブラリーの構築は、現在、分
子生物学の研究所では日常の作業である（Sambrook等の
前記文献の８章参照）。同様に、対象の配列を含有する
クローンを同定するために、オリゴヌクレオチドプロー
ブによってｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことは現在周知のことであり、当該技術分野の熟練者の
能力内に充分含まれている。ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするのにオリゴヌクレオチド類を使用する
ことについての説明は、Sambrook等の前記文献の実験室
マニュアルの１１章に記載されている。オリゴヌクレオ
チドプローブとの雑種形成反応に基づいて選択されたｃ
ＤＮＡクローンは、大きさ、制限部位の存在およびヌク
レオチド配列に特徴がある。このようなＤＮＡ分析法
は、Sambrook等の前記文献、およびAusubel 等、Short
Protocols in Molecular Biology、Green Publishing A
ssociates and Wiley Interscience、米国、ニューヨー
ク、１９８９年に充分に記載されている。このようにし
て得られたいずれのＰＭＴｃＤＮＡクローンも、それ自
体、ほかのＰＭＴ ｃＤＮＡクローンの同定に用いるプ
ローブとして使用できる。
子生物学の研究所では日常の作業である（Sambrook等の
前記文献の８章参照）。同様に、対象の配列を含有する
クローンを同定するために、オリゴヌクレオチドプロー
ブによってｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする
ことは現在周知のことであり、当該技術分野の熟練者の
能力内に充分含まれている。ｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングするのにオリゴヌクレオチド類を使用する
ことについての説明は、Sambrook等の前記文献の実験室
マニュアルの１１章に記載されている。オリゴヌクレオ
チドプローブとの雑種形成反応に基づいて選択されたｃ
ＤＮＡクローンは、大きさ、制限部位の存在およびヌク
レオチド配列に特徴がある。このようなＤＮＡ分析法
は、Sambrook等の前記文献、およびAusubel 等、Short
Protocols in Molecular Biology、Green Publishing A
ssociates and Wiley Interscience、米国、ニューヨー
ク、１９８９年に充分に記載されている。このようにし
て得られたいずれのＰＭＴｃＤＮＡクローンも、それ自
体、ほかのＰＭＴ ｃＤＮＡクローンの同定に用いるプ
ローブとして使用できる。
【００７６】タバコ〔ニコチアナ・タバクム L. var.
（Nicotiana tabacum L. var. ）ＮＫ３２６〕のゲノム
ライブラリーは市販されている（Clonetech Laboratori
es，Inc.、米国、カリフォルニア州パロ・アルト）。前
記のゲノムライブラリーは、販売者が提供するプロトコ
ールにしたがってスクリーニングされ、タバコＰＭＴを
コードする染色体遺伝子が得られる。
（Nicotiana tabacum L. var. ）ＮＫ３２６〕のゲノム
ライブラリーは市販されている（Clonetech Laboratori
es，Inc.、米国、カリフォルニア州パロ・アルト）。前
記のゲノムライブラリーは、販売者が提供するプロトコ
ールにしたがってスクリーニングされ、タバコＰＭＴを
コードする染色体遺伝子が得られる。
【００７７】したがって、この発明はタバコＰＭＴタン
パク質をコードする組換えＤＮＡ分子を提供するもので
ある。
パク質をコードする組換えＤＮＡ分子を提供するもので
ある。
【００７８】ＰＭＴ ＤＮＡ配列で、センス配向もしく
はアンチセンス配向に安定に形質転換されたトランスジ
ェニックタバコ細胞とタバコ植物の製造
はアンチセンス配向に安定に形質転換されたトランスジ
ェニックタバコ細胞とタバコ植物の製造
【００７９】またこの発明は、タバコＰＭＴタンパク質
をコードしかつＰＭＴアンチセンスＲＮＡ分子をコード
し、作動可能に調節配列に連結された組換えＤＮＡ分子
で安定に形質転換されたトランスジェニックタバコ細胞
とタバコ植物を提供するものである。
をコードしかつＰＭＴアンチセンスＲＮＡ分子をコード
し、作動可能に調節配列に連結された組換えＤＮＡ分子
で安定に形質転換されたトランスジェニックタバコ細胞
とタバコ植物を提供するものである。
【００８０】未形質転換の対照のタバコ植物よりもニコ
チン含量が低いタバコ植物を製造するために、タバコ細
胞を、部分ＰＭＴ ｃＤＮＡ配列、全長ＰＭＴ ｃＤＮ
Ａ配列、部分ＰＭＴ染色体配列、または全長ＰＭＴ染色
体配列を含有し、作動可能に連結された適切な調節配列
でアンチセンス配向にクローン化された人工のＰＭＴア
ンチセンス転写ユニットで形質転換される。適切な調節
配列には、転写開始配列（“プロモーター”）およびポ
リアデニル化／転写終結配列が含まれる。
チン含量が低いタバコ植物を製造するために、タバコ細
胞を、部分ＰＭＴ ｃＤＮＡ配列、全長ＰＭＴ ｃＤＮ
Ａ配列、部分ＰＭＴ染色体配列、または全長ＰＭＴ染色
体配列を含有し、作動可能に連結された適切な調節配列
でアンチセンス配向にクローン化された人工のＰＭＴア
ンチセンス転写ユニットで形質転換される。適切な調節
配列には、転写開始配列（“プロモーター”）およびポ
リアデニル化／転写終結配列が含まれる。
【００８１】トランスジェニックタバコ植物中のアンチ
センス配列の発現には、一般にハナヤサイ・モザイクウ
イルス（CaMV）３５Ｓプロモーターを使用する（例え
ば、Cornelissen 等、“Both RNA Level and Translati
on Efficiency are Reduced byAnti-Sense RNA in Tran
sgenic Tobacco ”、Nucleic Acids Res.、１７巻、８
３３〜８４３頁、１９８９年；Rezaian 等、“Anti-Sen
se RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Pla
nts Assessed for Contol of the Virus”、Plant Mole
cular Biology 、１１巻、４６３〜４７１頁、１９８８
年；Rodermel等、“Nuclear-organelle Interactions：
Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosph
ate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobac
coPlants”、Cell、５５巻、６７３〜６８１頁、１９８
８年；Smith 等、“Antisense RNA Inhibition of Poly
galacturonase Gene Expressionin Transgenic Tomatoe
s”、Nature、３３４巻、７２４〜７２６頁、１９８８
年；Van der Krol等、“AnAnti-Sense Chalcone Syntha
se Gene in Transgenic Plants Inhibits FlowerPigmen
tation ”、Nature、３３３巻、８６６〜８６９頁、１
９８８年を参照）。この発明の形質転換されたタバコの
細胞と植物内で、ＰＭＴを発現するのにCaMV３５Ｓプロ
モーターを用いることが好ましい。タバコの根の中で、
他の組換え遺伝子を発現するためにCaMVプロモーターを
用いることは充分に報告されている（Lam 等、“Site-S
pecific Mutations Alter In Vitro Factor Binding an
d Change Promoter Expression Pattern in Transgenic
Plants”、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 、８６巻、７
８９０〜７８９４頁、１９８９年；Poulsen 等、“Diss
ection of ５′Upstream Sequences for selective Exp
ression of the Nicotiana plumbaginifolia rbcs −８
Ｂ Gene ”、Mol. Gen. Genet.、２１４巻、１６〜２３
頁、１９８８年）。
センス配列の発現には、一般にハナヤサイ・モザイクウ
イルス（CaMV）３５Ｓプロモーターを使用する（例え
ば、Cornelissen 等、“Both RNA Level and Translati
on Efficiency are Reduced byAnti-Sense RNA in Tran
sgenic Tobacco ”、Nucleic Acids Res.、１７巻、８
３３〜８４３頁、１９８９年；Rezaian 等、“Anti-Sen
se RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Pla
nts Assessed for Contol of the Virus”、Plant Mole
cular Biology 、１１巻、４６３〜４７１頁、１９８８
年；Rodermel等、“Nuclear-organelle Interactions：
Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosph
ate Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobac
coPlants”、Cell、５５巻、６７３〜６８１頁、１９８
８年；Smith 等、“Antisense RNA Inhibition of Poly
galacturonase Gene Expressionin Transgenic Tomatoe
s”、Nature、３３４巻、７２４〜７２６頁、１９８８
年；Van der Krol等、“AnAnti-Sense Chalcone Syntha
se Gene in Transgenic Plants Inhibits FlowerPigmen
tation ”、Nature、３３３巻、８６６〜８６９頁、１
９８８年を参照）。この発明の形質転換されたタバコの
細胞と植物内で、ＰＭＴを発現するのにCaMV３５Ｓプロ
モーターを用いることが好ましい。タバコの根の中で、
他の組換え遺伝子を発現するためにCaMVプロモーターを
用いることは充分に報告されている（Lam 等、“Site-S
pecific Mutations Alter In Vitro Factor Binding an
d Change Promoter Expression Pattern in Transgenic
Plants”、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 、８６巻、７
８９０〜７８９４頁、１９８９年；Poulsen 等、“Diss
ection of ５′Upstream Sequences for selective Exp
ression of the Nicotiana plumbaginifolia rbcs −８
Ｂ Gene ”、Mol. Gen. Genet.、２１４巻、１６〜２３
頁、１９８８年）。
【００８２】CaMV３５Ｓプロモーターを使用する方が好
ましいけれども、他のプロモーターがタバコ植物内に異
種遺伝子を発現するのに成功裡に用いられることは明ら
かであり、CaMV３５Ｓプロモーター以外のプロモーター
を使用することもこの発明の範囲に含まれる。
ましいけれども、他のプロモーターがタバコ植物内に異
種遺伝子を発現するのに成功裡に用いられることは明ら
かであり、CaMV３５Ｓプロモーター以外のプロモーター
を使用することもこの発明の範囲に含まれる。
【００８３】各種の転写終結配列が知られている。転写
終結配列の起源と同一性は主として便宜上の問題であ
る。例えば、ノパリンシンターゼ（“ＮＯＳ”）、オク
トピンシンターゼ（“ＯＣＳ”）およびCaMVポリアデニ
ル化／転写終結配列は、トランスジェニックタバコ植物
中で異種の遺伝子を発現させるのに用いられ、ＰＭＴ配
列の発現に有用である（例えばRezian等の前記文献およ
びRodermel等の前記文献参照）。
終結配列の起源と同一性は主として便宜上の問題であ
る。例えば、ノパリンシンターゼ（“ＮＯＳ”）、オク
トピンシンターゼ（“ＯＣＳ”）およびCaMVポリアデニ
ル化／転写終結配列は、トランスジェニックタバコ植物
中で異種の遺伝子を発現させるのに用いられ、ＰＭＴ配
列の発現に有用である（例えばRezian等の前記文献およ
びRodermel等の前記文献参照）。
【００８４】次に、制限地図の作成、サザンブロット雑
種形成法、およびヌクレオチド配列分析法のような標準
方法を使用して、アンチセンス配向でＰＭＴ配列を有
し、調節配列（すなわちプロモーターと、ポリアデニル
化／転写終結配列）に作動可能に連結されているクロー
ンを同定する。
種形成法、およびヌクレオチド配列分析法のような標準
方法を使用して、アンチセンス配向でＰＭＴ配列を有
し、調節配列（すなわちプロモーターと、ポリアデニル
化／転写終結配列）に作動可能に連結されているクロー
ンを同定する。
【００８５】外因性ＤＮＡで安定に形質転換されたトラ
ンスジェニック細胞を製造するために、タバコ細胞のゲ
ノムに外因性ＤＮＡを導入するのに適用できるよく発達
した方法がある。多数の公知の、タバコ細胞形質転換法
のいずれかを、この発明を実施するのに使用できる。タ
バコ細胞の形質転換法は、アグロバクテリウム（Agroba
cterium ）系の成分を用いるか否かに基づいて簡便に分
類される。
ンスジェニック細胞を製造するために、タバコ細胞のゲ
ノムに外因性ＤＮＡを導入するのに適用できるよく発達
した方法がある。多数の公知の、タバコ細胞形質転換法
のいずれかを、この発明を実施するのに使用できる。タ
バコ細胞の形質転換法は、アグロバクテリウム（Agroba
cterium ）系の成分を用いるか否かに基づいて簡便に分
類される。
【００８６】アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefasciens）は、“Ｔ−ＤＮＡ”
（転移されたＤＮＡとして）と呼ばれるヌクレオチド配
列を有するプラスミドを有し、かつ天然の双子葉植物
（タバコを含む）の染色体に効率的に転移され組込ま
れ、感染した植物に腫瘍を成長させるグラム陰性菌であ
る。異種のＤＮＡを植物の染色体に組込むための天然産
のベクター系は、植物の遺伝子工学で、広く研究され、
変性され、開発されている（Deblaere等、“EfficientO
ctopine Ti Plasmid-Derived Vectors for Agrobacteri
um-Mediated Gene Transfer to Plants”、Nucleic Aci
ds Research、１３巻、４７７７〜４７８８頁、１９８
５年）。調節配列に対しセンス配向もしくはアンチセン
ス配向で作動可能に連結されたＰＭＴ ＤＮＡ配列を含
有する裸組換えＤＮＡ分子を、適当なＴ−ＤＮＡ配列に
通常の方法によって接続する。これらを、ポリエチレン
グリコール法または電気穿孔法によって（両法とも標準
の方法）、タバコの原形質体中に導入される。あるいは
ＰＭＴをコードする組換えＤＮＡ分子を含有するかよう
なベクターを、生アグロバクテリウム細胞に導入する。
次いでこの細胞がそのＤＮＡをタバコ植物細胞に転移さ
せる（Rogers等、“Gene Transfer in Plants ：Produc
tion of Transformed Plants Using Ti Plasmid Vector
s ”、Methods in Enzymology 、１１８巻、６２７〜６
４０頁、１９８６年）。
（Agrobacterium tumefasciens）は、“Ｔ−ＤＮＡ”
（転移されたＤＮＡとして）と呼ばれるヌクレオチド配
列を有するプラスミドを有し、かつ天然の双子葉植物
（タバコを含む）の染色体に効率的に転移され組込ま
れ、感染した植物に腫瘍を成長させるグラム陰性菌であ
る。異種のＤＮＡを植物の染色体に組込むための天然産
のベクター系は、植物の遺伝子工学で、広く研究され、
変性され、開発されている（Deblaere等、“EfficientO
ctopine Ti Plasmid-Derived Vectors for Agrobacteri
um-Mediated Gene Transfer to Plants”、Nucleic Aci
ds Research、１３巻、４７７７〜４７８８頁、１９８
５年）。調節配列に対しセンス配向もしくはアンチセン
ス配向で作動可能に連結されたＰＭＴ ＤＮＡ配列を含
有する裸組換えＤＮＡ分子を、適当なＴ−ＤＮＡ配列に
通常の方法によって接続する。これらを、ポリエチレン
グリコール法または電気穿孔法によって（両法とも標準
の方法）、タバコの原形質体中に導入される。あるいは
ＰＭＴをコードする組換えＤＮＡ分子を含有するかよう
なベクターを、生アグロバクテリウム細胞に導入する。
次いでこの細胞がそのＤＮＡをタバコ植物細胞に転移さ
せる（Rogers等、“Gene Transfer in Plants ：Produc
tion of Transformed Plants Using Ti Plasmid Vector
s ”、Methods in Enzymology 、１１８巻、６２７〜６
４０頁、１９８６年）。
【００８７】アグロバクテリウム法は当該技術分野では
広く用いられているが、この発明の方法では必要な要素
ではない。Ｔ−ＤＮＡベクター配列をもっていない裸Ｄ
ＮＡによる形質転換は、タバコ原形質体をＤＮＡ含有リ
ポソームと融合させるかまたは電気穿孔法によって行う
ことができる（Shillito等、“Direct Gene Transferto
Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonou
s Plants by a Number of Methods，Including Electro
poration ”、Methods in Enzymology 、１５３巻、３
１３〜３１６頁、１９８７年）。Ｔ−ＤＮＡベクター配
列をもっていない裸ＤＮＡも、不活性高速マイクロプロ
ジェクティル〔BIOLISTIC （登録商標）Particle Deliv
ery System、Dupont、米国、デラウエア州、ウイルミン
トン）によって、タバコ細胞を形質転換するのに用いる
ことができる。
広く用いられているが、この発明の方法では必要な要素
ではない。Ｔ−ＤＮＡベクター配列をもっていない裸Ｄ
ＮＡによる形質転換は、タバコ原形質体をＤＮＡ含有リ
ポソームと融合させるかまたは電気穿孔法によって行う
ことができる（Shillito等、“Direct Gene Transferto
Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonou
s Plants by a Number of Methods，Including Electro
poration ”、Methods in Enzymology 、１５３巻、３
１３〜３１６頁、１９８７年）。Ｔ−ＤＮＡベクター配
列をもっていない裸ＤＮＡも、不活性高速マイクロプロ
ジェクティル〔BIOLISTIC （登録商標）Particle Deliv
ery System、Dupont、米国、デラウエア州、ウイルミン
トン）によって、タバコ細胞を形質転換するのに用いる
ことができる。
【００８８】この発明の形質転換されたタバコ細胞とタ
バコ植物を作製するのに使用されるＰＭＴ組換えＤＮＡ
分子とベクターは、さらに、優性の選択マーカー遺伝子
を含有する方が好ましい。タバコに用いるのに適切な優
性の選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ
およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼをコードする抗生物質耐性遺伝子が含まれる。タバコ
に用いるのに適切な、その外の公知の優先の選択マーカ
ーは、メトトレキセート耐性ジヒドロ葉酸レダクターゼ
をコードする変異体のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
である（Deblaere等の前記文献）。適切な抗生物質耐性
遺伝子を含有するＤＮＡベクターおよび対応する抗生物
質は市販されている。
バコ植物を作製するのに使用されるＰＭＴ組換えＤＮＡ
分子とベクターは、さらに、優性の選択マーカー遺伝子
を含有する方が好ましい。タバコに用いるのに適切な優
性の選択マーカーには、ネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ
およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼをコードする抗生物質耐性遺伝子が含まれる。タバコ
に用いるのに適切な、その外の公知の優先の選択マーカ
ーは、メトトレキセート耐性ジヒドロ葉酸レダクターゼ
をコードする変異体のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
である（Deblaere等の前記文献）。適切な抗生物質耐性
遺伝子を含有するＤＮＡベクターおよび対応する抗生物
質は市販されている。
【００８９】形質転換されたタバコ細胞は、選択された
優性の選択マーカー遺伝子の産生物が耐性を与える抗生
物質（またはタバコ細胞に対して通常毒性の他の化合
物）を適当な濃度で含有する培地に、細胞の混合集団を
入れることによって、未形質転換細胞の周囲の集団から
選択される。したがって、形質転換されたタバコ細胞だ
けが生存し増殖する。
優性の選択マーカー遺伝子の産生物が耐性を与える抗生
物質（またはタバコ細胞に対して通常毒性の他の化合
物）を適当な濃度で含有する培地に、細胞の混合集団を
入れることによって、未形質転換細胞の周囲の集団から
選択される。したがって、形質転換されたタバコ細胞だ
けが生存し増殖する。
【００９０】形質転換された細胞は、当該技術分野で公
知のタバコ細胞と組織の培養法を適用することによっ
て、誘導されて、無傷で実りあるタバコ植物を再生す
る。植物再生方法は、形質転換法と整合するように選択
される。推定のトランスジェニックタバコ植物のゲノム
（genome）中にＰＭＴ配列が安定に存在して配向してい
ることの検定は、ＰＭＴの配列のメンデルの遺伝によっ
て行われ、制御された交雑によってもたらされる子孫に
対して行われる標準のＤＮＡ分析によって明らかにな
る。
知のタバコ細胞と組織の培養法を適用することによっ
て、誘導されて、無傷で実りあるタバコ植物を再生す
る。植物再生方法は、形質転換法と整合するように選択
される。推定のトランスジェニックタバコ植物のゲノム
（genome）中にＰＭＴ配列が安定に存在して配向してい
ることの検定は、ＰＭＴの配列のメンデルの遺伝によっ
て行われ、制御された交雑によってもたらされる子孫に
対して行われる標準のＤＮＡ分析によって明らかにな
る。
【００９１】トランスジェニックタバコ植物を、形質転
換された細胞から再生させた後、導入されたＰＭＴ配列
は、通常の植物増殖法で余分の実験なしで他のタバコ変
種に容易に転移される。
換された細胞から再生させた後、導入されたＰＭＴ配列
は、通常の植物増殖法で余分の実験なしで他のタバコ変
種に容易に転移される。
【００９２】ＰＭＴアンチセンストランスジェニックタ
バコ植物の減少したレベルのニコチンは標準のニコチン
検定法で検定される。
バコ植物の減少したレベルのニコチンは標準のニコチン
検定法で検定される。
【００９３】上記の組換えＤＮＡ法を知っていれば、全
長のＰＭＴ ｃＤＮＡ分子または全長のＰＭＴ染色体遺
伝子を用いて、適当な作動可能に連結された調節配列を
センス配向で連結させて、トランスジェニックタバコ細
胞とトランスジェニックタバコ植物を構築することがで
きることが分かる（また当該技術分野の熟練者は、セン
ス配向で遺伝子を発現する適当な調節配列が、上記のプ
ロモーターとポリアデニル化／転写終結配列に加えて、
公知の真核翻訳開始配列のいずれか一つを含んでいるこ
とが分かるであろう）。このような形質転換されたタバ
コ植物は、ＰＭＴタンパク質のレベルが増大し、したが
って未形質転換の対照のタバコ植物よりニコチン含有が
高いことが特徴である。
長のＰＭＴ ｃＤＮＡ分子または全長のＰＭＴ染色体遺
伝子を用いて、適当な作動可能に連結された調節配列を
センス配向で連結させて、トランスジェニックタバコ細
胞とトランスジェニックタバコ植物を構築することがで
きることが分かる（また当該技術分野の熟練者は、セン
ス配向で遺伝子を発現する適当な調節配列が、上記のプ
ロモーターとポリアデニル化／転写終結配列に加えて、
公知の真核翻訳開始配列のいずれか一つを含んでいるこ
とが分かるであろう）。このような形質転換されたタバ
コ植物は、ＰＭＴタンパク質のレベルが増大し、したが
って未形質転換の対照のタバコ植物よりニコチン含有が
高いことが特徴である。
【００９４】それ故に、ＰＭＴ ＤＮＡ配列を用いて、
ＰＭＴタンパク質のレベルを減少させるかまたは増加さ
せて、タバコ植物中のニコチン含量を減少させるかまた
は増加させることがこの発明の範囲に含まれることは理
解すべきである。
ＰＭＴタンパク質のレベルを減少させるかまたは増加さ
せて、タバコ植物中のニコチン含量を減少させるかまた
は増加させることがこの発明の範囲に含まれることは理
解すべきである。
【００９５】この発明を一層よく理解するために以下に
実施例を示す。これらの実施例は例示することだけを目
的とするもので、この発明の範囲を限定するものではな
い。
実施例を示す。これらの実施例は例示することだけを目
的とするもので、この発明の範囲を限定するものではな
い。
【００９６】実施例緩衝溶液の組成 緩衝液Ａ ５０ｍＭのトリス／HCl 、ｐＨ７．５ ５ｍＭのＥＤＴＡ（遊離酸） ２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリン ２ｍＭのＤＴＴ ０．５％（Ｗ／Ｖ）のアスコルビン酸ナトリウム ２％（Ｗ／Ｖ）のＰＥＧ４００ ０．４ｍｇ／ｌのＰＭＳＦ（１ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液由
来） ０．４ｍｇ／ｌのロイペプチン（１ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶
液由来） １００ｇ／ｌのＰＶＰＰ ４０ｇ／ｌのアンバーライトＸＡＤ−４緩衝液Ｂ １０ｍＭのトリス／HCl 、ｐＨ７．５ １ｍＭのＥＤＴＡ（遊離酸） ２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリン ２ｍＭのＤＴＴ ０．４ｍｇ／ｌのＰＭＳＦ（１ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液由
来） ０．４ｍｇ／ｌのロイペプチン（１ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶
液由来）緩衝液Ｃ １０ｍＭのトリス／HCl 、ｐＨ７．５ １ｍＭのＥＤＴＡ（遊離酸） ２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリン ２ｍＭのＤＴＴ
来） ０．４ｍｇ／ｌのロイペプチン（１ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶
液由来） １００ｇ／ｌのＰＶＰＰ ４０ｇ／ｌのアンバーライトＸＡＤ−４緩衝液Ｂ １０ｍＭのトリス／HCl 、ｐＨ７．５ １ｍＭのＥＤＴＡ（遊離酸） ２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリン ２ｍＭのＤＴＴ ０．４ｍｇ／ｌのＰＭＳＦ（１ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液由
来） ０．４ｍｇ／ｌのロイペプチン（１ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶
液由来）緩衝液Ｃ １０ｍＭのトリス／HCl 、ｐＨ７．５ １ｍＭのＥＤＴＡ（遊離酸） ２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリン ２ｍＭのＤＴＴ
【００９７】プロテアーゼ阻害剤の貯蔵溶液 ＰＭＳＦ（１ｍｇ／ｍｌ）をジメチルホルムアミドに溶
解し、２．１ｍｌずつを、使用するまで−２０℃で貯蔵
した。ロイペプチン（１ｍｇ／ｍｌ）を蒸留水に溶解
し、２．１ｍｌずつを、使用するまで−２０℃で貯蔵し
た。
解し、２．１ｍｌずつを、使用するまで−２０℃で貯蔵
した。ロイペプチン（１ｍｇ／ｍｌ）を蒸留水に溶解
し、２．１ｍｌずつを、使用するまで−２０℃で貯蔵し
た。
【００９８】粗製抽出液の製造 水耕栽培法で栽培したタバコ（ニコチアナ・タバクム
L. var.バーレイ２１）植物の根の約１Ｋｇを、摘花し
てから３日後に収穫した。収穫した根を冷水で洗浄しブ
フナー漏斗に入れて水を吸引して除去した。洗浄した根
を−８０℃に冷凍して貯蔵した。冷凍した根を、１ガロ
ンワーリングブレンダー中で予め冷却してスラリーにし
ておいた２．５ｌの緩衝液に添加した。根を大きなスプ
ーンで緩衝液スラリーと混合した。ブレンダーを低速度
設定で運転を開始し、次に中速度設定でホモゲナイゼー
ションを行った。ホモジネートの温度が３〜５℃より高
くならないように注意した。
L. var.バーレイ２１）植物の根の約１Ｋｇを、摘花し
てから３日後に収穫した。収穫した根を冷水で洗浄しブ
フナー漏斗に入れて水を吸引して除去した。洗浄した根
を−８０℃に冷凍して貯蔵した。冷凍した根を、１ガロ
ンワーリングブレンダー中で予め冷却してスラリーにし
ておいた２．５ｌの緩衝液に添加した。根を大きなスプ
ーンで緩衝液スラリーと混合した。ブレンダーを低速度
設定で運転を開始し、次に中速度設定でホモゲナイゼー
ションを行った。ホモジネートの温度が３〜５℃より高
くならないように注意した。
【００９９】得られた抽出物を遠心分離びんに入れ、１
３６８０×ｇで７０分間４℃で遠心分離して不溶性の破
片をペレット化した。
３６８０×ｇで７０分間４℃で遠心分離して不溶性の破
片をペレット化した。
【０１００】上澄み液をデカントしたがその容積は２．
３７ｌであった。約０．７７ｇのＤＴＴを抽出液に添加
した。
３７ｌであった。約０．７７ｇのＤＴＴを抽出液に添加
した。
【０１０１】硫酸アンモニウムによる分画 硫酸アンモニウムの結晶を、抽出液１００ｍｌ当り２
２．６ｇの量で抽出液に徐々に添加し、硫酸アンモニウ
ムで抽出液を４０％飽和度にした。得られた硫酸アンモ
ニウム含有抽出液を４℃で２時間撹拌した。
２．６ｇの量で抽出液に徐々に添加し、硫酸アンモニウ
ムで抽出液を４０％飽和度にした。得られた硫酸アンモ
ニウム含有抽出液を４℃で２時間撹拌した。
【０１０２】４０％飽和度の硫酸アンモニウムによる沈
澱を、２７５００×ｇで３０分間４℃にて遠心分離する
ことによって取出した。抽出液１ｌ当り０．３３ｇの追
加のＤＴＴを添加した。硫酸アンモニウムの結晶を、抽
出液１００ｍｌ当り１５．３ｇの量で抽出液に徐々に添
加して、硫酸アンモニウムの濃度を４０％飽和度から６
５％飽和度まで増大させた。６５％飽和度の硫酸アンモ
ニウム含有の抽出液を一夜４℃で撹拌した。４０〜６５
％飽和度の硫酸アンモニウムによる画分を、２７５００
×ｇで７０分間４℃にて遠心分離することによってペレ
ット化し、上澄み液を廃棄した。
澱を、２７５００×ｇで３０分間４℃にて遠心分離する
ことによって取出した。抽出液１ｌ当り０．３３ｇの追
加のＤＴＴを添加した。硫酸アンモニウムの結晶を、抽
出液１００ｍｌ当り１５．３ｇの量で抽出液に徐々に添
加して、硫酸アンモニウムの濃度を４０％飽和度から６
５％飽和度まで増大させた。６５％飽和度の硫酸アンモ
ニウム含有の抽出液を一夜４℃で撹拌した。４０〜６５
％飽和度の硫酸アンモニウムによる画分を、２７５００
×ｇで７０分間４℃にて遠心分離することによってペレ
ット化し、上澄み液を廃棄した。
【０１０３】４０〜６５％飽和度の硫酸アンモニウムに
よる沈澱を緩衝液Ｂに溶解して全容積を２００ｍｌに
し、次に１７．５３ｇのNaClを添加し、氷上で撹拌して
溶解させた。NaClを添加した４０〜６５％画分の溶液を
４７８００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、生成し
たペレットを廃棄した。
よる沈澱を緩衝液Ｂに溶解して全容積を２００ｍｌに
し、次に１７．５３ｇのNaClを添加し、氷上で撹拌して
溶解させた。NaClを添加した４０〜６５％画分の溶液を
４７８００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、生成し
たペレットを廃棄した。
【０１０４】粗製抽出液の製造と硫酸アンモニウムによ
る分画を、先に述べたのと実質的に同じようにしてさら
に３回実施し、得られた四つの４０〜６５％飽和度硫酸
アンモニウム画分（各々２００ｍｌ）をプールした。こ
のようにして製造した８００ｍｌのプールは合計５．２
３９Ｋｇの根の組織に相当するものであった。
る分画を、先に述べたのと実質的に同じようにしてさら
に３回実施し、得られた四つの４０〜６５％飽和度硫酸
アンモニウム画分（各々２００ｍｌ）をプールした。こ
のようにして製造した８００ｍｌのプールは合計５．２
３９Ｋｇの根の組織に相当するものであった。
【０１０５】疎水性相互作用クロマトグラフィ フェニル−セファロースＣＬ４Ｂ（Pharmacia Inc.、米
国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ、カタログ番
号：１７−０８１０−０１）疎水性相互作用カラム（５
ｃｍ×２０ｃｍ）を、１．５Ｍ NaCl を補充した緩衝液
Ｃで平衡化した。５．２３９Ｋｇの根の組織に相当す
る、８００ｍｌのプールの透明な４０〜６５％飽和度硫
酸アンモニウム画分を、上記の平衡化したフェニル−セ
ファロースカラムに注入した。２８０ｎｍ波長光の吸光
度の安定したベースラインが得られるまで（未結合のタ
ンパク質がすべて除去されたことを示す）、カラムを、
１．５Ｍ NaCl を補充した緩衝液Ｃで洗浄した。次に、
緩衝液Ｃ中１．５Ｍから０．０Ｍまで濃度が低下するNa
CLの線状勾配液２ｌでＰＭＴを溶離した。追加の緩衝液
Ｃ１ｌでさらにカラムを洗浄した。各々１２ｍｌずつの
画分を収集し、画分を（ＰＭＴ活性がピーク時およびそ
の前後では３画分毎に、その外の勾配液の画分では１０
画分毎に）、つぎのようにしてＰＭＴ活性を連続して検
定した。疎水性相互作用クロマトグラフィを、４℃にて
４．７ｍｌ／ｍｉｎの流速で実施した。
国、ニュージャージー州、ピスカタウエイ、カタログ番
号：１７−０８１０−０１）疎水性相互作用カラム（５
ｃｍ×２０ｃｍ）を、１．５Ｍ NaCl を補充した緩衝液
Ｃで平衡化した。５．２３９Ｋｇの根の組織に相当す
る、８００ｍｌのプールの透明な４０〜６５％飽和度硫
酸アンモニウム画分を、上記の平衡化したフェニル−セ
ファロースカラムに注入した。２８０ｎｍ波長光の吸光
度の安定したベースラインが得られるまで（未結合のタ
ンパク質がすべて除去されたことを示す）、カラムを、
１．５Ｍ NaCl を補充した緩衝液Ｃで洗浄した。次に、
緩衝液Ｃ中１．５Ｍから０．０Ｍまで濃度が低下するNa
CLの線状勾配液２ｌでＰＭＴを溶離した。追加の緩衝液
Ｃ１ｌでさらにカラムを洗浄した。各々１２ｍｌずつの
画分を収集し、画分を（ＰＭＴ活性がピーク時およびそ
の前後では３画分毎に、その外の勾配液の画分では１０
画分毎に）、つぎのようにしてＰＭＴ活性を連続して検
定した。疎水性相互作用クロマトグラフィを、４℃にて
４．７ｍｌ／ｍｉｎの流速で実施した。
【０１０６】ＰＭＴ活性を有するフェノール−セファロ
ース画分＃８６〜＃１１６をプールし、得られたプール
を絶えず撹拌しながら、９ｌの緩衝液Ｃに対して約１８
時間透析した。透析された試料を１００ｍｌずつの四つ
の部分に分けて−８０℃に冷却した。
ース画分＃８６〜＃１１６をプールし、得られたプール
を絶えず撹拌しながら、９ｌの緩衝液Ｃに対して約１８
時間透析した。透析された試料を１００ｍｌずつの四つ
の部分に分けて−８０℃に冷却した。
【０１０７】ＰＭＴ活性の検定 各反応管に以下のものを入れた。 １２．５ｎｍｏｌ トリス／HCl ８．３ ０．２５ｎｍｏｌ ＥＤＴＡ １．２５ｎｍｏｌ ２−メルカプトエタノール ０．９ｎｍｏｌ プトレッシン ０．１５ｎｍｏｌ 未標識Ｓ−アデノシルメチオニン ０．１８ｎｍｏｌ 〔14Ｃ−メチル〕Ｓ−アデノシルメチオニン （５７ｎＣｉ／ｎｍｏｌ） 酵素試料 ──────────────────── 合計容積＝０．２５ｍｌ
【０１０８】反応は酵素試料を添加することによって開
始され、３０℃にて３０分間行った。NaClで飽和した１
０％（Ｗ／Ｖ）NaOH溶液０．５ｍｌを添加することによ
って反応を停止させた。
始され、３０℃にて３０分間行った。NaClで飽和した１
０％（Ｗ／Ｖ）NaOH溶液０．５ｍｌを添加することによ
って反応を停止させた。
【０１０９】放射性生成物、Ｎ−〔14Ｃ−メチル〕プト
レッシンを、クロロホルムへの溶媒抽出によって、基質
から分離した。反応を停止させた混合物を１ｍｌのクロ
ロホルムとともに９０秒間旋回撹拌した後、１６００×
ｇａｖで５分間遠心分離して有機相と水相に分離させ
た。次に、有機相の０．５ｍｌを検定した。０．５ｍｌ
の有機相を９．５ｍｌの液体シンチレーションカクテル
（Beckman Instruments、米国、メリーランド州、コロ
ンビア）に添加し、放射能を液体シンチレーションカウ
ンターを用い標準の方法で測定した。
レッシンを、クロロホルムへの溶媒抽出によって、基質
から分離した。反応を停止させた混合物を１ｍｌのクロ
ロホルムとともに９０秒間旋回撹拌した後、１６００×
ｇａｖで５分間遠心分離して有機相と水相に分離させ
た。次に、有機相の０．５ｍｌを検定した。０．５ｍｌ
の有機相を９．５ｍｌの液体シンチレーションカクテル
（Beckman Instruments、米国、メリーランド州、コロ
ンビア）に添加し、放射能を液体シンチレーションカウ
ンターを用い標準の方法で測定した。
【０１１０】ＰＭＴ活性の１単位は、３０℃にて３０分
間に生成する生成物の１ナノモルと定義する。
間に生成する生成物の１ナノモルと定義する。
【０１１１】負の対照がすべての検定に含まれている。
負の対照は、酵素なしの反応混合物、または時間零の時
点でNaOHで反応を停止させた混合物で構成されている。
負の対照は、酵素なしの反応混合物、または時間零の時
点でNaOHで反応を停止させた混合物で構成されている。
【０１１２】アニオン交換クロマトグラフィ フェニル−セファロースで精製した１００ｍｌずつの二
つの試料を解凍し、次いで、４℃にて緩衝液Ｃで平衡化
したＤＥＡＥ−セファロース“Fast Flow ”カラム（Ph
armacia −LKB 、米国、ニュージャージー州、ピスカタ
ウエイ、カタログ番号：１７−０７０９−０１、ロット
番号：ＯＢ−０５８５４，１ｃｍ×１４．５ｃｍ）に、
４℃にて、１．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で注入した。
つの試料を解凍し、次いで、４℃にて緩衝液Ｃで平衡化
したＤＥＡＥ−セファロース“Fast Flow ”カラム（Ph
armacia −LKB 、米国、ニュージャージー州、ピスカタ
ウエイ、カタログ番号：１７−０７０９−０１、ロット
番号：ＯＢ−０５８５４，１ｃｍ×１４．５ｃｍ）に、
４℃にて、１．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で注入した。
【０１１３】次にＤＥＡＥ−セファロースカラムを、安
定した２８０ｎｍのベースラインが得られるまで、１０
ｍＭ NaCl を含有する緩衝液Ｃ７０ｍｌを用い、１．５
ｍｌ／ｍｉｎの流速で洗浄した。次にこのカラムを、Na
Clなしの緩衝液Ｃの５０ｍｌで再び平衡化した。次にカ
ラムの温度を室温（２４℃）まで上昇させ、カラムの空
隙容量を、５ｍＭプトレッシン（SigmaChemical Co.、
米国、ミズリー州、セントルイス、カタログ番号：Ｐ７
５０５、ロット番号：３９Ｆ００３９）含有緩衝液Ｃで
置換した。カラムを２４℃で約１時間、何も通過させず
に保持し、次いで５ｍＭプトレッシン含有緩衝液Ｃ６３
２ｍｌを用いて０．７ｍｌ／ｍｉｎ（１５時間）の流速
で２４℃にてＰＭＴを溶離した。
定した２８０ｎｍのベースラインが得られるまで、１０
ｍＭ NaCl を含有する緩衝液Ｃ７０ｍｌを用い、１．５
ｍｌ／ｍｉｎの流速で洗浄した。次にこのカラムを、Na
Clなしの緩衝液Ｃの５０ｍｌで再び平衡化した。次にカ
ラムの温度を室温（２４℃）まで上昇させ、カラムの空
隙容量を、５ｍＭプトレッシン（SigmaChemical Co.、
米国、ミズリー州、セントルイス、カタログ番号：Ｐ７
５０５、ロット番号：３９Ｆ００３９）含有緩衝液Ｃで
置換した。カラムを２４℃で約１時間、何も通過させず
に保持し、次いで５ｍＭプトレッシン含有緩衝液Ｃ６３
２ｍｌを用いて０．７ｍｌ／ｍｉｎ（１５時間）の流速
で２４℃にてＰＭＴを溶離した。
【０１１４】吸着によるＰＭＴの濃縮 ＤＥＡＥ−セファロースカラムから溶出させたＰＭＴ
を、ω−アミノヘキシル−セファロース４Ｂ（“ＡＨ
Ｓ”）（Sigma Chemical Co.、米国、ミズリー州、セン
トルイス、カタログ番号：Ａ８８９４）のカラム（１ｃ
ｍ×３ｃｍ）（４℃に保存した）に直接集めた。ＰＭＴ
を、上記ＡＨＳカラムから、１．５Ｍ NaClを含有する
緩衝液Ｃを用いて１．６ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶離し
た。１２〜１５ｍｌずつの四つの画分を収集し、上記の
ようにしてＰＭＴ活性を検定した。最初の画分（１４．
７ｍｌ）が、ＡＨＳ濃縮カラムから回収された全ＰＭＴ
活性の８０％以上を含有していた。
を、ω−アミノヘキシル−セファロース４Ｂ（“ＡＨ
Ｓ”）（Sigma Chemical Co.、米国、ミズリー州、セン
トルイス、カタログ番号：Ａ８８９４）のカラム（１ｃ
ｍ×３ｃｍ）（４℃に保存した）に直接集めた。ＰＭＴ
を、上記ＡＨＳカラムから、１．５Ｍ NaClを含有する
緩衝液Ｃを用いて１．６ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶離し
た。１２〜１５ｍｌずつの四つの画分を収集し、上記の
ようにしてＰＭＴ活性を検定した。最初の画分（１４．
７ｍｌ）が、ＡＨＳ濃縮カラムから回収された全ＰＭＴ
活性の８０％以上を含有していた。
【０１１５】限外濾過 さらに濃縮するために、１３．７ｍｌの最初のＡＨＳ画
分を六つの部分に分けて、“Centricon ３０”（Amico
n、米国、マサチューセッツ州、デンバーズ）限外濾過
装置に入れて約２５倍に濃縮した。６台の上記装置から
の濃縮液をプールし、塩を添加していない緩衝液Ｃで約
８０倍に希釈し、単一の“Centricon ３０”を用いて、
全容積が約１５０μｌになるまで第２回の限外濾過を行
った。得られた１５０μｌの濃縮液を−８０℃で貯蔵し
た。
分を六つの部分に分けて、“Centricon ３０”（Amico
n、米国、マサチューセッツ州、デンバーズ）限外濾過
装置に入れて約２５倍に濃縮した。６台の上記装置から
の濃縮液をプールし、塩を添加していない緩衝液Ｃで約
８０倍に希釈し、単一の“Centricon ３０”を用いて、
全容積が約１５０μｌになるまで第２回の限外濾過を行
った。得られた１５０μｌの濃縮液を−８０℃で貯蔵し
た。
【０１１６】分取等電点焦点化電気泳動 ＤＥＡＥ／ＡＨＳ工程（限外濾過法による濃縮を含む）
で精製したＰＭＴを、等電点焦点化電気泳動法でさらに
精製した。分取規模の等電点焦点化電気泳動法を、スク
ロース密度勾配液中（１．６ｃｍ×２１ｃｍ）で市販の
両性電解質（Pharmacia-LKB 、米国、ニュージャージー
州、ピスカタウエイ）を使って実施した。ｐＨ勾配液は
両性電解質の販売者の説明書にしたがって作製し、ｐＨ
の範囲を約５．３〜約６．３とした。１０００〜４００
０ボルトの電圧を印加して（１〜４ワットの電力）、約
３時間焦点化を行った。焦点化を行った後、１ｍｌずつ
の画分を集め、各画分のｐＨとＰＭＴの活性を測定し
た。焦点化と画分の収集は４℃で行った。
で精製したＰＭＴを、等電点焦点化電気泳動法でさらに
精製した。分取規模の等電点焦点化電気泳動法を、スク
ロース密度勾配液中（１．６ｃｍ×２１ｃｍ）で市販の
両性電解質（Pharmacia-LKB 、米国、ニュージャージー
州、ピスカタウエイ）を使って実施した。ｐＨ勾配液は
両性電解質の販売者の説明書にしたがって作製し、ｐＨ
の範囲を約５．３〜約６．３とした。１０００〜４００
０ボルトの電圧を印加して（１〜４ワットの電力）、約
３時間焦点化を行った。焦点化を行った後、１ｍｌずつ
の画分を集め、各画分のｐＨとＰＭＴの活性を測定し
た。焦点化と画分の収集は４℃で行った。
【０１１７】図４は、等電点焦点化電気泳動を行った後
の、ＰＭＴ相対活性とｐＨ対画分番号（すなわちスクロ
ース密度勾配の位置）の双対グラフである。図４に示す
実験データは、タバコＰＭＴの等電点が約５．７である
ことを示している。他の等電点焦点化電気泳動の実験で
は、タバコＰＭＴのＰＩは、５．０という低い値と５．
８という高い値を示すようである。実際には、多くの因
子が見掛けのＰＩに影響して、ＰＩの測定値は通常いく
らか変動することは、当該技術分野の熟練者ならば分か
るであろう。
の、ＰＭＴ相対活性とｐＨ対画分番号（すなわちスクロ
ース密度勾配の位置）の双対グラフである。図４に示す
実験データは、タバコＰＭＴの等電点が約５．７である
ことを示している。他の等電点焦点化電気泳動の実験で
は、タバコＰＭＴのＰＩは、５．０という低い値と５．
８という高い値を示すようである。実際には、多くの因
子が見掛けのＰＩに影響して、ＰＩの測定値は通常いく
らか変動することは、当該技術分野の熟練者ならば分か
るであろう。
【０１１８】精製工程の連続した段階におけるＰＭＴの
相対純度を比活性の測定値で評価した（表１）。表１に
示す精製度値（倍）は、タバコの根の粗製抽出液からの
実際の精製度の過小評価値である。なぜならば４０〜６
５％飽和度硫酸アンモニウムによる画分を、活性収率を
計算する際に１００％としているからである。
相対純度を比活性の測定値で評価した（表１）。表１に
示す精製度値（倍）は、タバコの根の粗製抽出液からの
実際の精製度の過小評価値である。なぜならば４０〜６
５％飽和度硫酸アンモニウムによる画分を、活性収率を
計算する際に１００％としているからである。
【０１１９】 表 １ ─────────────────────────────────── 工程の段階 全タンパク質 比 活 性 活性収率 精製度 （ｍｇ） （単位／ｍｇ） （％） （倍） ─────────────────────────────────── 硫酸アンモニウム 4128* 47.9 100.0 1.0 フェニル−セファロース 680 134.6 46.3 2.8 ＤＥＡＥ／ＡＨＳ 1.76** 5203 7.7** 108.6 ─────────────────────────────────── * 四つの別個の粗製抽出液由来の４０〜６５％飽和度硫
酸アンモニウムによる画分のプール。 ** フェニル−セファロースカラム由来の物質の１／２
だけを示す。
酸アンモニウムによる画分のプール。 ** フェニル−セファロースカラム由来の物質の１／２
だけを示す。
【０１２０】また、この発明の方法の連続した段階にお
けるＰＭＴの相対純度を、標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した。図１は、ＰＭＴ精製工程の各段階において試
料が（銀染色時に）示すＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質バ
ンドパターンを示す。ゲル上の試料は次のとおりであ
る。レーン１と６：分子量基準タンパク質（後記の図面
の簡単な説明の欄に列挙した）；レーン２：４０〜６５
％飽和度硫酸アンモニウムによる画分；レーン３：フェ
ニル−セファロースカラム由来のＰＭＴ活性がピークの
画分；レーン４：ＤＥＡＥ／ＡＨＳ段階由来の濃縮物
質；レーン５：ＤＥＡＥ／ＡＨＳ段階由来の濃縮物質を
等電点焦点化電気泳動させたもののＰＭＴ活性がピーク
の画分。ＤＥＡＥ／ＡＨＳで精製された物質（レーン
４）で支配的なＰＭＴバンド（矢印で示す）が、前出の
疎水性相互作用の段階由来の物質（レーン３）中にはほ
とんど目視できないことが分かる。
けるＰＭＴの相対純度を、標準のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で
測定した。図１は、ＰＭＴ精製工程の各段階において試
料が（銀染色時に）示すＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質バ
ンドパターンを示す。ゲル上の試料は次のとおりであ
る。レーン１と６：分子量基準タンパク質（後記の図面
の簡単な説明の欄に列挙した）；レーン２：４０〜６５
％飽和度硫酸アンモニウムによる画分；レーン３：フェ
ニル−セファロースカラム由来のＰＭＴ活性がピークの
画分；レーン４：ＤＥＡＥ／ＡＨＳ段階由来の濃縮物
質；レーン５：ＤＥＡＥ／ＡＨＳ段階由来の濃縮物質を
等電点焦点化電気泳動させたもののＰＭＴ活性がピーク
の画分。ＤＥＡＥ／ＡＨＳで精製された物質（レーン
４）で支配的なＰＭＴバンド（矢印で示す）が、前出の
疎水性相互作用の段階由来の物質（レーン３）中にはほ
とんど目視できないことが分かる。
【０１２１】タバコＰＭＴの分子量 タバコＰＭＴの見掛けの分子量を、硫酸アンモニウム、
フェニル−セファロース、およびＤＥＡＥ−ＡＨＳ／限
外濾過の精製段階を通過したＰＭＴ物質を注入した非変
性の電気泳動ゲル上でＰＭＴを単離した実験で測定し
た。非変性濃縮用ゲルの緩衝液は、０．２７Ｍトリス／
HCl （ｐＨ６．８）、１０％（Ｖ／Ｖ）グリセリンおよ
び２０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有してい
た。非変性１２．５％ポリアクリルアミド分離用ゲル緩
衝液は０．３８Ｍトリス／HCl （ｐＨ８．８）、１０％
（Ｖ／Ｖ）グリセリン、および１２ｍＭの２−メルカプ
トエタノールを含有していた。
フェニル−セファロース、およびＤＥＡＥ−ＡＨＳ／限
外濾過の精製段階を通過したＰＭＴ物質を注入した非変
性の電気泳動ゲル上でＰＭＴを単離した実験で測定し
た。非変性濃縮用ゲルの緩衝液は、０．２７Ｍトリス／
HCl （ｐＨ６．８）、１０％（Ｖ／Ｖ）グリセリンおよ
び２０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含有してい
た。非変性１２．５％ポリアクリルアミド分離用ゲル緩
衝液は０．３８Ｍトリス／HCl （ｐＨ８．８）、１０％
（Ｖ／Ｖ）グリセリン、および１２ｍＭの２−メルカプ
トエタノールを含有していた。
【０１２２】非変性ゲル由来の単一のレーンを切取り、
長さ方向に１／２に切断し、次いで３ｍｍ厚のスライス
に切断した。各ゲルスライスの１／２を、標準のＰＭＴ
検定混合物に直接入れ、各ゲルスライスの対応する１／
２をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。
長さ方向に１／２に切断し、次いで３ｍｍ厚のスライス
に切断した。各ゲルスライスの１／２を、標準のＰＭＴ
検定混合物に直接入れ、各ゲルスライスの対応する１／
２をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。
【０１２３】最高のＰＭＴ活性を示した非変性ゲルスラ
イス（図２）は、特に、見掛けの分子量が約６０ＫＤの
単一タンパク質を含有していた（図３）。
イス（図２）は、特に、見掛けの分子量が約６０ＫＤの
単一タンパク質を含有していた（図３）。
【０１２４】ＰＭＴの酵素活性 基質特異性試験を、この発明の高度に精製したタバコＰ
ＭＴについて行った。１，３−ジアミノプロパンと１，
５−ジアミノペンタン（いずれもプトレッシンの化学的
類似体）、ホスファチジルエタノールアミン（メチル基
受容体）およびＮ−メチルプトレッシン（ＰＭＴの通常
の産生物）をＰＭＴに対する基質として働く性能につい
て、プトレッシン（１，４−ジアミノブタン）と比較し
た。１，３−ジアミノプロパン、１，５−ジアミノペン
タンおよびホスファチジルエタノールアミンを、標準の
ＰＭＴ検定法（上記の検定法）でプトレッシンの代わり
に用いた場合、検出可能な量の放射性産生物は生成しな
かった。ＰＭＴの検定に、Ｎ−メチルプトレッシンをプ
トレッシンの代わりに用いた場合、放射性産生物の生成
は、プトレッシンで観察したときの６％以下であった。
ＭＴについて行った。１，３−ジアミノプロパンと１，
５−ジアミノペンタン（いずれもプトレッシンの化学的
類似体）、ホスファチジルエタノールアミン（メチル基
受容体）およびＮ−メチルプトレッシン（ＰＭＴの通常
の産生物）をＰＭＴに対する基質として働く性能につい
て、プトレッシン（１，４−ジアミノブタン）と比較し
た。１，３−ジアミノプロパン、１，５−ジアミノペン
タンおよびホスファチジルエタノールアミンを、標準の
ＰＭＴ検定法（上記の検定法）でプトレッシンの代わり
に用いた場合、検出可能な量の放射性産生物は生成しな
かった。ＰＭＴの検定に、Ｎ−メチルプトレッシンをプ
トレッシンの代わりに用いた場合、放射性産生物の生成
は、プトレッシンで観察したときの６％以下であった。
【０１２５】二つのＰＭＴの基質、すなわちプトレッシ
ンとＳ−アデノシルメチオニンの見掛けのＫｍ値を他の
基質を過剰に存在させながら、一つの基質の各種の律速
濃度で（上記のようにして）ＰＭＴ活性を測定すること
によって決定した。軽度に精製したタバコＰＭＴのプト
レッシンについてのＫｍは約４００μＭであった。高度
に精製したタバコＰＭＴのＳ−アデノシルメチオニンに
ついてのＫｍは約１２５μＭであった。軽度に精製され
たタバコＰＭＴによってプトレッシンについて見出され
たＫｍ値と、高度に精製されたタバコＰＭＴによってＳ
−アデノシルメチオニンについて見出されたＫｍ値は、
ＰＭＴについて発表された値とよく一致している（Mizu
saki等の前記文献；Feth等、“Determination of Putre
scine N-methyltransferase By High Performance Liqu
id Chromatography ”、Phytochemistry、２４巻、９２
１〜９２３頁、１９８５年）。
ンとＳ−アデノシルメチオニンの見掛けのＫｍ値を他の
基質を過剰に存在させながら、一つの基質の各種の律速
濃度で（上記のようにして）ＰＭＴ活性を測定すること
によって決定した。軽度に精製したタバコＰＭＴのプト
レッシンについてのＫｍは約４００μＭであった。高度
に精製したタバコＰＭＴのＳ−アデノシルメチオニンに
ついてのＫｍは約１２５μＭであった。軽度に精製され
たタバコＰＭＴによってプトレッシンについて見出され
たＫｍ値と、高度に精製されたタバコＰＭＴによってＳ
−アデノシルメチオニンについて見出されたＫｍ値は、
ＰＭＴについて発表された値とよく一致している（Mizu
saki等の前記文献；Feth等、“Determination of Putre
scine N-methyltransferase By High Performance Liqu
id Chromatography ”、Phytochemistry、２４巻、９２
１〜９２３頁、１９８５年）。
【０１２６】アミノ末端アミノ酸配列の分析 配列分析用のタバコＰＭＴは、硫酸アンモニウムによる
分画、フェニル−セファロースクロマトグラフィ、プト
レッシンで溶離するＤＥＡＥセファロースクロマトグラ
フィ（次いでＡＨＳと限外濾過で濃縮を行う）、および
フリーフロー等電点焦点化電気泳動法の精製工程にかけ
た物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に付することによって単
離した。高度に精製したＰＭＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付
した後、得られたタンパク質のバンドをポリ二フッ化ビ
ニリデンの膜（“Immobilon ”、Millipore 、米国、マ
サチューセッツ州、ベッドフォード）上にエレクトロブ
ロットを行い、次いでアミドブラックを用い、標準方法
で視覚化した。“ａ１”バンド（図５参照）を有する膜
片は、タバコＰＭＴの分子量特性を示す高度に精製され
た製剤の二つだけのバンド（図３参照）の一つである
が、これを、隣接する“ａ２”バンドをさけて切取っ
た。このようにして単離したＰＭＴについて、メーカー
が推薦する方法にしたがって、オンライン１２０Ａ分析
計（パルス液相シークエンサー）を備えたApplied Bios
ystems ４７７Ａ型を用いてアミノ末端アミノ酸配列分
析を行った。
分画、フェニル−セファロースクロマトグラフィ、プト
レッシンで溶離するＤＥＡＥセファロースクロマトグラ
フィ（次いでＡＨＳと限外濾過で濃縮を行う）、および
フリーフロー等電点焦点化電気泳動法の精製工程にかけ
た物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に付することによって単
離した。高度に精製したＰＭＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥに付
した後、得られたタンパク質のバンドをポリ二フッ化ビ
ニリデンの膜（“Immobilon ”、Millipore 、米国、マ
サチューセッツ州、ベッドフォード）上にエレクトロブ
ロットを行い、次いでアミドブラックを用い、標準方法
で視覚化した。“ａ１”バンド（図５参照）を有する膜
片は、タバコＰＭＴの分子量特性を示す高度に精製され
た製剤の二つだけのバンド（図３参照）の一つである
が、これを、隣接する“ａ２”バンドをさけて切取っ
た。このようにして単離したＰＭＴについて、メーカー
が推薦する方法にしたがって、オンライン１２０Ａ分析
計（パルス液相シークエンサー）を備えたApplied Bios
ystems ４７７Ａ型を用いてアミノ末端アミノ酸配列分
析を行った。
【０１２７】タバコＰＭＴの“ａ１”バンドのアミノ末
端における最初の１７のアミノ酸の配列は、（配列番号
１）：Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｘａａ Ａｓｎ ＰｈｅＬｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｘ
ａａ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｕであることが分かった。
端における最初の１７のアミノ酸の配列は、（配列番号
１）：Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｘａａ Ａｓｎ ＰｈｅＬｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｘ
ａａ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｕであることが分かった。
【０１２８】“ａ２”バンド（図５参照）は、タバコＰ
ＭＴの分子量を示す二つだけのバンドの２番目のもので
あった（図３参照）。“ａ２”バンド（図５）を作り
“ａ１”バンドと同様にして分析したところ、“ａ２”
バンドは、以下の部分アミノ酸配列（配列番号２）：Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈ
ｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｕを生成した。
ＭＴの分子量を示す二つだけのバンドの２番目のもので
あった（図３参照）。“ａ２”バンド（図５）を作り
“ａ１”バンドと同様にして分析したところ、“ａ２”
バンドは、以下の部分アミノ酸配列（配列番号２）：Ｌ
ｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈ
ｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ
Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｕを生成した。
【０１２９】この発明のいくつかの態様を説明してきた
が、基本的な構造を変えてこの発明の方法と生成物を利
用する他の態様を提供することができることは明らかで
ある。それ故に、この発明の範囲は、実施例として示し
た特定の態様ではなく特許請求の範囲によって定義され
るべきであることが分かる。
が、基本的な構造を変えてこの発明の方法と生成物を利
用する他の態様を提供することができることは明らかで
ある。それ故に、この発明の範囲は、実施例として示し
た特定の態様ではなく特許請求の範囲によって定義され
るべきであることが分かる。
【０１３０】配 列 表 (1) 配列番号：１ (i) 配列の特性： (A) 長さ：１７アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (iii)ハイポセティカル：Ｎ (v) フラグメント型：Ｎ末端フラグメント (vi) 起源： (A) 生物名：ニコチアナ・タバクム (B) 株名：バーレイ２１ (F) 組織の種類：根 (2) 配列番号：２ (i) 配列の特性： (A) 長さ：１７アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (iii)ハイポセティカル：Ｎ (v) フラグメント型：Ｎ末端フラグメント (vi) 起源： (A) 生物名：ニコチアナ・タバクム (B) 株名：バーレイ２１ (F) 組織の種類：根 (3) 配列番号：３ (i) 配列の特性： (A) 長さ：１７アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：タンパク質 (iii)ハイポセティカル：Ｎ (v) フラグメント型：Ｎ末端フラグメント (vi) 起源： (A) 生物名：ニコチアナ・タバクム (B) 株名：バーレイ２１ (F) 組織の種類：根
【図１】図１は、タバコＰＭＴの精製工程の連続段階で
得られたタンパク質のパターンを示す、銀染色１２．５
％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真の複写物であ
る。レーン１と６：分子量基準タンパク質（ホスホリラ
ーゼＢ、９５．５ＫＤ；グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、５５．０ＫＤ；オボアルブミン、４３．０ＫＤ；乳
酸デヒドロゲナーゼ、３６．０ＫＤ；カルボニックアン
ヒドラーゼ、２９．０ＫＤ；ラクトグロブリン、１８．
４ＫＤ；シトクロムＣ、１２．４ＫＤ）。レーン２：４
０〜６５％飽和度硫酸アンモニウム画分。レーン３：疎
水性相互作用カラム由来のＰＭＴ活性ピーク画分。レー
ン４：アニオン交換カラムからプトレッシンで溶離して
濃縮した物質。レーン５：アニオン交換カラム由来の濃
縮物質のフリーフロー等電点焦点化電気泳動によって得
られたＰＭＴ活性ピーク画分。
得られたタンパク質のパターンを示す、銀染色１２．５
％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真の複写物であ
る。レーン１と６：分子量基準タンパク質（ホスホリラ
ーゼＢ、９５．５ＫＤ；グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ、５５．０ＫＤ；オボアルブミン、４３．０ＫＤ；乳
酸デヒドロゲナーゼ、３６．０ＫＤ；カルボニックアン
ヒドラーゼ、２９．０ＫＤ；ラクトグロブリン、１８．
４ＫＤ；シトクロムＣ、１２．４ＫＤ）。レーン２：４
０〜６５％飽和度硫酸アンモニウム画分。レーン３：疎
水性相互作用カラム由来のＰＭＴ活性ピーク画分。レー
ン４：アニオン交換カラムからプトレッシンで溶離して
濃縮した物質。レーン５：アニオン交換カラム由来の濃
縮物質のフリーフロー等電点焦点化電気泳動によって得
られたＰＭＴ活性ピーク画分。
【図２】図２は、１２．５％非変性ポリアクリルアミド
ゲル由来の３ｍｍ厚連続スライスのＰＭＴ活性を示すグ
ラフであり、そのゲルには、アニオン交換カラムからプ
トレッシンで溶離して濃縮した物質をロードした。ＰＭ
Ｔの酵素活性は、生成物として回収された14Ｃ壊変数／
分（バックグランド上）として表現し、“相対活性”と
命名してある。
ゲル由来の３ｍｍ厚連続スライスのＰＭＴ活性を示すグ
ラフであり、そのゲルには、アニオン交換カラムからプ
トレッシンで溶離して濃縮した物質をロードした。ＰＭ
Ｔの酵素活性は、生成物として回収された14Ｃ壊変数／
分（バックグランド上）として表現し、“相対活性”と
命名してある。
【図３】図３は、非変性電気泳動ゲルのＰＭＴ活性のバ
ンドおよびその前後の３ｍｍ厚連続スライス（図２）が
純度と見掛けの分子量について分析された、銀染色１
２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真の複写
物である。“Ｓｍ”と命名されているレーンは出発物質
（すなわち非変性ゲルに添加された物質）を含有してい
る。“Ｓｔｄ”と命名したレーンは、分子量基準タンパ
ク質（ホスホリラーゼＢ、９５．５ＫＤ；グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ、５５．０ＫＤ；オボアルブミン、４
３．０ＫＤ；乳酸デヒドロゲナーゼ、３６．０ＫＤ；カ
ルボニックアンヒドラーゼ、２９．０ＫＤ；ラクトグロ
ブリン、１８．４ＫＤ；シトクロムＣ、１２．４ＫＤ）
を含有している。
ンドおよびその前後の３ｍｍ厚連続スライス（図２）が
純度と見掛けの分子量について分析された、銀染色１
２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真の複写
物である。“Ｓｍ”と命名されているレーンは出発物質
（すなわち非変性ゲルに添加された物質）を含有してい
る。“Ｓｔｄ”と命名したレーンは、分子量基準タンパ
ク質（ホスホリラーゼＢ、９５．５ＫＤ；グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ、５５．０ＫＤ；オボアルブミン、４
３．０ＫＤ；乳酸デヒドロゲナーゼ、３６．０ＫＤ；カ
ルボニックアンヒドラーゼ、２９．０ＫＤ；ラクトグロ
ブリン、１８．４ＫＤ；シトクロムＣ、１２．４ＫＤ）
を含有している。
【図４】図４は、硫酸アンモニウム分画法、疎水性相互
作用クロマトグラフィ、およびアニオン交換カラムから
のプトレッシンによる溶離に続いて試料を濃縮すること
によって精製したタバコＰＭＴを等電点焦点化電気泳動
させることによって得られた画分の相対ＰＭＴ活性とｐ
Ｈを画くグラフである。ＰＭＴの酵素活性は、生成物と
して回収された14Ｃ壊変数／分（バックグランド上）と
して表現し、“相対活性”と命名してある。
作用クロマトグラフィ、およびアニオン交換カラムから
のプトレッシンによる溶離に続いて試料を濃縮すること
によって精製したタバコＰＭＴを等電点焦点化電気泳動
させることによって得られた画分の相対ＰＭＴ活性とｐ
Ｈを画くグラフである。ＰＭＴの酵素活性は、生成物と
して回収された14Ｃ壊変数／分（バックグランド上）と
して表現し、“相対活性”と命名してある。
【図５】図５は、（不活性膜にエレクトロブロットした
後）切取り、アミノ酸配列の決定を行ったＰＭＴタンパ
ク質バンド（“ａ１”と“ａ２”）を示す銀染色１２．
５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真の複写物で
ある。ゲルにロードした試料は、アニオン交換カラムか
らプトレッシンで溶離された物質を等電点焦点化電気泳
動させて得た画分の一部分である。配列分析に用いられ
た実際のバンドは、図５のゲルで分析されたのと同じ物
質の一部をロードした別個の（しかし同じ）ポリアクリ
ルアミドゲル由来のものである。
後）切取り、アミノ酸配列の決定を行ったＰＭＴタンパ
ク質バンド（“ａ１”と“ａ２”）を示す銀染色１２．
５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの写真の複写物で
ある。ゲルにロードした試料は、アニオン交換カラムか
らプトレッシンで溶離された物質を等電点焦点化電気泳
動させて得た画分の一部分である。配列分析に用いられ
た実際のバンドは、図５のゲルで分析されたのと同じ物
質の一部をロードした別個の（しかし同じ）ポリアクリ
ルアミドゲル由来のものである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１２月６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/11 15/54 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヴエドパル・エス・マリク アメリカ合衆国ヴアージニア州23236、リ ツチモンド、テイーベリイ、ドライヴ 2714
Claims (23)
- 【請求項１】 Ｓ−アデノシルメチオニンのメチル基
を、プトレッシンのδ−アミノ基へ転移させる反応を触
媒する性能を特徴とし、その外のタバコタンパク質を実
質的に含有していないタバコタンパク質。 - 【請求項２】 さらに、(a) 分子量が５０〜６５キロダ
ルトン、(b) 未変性等電点がｐＨ５．０〜６．０、(c)
プトレッシンについてのＫｍが３００〜５００μＭ、お
よび(d) Ｓ−アデノシルメチオニンについてのＫｍが１
００〜１５０μＭであることを特徴とする請求項１記載
のタバコタンパク質。 - 【請求項３】 配列番号１、配列番号２、または配列番
号３で定義されるアミノ酸配列を含有する請求項２記載
のタバコタンパク質。 - 【請求項４】 (a) プトレッシンＮ−メチルトランスフ
ェラーゼがアニオン交換媒体に保持されるような、添加
温度およびタバコ抽出液のｐＨと化学組成で、タバコ抽
出液をアニオン交換媒体に加え、ならびに(b) ポリアミ
ンを含有していなければ、プトレッシンＮ−メチルトラ
ンスフェラーゼがアニオン交換媒体に保持されるよう
な、溶離温度および溶離緩衝液のｐＨおよび化学組成
で、有効量のポリアミンを含有する溶離緩衝液で、プト
レッシンＮ−メチルトランスフェラーゼをアニオン交換
媒体から溶離する、ことを特徴とする、プトレッシンＮ
−メチルトランスフェラーゼをタバコ植物抽出液から精
製する方法。 - 【請求項５】 ポリアミンが、プトレッシン、Ｎ−メチ
ルプトレッシン、スペルミン、スペルミジン、アグマチ
ン、カダベリンまたはその混合物である請求項４記載の
方法。 - 【請求項６】 アニオン交換媒体が、ジエチルアミノエ
チル、ポリエチレンイミノ、第三級アミノ、第四級アミ
ノ、ｐ−アミノベンジルおよびジエチル−（２−ヒドロ
キシプロピル）アミノエチルから選択される一つ以上の
機能部分をもっている請求項４または５に記載の方法。 - 【請求項７】 機能部分がジエチルアミノエチルで、ア
ニオン交換媒体が好ましくはジエチルアミノエチルアガ
ロースである請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 (a) 添加温度が２〜１０℃で好ましくは
４〜８℃であり、(b) 抽出液のｐＨが７．２〜８．３で
好ましくは約７．５であり、および(c) 抽出液が、(i)
有効量の緩衝剤、(ii) 有効量の還元剤、(iii)有効量の
水活性変性剤および(iv) 有効量の重金属キレート化剤
を、含有している請求項４記載の方法。 - 【請求項９】 (a) 溶離温度が１８〜２６℃、(b) 溶離
緩衝液のｐＨが７．２〜８．３で好ましくは約７．５で
あり、(c) さらに溶離緩衝液が、(i) 有効量の緩衝剤、
(ii) 有効量の還元剤、(iii)有効量の水活性変性剤およ
び(iv) 有効量の重金属キレート化剤を、含有している
請求項４記載の方法。 - 【請求項１０】 (i) 約１０ｍＭのトリス−（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン、(ii) 約２ｍＭジチオトレイ
トール、(iii)約２０％（Ｖ／Ｖ）のグリセリンおよび
(iv) 約１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を、抽出液が
含有する請求項８記載の方法、または上記４成分を溶離
緩衝液が含有する請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 ポリアミンがプトレッシンであり、溶
離緩衝液中０．５〜５０ｍＭの量で存在している請求項
９または１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 プトレッシンが、溶離緩衝液中約５ｍ
Ｍの量で存在している請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 アニオン交換媒体溶離緩衝液の存在下
でプトレッシンＮ−メチルトランスフェラーゼに対して
親和性を有するクロマトグラフィ媒体に、溶出液を直接
添加し、次いで結合した物質をクロマトグラフィ媒体か
ら溶離することによってアニオン交換溶出液を濃縮する
工程をさらに有する請求項４記載の方法。 - 【請求項１４】 前記クロマトグラフィ媒体がω−アミ
ノヘキシルアガロースである請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項１，２または３に記載のタバコ
タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項１６】 さらに、作動可能に連結された調節配
列を含有し、タバコタンパク質をコードする配列がセン
ス配向である請求項１５記載の組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項１７】 請求項１６の組換えＤＮＡ分子がコー
ドするｍＲＮＡと雑種を形成するＤＮＡをコードするア
ンチセンス組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項１８】 請求項１６のセンス組換えＤＮＡ分子
を含有するベクター。 - 【請求項１９】 請求項１７のアンチセンス組換えＤＮ
Ａ分子を含有するベクター。 - 【請求項２０】 請求項１５，１６または１７の組換え
ＤＮＡ分子で安定に形質転換された培養トランスジェニ
ックタバコ細胞。 - 【請求項２１】 請求項１８または１９のベクターで安
定に形質転換された培養トランスジェニックタバコ細
胞。 - 【請求項２２】 未形質転換の対照タバコ植物よりニコ
チン含量が高いことを特徴とする、請求項１５もしくは
１６記載の組換えＤＮＡ分子または請求項１８記載のベ
クターで安定に形質転換されたトランスジェニックタバ
コ植物。 - 【請求項２３】 未形質転換の対照タバコ植物よりニコ
チン含量が低いことを特徴とする、請求項１５もしくは
１７記載の組換えＤＮＡ分子または請求項１９記載のベ
クターで安定に形質転換されたトランスジェニックタバ
コ植物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US613160 | 1990-11-14 | ||
| US07/613,160 US5260205A (en) | 1990-11-14 | 1990-11-14 | Method of purifying putrescine N-methyltransferase from tobacco plant extract with a polyamine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0584075A true JPH0584075A (ja) | 1993-04-06 |
Family
ID=24456121
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3326531A Pending JPH0584075A (ja) | 1990-11-14 | 1991-11-13 | プトレツシンｎ−メチルトランスフエラーゼ、プトレツシンｎ−メチルトランスフエラーゼをコードする組換えｄｎａ分子、およびニコチン含量が変化したトランスジエニツクタバコ植物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5260205A (ja) |
| EP (1) | EP0486214A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0584075A (ja) |
| KR (1) | KR920009843A (ja) |
| BR (1) | BR9104965A (ja) |
| TR (1) | TR27504A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021531021A (ja) * | 2018-07-26 | 2021-11-18 | アルトリア クライアント サーヴィシーズ リミテッド ライアビリティ カンパニー | 変化したアルカロイドレベルを有するタバコ植物および製品を産生するためのｐｍｔ操作に基づく組成物および方法 |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5260205A (en) * | 1990-11-14 | 1993-11-09 | Philip Morris Incorporated | Method of purifying putrescine N-methyltransferase from tobacco plant extract with a polyamine |
| EP0701614A1 (en) * | 1993-06-01 | 1996-03-20 | Philip Morris Products Inc. | Putrescine n-methyltransferase, recombinant dna molecules encoding putrescine n-methyltransferase, and transgenic tobacco plants with decreased alkaloid content |
| US7361331B2 (en) * | 1996-10-18 | 2008-04-22 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food | Plant bioreactors |
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