JPS587561A - 酵素免疫分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ある物質を含有すると推定される媒体中のそ
の物質の存在を決定しあるいは定量するための酵素免疫
分析法に関する。

酵素免疫分析法はさまざまなテクニックが既知であり、
それらの中にはその存在を検出すべき抗体または抗原と
酵素が結合される方法も含まれている。酵素免疫分析法
特に均質酵素免疫分析法痕Ｕ、に、特許出ｄ４ｔｒ号２
，０４３．２４５　Ａにおいて概括されている。この特
定の荷許出顧は一酵素とその＃Ａに対する非可逆的阻害
剤が存在し、その非可逆的酵素阻害剤が検出されるべき
配位子の類似物質に摺合されてその抱合体がその酵素と
反応して共有結合を形成することができ、その共有結合
が酵素の構造を変化させることによって非可逆的にその
酵素活性を阻害するような均質酵素免疫分析に関するも
のである。検出されるべき配位子に結合ｏＴ能な結合蛋
白砧よび配位子抱合体もまた存在するがその抱合体は結
合蛋白に結合された時不活性化される。検出されるべき
配位子の量は、抱合体と結合蛋白の間の結合に影響を及
ぼし、したがってその抱合体が酵素の活性に対してもつ
作用をもたらす。酵素活性をそこで測定し、配位子の存
在しない時の活性と比較し存在する配位子量を定量する
。

ＩＦＫＢＳ　１ｅｔｔｅｒｓ第１６巻、１９８０年７月
の２８５画から２８８頁もまたそのようなシステムを記
載しているが、更に、同じ原理上で慟〈均質＃素免疫シ
ステムのいくつかの代りをも示唆している。しかしなが
ら、これらは例証されていない。

そのようなシステムは、野性型−大腸−β−ガラクトシ
ダーゼに対する抗体のごとき酵素活性化剤の使用を含む
ことができると示唆されている。

本発明は、不活性酵素の活性化に基き、その酵素の活性
化の度合がそこに存在する物質量に左右されるような存
在すると信じられるある物質の定量のための一新規均質
酵素免疫分析法に関するものである。

従って本発明はある物質を含有すると推定される媒体中
のその物質の存在を決定し、あるいは定量するための一
方法を提供し、その方法は、ａ）　　’！質的に不活性
の酵素を活性化し得る抗体と結合した物質から成る抱合
体、その物質に特異的な結合蛋白あるいは抗体、および
実質的に不活性の酵素の過剰と媒体とを共に混合し、そ
の構成成分の添加の順序は、媒体中のいかなる物質も、
その物質忙特異的な結合蛋臼または抗体と反応する機会
をもつまでにその酵素が抱合体と混合されないように添
加してゆく。

ｂ）酵素に対する基質を加えその酵素活性を測定する ことからなる。

一つの好ましい具体例として、本発明は、ａ）媒体をそ
の物質に特異的な結合蛋白または抗体を実質的に不活性
の酵素の過剰との混合物に添加し、 ｂ）実質的に不活性の酵素を活性化し得る抗体に結合し
た物質から成る抱合体を加え、そして Ｃ）その酵素に対する基質を加え、酵素の活性を定量す
る ことからなる、ある物質を含有すると推定される媒体中
のその物質の存在を決定しまたは定量するための一方法
を提供する。

更に好ましい実施例として、本発明は（ａｌ実質的に不
活性の酵素を活性化し得る抗体に結合した物に特異的な
結合蛋白または抗体を加え、（Ｃ１実質的に不活性の酵
素の過剰を加え、（（１）酵素に対する基質を加えてそ
の酵素活性を定量することからなる、ある物質を含有す
ると推定されるある媒体中のその物質の存在の決定また
は定量のための一方法を提供している。

望ましくは、実質的に不活性の酵素を活性化し得る抗体
は単クローン性抗体である。

その物質に特異的な結合蛋白あるいは抗体は、その物質
が抱合されていない時または活性化抗体に抱合されてい
る時、その物質に結合することができる。その物質に特
異的な抗体または結合蛋白が抱合体に結合される時、こ
れは観察される酵素活性化のレベルを減少させる。抗体
を標準技法で精製してあれば適当でありたとえば硫酸ア
ンモニウムを用いる沈澱化を含む分画化とそれに続くイ
オン交換セルローズ上でのカラムクロマトグラフィによ
り精製する。この精製された抗体は実質的に他の蛋白質
を含まぬ状態すなわち他の蛋白の含量が１０優より少な
いことが過当である。

実質的に不活性の酵素を活性化し得る更にもう一つの抗
体を、酵素を他の成分のいずれかに添加する前にその＃
索と混合することが適切である。

実質的に不活性の酵素とは、活性化された時にその活性
がβ−ガラクトシダーゼの活性の１０憾より小さく、適
切には５張より小さく、好ましくは１優より小さいβ−
がラクトシダーゼの不活性変異株のごとき酵素を意味し
ている。そのよりなβ−がラクトシダーゼの変異型は大
腸菌の突体変異株の培養によって調製するのが望ましい
。

大腸菌の突然変異株培養により作られた実質的に不活性
のβ−がラクトシダーゼの多くのタイプは不安定である
ことが発見されている。実質的に不活性のβ−ガラクト
シダーゼの多くのタイプは背景に高いノイズを生ずるこ
と、すなわち活性化抗体の存在なしに基質と混合された
時、発色反応をおこすことも発見された。したがって当
該方法の甲に含むに適する実質的に不活性のβ−ガラク
トシダーゼは安定なもの（すなわち数ケ月にわたつに活
性化される能力を保持し何分間もの間、直線的な反応を
触媒する）であって重大な背景のノイズを生じないもの
である。β−がラクトシダーゼの特に通するタイプはに
、ｃｏｌｉのＷＭ　２９８株すなわちＡ１１ｅｌｅ　：
　ｌａｃ　ａｂａ　（５２７，−ｒ　７　クスブランク
研究所のＷ、１ｌｌｅｓｓｅｒ博士１Ｂｅｒｌｉｎ　３
３（ＤＡＨＩＪＭ）。

工ｈｎｅｓｔｒａｇｓｅ　６６−７３から得られた一株
からつくられる。

この技法で用いられる活性化率クローン性抗体は、免疫
グロブリンの断片もまた用いられるけれども無傷のまま
の免疫グロブリンであることが適当である。試験される
べき物質に特異的な抗体もしくは結合蛋白は望ましくは
高力価の多クローン性抗体がまたはこの物質に特異的な
単クローン性抗体である。

本発明は血清、血漿、を髄液、そして尿のような生物学
的液体中の物質の測定に特に適した方法に関する。本発
明の方法により検出し定量するのに適した物質はホルモ
ン、蛋白質、ビタミン、毒物、薬品または薬品の代ｍｉ
ｉ物を含む。本発明の方法は医学的Ｋ１１ｌｌｌな物質
の検出に特に適している・そのような物質はステロイド
、Ｃりｊン、蛋白質および蛋白質の断片、葉酸、セロト
ニン、プロスタグランディ／、アドレナリン、ノルアド
レナリン、阿片、テオフィリ／、シランチン、パルピッ
レート、アミノグリコシド抗生物質、アシクロヴイルそ
して抗ヴイルス剤である。望ましくは、その物質は抗て
んかん剤、抗生物質、抗ヴイルス剤、ホルモンまたは蛋
白質である。この方法は、ジフェニル　ヒダントイン、
コルチゾール、アシクロヴイル、フイブリノーゲンそし
てフイデリノーｒノ分解童物りの定量ｔｃＩＫ便利であ
ることが発見された。本発明の方法は、蛋白質および蛋
白質の断片のような高分子量の物質すなわち１０，００
０から、ｉ、、ｏ　ｏ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏの関め物質の検
出に適しているということは、特に’ｌＮ＜べきことで
あシ、有駒なことであると考えられる。

定型されるべき物質は、通常１ナノモル以上の濃度で存
在するであろう。コルチゾールの場合には４０ナノモル
以上の濃度、アシクロヴイルの場合には２５０ナノモル
以上の濃度、ジフェニルヒ／ントインの場合には１０マ
イクロモル以上の濃度、フイブリノーゲンとフイブリノ
ーゲンの分解産物りの場合には６０ナノモル以上の濃度
が適尚である。

その物質と、実質的に不活性の酵素を活性化しうる抗体
とから成る抱合体は、尚業者にとり曳く知られた伝統的
な方法によって調製される。その物質は通常の架橋基に
よって抗体に結合されるであろう。コルチゾール、アシ
クはヴイルそしてジフェニル　ヒダントインに対して共
に、４１に適切な方法は、これらの配位子中へカルギン
酸基を導入し、次に単りロー／性抗体の適切な基へ容易
に結合するＮ−ヒドロキシ　サクシェミド　エステルへ
と変換させることであった。フィデリノーｒノ分解産物
ＤＪＣ対しては、特Ｆｃ遁幽な方法はＤ断片中に像映さ
れたチオール基な導入し、マレイばド残基な単クローン
性抗体中に導入し、それからチオール残基から保護グル
ープを除去してこの２つの蛋白質を容易にカップリング
させるように混合することであった。その他の適切な抱
合方法は、Ｋａｂａｋｏｆｆによって酵素免疫分析Ｃ，
Ｒ，Ｃ１Ｐｒｏｍｓ。

Ｈ，Ｔ、　Ｍａｇｇｉｏ編集１９８０．７１−１０４の
中に概括されている。

ギ発明の分析は、通常では−の４囲５から１０まで望ま
しくは約−７，４で水性液体媒体中で実施されるであろ
う。本分析は−を約−１０にまで上ケＩｃＤＴＡのよう
なマグネシウムに対するキレート化剤を加え、コール酸
ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウムのような
脂質可溶化剤を加えることにより停止させるのが便宜で
ある。アルカノールかポリオールがその水性液体媒体中
に存在することが望ましい。メタノール、エタンジオー
ル、プロパン−１，２−ジオール、マンニトール、フル
ビトールおよびＤ−アラビトールはこの水性媒体中に含
有させるのに特に適して−る。、璽〈べきことにはＤ−
アラビトールはメタノールの作用機序とは異なり、それ
に附加的なある機序によって分析の感度を増加させ同時
に分析の実施に要する時間の長さを減少させることが発
見された。本発明の方法の実施中液体媒体の温度は通常
１０℃から４５℃の間であり、３７℃であると都合がよ
い。

適切な免疫学的反応をおこさせるためには、すなわちそ
の物質に特異的な抗体もしくは結合蛋白と抱合体および
もしその物質が存在する時には媒体中のその物質との反
応をおこさせ、又、酵素をその適切な活性化状態に到達
させ得るためにある時間が必要である（保温培養期）こ
とは当業者には明らかであろう。インキュベーションの
実施を要する正確な段階は分析の特殊状況によって左右
さ汰る。たとえば試薬の添加順序に依存しているが、イ
ンキュベーションは常に基質の添加前におこなわれるで
あろう、当業者は特別なインキュベーション段階がいつ
適切であるかという時期を判断することができるであろ
う。

その物質、抱合体酵素および抗体はこの方法が実施され
る媒体に通常可溶である。基質は媒体にｆ＃解するかあ
るいは不溶であるかもしれないが、媒体に可溶の方が便
利である。ある状況においては不溶の合成基質を用意す
るかまたは不溶の天然基質を用いることが望ましいこと
もある。

媒体中に偶然存在して実質的に不活性の酵素を活裡化し
得る抗体と相互作用をおこすかもしれない抗体の効果を
中オロするために本発明の分析にお一七たとえば標準的
ヒツジ免疫グロブリンのような標準的免疫グロブリンの
過剰を含有せしめることは都合がよい。β−がラクトシ
ダーゼの変異減はその活性に必須のチオール基を含むこ
とが知られている。そのような＃素が当該発明の分析に
用いられる時にはジチオールトレイトールまたは同様の
試薬を存在するチオール基の酸化防止のために通常含め
られる。ナトリウムアジ化りのように適当な防腐剤を本
発明の分析中に加えることは便利であり、利益となる。

本発明の方法においては、定量されるべきその物質が存
在する場合にはその物質と、実質的に不活性の酵素を活
性化しうる抗体およびその物質とから成る抱合体との間
に特異的な抗体または結合蛋白への結合をめぐって競合
がおこなわれる。酵素活性化のレベルはその抱合体、と
特異抗体または結合蛋白との閣の結合度に正確に左右さ
れるから、サンプルの酵素活性はサンプル中の物質量に
より左右される。

酵素活性の分析方法は、必要に応じて変化する。

分光測光法的測定または螢光針的測定が酵素活性レベル
を測定するのに都合よく用いられる。

定量されるべき物質が、実質的に不活性の酵素を活性化
し得る抗体に結合して成り立つ抱合体は新規なもので本
発明の東に重要な部分をなしている。

本発明はまた 試薬１：実質的に不活性の酵素と混合された分析される
べき物質に特異的な抗体 試薬２：抱合体 試薬６：酵素に対する基質 試薬４：停止剤 からなる試験キットをも提供する。

試薬１は実質的に不活性の酵素を活性化しうる抗体を含
むことが適切である。その実質的に不活性の酵素はβ−
がラクトシダーゼの変異型であることが適切でその場合
には、試薬１は通常β−ガラクトシダーぜ中に含まれる
チオール基の酸化防止のためにジチオトレイトールまた
は同等の試薬を蒼む。試４１はまた標準的免４ｇｔグロ
ブリンをも含むと便利であり、又、標準的ヒツジの免疫
グロブリンを含むことが望ましい。試薬１および２はポ
リオールの１つ好まＣ＜はＤ−アラ−トールを含むこと
が適、当である。

試薬２は標準的免疫グロブリンを望ましくは標準的ヒツ
ジ免疫グロブリンを含むことが適当である。

試゛薬６はメタノールのようなアルカノールの１つを含
むことが望ましい。停止剤は−の高い緩衝溶液、マグネ
シウムに対するキレート化剤および脂質可溶化剤の混合
物である。−緩衝溶液はグリシン中に水酸化ナトリウム
を含み、キレート化剤はＫＤＴＡであって脂質可溶化剤
はコール酸す）　＋７ウムであると適当である。当該試
験法の諸成分の調製および試験法の操作は以下に例証さ
れている：酵素の精製 ＭｅｌｃｈｅｒｓとＭｅｓｓｅｒ　（Ｂｕｒ、　、ｒ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７（１９７０）、２６７）Ｋより
紀−されたような活性化しうる変異型のβ−がラクトシ
ダーゼな産生した大腸菌の一株をコハク酸ナトリウムと
チアミンを補給した鉱ｒ！Ｉｔ項培地中で成長させた（
　ＦＯＷ１８ｒ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ、１１２　
（１９７２）、８５６）、更にｂ″ｏｗ１ｅｒ　（上８
己参照）ノ１ｉｅ４１ＫＬｆようなＡ３２４５株を酵素
的に活性の野性タイプのβ−がラクトシダーゼを用意す
るために成長させた。

細菌を遠心分離により収穫し、必要時まで冷凍廚蔵した
。解凍と高周波分解の後β−ガラクトシダーゼとその種
々の抗体活性化可能変異型をｏｒａｖｅｎら（、ｒ、　
Ｂ１Ｃ１１，Ｏｈｅｍ、　２４０　（１９６５）、２４
６８）とＴｅｎｕら（ｌ１ｉｕｒ０．Ｔ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ　２　Ｑ、（１９８１）、６６３）の記述したような
古典的クロマトグラフィー法により精製した。親和性ク
ロマトグラフィもまた用いることができるが、カラム溶
媒の合成費用が高いことと容量の低いことという不利点
がある。典型的な精製においては、６０リツトルの細菌
成長培地が収穫されそれから細菌は高周波分解され、そ
の懸濁液を遠心分離する。縮重からのすべてのβ−ガラ
クトシダーゼな含む上澄液約１リツトルが得られその酵
素を部分的に精製してｔＡ酸アンモニウムで１５係から
４５俤の間の飽和により沈澱する物質を集めることによ
って濃縮させる。透析またはｒルＰ通の後に酵素をＤＩ
ＢＡＥ−セルローズのカラムに適用し、ある勾配で浴出
する。酵素を結合しているＤＥＡＲカラムからの分画を
プールし、直接に水酸化燐灰石のカラムに適用し、燐酸
の勾配で溶出する。再び酵素を含んでいる分画をプール
し、それからＤＥＡＲ−セファローズ０Ｌ４Ｂのカラム
に直接適用する。ある勾配での溶出は５００〜１０００
＃の均質なβ−がラクトシダーゼを産生じた。水酸化燐
灰石のカラムは効率を損することなくセファクリル５６
０００カラムによっておきかえることができる。

との′ｄＩｇされた酵素は、メルカゾトエタノールまた
はその他のスルフィドリル保譲剤を含む５０俤飽和硫酸
アンモニウムの緩衝溶液中に懸濁させることにより実質
的あるいは潜在的触媒作用活性を損することなく何ケ月
も貯そうすることができる。

抗体の生産 マウスを精製した野性タイプのβ−ガラクトシダーゼで
兄疫化し、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｅｔｅｉｎ　（Ｂｕｒ
、Ｊ。

工ｍＬｎｕｎｏｘ　；　（５（１９７５）、５１１）に
由来する方法に従ってその膵臓を骨髄嘘細胞系と共に溶
融した。その融解した細胞をマルチウェルプレート甲で
試験管内培養し、上澄溶液をそうでなければ不活性の変
異型酵素を活性化した抗β−がラクトシダーゼ抗体につ
いて検索した。望む抗体を産生じたウェルからの細胞を
限定稀釈法により反覆クローンせしめた。単クローン性
抗体細胞系はかくして形成され組織培養を用いて試験管
内でかあるいはマウスの腹腔内で腹水を与えて生体内で
かのいずれかで必要に応じて成長させられた。抗体はイ
オン交換セルロース上クロマトグラフィによって培養培
地または腹水から精製された。

抗体ヲ産生ずる４本の細胞系統が形成されＢＧ−１８、
ｋ３Ｇ−１９、ＢＧ−７９、Ｊ３Ｇ−８１と番号をつけ
られた。これらの系統により産生された兎唖ゲロプリン
は不活性の精製変異！！１１酵素と混合された時、β−
ガラクトシダーゼ活性を与えた。

ＢＧ−７９系統からの抗体は特殊な性質を示した。

他の６系統のいずれかからの抗体と混合し、不活性の変
異減酵素に加えると、酵素活性が相乗作用的に増加して
、それぞれ単独に用いた抗体のいずれについての飽和か
ら期待されるよりも大きい活性をもたらせるということ
が発見された。その活性ハメタノール、エタンジオール
、プロパン−１゜２−ジオールまたは水酸官能基を含む
その他の化合物の使用により増加されるし、父、附加的
に別の機序によって糖アルコール、特にソルビトールお
よびマンニトールしかしとりわけＤ−アラビトールによ
って増加される。

観察された相乗作用と添加したメタノールの効果は第１
表に示しである。

４１表 ＢＧ−７９による　　　７．６士肌１６　　　　　４．
６±０．４ＢＧ−８１０，８６±０．０４　　　　０．
２±０．００４８Ｇ−１８゛　　１２．５±０．０！＋
　　　　　３２±０．２５８Ｇ−１９１，０±ｏ、ｏｉ
　　　　　　ｏ、ｓｓ　±０．００３ＢＧ−７９十ＢＧ
−８１２８±　１．２　　　　　４６　±　１．８ＢＧ
−７９十ＢＧ−１９１０，９±０．２　　　　　１６．
９±０．１ＢＧ−７９＋ＢＧ−１８４２，５±０．５　
　　　　９５．５±６．５ＢＧ−１８十ＢＧ−１９１８
− 過剰の抗体の存在下での酵素活性は、μｍｏｌｅ（７）
Ｏ−ニトロフェノール／　ｎ　ｍｏｌｅ酵素／分で表現
され、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトンドを基
質として用いて定量される。

単クローン性抗体番号ＢＧ−１８、ＢＧ−１９、ＢＧ−
７９、ＢＧ−８１はＷｅｌｌｃｏｍｅａ　Ｄｉａｇｎｏ
ａｔｉｃｓ。

Ｄａｒｔｆｏｒｄ、イギリスから入手できる。

抗体の調製 凍結乾燥粉末として保存された単クローン性抗体を再水
和化し、ついで５０憾飽和硫酸アンモニウムを用いる沈
澱化により分画化した。収量した沈澱の再懸濁化とゲル
ー過の後にその為クローン性抗体をＤ　Ｂ　Ａ、に−セ
ルローズのカラムまたはＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｄ　Ｂを置換
したＰｒｏｃｉｏｎ　−６Ｂのカラムに１ＱｍＭの燐酸
緩衝浴液中でｐ）ｌ　７．０で適用した。

浴出した抗体は実質上均質で再懸濁した凍結乾燥粉末１
０−につき４５ノ９までの抗体の収量であった。

精製された率クローン性抗体なＮ−ヒドロキシサクシニ
ミドエステルまたは問題の配位子のその他の適当な活性
誘導体で処理することにより置換した。コルチ・戸−ル
に対しては最適濃度１０分子のＮ（コルチゾールー２１
−へミサクシニル）−サクシネートを各分子の精製抗体
と１６−２０時間Ｏ℃で１０係ジメ卆ルフオルマミド、
［１、食塩水を含む緩衝溶液中でｐｉ−１７，４で反応
せしめた。

置換された抗体は、７０％飽和硫酸アンモニウムで沈澱
させ、７０壬飽和硫酸アンモニウム中再−濁により洗滌
後、少くとも２回遠心分離し、蛋白結合しているもの以
外のすべてのコルチゾール−２１−ヘミサクシネートの
痕跡をｒルｐ過により除去した。製品を適当に稀釈し、
凍結乾燥法は置換し得るけれども凍結して貯蔵した。

ジフェニルヒダントインニ対しては、！１−（Ｎ−カル
ボキシルメチル）−ジフェニルヒダントインのＮ−ヒド
ロキシサクシニミドエステルの２０分子を精製された抗
体の各分子と１６時間室温（２０℃）で、燐酸０．０１
　Ｍと食塩を含む緩薗浴液中ｐａｌ　７．４で反応せし
められた。置換された抗体は遊離の３−（Ｎ−カルボキ
シメチル）−ジフェニルヒダントインからＢｉＯｇｅｌ
　Ｐ　１Ｑのカラムを用いるｒルｐ過で、２００−４０
０メツシユで６−のペソドコリウムに１４のサンプルで
食塩水０．１５　Ｍと平衡にされたカラムを用いて分離
された、フイブリノーゲンおよびフイブリノーゲンの分
解域生産物りに対してはその精製された蛋白またはＤ断
片を保護されたチオール基を導入するために８−アセチ
ルメルカプト無水コハク酸と反応さ奢た。単クローン性
の抗体はマレイミド残分を導入するためにサクシニミジ
ル４−（Ｎ−？Ｌ／ノミトメチル）シクロヘキサン−１
−カルボキシレートと反応させた。カップリングのため
にフィブリノ−ｒンまたはＤｆｉ片中の保傾されたチオ
ール基をヒドロキシラミン２５ｍＭと−７で室温で１時
間処理することによって４出させた。そのチオール蛋白
または断片りをそれからマレイミド−単クローン性抗体
と混合させた。−昼夜のカップリングの後、抱合体なメ
ルカプトエタノールで処理して過剰のマレイミド残分な
ふさぎ次にＮ−エチルマレイミドを過剰のチオール基を
ふさぐために処理する。抱合体をそれからフイデリノー
ｒンー抗体に対してセファローズＣＬ−４Ｂ上で断片り
一抗体に対してセファクリル８−３００上でのクロマト
グラフィにより精製したが最初の溶出された蛋白質は有
用である。

化学名９−　（２−ヒドロキシ−エトキシメチル）グア
ニンなる抗ヴイルス剤アシクロヴイル（ａｃｙｃｌｏｖ
ｉｒ　）に対しては、サクシニルアシクロヴイルのＮ−
１，ドロキシテクシニミドエステルの１０分子を精製さ
れた抗体の各分子と室温（２０℃）で１６時間燐酸０．
０１　Ｍと食塩を含む緩衝溶液中で−７，４にて反応せ
しめた。置換された抗体は遊離の小さい分子からＢｉＯ
ｇｅｌ　Ｐ　ｉ　Ｑのカラムを用いるデルー過により、
２００−４００メツシユで６ｗｔのペットボリウム１１
１ｄのサンプルを用す１食塩水０．１５　Ｍと平衡させ
たカラムで分離した。

０から１０００ピコモル（ｐｉｃｏｍｏｌｅａ　）のコ
ルチゾールを含むと信じられる血清または尿のサンプル
５０ａ＃を、１ピコモルのコルチゾール−単クローン性
Ｂ（）−７９抗体抱合体、２０μｊ中のコルチゾールに
対して向けられた抗血清からの精製工ｇ０６０ピコモル
、２ｍＭのナトリウム８−アニリノ−１−ナフチレンス
ルフオーネート５０μＩｃ？７．６）と混合した。３７
℃で３０分間イン中ユペートシたｉ、１３０ナノモルの
ジチオトレイトールと２０ピコモルの第２非置換活性化
抗体ＢＧ−８１にすでに混合された活性化しうるβ−ガ
ラクトシダーゼの約１ピコモルを、１０ｍメタノールを
含む−７，４０の燐酸緩衝溶液１００　ｍＭ中の７ｍＭ
のｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ　−カ９　／　）シト基
質の２００μ！に添加した。インキュペータヨンを更に
もう３０分間継続し、それから光学濃度を４２０　ｎｍ
で読んで記録し、反応を１０憾ジメチル−スルフオキシ
ドまたはその他の有機溶媒または１１のデオキシコール
酸ナトリウムを含む０．４Ｍの炭酸ナトリウム１−で停
止させた。標準を適切な範囲にわたって用意し、又各サ
ンプルに対するブランク（抗−コルチゾールなし置換さ
れた抗体なし）もまた準備した。その結果は下記の第２
表に示されている。

コルチゾールの存在　　　　　　　光学濃度４２０（ｐ
　ｍｏｌ　） ０　　　　　　　　　　　　　　０．６Ｂ５　　　　　
　　　　　　　　　０．９５１０　　　　　　　　　　
　　　　１．０７２０　　　　　　　　　　　　　　１
．１２４０　　　　　　　　　　　　　　　　１．１８
６０　　　　　　　　　　　　　　　　１．２１１００
　　　　　　　　　　　　　　　　１．２５１０００　
　　　　　　　　　　　　　　１．３６ｆＩＪ２−ジフ
ェニルヒダントインに対する分析０．５かう２．５　ｎ
　ｍｏｂのジフェニルヒダントインを含むと信じられる
血清サンプル２５μｌを２５μｌ中のジフェニルヒダン
トイン−単りローン性ＢＧ−７９抗体抱合体４ピコモル
およびジフェニルヒダントインに対抗して向けられた抗
血清からの２５μ！中の精製工ｇＧ９０Ｑピコモルと混
合させた。そのチューブを６７℃でインキュベーション
におき、５００ナノモルのジチオトレイトールおよび２
０ピコモルの第２非置換活性化抗体ＢＧ−８１をすでに
混合しである活性化しうるβ−ガラクトシダーゼ酵素の
６ぎコモルを添加した。−７，４の１００　ｍＭの燐酸
緩衝溶液中の７　ｍＭの〇−二トロフェニルーβ−Ｄ−
ガラクトシド基質の２００μ−をそれから添加し総イン
キュベーション量３２５μぎとした。インキュベーショ
ンは６ノ℃で１５分間継続し、それから１１のデオキシ
コール酸ナトリウムを含む肌２Ｍの炭酸ナトリウムの１
−で反応を停止し、光学濃度を４２０　ｎｍでｄみとっ
た。ジフェニルヒダントインの標準を５から２０μｇ／
ｌｒｔの血清の適切な範囲にわたって準備し、又、各サ
ンプルに対するブランク（抗フェニトインなし、ジフェ
ニルヒダントイン抱合抗体なし）をも用意した。その結
果は下記の第３表に示されている。

ｏＯ，１７５ ５０，２２５ １００，２４１ ２００，２４７ コントロール：抗体なし　　　　　　　０．３２８コン
トロール：抱合体なし　　　　　　０．０７４０．６か
ら２４ピコモルの断片Ｄ’ｇ含むと信じられる血清のサ
ンプル１０μｌを試薬１と室温で混合し５分間反応せし
めた。次に２０μｌの試薬２ヲ添加し、イン中ユベーシ
ョンを６７℃で１０分間始めた。次に５００μｌの基質
を加え、インキュベーション１ｔ６７℃で５分間継続し
た。次−で反応を１００μＩの停止剤の添加により停止
させ。

浴液の光学濃度を４２０　ｎｍで読みとった。断片りの
標準を適切な範囲５から２００μｇ／＋ｄ血清にわたっ
て調製した。使用した試薬と得られた結果を第４表およ
び第５表にそれぞれ示しである。

第４表 フィブリノーゲン分解産物ＤＫ対する分析試薬ジチオト
レイトール２５０　ｍＭ水中４００μｌ試薬２　率クロ
ーン性工ｇＧ−Ｄ断片の抱合体＝８００μｌ、アラビ、
トール６００１Ｒｆｉ／ｌ、１１５μｌ−標準ヒツジ免
疫グロブリンニア、２００μｌ緩衝溶液中。

試薬１および２ならびに基質に用いられる緩衝溶液 ５０　ｍＭ　）リス ２５ｍＭ塩化ナトリウム １０ｍＭ塩化マグネシウム １ｍ　Ｍ　ＩＩ！ＤＴＡ −７，５ 基質２．５モラルメタノールを含む緩衝溶液中の０−ニ
トロフェニルβ−Ｄ−がラクトシＩＰ２．５１１９／ｓ
ｇ停止試薬　２Ｍグリシン ０．２係コール酸ナトリウム 第５表 断片Ｄμｇ／ｌｄ　　　　　　　　　　光学濃度４２０
　ｎｍ０　　　　　　　　　　　　　　　０．４０４１
５　　　　　　　　　　　　　　　０．４０９２５　　
　　　　　　　　　　　　　０．４１２４０　　　　　
　　　　　　　　　　０．４２６６５　　　　　　　　
　　　　　　　０．４６４１００　　　　　　　　　　
　　　　　　０．５４８２００　　　　　　　　　　　
　　　　０．５６６例４−フイブリノーゲンに対する分
析 ０から３１Ｊｖ／−のフイブリノーゲンを含むと信じら
れる血清のサンプル２０μｌをフィブリノ−ｒンに対抗
して向けられた抗血清からの精製工ｇＧの２６０μｇ／
−溶液の２０μｌと混合した。抱合されたフイデリノー
デンーエｇＧ（７９）２０μｌ、光学濃度２８”ｈｍ　
＋　０．２２　Ｋそれから酵素混合物２０μｌｃ＃ｌ素
の硫酸アンモニウム懸濁液６μ／、１０ダ／−のジチオ
トレイトール１００μＪ、２５０ｍＭのトリス緩ｆＩ溶
液１−とフラスコ成長率クローン性抗体ＢＧ−８１１ｍ
ｇ）を加えた。その混合溶液を５分間６７℃でインキュ
ベートしそれから１０憾メタノールを含むトリス緩衝溶
液中のｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド７ｍ
Ｍの２００μｌ’を加、ｔた。インキュベーションＹ２
０分間３７℃で継続し、それから反応を１優のデオΦシ
コール酸ナトリウムを含む０．４Ｍの炭酸ナトリウム５
００μｌで停止した。標準を適切な範囲にわたり調製し
、各々のサンプルに対する置換された単クローン性抗体
を含まぬブランクもまた用意した。

その結果は下記の第６表に示しである。

第６表　　フィブリノ−ｒン標準曲線 ０　　　　　　　　　０．５１８ ０．０３１　　　　　　　０．６２６ ０．０６３　　　　　　　０．６６７ ０．１２５　　　　　　　０．７６９ ０．２５　　　　　　　０．８９２ ０．５０　　　　　　　０．９５５ １．０　　　　　　　　１．１０２ むと信じられる崩清をｄｋ衝浴溶液４倍に稀釈し、それ
から１０μｌのサンプルを室温で２０μｌの試４Ａと混
合し、５分間反応せしめた。それから２０μぎの試薬Ｂ
を加え、インキュベーションを室温で１０分間継続した
。前もって３７℃にあたためた５００μｌの基質を加え
６７℃の水浴で５分間インキュベーションを開始した。

それから、反応を１００μｇの停止試薬の添加により停
止させ、溶液の光学濃度を４２０　ｎｍで読みとった。

アシクロヴイルの標準を、血清中１から１０μＭの適切
な範囲にわたって調製した。使用した試薬と得られた結
果は第７表および第８表にそれぞれ示しである。

第７表 丁シクロヴイルの分析用試薬 試薬Ａ Ｄ（＋）アラビトール　　　　　　　　　　　　１．２
ｇ緩衝溶液　　　　　　　　　　　　　　６０００μ！
試薬Ｂ Ｏ，１１ｖ／−標準ヒツジ免疫グロブリンと共に、緩衝
浴液中２０μｇ／−での単りローン性工ｇＧ−アシクロ
ヴイルの抱合体、 試薬ＡおよびＢならびに基質に用いられた緩衝溶液５０
ｍＭ）リス ２５ｍＭ塩化ナトリウム ’ｌ　［３ｍＭ塩化マグネシウム １ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ 塩酸でｐ）１７．５に調整する 基質 ２．５モラールのメタノールを含む緩衝溶液中０−ニト
ロフェニルβ−Ｄ−がラクトシｌ＆２＋４’／−６停止
試薬 ２Ｍ〆リシン ２　Ｑ　Ｑ　ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ ０．２係コール酸ナトリウム 水酸化ナトリウムでｐ）１１０．１にａＭｉ整する第８
表 アシクロヴイル標準曲線 ０　　　　　　　　　　０．５２９ ０．３４５ ２．５　　　　　　　　　　０．３９１０．５９５ ５　　　　　　　　　　　０．５６９ ０．５７５ ７．５　　　　　　　　　　０．６４５０．６２９ １０　　　　　　　　　　０．６７５ ０．６６５ 代理人　　浅　村　　　皓 外４名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ある物質を含有すると推定される媒体中のそ
   の物質の存在を決定し、または定量する方法であって、 ａ）実質的に不活性の酵素を活性化できる抗体に結合し
   た物質からなる抱合体、その物質に４１員的な抗体もし
   くは結合蛋白、および実質的に不活性の酵素の過剰とそ
   の媒体を共に混合し、媒体中のいかなる物質屯その物質
   に特異的な結合蛋白もしくは抗体と反応する機会をもつ
   までに酵素が抱合体と混合しな―ような順序でその構成
   成分を添加し、そして ｂ）酵素に対する基質を加え、その酵素の活性を測定す
   ること、 からなる方法。 ＋２１＆）　その物質に特異的な結合蛋白もしくは抗体
   と実質的に不活性の酵素の混合物へ媒体を加え。 −１））　　’＊質的に不活性の酵素を活性化できる抗
   体と結合したその物質の抱合体を加え、そしてＣ）ｄＩ
   素に対する基質を加えてその酵素活性を測定すること からなる上糾第（１１項の方法。 （３１！Ｌ）　　実質的に不活性の酵素を活性化できる
   抗体に結合した物質からなる抱合体：およびその物質に
   ｔ！！ｉＪＡ的な結合蛋白もしくは抗体と媒体を共に混
   合し、 ｂ）実質的に不活性の酵素の過剰を添加し、そして Ｃ）その酵素の基質を添加して酵素活性を定量すること
   からなる上記第（１１項の方法。 （４）　　実質的に不活性の酵素を活性化できる抗体が
   巣クローン性抗体である上記１Ｘ（１）項からｔａ）項
   までのいずれか一つの方法。 （５）　　実質的に不活性な＃！ｅを活性化し傅るＪｌ
   ！にもう一つの抗体を酵素が他の成分のいずれかに添加
   される前にその＃素と混合させる上記第（１１項から（
   ４）項までの−ずれか一つの方法。 （６）実質的に不活性の＃累が活性化された時にβ−が
   ラクトシダーゼの活性の１憾より小さめ活性をもつβ−
   がラクトシダーゼの変１４型である上記第（１１％から
   （５）項までのいずれか一つの方法。 （７）　　β−がラクトシダーゼの変異型が大腸−の突
   然変異株の培養によりａ４製されるような上記第（６）
   項の方法。 （８）試験される脂質が抗てんかん薬、抗生物質、抗ヴ
   イルス剤、ホルモンまたは蛋白質である上記証（１）項
   から（７）項までのいずれか一つの方法。 （９）その分析が制約７．４、アルカノールまたは？リ
   オールの存在下に１０℃から４５℃の間で実施される上
   ＩＥ［（１１項から（８）項までのいずれか一つの方法
   。 （ＩＩ　　Ｄ−アラピタールの存在下に実施される上記
   第（１）項から（９）項までのいずれか一つの方法。 （１υ　メタノールの存在下に実施される上記第（１）
   項から０１項までのいずれか一つの方法。 （至）　その分析が−を約−１０にまで変化させマグネ
   シウムに対するキレート化剤と脂質可溶化剤をから０９
   項までのいずｔか一つの方法。 Ｕ　実質的に不活性の酵素を活性化可能な抗体に結合し
   た、前記に定義したような測定されるべき物質からなる
   抱合体。 α荀　試薬１：実質的に不活性の酵素と混合した分析さ
   れるべき物質に特異的な抗体 試薬２：実質的に不活性な酵素を活性化し得る抗体に結
   合した物質から成る抱合 体 試薬３：実質的に不活性の酵素に対する基質試薬４：停
   止剤 からなる試験キット。