JPH0585560B2 - - Google Patents
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- JPH0585560B2 JPH0585560B2 JP59063089A JP6308984A JPH0585560B2 JP H0585560 B2 JPH0585560 B2 JP H0585560B2 JP 59063089 A JP59063089 A JP 59063089A JP 6308984 A JP6308984 A JP 6308984A JP H0585560 B2 JPH0585560 B2 JP H0585560B2
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Description
本発明は蛋白質をポリスチレン表面に不可逆的
に結合させる方法、この方法によつてえられたポ
リスチレン表面ならびにその使用法に関するもの
である。 酵素、抗体、抗原の如き生物学的に活性な蛋白
質の固定（immoblizatior）には種々の目的に、
たとえば、酵素反応器、親和性クロマトグラフイ
ー、免疫吸着、固相分離を有するリガンド測定な
どに広い用途がある。 特別な用途は不均質な系における相分離のため
の免疫測定（例えばRIA，ELISA等）の分野に
おける固定された抗原と抗体のそれである。不均
質免疫測定の系には一乃至数工程あり、それによ
り分析物（analyte）又は試薬の結合及び非結合
部分の間の分離が達成される。この結合は抗原抗
体反応にある。 一定の結合パートナー（測定の抗体又は特定の
抗原）が滑らかな巨視的表面に反応性の形で不可
逆的に固定されれば、必要な分離を優雅に実施す
ることができる。この固定は例えば反応容器の内
壁上で又は反応液によつて被覆されているビーズ
上で実施することができる。 顕微鏡的に分散された表面（例えばラテツク
ス）によつて必要な例えば遠心分離又は過によ
る機械的な分離を避けるには、そして粘着する反
応液の量（これは例えばゲルのような多孔質な物
質では高い）を減少するには滑らかな巨視的な表
面が好ましい。 蛋白質で吸収しうるように被覆されたポリスチ
レン表面は固相分離免疫測定法に広い用途があ
る。 ポリスチレンには次のような利点がある。 − 価格が安い。 − 明瞭で透明である。 − いろいろな種類の反応容器やビーズを商業的
に入手することができる。 吸着性被覆の主な利点は簡単なことである。適
当な濃度の蛋白質溶液を蛋白質吸着条件下に一定
時間例えば３〜16時間プラスチツク表面と接触さ
せ、その後蛋白質溶液を除去し表面を洗浄する。
その収率は固定された蛋白質の60％以下であり、
密度は１cm2あり蛋白質1μgのオーダーである。簡
単な被覆の利点は使用上の難点と対比される。も
つと弱い結合蛋白質では、十分な密度の被覆はか
なり過剰の蛋白質を用いたときのみ達成される。
固定は測定条件下（即ち、望ましくないつづく吸
着を防ぐため他の蛋白質又はTween20の存在下）
に可逆的であるか、又は固定された（出血する）
蛋白質の損失が観察され、これは測定を阻害す
る。 プラスチツク表面に共有結合を導入することに
よつて吸着性固定のこれら難点を克服する試みが
ある。種々の方法が記載されており、これはカツ
プリング剤としてグルタールジアルデヒドを用い
ている。そこに含まれる機構、特に観察される改
良がプラスチツク物質に関連してグルタールジア
ルデヒドを組み入れたためかどうか、又はこれら
が分子間の架橋による蛋白質の生物学的に活性な
整合（conformation）の安定化によつて生ずる
かどうかは確認されていない。 加えて蛋白質の吸着性結合を改良するためにポ
リスチレン物質のＹ−照射（コバルト安定化）が
用いられているが、これは商業的に入手しうる物
質の価格をかなり上げる。 従つて、本発明の目的は蛋白質をその生物学的
活性を保ちつつポリスチレン表面に不可逆的に結
合させるための簡単で低価格の方法を提供するこ
とである。 この目的は、 ａ ポリスチレン表面を一般式
に結合させる方法、この方法によつてえられたポ
リスチレン表面ならびにその使用法に関するもの
である。 酵素、抗体、抗原の如き生物学的に活性な蛋白
質の固定（immoblizatior）には種々の目的に、
たとえば、酵素反応器、親和性クロマトグラフイ
ー、免疫吸着、固相分離を有するリガンド測定な
どに広い用途がある。 特別な用途は不均質な系における相分離のため
の免疫測定（例えばRIA，ELISA等）の分野に
おける固定された抗原と抗体のそれである。不均
質免疫測定の系には一乃至数工程あり、それによ
り分析物（analyte）又は試薬の結合及び非結合
部分の間の分離が達成される。この結合は抗原抗
体反応にある。 一定の結合パートナー（測定の抗体又は特定の
抗原）が滑らかな巨視的表面に反応性の形で不可
逆的に固定されれば、必要な分離を優雅に実施す
ることができる。この固定は例えば反応容器の内
壁上で又は反応液によつて被覆されているビーズ
上で実施することができる。 顕微鏡的に分散された表面（例えばラテツク
ス）によつて必要な例えば遠心分離又は過によ
る機械的な分離を避けるには、そして粘着する反
応液の量（これは例えばゲルのような多孔質な物
質では高い）を減少するには滑らかな巨視的な表
面が好ましい。 蛋白質で吸収しうるように被覆されたポリスチ
レン表面は固相分離免疫測定法に広い用途があ
る。 ポリスチレンには次のような利点がある。 − 価格が安い。 − 明瞭で透明である。 − いろいろな種類の反応容器やビーズを商業的
に入手することができる。 吸着性被覆の主な利点は簡単なことである。適
当な濃度の蛋白質溶液を蛋白質吸着条件下に一定
時間例えば３〜16時間プラスチツク表面と接触さ
せ、その後蛋白質溶液を除去し表面を洗浄する。
その収率は固定された蛋白質の60％以下であり、
密度は１cm2あり蛋白質1μgのオーダーである。簡
単な被覆の利点は使用上の難点と対比される。も
つと弱い結合蛋白質では、十分な密度の被覆はか
なり過剰の蛋白質を用いたときのみ達成される。
固定は測定条件下（即ち、望ましくないつづく吸
着を防ぐため他の蛋白質又はTween20の存在下）
に可逆的であるか、又は固定された（出血する）
蛋白質の損失が観察され、これは測定を阻害す
る。 プラスチツク表面に共有結合を導入することに
よつて吸着性固定のこれら難点を克服する試みが
ある。種々の方法が記載されており、これはカツ
プリング剤としてグルタールジアルデヒドを用い
ている。そこに含まれる機構、特に観察される改
良がプラスチツク物質に関連してグルタールジア
ルデヒドを組み入れたためかどうか、又はこれら
が分子間の架橋による蛋白質の生物学的に活性な
整合（conformation）の安定化によつて生ずる
かどうかは確認されていない。 加えて蛋白質の吸着性結合を改良するためにポ
リスチレン物質のＹ−照射（コバルト安定化）が
用いられているが、これは商業的に入手しうる物
質の価格をかなり上げる。 従つて、本発明の目的は蛋白質をその生物学的
活性を保ちつつポリスチレン表面に不可逆的に結
合させるための簡単で低価格の方法を提供するこ
とである。 この目的は、 ａ ポリスチレン表面を一般式
【化】
（式中R1は水素原子、ハロゲン原子、アル
キル基、アルコキシ基又はニトロ基を表わし、
R2は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基を
表わし、Ｘはハロゲンイオン又はテトラフルオ
ロポレートイオンを表わす） のビスジアゾニウム化合物で前処理すると、 ｂ このように処理された表面につづいて蛋白質
を吸着させること によつて達成される。 アルキル基又はアルコキシ基は１〜４炭素原子
を有するものであり、メチルとメトキシが好まし
い。ハロゲン原子は臭素、塩素とフツ素であり、
塩素が好ましい。好ましいビスジアゾニウム化合
物は一般式ａ
キル基、アルコキシ基又はニトロ基を表わし、
R2は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基を
表わし、Ｘはハロゲンイオン又はテトラフルオ
ロポレートイオンを表わす） のビスジアゾニウム化合物で前処理すると、 ｂ このように処理された表面につづいて蛋白質
を吸着させること によつて達成される。 アルキル基又はアルコキシ基は１〜４炭素原子
を有するものであり、メチルとメトキシが好まし
い。ハロゲン原子は臭素、塩素とフツ素であり、
塩素が好ましい。好ましいビスジアゾニウム化合
物は一般式ａ
【化】
（式中R1aは水素原子、メチル基又はメトキシ
基を表わし、R2aは水素原子又はメチル基を表わ
し、Ｘはハロゲンイオン又はテトラフルオロボレ
ートイオンを表わす） を有するものである。 好ましい式ａの化合物はR1aがメトキシ基、
R2aがハロゲン原子、ＸがＣ-又はBF4 -を表わ
すものである。 又このビスジアゾニウム化合物又はａは他
の商業的に入手しうる形、例えば錯体の形で用い
ることができる。 ポリスチレン表面はある一定の形で存在しう
る。例えば、反応容器として、試験管、ビーカ
ー、キュベツト、カラム、微量滴定
（microtiter）、微量試験（microtest）の板とし
て又は部品として例えばビーズ、ロツド、デイス
ク又はプレートとして存在することができる。か
かるポリスレン表面は当業者には周知であり、容
易に入手することがきる。 前処理（活性化）は前処理条件下、例えば約−
５乃至約＋30℃、好ましくは４〜10℃の温度で実
施され、活性化時間は約５乃至60分である。ビス
ジアゾニウム化合物の典型的な濃度は、好ましく
はPH６〜８の緩衝液中で約10-5乃至10-1モル／
の間である。安定化のためNaC，KI又は
NaIO4のような適当な塩を安定化量添加すること
ができる。 つづいて蛋白質を吸着する前に、ポリスチレン
表面を緩衝液及び／又は水で洗浄することによつ
て未反応のビスジアゾニウム化合物から清浄に
される。吸着は活性化の直後又はタイムラグをお
いて実施される。 つづく蛋白質の吸着は、蛋白質吸着条件下に、
たとえば約10-9〜10-3ｇ／ml、好ましくは10-6〜
10-4ｇ／mlの濃度でPH６〜８の緩衝液に溶解した
蛋白質を約１〜72時間保温することによつて実施
される。任意の蛋白質、例えば抗体、抗原、ハプ
テン蛋白質接合体、抗体結合蛋白質、例えばブド
ウ状球菌の蛋白質Ａ又は補体成分C1q、酵素、レ
クチンを用いることができる。 吸着された（固定された）蛋白質を有するポリ
スチレン表面は吸着直後又は貯蔵後所望の目的に
用いることができる。 ポリスチレン表面の活性化は蛋白質の実際的に
不可逆な結合をもたらし、これによりたとえば免
疫測定（出血せず）において感度の向上、物質消
費量の低下が可能となる。この活性化は、特につ
づいて乾燥工程が実施されるとき、吸着された蛋
白質の安定化をもたらす。 ポリスチレン物質は活性化後又は蛋白質吸着後
又はキツトの形で市販することができる。キツト
の形で市販されるならば、これにはポリスチレン
物質の外に、試験管又は微量試験板、他の通常の
成分、例えば、標識抗体やマーカーのための検出
試剤、たとえば色素産生（chromogenic）基質が
含まれる。 ビスジアゾニウム化合物はよく知られてお
り、周知の方法で相当するベンジジンから調整さ
れる。（Houben−Weyl，Methoden der
organischen Chemie，Georg Thieme Verlag
Stuttgart，Vol.10／３，pp.1−212，esp.46；
Ullmanns Enzyklopadie der technischen
Chemie，4.Auflage Verlag Chemie
Weinheim，Vol.8，p.356 ff.） 以下の実施例は本発明を説明するためのもので
あり、何ら本発明を限定するものではない。温度
は℃で与えられている。 一般的実施法 １ ポリスチレン表面を、PH６，８，0.01モル／
のリン酸ナトリウム緩衝液中0.001モル／
のFBS（BF4）2（FBS＝フアストブルーＢ塩＝
ビス−ジアゾ化０−ジアニジン）溶液で30分間
4°で、直射光線からの保護の下、完全に被覆す
る。FBS溶液を除去し、ポリスチレン物質を
0.01モル／リン酸ナトリウム緩衝液で３回洗
浄する。 ２ 蛋白質吸着 上記１によつて前処理されたポリスチレン物質
を、PH６，８，0.01モル／リン酸ナトリウム緩
衝液中の所望の蛋白質（被覆されるべき表面の平
方センチメートルあたり最大2μｇの蛋白質）の
溶液又は懸濁液で16時間４℃に保温する。この蛋
白質溶液は除去され、弱く結合した蛋白質は0.1
％Tween20（ポリソルベート20＝ポリオキシエチ
レン20ソルビタンモノラウレート）を含有するリ
ン酸ナトリウム緩衝液で１時間保温することによ
つて除去される。 特定例 １ 125標識Ｙ−グロブリン（ヤギから
140000epm／ug蛋白質）をA.2により未処理ポ
リスチレン管（11×65，Greiner.ドイツ）と
A.1により前処理された同じ管として、被覆し
た。FBSとＹ−グロブリン溶液の容積は各１
mlであり、Ｙ−グロブリンは、漸次変化した濃
度の範囲：１；0.5，0.25，０，125，0.0625及
び0.03125μｇ／mlで適用された。 得られた結果を第１表に示す。
基を表わし、R2aは水素原子又はメチル基を表わ
し、Ｘはハロゲンイオン又はテトラフルオロボレ
ートイオンを表わす） を有するものである。 好ましい式ａの化合物はR1aがメトキシ基、
R2aがハロゲン原子、ＸがＣ-又はBF4 -を表わ
すものである。 又このビスジアゾニウム化合物又はａは他
の商業的に入手しうる形、例えば錯体の形で用い
ることができる。 ポリスチレン表面はある一定の形で存在しう
る。例えば、反応容器として、試験管、ビーカ
ー、キュベツト、カラム、微量滴定
（microtiter）、微量試験（microtest）の板とし
て又は部品として例えばビーズ、ロツド、デイス
ク又はプレートとして存在することができる。か
かるポリスレン表面は当業者には周知であり、容
易に入手することがきる。 前処理（活性化）は前処理条件下、例えば約−
５乃至約＋30℃、好ましくは４〜10℃の温度で実
施され、活性化時間は約５乃至60分である。ビス
ジアゾニウム化合物の典型的な濃度は、好ましく
はPH６〜８の緩衝液中で約10-5乃至10-1モル／
の間である。安定化のためNaC，KI又は
NaIO4のような適当な塩を安定化量添加すること
ができる。 つづいて蛋白質を吸着する前に、ポリスチレン
表面を緩衝液及び／又は水で洗浄することによつ
て未反応のビスジアゾニウム化合物から清浄に
される。吸着は活性化の直後又はタイムラグをお
いて実施される。 つづく蛋白質の吸着は、蛋白質吸着条件下に、
たとえば約10-9〜10-3ｇ／ml、好ましくは10-6〜
10-4ｇ／mlの濃度でPH６〜８の緩衝液に溶解した
蛋白質を約１〜72時間保温することによつて実施
される。任意の蛋白質、例えば抗体、抗原、ハプ
テン蛋白質接合体、抗体結合蛋白質、例えばブド
ウ状球菌の蛋白質Ａ又は補体成分C1q、酵素、レ
クチンを用いることができる。 吸着された（固定された）蛋白質を有するポリ
スチレン表面は吸着直後又は貯蔵後所望の目的に
用いることができる。 ポリスチレン表面の活性化は蛋白質の実際的に
不可逆な結合をもたらし、これによりたとえば免
疫測定（出血せず）において感度の向上、物質消
費量の低下が可能となる。この活性化は、特につ
づいて乾燥工程が実施されるとき、吸着された蛋
白質の安定化をもたらす。 ポリスチレン物質は活性化後又は蛋白質吸着後
又はキツトの形で市販することができる。キツト
の形で市販されるならば、これにはポリスチレン
物質の外に、試験管又は微量試験板、他の通常の
成分、例えば、標識抗体やマーカーのための検出
試剤、たとえば色素産生（chromogenic）基質が
含まれる。 ビスジアゾニウム化合物はよく知られてお
り、周知の方法で相当するベンジジンから調整さ
れる。（Houben−Weyl，Methoden der
organischen Chemie，Georg Thieme Verlag
Stuttgart，Vol.10／３，pp.1−212，esp.46；
Ullmanns Enzyklopadie der technischen
Chemie，4.Auflage Verlag Chemie
Weinheim，Vol.8，p.356 ff.） 以下の実施例は本発明を説明するためのもので
あり、何ら本発明を限定するものではない。温度
は℃で与えられている。 一般的実施法 １ ポリスチレン表面を、PH６，８，0.01モル／
のリン酸ナトリウム緩衝液中0.001モル／
のFBS（BF4）2（FBS＝フアストブルーＢ塩＝
ビス−ジアゾ化０−ジアニジン）溶液で30分間
4°で、直射光線からの保護の下、完全に被覆す
る。FBS溶液を除去し、ポリスチレン物質を
0.01モル／リン酸ナトリウム緩衝液で３回洗
浄する。 ２ 蛋白質吸着 上記１によつて前処理されたポリスチレン物質
を、PH６，８，0.01モル／リン酸ナトリウム緩
衝液中の所望の蛋白質（被覆されるべき表面の平
方センチメートルあたり最大2μｇの蛋白質）の
溶液又は懸濁液で16時間４℃に保温する。この蛋
白質溶液は除去され、弱く結合した蛋白質は0.1
％Tween20（ポリソルベート20＝ポリオキシエチ
レン20ソルビタンモノラウレート）を含有するリ
ン酸ナトリウム緩衝液で１時間保温することによ
つて除去される。 特定例 １ 125標識Ｙ−グロブリン（ヤギから
140000epm／ug蛋白質）をA.2により未処理ポ
リスチレン管（11×65，Greiner.ドイツ）と
A.1により前処理された同じ管として、被覆し
た。FBSとＹ−グロブリン溶液の容積は各１
mlであり、Ｙ−グロブリンは、漸次変化した濃
度の範囲：１；0.5，0.25，０，125，0.0625及
び0.03125μｇ／mlで適用された。 得られた結果を第１表に示す。
【表】
FBS前処理なしのときの被覆収率は約65％，
FBS前処理したときのそれは約60％であつた。
両方の被覆された管を１時間、生理食塩水中
Tween20の0.1％溶液で保温すると、FBS前処
理なしの管の被覆収率は約20％に低下し、前処
理した管では実際上変化せずにとどまつた。 ２ B.1によつて未処理及びFBS前処理ポリスチ
レン管をテオフイリン抗血清（ウサギから、管
あたり１ml、希釈度１：36000）で被覆した。
この管をつづいて１時間PH７，４，0.01モル／
のリン酸カリウム緩衝液中１％のポリビニル
アルコール（低分子量型）溶液で洗浄した。被
覆した管を、１時間室温で0.1％ゼラチン、0.9
％Nacと0.03％１−アニリノ−ナフタレン−
８−スルホン酸マグネシウムを含有し、PH７，
４，0.01モル／リン酸カリウム緩衝液中テオ
フイリン−ペルオキシダーゼ接合体（10-7ｇ／
ml、西洋わさびペルオキシダーゼ１分子当り約
２分子のラオフイリン）の溶液各１mlで保温し
た。つづいて低温タツプ水で３回洗浄した。PH
５，６，0.1モル／トリスアセテート緩衝液
中に0.33mg／mlのＯ−フエニレンジアミンと
0.05mg／mlH2O2を含む１mlの溶液で室温に20
分間管を保温することによつて抗体結合酵素活
性の測定が行なわれた。この反応は１モル／
硫酸１mlの添加によつて停止した。492での光
学濃度を光学的に測定した。結果は未処理の管
では0.129，FBS前処理した管では0.944であつ
た。 ３ (a) B.1に従つて、未処理及びFBS前処理ポ
リスチレン微量滴定板を、種々の希釈度のス
トレプトリジン−０調整液（0.131mg／ml蛋
白質、約4000IU／mg蛋白質）の0.1ml／カツ
プで被覆した。 １：２希釈シリーズ（容積0.1ml／カツプ）
の抗−ストレプトリジン標準血清（Behring
−Werke，Marburg，10IU／ml）が、希釈
剤として0.1％Tween20を有するPH７，８，
0.1モル／トリス−HC緩衝液を用いて、
別々に被覆された微量滴定板でつくられた。
この板を30分間37℃に保温し、血清希釈物を
除去し、板を低温タツプ水で１回洗浄した。
各カツプに、抗−HuIgG−ベルオキシダー
ゼ接合体（西洋わさびペルオキシダーゼにカ
ツプリングされたヒトIgGに対するウサギ
IgG）の2ug／mlを含む滴液0.1mlを加え、30
分間37℃に保温した。接合体溶液の除去後、
その板を低温タツプ水で３回洗浄した。免疫
吸着によつて固定されたペルオキシダーゼ活
性検出のため、基質混合物（PH５，0.1モ
ル／トリスサイトレート緩衝液中0.16mg／
ml０−トリジン，0.05mg／mlH2O2）のカツ
プ当り0.1mlを加えて30分間室温に保養した。
評価のためなお青い色を生成する最高の血清
希釈度を確認した。 結果を第２表に示す。
FBS前処理したときのそれは約60％であつた。
両方の被覆された管を１時間、生理食塩水中
Tween20の0.1％溶液で保温すると、FBS前処
理なしの管の被覆収率は約20％に低下し、前処
理した管では実際上変化せずにとどまつた。 ２ B.1によつて未処理及びFBS前処理ポリスチ
レン管をテオフイリン抗血清（ウサギから、管
あたり１ml、希釈度１：36000）で被覆した。
この管をつづいて１時間PH７，４，0.01モル／
のリン酸カリウム緩衝液中１％のポリビニル
アルコール（低分子量型）溶液で洗浄した。被
覆した管を、１時間室温で0.1％ゼラチン、0.9
％Nacと0.03％１−アニリノ−ナフタレン−
８−スルホン酸マグネシウムを含有し、PH７，
４，0.01モル／リン酸カリウム緩衝液中テオ
フイリン−ペルオキシダーゼ接合体（10-7ｇ／
ml、西洋わさびペルオキシダーゼ１分子当り約
２分子のラオフイリン）の溶液各１mlで保温し
た。つづいて低温タツプ水で３回洗浄した。PH
５，６，0.1モル／トリスアセテート緩衝液
中に0.33mg／mlのＯ−フエニレンジアミンと
0.05mg／mlH2O2を含む１mlの溶液で室温に20
分間管を保温することによつて抗体結合酵素活
性の測定が行なわれた。この反応は１モル／
硫酸１mlの添加によつて停止した。492での光
学濃度を光学的に測定した。結果は未処理の管
では0.129，FBS前処理した管では0.944であつ
た。 ３ (a) B.1に従つて、未処理及びFBS前処理ポ
リスチレン微量滴定板を、種々の希釈度のス
トレプトリジン−０調整液（0.131mg／ml蛋
白質、約4000IU／mg蛋白質）の0.1ml／カツ
プで被覆した。 １：２希釈シリーズ（容積0.1ml／カツプ）
の抗−ストレプトリジン標準血清（Behring
−Werke，Marburg，10IU／ml）が、希釈
剤として0.1％Tween20を有するPH７，８，
0.1モル／トリス−HC緩衝液を用いて、
別々に被覆された微量滴定板でつくられた。
この板を30分間37℃に保温し、血清希釈物を
除去し、板を低温タツプ水で１回洗浄した。
各カツプに、抗−HuIgG−ベルオキシダー
ゼ接合体（西洋わさびペルオキシダーゼにカ
ツプリングされたヒトIgGに対するウサギ
IgG）の2ug／mlを含む滴液0.1mlを加え、30
分間37℃に保温した。接合体溶液の除去後、
その板を低温タツプ水で３回洗浄した。免疫
吸着によつて固定されたペルオキシダーゼ活
性検出のため、基質混合物（PH５，0.1モ
ル／トリスサイトレート緩衝液中0.16mg／
ml０−トリジン，0.05mg／mlH2O2）のカツ
プ当り0.1mlを加えて30分間室温に保養した。
評価のためなお青い色を生成する最高の血清
希釈度を確認した。 結果を第２表に示す。
【表】
３ (b) 被覆法のあとに乾燥工程（0.1ミリバー
ルの減圧下室温で３時間）を行えば差異が一
層顕著であり、これは長期の貯蔵に有利であ
る。 第３表は３(a)（ストレプトリジン希釈度
１：80標準血清及び患者血清に与えられる最
高の正希釈度（posittive dilution）によつ
てえられた結果を示している。活性化された
板がより良好に働いたこと見出される。
ルの減圧下室温で３時間）を行えば差異が一
層顕著であり、これは長期の貯蔵に有利であ
る。 第３表は３(a)（ストレプトリジン希釈度
１：80標準血清及び患者血清に与えられる最
高の正希釈度（posittive dilution）によつ
てえられた結果を示している。活性化された
板がより良好に働いたこと見出される。
【表】
４ B.1に従つて、処理されない又はFBS処理さ
れたポリスチレン微量滴定板を（ドイツ、ザー
ル大学、H.Mauch博士によつて予めつくられ
た）モニリア菌の糖蛋白質0.01mg／mlを含有す
る１カツプ当り0.1mlの溶液で被覆した。 以下に示す血清試料をPH７，８，0.1％
Tween20を含む0.1モル／トリスHC緩衝
液中に１：4600の希釈度で希めた液をつくり、
被覆された板に１カツプ当り0.1mlで１時間室
温で保温した。 血清Ａ：モニリア菌に対し低い抗体濃度の健全
な基本者 血清Ｂ：健全な供与者からプールされた血清 血清Ｃ：モニリア菌に対し高い抗体濃度を有す
る患者血清 血清Ｄ：モニリア菌に対し高い抗体濃度を有す
る患者血清 血清を除去した後、板を一度低温タツプ水で洗
浄した。各カツプに0.1μｇ／の抗HuIgG−ペル
オキシダーゼ接合体（西洋わさびペルオキシダー
ゼに組合わさされたヒトIgGに対するウサギIgG）
を含有する0.1mlの溶液を添加し、１時間室温に
保温した。接合体溶液除去受、板を３回低温タツ
プ水で洗浄した。免疫吸着によつて固定されたペ
ルオキシダーゼ活性を検出するためカツプ当り
0.1mlの基質混合物（PH５，0.1モル／トリスサ
イトレート緩衝液中の0.1mg／ml３，3′，５，5′−
テトラメチルベンジジン、0.06mg／mlH2O2）を
添加し、30分間室温に保温した。１モル／硫酸
１モル／カツプを添加して反応を停止し、455mm
での吸着をKontron SLT210微量滴定板リーダで
光学的に測定した。 その結果を第４表に示す。
れたポリスチレン微量滴定板を（ドイツ、ザー
ル大学、H.Mauch博士によつて予めつくられ
た）モニリア菌の糖蛋白質0.01mg／mlを含有す
る１カツプ当り0.1mlの溶液で被覆した。 以下に示す血清試料をPH７，８，0.1％
Tween20を含む0.1モル／トリスHC緩衝
液中に１：4600の希釈度で希めた液をつくり、
被覆された板に１カツプ当り0.1mlで１時間室
温で保温した。 血清Ａ：モニリア菌に対し低い抗体濃度の健全
な基本者 血清Ｂ：健全な供与者からプールされた血清 血清Ｃ：モニリア菌に対し高い抗体濃度を有す
る患者血清 血清Ｄ：モニリア菌に対し高い抗体濃度を有す
る患者血清 血清を除去した後、板を一度低温タツプ水で洗
浄した。各カツプに0.1μｇ／の抗HuIgG−ペル
オキシダーゼ接合体（西洋わさびペルオキシダー
ゼに組合わさされたヒトIgGに対するウサギIgG）
を含有する0.1mlの溶液を添加し、１時間室温に
保温した。接合体溶液除去受、板を３回低温タツ
プ水で洗浄した。免疫吸着によつて固定されたペ
ルオキシダーゼ活性を検出するためカツプ当り
0.1mlの基質混合物（PH５，0.1モル／トリスサ
イトレート緩衝液中の0.1mg／ml３，3′，５，5′−
テトラメチルベンジジン、0.06mg／mlH2O2）を
添加し、30分間室温に保温した。１モル／硫酸
１モル／カツプを添加して反応を停止し、455mm
での吸着をKontron SLT210微量滴定板リーダで
光学的に測定した。 その結果を第４表に示す。
【表】
５ ヒト血清中のストレプトリジン−０に対する
抗体測定用キツト このキツトは次のものからなる： ａ 抗体被覆反応容器として働く、本発明に係
るストレプトリジン−０被覆微量滴定板 ｂ （必要により凍結乾燥された）ヒトIgGに
対するウサギIgGとホースラデイツシユペル
オキシダーゼの接合体溶液 ｃ ペルオキシダーゼ反応用PH５の0.1モル／
トリスサイトレート緩衝液 ｄ ペルオキシダーゼ反応の色原体として働く
ジメチルスルホキシド中３，3′，５，5′−テ
トラメチルベンジジン既成溶液（0.19mg／
ml） ｅ ペペルオキシダーゼ反応用過酸化水素溶液
（３％） ｆ 血清試料と抗体−ペルオキシダーゼ接合体
用希釈剤として働く、PH７，８，0.1％
Tween20含有0.1モル／トリスHC緩衝
液。
抗体測定用キツト このキツトは次のものからなる： ａ 抗体被覆反応容器として働く、本発明に係
るストレプトリジン−０被覆微量滴定板 ｂ （必要により凍結乾燥された）ヒトIgGに
対するウサギIgGとホースラデイツシユペル
オキシダーゼの接合体溶液 ｃ ペルオキシダーゼ反応用PH５の0.1モル／
トリスサイトレート緩衝液 ｄ ペルオキシダーゼ反応の色原体として働く
ジメチルスルホキシド中３，3′，５，5′−テ
トラメチルベンジジン既成溶液（0.19mg／
ml） ｅ ペペルオキシダーゼ反応用過酸化水素溶液
（３％） ｆ 血清試料と抗体−ペルオキシダーゼ接合体
用希釈剤として働く、PH７，８，0.1％
Tween20含有0.1モル／トリスHC緩衝
液。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ａ 巨視的なポリスチレン表面を下記一般式
（） 【化】 （式中、R1は水素原子、ハロゲン原子、ア
ルキル基、アルコシキ基またはニトロ基、R2
は水素原子、ハロゲン原子またはアルキル基、
Ｘはアニオンを示す）のビスジアゾニウム化合
物で、ビスジアゾニウム化合物処理条件下に処
理する工程と、 ｂ 工程ａ）の後、蛋白質を、蛋白質吸着条件下
にポリスチレン表面に吸着させる工程を含む、
蛋白質をポリスチレン表面に不可逆的に結合さ
せる方法。 ２ 前記式（）中、各R1は窒素原子に対して
オルト位にあつて、水素原子、メチル基またはメ
トキシ基であり、各R2は窒素原子に対してオル
ト位にあつて、水素原子またはメチル基であり，
Ｘはハロゲンイオンまたはテトラフルオロボレー
トイオン（BF4 -）である特許請求の範囲第１項
記載の方法。 ３ 前記式（）中、R1はメトキシ基、R2は水
素原子、ＸはC1-またはBF4 -である特許請求の範
囲第２項記載の方法。 ４ ビスジアゾニウム化合物は錯体の形をとつて
いる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 前記蛋白質は、抗体、抗原、ハプテン蛋白質
結合体、抗体結合蛋白質、酵素またはレクチンで
ある特許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3311889.2 | 1983-03-31 | ||
| DE19833311889 DE3311889A1 (de) | 1983-03-31 | 1983-03-31 | Verfahren zur irreversiblen bindung von protein an polystyroloberflaechen unter erhaltung der biologischen aktivitaet, so erhaltene polystyroloberflaechen und ihre verwendung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6035000A JPS6035000A (ja) | 1985-02-22 |
| JPH0585560B2 true JPH0585560B2 (ja) | 1993-12-07 |
Family
ID=6195287
Family Applications (1)
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