JPH0588115B2 - - Google Patents
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- JPH0588115B2 JPH0588115B2 JP60087354A JP8735485A JPH0588115B2 JP H0588115 B2 JPH0588115 B2 JP H0588115B2 JP 60087354 A JP60087354 A JP 60087354A JP 8735485 A JP8735485 A JP 8735485A JP H0588115 B2 JPH0588115 B2 JP H0588115B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はモノクローナル抗体に関する。
ヒト末梢血液はナチユラルキラー（NK）細胞
と称される単核球細胞の集団を含む。NK細胞は
抗体、すなわち抗体の不在下または予め免疫なし
にインビトロで腫瘍細胞を溶解する能力を有する
ものと定義されている。 Griffinら（1983）J.Immunol.130，2947、に
は、非NKヒト単球、顆粒球、Ｂ−リンパ球、Ｔ
細胞、赤血球および血小板とは反応性でない、
NK細胞に対するモノクローナル抗体（“N901”
と称される）が記載されている。この抗体は補体
の存在下にインビトロでヒトNK細胞およびNK
様細胞を溶解することは不可能である。（ここで
“NK様細胞”とは正常な末梢血液以外に見られ
る細胞で、たとえば培養NK細胞、あるいは他の
器官または悪性腫瘍の細胞であつて、いずれも
NK細胞の溶解能力を有し、NK細胞に特異的な
表面抗原決定基を担持している。） Perussiaら（1983）J.Immunol.130，2133には
NK細胞と反応性の他のモノクローナル抗体が記
載されている。 一般に、本発明は一態様として、補体の存在下
にインビトロでヒトNK細胞を溶解することがで
きるモノクローナル抗体である。 好適具体例として該抗体は非NKヒト顆粒球、
非NKヒト単球、ヒト赤血球、ヒト血小板、ヒト
胸腺細胞および非NKヒトT3レンパ球と反応性で
はなく；該抗体はIgまたはIgG2アイソタイプで
あつて；該抗体は実質的にすべてのNK細胞の表
面上の約200000〜220000ダルトンNK細胞に特異
的な抗原決定基を認識する（特定の抗原決定基は
ここでは“NKH1A”と称する。）。 本発明の抗体（“抗−NKH1A”）はたとえば放
射性同位元素または螢光染料で標識して使用する
ことによりNK細胞を固定でき、これらの細胞を
非NK細胞から区別できる。この抗体は組織、た
とえば患者に埋め込まれる骨随中のNK細胞を殺
して移植組織対宿主病を阻止するのにも使用でき
る。 上記特異性と特性を有するすべてのモノクロー
ナル抗体は本発明に包含される。これらのモノク
ローナル抗体は従来のハイブリダイゼーシヨンと
スクリーニング技術（Reinherzら（1979）J.
Immunol.123，1312およびRitzらNature（1980）
283，583に記載されているような技術）を使用し
てつくつたハイブリツド細胞によつて産生され
る。モノクローナル抗体の分野で周知のように、
同一の特定の抗原決定基に対して特異的なモノク
ローナル抗体を産生する各々の独立して産生され
たハイブリツド細胞株は他のすべてのものからあ
まり異ならず、それにより産生されたモノクロー
ナル抗体も各々あまり異ならない。このようにし
て、下記の方法を繰返すと、NK細胞に対して特
異的でNK細胞を溶解することができる有用なモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリツド細胞株
を産生できるが、化学的に下記モノクローナル抗
体の正確なコピーであるモノクローナル抗体を産
生する細胞株を産生するであろうことはほとんど
あり得ない。 本発明の好適具体例は下記のとおりである。 ハイブリドーマ産生およびスクリーニング ６週令の雌Balb／Ｃマウスをヒトクローン化
NK細胞株JT3の細胞で免疫化した。該細胞株は
Hercendら（1983）Nature301，158に記載され
ている。JT3クローンは、精製された大きな顆粒
リンパ球（LGL）をまずPHAで刺激したものと
インターロイキン−２を含む培地から誘導され
る。18ケ月を越える間、JT3細胞は培養を維持さ
れ、安定な表現型（T3−T4−T8−T11＋N901
＋）および細胞毒性を、インビトロで確立した細
胞株の大きなパネルに対して試験したとき示すこ
とがわかつた。 JT3クローンはHercendら（1982））J.
Immunol.129，1299とHercendら（1983）
Nature301，158に記載された限定希釈法によつ
て発生された。この方法は、自己由来の照射
（5000ラド）ヒト末梢血液単核球（PBMC）プラ
スPHA（2μg／ml）または同種異系間によるか若
しくは自己由来の照射（5000ラド）EBV形質転
換Ｂ細胞の供給層上で１個の細胞を１つの穴の割
合でLGLをクローニングすることからなる。選
択されたコロニーは３日毎にLCM（最終希釈率10
〜15％）を含有する培地を添加することによつて
増殖された。培地はペニシリン−ストレプトマイ
シン１％、ピルビン酸ナトリウム１％、ヒトAB
血清20％のRPMI1640であつた。JT3株は次い
で、オートローガス照射PBMCプラス照射され
たEBV形質転換Ｂ細胞の供給層上で100細胞／穴
で２回サブクローン化された。サブクローニング
後、表現型と細胞毒性機能は両方とも安定であつ
た。 免疫化は、まず完全フロインドアジユバント
（ミシガン州デトロイトのデイフコ）中で乳化さ
れた４×106JT3細胞の腹腔内注射に始まり、次
いで２週間リン酸塩で緩衝化された生理塩水
（PBS）中４×106生細胞を腹腔内注射することか
らなる。２週間後、２×106細胞を静脈内注射し、
３日後脾臓除去した。体細胞ハイブリダイゼーシ
ヨンはKohlerおよびMilstein（1975）Nature
256、495の方法で行なつた。 得られたハイブリドーマは、1984年５月17日
に、アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨン（ATCC）においてATCCHB8564としてブ
ダペスト条約下に寄託された。 ハイブリドーマ上清のスクリーニングをまず次
のように行なつた：1000051Cr標識JT3細胞をＶ
底滴板で室温で30分間各ハイブリドーマ上清のア
リコツトとインキユベートした。適当な非毒性希
釈（通常１：10）でウサギ補体を次いで１時間37
℃で添加した。次いで、滴板をスピンダウンさ
せ、抗体反応性をガンマシンチレーシヨンカウン
ターを使用して上記上清への51Crの放出として測
定した。陽性上清を次いで同一の実験条件下に自
己由来の／MHC制限細胞毒性Ｔ細胞クローンな
らびに自然界EBV形質転換Ｂ細胞株に対して試
験した。補体の存在下にJT3細胞を溶解するが
MHC制限細胞毒性Ｔ細胞クローンまたはEBV形
質転換Ｂ細胞株を溶解しない抗体を産生した細胞
を選択した。抗体産生ハイブリドーマを制限希釈
法によつて２回再クローンし、免疫腹水症をつく
り出した。 抗体特性 抗体の反応性パターンを、リンパ球と非リンパ
球を間接イムノフルオレセンスアツセイ、続いて
FACSIフローサイトメーターまたはEpicsVフロ
ーサイトメーターのいずれかを使用して分析して
純粋培養することにより試験して決定した。試験
のために適当な細胞を得るために、Ficoll−
Hypaque（Ｆ／Ｈ）密度匂配遠心分離により健康
なボランテイアー提供者からPBMCを単離した。
単球に富んだ接着細胞がプラスチツク培養皿上で
２段階接着によつてPBMCから得られた。高分
子デキストランを使用してＦ／Ｈ匂配ペレツトか
ら顆粒球が単離された。活性化Ｔ細胞は、Ｅ＋細
胞をフイトヘマグルチニン（PHA）（2μg／ml）
で刺激することによつて発生し、刺激後７日目に
試験された。 この抗体はJT3免疫細胞と強く反応性であるこ
とがわかつた。さらに、下表に示されるように、
末梢血液に存在する少量（12％）のリンパ球と反
応することがわかつた。ヒト単球、顆粒球、血小
板、赤血球、胸腺細胞、T3リンパ球、および
PHA活性化Ｅ＋細胞は陰性であつた。 【表】 さらに実験した結果、抗−NKH1Aはウイルス
で形質転換した細胞または腫瘍細胞から得られた
一連の14リンパ造血細胞株のすべての細胞とは反
応性ではなかつた。 未刺激末梢血液中のNKH1A＋細胞の形態学的
特徴はイムノフルオレセンス細胞分類によつてこ
れらの細胞を精製することによつて決定した。こ
の目的のために、２人の個々の提供者からの末梢
血リンパ球を抗NKH1A＋GM−FITCとともにイ
ンキユベートした。少数（約50000）のNKH1A
＋細胞をEpics Ｖセルソーターを使用して精製
し、細胞遠心分離物を調製し分析した。NKH1A
＋精製フラクシヨンはほとんど全部（90％以上）
大きな顆粒リンパ球からなつていた。この発見
は、末梢血液中に存在する全NK活性が、大きな
サイズおよび細胞質中のアズール好性顆粒の存在
から、形態学的に同定できるわずかなフラクシヨ
ンのリンパ球によつて媒介された、という以前の
研究結果と一致する。 細胞溶解 抗NKH1AはIgM抗体であるので、補体の存在
下にヒト末梢血液中のNK細胞を溶解する能力を
研究することが可能であつた。この目的のため
に、末梢血単核細胞を培地あるいは抗NKH1Aと
30分間室温でインキユベートした。抗N901（上述
の）、すなわちNK細胞において指令される非溶
解性IgGi抗体は、これらの実験で対照として使
用された。過剰の抗体を洗い、補体を45分間37℃
で添加した。この方法を２回繰返した。次いで、
残つている生細胞をカウントし、51Cr標識標的細
胞を添加した。 この方法は、白血病Ｔ細胞株に対する自己細胞
毒性が非常に高いレベルであるために多くのNK
細胞の存在を示す提供者からのPBL標的細胞に
使用された。これらのPBLを抗NKH1A＋補体で
処理すると事実上完全にNK活性を失い、抗
NKH1Aは末梢血中のすべてのNK細胞を反応す
ることを示した。対照の処理PBLは継続して高
いレベルの細胞毒性を示した。 NKH1A抗原の特性 免疫沈澱実験を行つて抗NKH1Aによつて明確
になつた抗原の分子量を測定した。 ウサギ抗マウスIgと抗NKH1Aとであらかじめ
形成された複合体を使用して免疫沈澱を行つた。
これらのあらかじめ形成された複合体を125I表面
標識JT3細胞溶解物（これらは３回、４℃で１時
間ホルマリン固定スタフ（Staph）Ａ細菌およ
び／またはウサギ抗マウスIg非特異的モノクロー
ナル抗体のあらかじめ形成された複合体とインキ
ユベートしてあらかじめ澄明にしておいた）と反
応させた。あらかじめ澄明にしておいた溶解物の
アリコツトを次いで特異的なあらかじめ形成して
おいた複合体と２時間４℃でインキユベートし
た。免疫沈澱物を次いで４回RIPA緩衝液で洗
い、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（SDS−PAGE）試料緩衝液に溶解
し、10％ポリアクリルアミド平板ゲル上の別々の
溝にのせた。免疫沈澱の同一のアリコツトは、非
還元条件下および２−メルカプトエタノールを
SDS−PAGE試料緩衝液に添加した還元条件下に
泳動した。ゲルを乾燥し、放射性同位元素で標識
された沈澱物を標準的方法で可視化した。抗
NKH1Aは約200−220kDの巾広バンドとして沈澱
した。さらに実験することにより、該沈澱物を５
−15％ポリアクリルアミド勾配により分析した
が、他の特異的バンドは同定されなかつた。勾配
ゲルを使用すると、10％ポリアクリルアミドゲル
に比較してわずかに低分子量（180−200kD）の
特異的バンドが見られた。 抗NKH1Aおよび抗N901は、一連の競合的結合
実験により、おそらく同一のNK表面抗原子に対
するものであることが示された。これら２つの抗
体の異なるアイソタイブ（抗NKH1AはIgM、抗
N901はIgG1）は利点を有する。アイソタイプ特
異的FITCを間接イムノフルオレセンスアツセイ
で使用すると、抗N901は効率よくNKH1Aの結合
をブロツクするのに対し、抗NKH1Aは抗N901の
結合に何ら有意の影響を与えない。これらの結果
は、両者の抗体が同一の細胞表面抗原に対して特
異的であつて、IgG1抗体（抗N901）はIgM（抗
NKH1A）より親和性が高いことを示している。 寄 託 抗NKH1を産生する細胞はアメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨン（メリーランド州
ロツクビル）に寄託されており、ATCC No.
HB8564である。 用 途 NK細胞およびNK様細胞の確認 本発明のモノクローナル抗体を使用して末梢血
液試料中および他の組織、たとえば骨随中のNK
およびNK様細胞を固定できる。 上記抗体を使用して、臨床試料中のそのような
細胞を、従来のイムノアツセイ技術、たとえば間
接イムノフルオレセンスまたは標識抗体、たとえ
ば放射性標識によるものを使用した直接アツセイ
を使用して検出することができる。 上記抗体も血漿や他の体液中のNKまたはNK
様細胞、あるいは細胞を含まない抗原をインビト
ロで検出するのにも使用できる。 循環するNK細胞を検出し定量することによつ
て、種々の症状とNK細胞数との相関関係を明確
にでき、そのような情報により健康な人と病人の
NK細胞の役割、すなわち、悪性腫瘍の破壊を含
む役割を明確にすることができる。 治 療 NK細胞は、器官または組織移植後の移植物対
宿主の病気（GVHD）において有害であるかも
しれないので、本発明の上記抗体は関連のNK細
胞を殺すことによつてGVHDを撲滅するのに有
用であり得る。たとえば、骨髄についていえば、
抗体＋補体を使用して移植前に骨髄を処理して骨
髄に対する宿主の拒絶反応の原因となりうるNK
細胞を殺すのに使用できる。捕体の存在下にNK
細胞を溶解する抗体の能力はIgMアイソタイプの
特性であり、一般的にIgMおよびIgG2抗体のみ
がこの特性を有している。組織のNK細胞の撲滅
速度はすでに結合されている抗体を使用して、従
来技術を使用して、リシンまたはアジアマイシン
のような細胞毒性剤を使用することによつて増大
できる。 NK細胞をインビボで選択的にとり出すことに
より、一部はNK細胞によつて媒介されている
SLEのような自己免疫疾患の治療に有用であるこ
とも証明できる。 この抗体は、抗NKH1Aを使用することによ
り、骨髄および腎臓のような移植物の拒絶を阻止
して、移植物を攻撃する宿主NK細胞を不活性化
するのに有用であることも証明できる。 抗体のもう１つの用途は、末梢血液または造血
組織、たとえば骨髄の細胞懸濁液、またはリンパ
組織、たとえば胸腺、脾臓、またはリンパ節組織
の細胞懸濁液からのNK細胞の精製である。本発
明の抗体は、従来からの細胞分離技術、たとえば
細胞分類、免疫ロゼツト化、パニング、あるいは
イムノアフイニテイカラムクロマトグラフイーと
組合せてそのような精製に使用できる。 NK細胞のそのような精製は、特定の医学上の
疾患がNK細胞の患者への注入を要する場合（患
者自身から、あるいは提供者から）有用であり得
る。そのようなNK細胞の注入はたとえばNK細
胞による攻撃に感受性の悪性腫瘍を処理するのに
使用できる。 そのような治療のために患者自身のNK細胞を
使用することが特に有用であることが明らかであ
る。抗NKを使用して患者の血液または他の組織
からNK細胞を精製後、選択されたNK細胞を培
養して増殖させ、患者に再注入できる。適当な培
養方法はHercendら（1982）J.Immunol.129，
1299およびHercendら（1983）Nature301，158
に記載されている。 他の具体例も本発明の範囲にある。たとえば、
本発明の抗体は、種々の方法、たとえばフルオレ
セインを有するリガンド、重金属、または13Cを
有する化合物で標識できる。
と称される単核球細胞の集団を含む。NK細胞は
抗体、すなわち抗体の不在下または予め免疫なし
にインビトロで腫瘍細胞を溶解する能力を有する
ものと定義されている。 Griffinら（1983）J.Immunol.130，2947、に
は、非NKヒト単球、顆粒球、Ｂ−リンパ球、Ｔ
細胞、赤血球および血小板とは反応性でない、
NK細胞に対するモノクローナル抗体（“N901”
と称される）が記載されている。この抗体は補体
の存在下にインビトロでヒトNK細胞およびNK
様細胞を溶解することは不可能である。（ここで
“NK様細胞”とは正常な末梢血液以外に見られ
る細胞で、たとえば培養NK細胞、あるいは他の
器官または悪性腫瘍の細胞であつて、いずれも
NK細胞の溶解能力を有し、NK細胞に特異的な
表面抗原決定基を担持している。） Perussiaら（1983）J.Immunol.130，2133には
NK細胞と反応性の他のモノクローナル抗体が記
載されている。 一般に、本発明は一態様として、補体の存在下
にインビトロでヒトNK細胞を溶解することがで
きるモノクローナル抗体である。 好適具体例として該抗体は非NKヒト顆粒球、
非NKヒト単球、ヒト赤血球、ヒト血小板、ヒト
胸腺細胞および非NKヒトT3レンパ球と反応性で
はなく；該抗体はIgまたはIgG2アイソタイプで
あつて；該抗体は実質的にすべてのNK細胞の表
面上の約200000〜220000ダルトンNK細胞に特異
的な抗原決定基を認識する（特定の抗原決定基は
ここでは“NKH1A”と称する。）。 本発明の抗体（“抗−NKH1A”）はたとえば放
射性同位元素または螢光染料で標識して使用する
ことによりNK細胞を固定でき、これらの細胞を
非NK細胞から区別できる。この抗体は組織、た
とえば患者に埋め込まれる骨随中のNK細胞を殺
して移植組織対宿主病を阻止するのにも使用でき
る。 上記特異性と特性を有するすべてのモノクロー
ナル抗体は本発明に包含される。これらのモノク
ローナル抗体は従来のハイブリダイゼーシヨンと
スクリーニング技術（Reinherzら（1979）J.
Immunol.123，1312およびRitzらNature（1980）
283，583に記載されているような技術）を使用し
てつくつたハイブリツド細胞によつて産生され
る。モノクローナル抗体の分野で周知のように、
同一の特定の抗原決定基に対して特異的なモノク
ローナル抗体を産生する各々の独立して産生され
たハイブリツド細胞株は他のすべてのものからあ
まり異ならず、それにより産生されたモノクロー
ナル抗体も各々あまり異ならない。このようにし
て、下記の方法を繰返すと、NK細胞に対して特
異的でNK細胞を溶解することができる有用なモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリツド細胞株
を産生できるが、化学的に下記モノクローナル抗
体の正確なコピーであるモノクローナル抗体を産
生する細胞株を産生するであろうことはほとんど
あり得ない。 本発明の好適具体例は下記のとおりである。 ハイブリドーマ産生およびスクリーニング ６週令の雌Balb／Ｃマウスをヒトクローン化
NK細胞株JT3の細胞で免疫化した。該細胞株は
Hercendら（1983）Nature301，158に記載され
ている。JT3クローンは、精製された大きな顆粒
リンパ球（LGL）をまずPHAで刺激したものと
インターロイキン−２を含む培地から誘導され
る。18ケ月を越える間、JT3細胞は培養を維持さ
れ、安定な表現型（T3−T4−T8−T11＋N901
＋）および細胞毒性を、インビトロで確立した細
胞株の大きなパネルに対して試験したとき示すこ
とがわかつた。 JT3クローンはHercendら（1982））J.
Immunol.129，1299とHercendら（1983）
Nature301，158に記載された限定希釈法によつ
て発生された。この方法は、自己由来の照射
（5000ラド）ヒト末梢血液単核球（PBMC）プラ
スPHA（2μg／ml）または同種異系間によるか若
しくは自己由来の照射（5000ラド）EBV形質転
換Ｂ細胞の供給層上で１個の細胞を１つの穴の割
合でLGLをクローニングすることからなる。選
択されたコロニーは３日毎にLCM（最終希釈率10
〜15％）を含有する培地を添加することによつて
増殖された。培地はペニシリン−ストレプトマイ
シン１％、ピルビン酸ナトリウム１％、ヒトAB
血清20％のRPMI1640であつた。JT3株は次い
で、オートローガス照射PBMCプラス照射され
たEBV形質転換Ｂ細胞の供給層上で100細胞／穴
で２回サブクローン化された。サブクローニング
後、表現型と細胞毒性機能は両方とも安定であつ
た。 免疫化は、まず完全フロインドアジユバント
（ミシガン州デトロイトのデイフコ）中で乳化さ
れた４×106JT3細胞の腹腔内注射に始まり、次
いで２週間リン酸塩で緩衝化された生理塩水
（PBS）中４×106生細胞を腹腔内注射することか
らなる。２週間後、２×106細胞を静脈内注射し、
３日後脾臓除去した。体細胞ハイブリダイゼーシ
ヨンはKohlerおよびMilstein（1975）Nature
256、495の方法で行なつた。 得られたハイブリドーマは、1984年５月17日
に、アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨン（ATCC）においてATCCHB8564としてブ
ダペスト条約下に寄託された。 ハイブリドーマ上清のスクリーニングをまず次
のように行なつた：1000051Cr標識JT3細胞をＶ
底滴板で室温で30分間各ハイブリドーマ上清のア
リコツトとインキユベートした。適当な非毒性希
釈（通常１：10）でウサギ補体を次いで１時間37
℃で添加した。次いで、滴板をスピンダウンさ
せ、抗体反応性をガンマシンチレーシヨンカウン
ターを使用して上記上清への51Crの放出として測
定した。陽性上清を次いで同一の実験条件下に自
己由来の／MHC制限細胞毒性Ｔ細胞クローンな
らびに自然界EBV形質転換Ｂ細胞株に対して試
験した。補体の存在下にJT3細胞を溶解するが
MHC制限細胞毒性Ｔ細胞クローンまたはEBV形
質転換Ｂ細胞株を溶解しない抗体を産生した細胞
を選択した。抗体産生ハイブリドーマを制限希釈
法によつて２回再クローンし、免疫腹水症をつく
り出した。 抗体特性 抗体の反応性パターンを、リンパ球と非リンパ
球を間接イムノフルオレセンスアツセイ、続いて
FACSIフローサイトメーターまたはEpicsVフロ
ーサイトメーターのいずれかを使用して分析して
純粋培養することにより試験して決定した。試験
のために適当な細胞を得るために、Ficoll−
Hypaque（Ｆ／Ｈ）密度匂配遠心分離により健康
なボランテイアー提供者からPBMCを単離した。
単球に富んだ接着細胞がプラスチツク培養皿上で
２段階接着によつてPBMCから得られた。高分
子デキストランを使用してＦ／Ｈ匂配ペレツトか
ら顆粒球が単離された。活性化Ｔ細胞は、Ｅ＋細
胞をフイトヘマグルチニン（PHA）（2μg／ml）
で刺激することによつて発生し、刺激後７日目に
試験された。 この抗体はJT3免疫細胞と強く反応性であるこ
とがわかつた。さらに、下表に示されるように、
末梢血液に存在する少量（12％）のリンパ球と反
応することがわかつた。ヒト単球、顆粒球、血小
板、赤血球、胸腺細胞、T3リンパ球、および
PHA活性化Ｅ＋細胞は陰性であつた。 【表】 さらに実験した結果、抗−NKH1Aはウイルス
で形質転換した細胞または腫瘍細胞から得られた
一連の14リンパ造血細胞株のすべての細胞とは反
応性ではなかつた。 未刺激末梢血液中のNKH1A＋細胞の形態学的
特徴はイムノフルオレセンス細胞分類によつてこ
れらの細胞を精製することによつて決定した。こ
の目的のために、２人の個々の提供者からの末梢
血リンパ球を抗NKH1A＋GM−FITCとともにイ
ンキユベートした。少数（約50000）のNKH1A
＋細胞をEpics Ｖセルソーターを使用して精製
し、細胞遠心分離物を調製し分析した。NKH1A
＋精製フラクシヨンはほとんど全部（90％以上）
大きな顆粒リンパ球からなつていた。この発見
は、末梢血液中に存在する全NK活性が、大きな
サイズおよび細胞質中のアズール好性顆粒の存在
から、形態学的に同定できるわずかなフラクシヨ
ンのリンパ球によつて媒介された、という以前の
研究結果と一致する。 細胞溶解 抗NKH1AはIgM抗体であるので、補体の存在
下にヒト末梢血液中のNK細胞を溶解する能力を
研究することが可能であつた。この目的のため
に、末梢血単核細胞を培地あるいは抗NKH1Aと
30分間室温でインキユベートした。抗N901（上述
の）、すなわちNK細胞において指令される非溶
解性IgGi抗体は、これらの実験で対照として使
用された。過剰の抗体を洗い、補体を45分間37℃
で添加した。この方法を２回繰返した。次いで、
残つている生細胞をカウントし、51Cr標識標的細
胞を添加した。 この方法は、白血病Ｔ細胞株に対する自己細胞
毒性が非常に高いレベルであるために多くのNK
細胞の存在を示す提供者からのPBL標的細胞に
使用された。これらのPBLを抗NKH1A＋補体で
処理すると事実上完全にNK活性を失い、抗
NKH1Aは末梢血中のすべてのNK細胞を反応す
ることを示した。対照の処理PBLは継続して高
いレベルの細胞毒性を示した。 NKH1A抗原の特性 免疫沈澱実験を行つて抗NKH1Aによつて明確
になつた抗原の分子量を測定した。 ウサギ抗マウスIgと抗NKH1Aとであらかじめ
形成された複合体を使用して免疫沈澱を行つた。
これらのあらかじめ形成された複合体を125I表面
標識JT3細胞溶解物（これらは３回、４℃で１時
間ホルマリン固定スタフ（Staph）Ａ細菌およ
び／またはウサギ抗マウスIg非特異的モノクロー
ナル抗体のあらかじめ形成された複合体とインキ
ユベートしてあらかじめ澄明にしておいた）と反
応させた。あらかじめ澄明にしておいた溶解物の
アリコツトを次いで特異的なあらかじめ形成して
おいた複合体と２時間４℃でインキユベートし
た。免疫沈澱物を次いで４回RIPA緩衝液で洗
い、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（SDS−PAGE）試料緩衝液に溶解
し、10％ポリアクリルアミド平板ゲル上の別々の
溝にのせた。免疫沈澱の同一のアリコツトは、非
還元条件下および２−メルカプトエタノールを
SDS−PAGE試料緩衝液に添加した還元条件下に
泳動した。ゲルを乾燥し、放射性同位元素で標識
された沈澱物を標準的方法で可視化した。抗
NKH1Aは約200−220kDの巾広バンドとして沈澱
した。さらに実験することにより、該沈澱物を５
−15％ポリアクリルアミド勾配により分析した
が、他の特異的バンドは同定されなかつた。勾配
ゲルを使用すると、10％ポリアクリルアミドゲル
に比較してわずかに低分子量（180−200kD）の
特異的バンドが見られた。 抗NKH1Aおよび抗N901は、一連の競合的結合
実験により、おそらく同一のNK表面抗原子に対
するものであることが示された。これら２つの抗
体の異なるアイソタイブ（抗NKH1AはIgM、抗
N901はIgG1）は利点を有する。アイソタイプ特
異的FITCを間接イムノフルオレセンスアツセイ
で使用すると、抗N901は効率よくNKH1Aの結合
をブロツクするのに対し、抗NKH1Aは抗N901の
結合に何ら有意の影響を与えない。これらの結果
は、両者の抗体が同一の細胞表面抗原に対して特
異的であつて、IgG1抗体（抗N901）はIgM（抗
NKH1A）より親和性が高いことを示している。 寄 託 抗NKH1を産生する細胞はアメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨン（メリーランド州
ロツクビル）に寄託されており、ATCC No.
HB8564である。 用 途 NK細胞およびNK様細胞の確認 本発明のモノクローナル抗体を使用して末梢血
液試料中および他の組織、たとえば骨随中のNK
およびNK様細胞を固定できる。 上記抗体を使用して、臨床試料中のそのような
細胞を、従来のイムノアツセイ技術、たとえば間
接イムノフルオレセンスまたは標識抗体、たとえ
ば放射性標識によるものを使用した直接アツセイ
を使用して検出することができる。 上記抗体も血漿や他の体液中のNKまたはNK
様細胞、あるいは細胞を含まない抗原をインビト
ロで検出するのにも使用できる。 循環するNK細胞を検出し定量することによつ
て、種々の症状とNK細胞数との相関関係を明確
にでき、そのような情報により健康な人と病人の
NK細胞の役割、すなわち、悪性腫瘍の破壊を含
む役割を明確にすることができる。 治 療 NK細胞は、器官または組織移植後の移植物対
宿主の病気（GVHD）において有害であるかも
しれないので、本発明の上記抗体は関連のNK細
胞を殺すことによつてGVHDを撲滅するのに有
用であり得る。たとえば、骨髄についていえば、
抗体＋補体を使用して移植前に骨髄を処理して骨
髄に対する宿主の拒絶反応の原因となりうるNK
細胞を殺すのに使用できる。捕体の存在下にNK
細胞を溶解する抗体の能力はIgMアイソタイプの
特性であり、一般的にIgMおよびIgG2抗体のみ
がこの特性を有している。組織のNK細胞の撲滅
速度はすでに結合されている抗体を使用して、従
来技術を使用して、リシンまたはアジアマイシン
のような細胞毒性剤を使用することによつて増大
できる。 NK細胞をインビボで選択的にとり出すことに
より、一部はNK細胞によつて媒介されている
SLEのような自己免疫疾患の治療に有用であるこ
とも証明できる。 この抗体は、抗NKH1Aを使用することによ
り、骨髄および腎臓のような移植物の拒絶を阻止
して、移植物を攻撃する宿主NK細胞を不活性化
するのに有用であることも証明できる。 抗体のもう１つの用途は、末梢血液または造血
組織、たとえば骨髄の細胞懸濁液、またはリンパ
組織、たとえば胸腺、脾臓、またはリンパ節組織
の細胞懸濁液からのNK細胞の精製である。本発
明の抗体は、従来からの細胞分離技術、たとえば
細胞分類、免疫ロゼツト化、パニング、あるいは
イムノアフイニテイカラムクロマトグラフイーと
組合せてそのような精製に使用できる。 NK細胞のそのような精製は、特定の医学上の
疾患がNK細胞の患者への注入を要する場合（患
者自身から、あるいは提供者から）有用であり得
る。そのようなNK細胞の注入はたとえばNK細
胞による攻撃に感受性の悪性腫瘍を処理するのに
使用できる。 そのような治療のために患者自身のNK細胞を
使用することが特に有用であることが明らかであ
る。抗NKを使用して患者の血液または他の組織
からNK細胞を精製後、選択されたNK細胞を培
養して増殖させ、患者に再注入できる。適当な培
養方法はHercendら（1982）J.Immunol.129，
1299およびHercendら（1983）Nature301，158
に記載されている。 他の具体例も本発明の範囲にある。たとえば、
本発明の抗体は、種々の方法、たとえばフルオレ
セインを有するリガンド、重金属、または13Cを
有する化合物で標識できる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 補体の存在下においてインビトロでヒトNK
細胞を溶解することができ、かつ非NKヒト顆粒
球、非NKヒト単球、ヒト赤血球、ヒト胸腺細胞
および非NKヒトT3リンパ球とは反応性でないモ
ノクローナル抗体。 ２ IgMまたはIgG2アイソタイプである、特許
請求の範囲第１項記載の抗体。 ３ ヒトNK細胞の表面上の抗原決定基を認識す
る抗体であつて、その際、該抗原決定基が10％ポ
リアクリルアミド平板ゲルを用いたSDS−PAGE
の測定によると約200−220kDの分子量を有する、
特許請求の範囲第１項記載の抗体。 ４ 細胞傷害剤と結合した、特許請求の範囲第１
項記載の抗体。 ５ 検出可能な標識で標識された、特許請求の範
囲第１項記載の抗体。 ６ 抗体が放射性同位元素で標識されている、特
許請求の範囲第５項記載の抗体。 ７ 抗体が蛍光染料で標識されている、特許請求
の範囲第５項記載の抗体。 ８ ハイブリドーマ細胞（ATCC No.
HB8564）によつて産生される、特許請求の範囲
第１項記載のモノクローナル抗体。 ９ ヒト患者からの細胞含有臨床試料における
NKまたはNK様細胞の存在を検出する方法であ
つて、上記患者からの細胞含有臨床試料を、補体
の存在下においてインビトロでヒトNK細胞を溶
解することができ、かつ非NKヒト顆粒球、非
NKヒト単球、ヒト赤血球、ヒト胸腺細胞および
非NKヒトT3リンパ球とは反応性でないモノクロ
ーナル抗体と接触させ、上記細胞の存在を指示す
るものとして免疫複合体を検出することからなる
方法。 １０ 臨床試料を、補体の存在下においてインビ
トロでヒトNK細胞を溶解することができ、かつ
非NKヒト顆粒球、非NKヒト単球、ヒト赤血球、
ヒト胸腺細胞および非NKヒトT3リンパ球とは反
応性でないモノクローナル抗体と、補体の存在下
にインキユベートすることからなる臨床試料中の
NK細胞またはNK様細胞を溶解する方法。 １１ 上記試料が骨随試料である、特許請求の範
囲第１０項記載の方法。 １２ 臨床試料中のNK細胞またはNK様細胞を
溶解する方法であつて、該試料を、 (a) 補体の存在下においてインビトロでヒトNK
細胞を溶解することができ、かつ (b) 非NKヒト顆粒球、非NKヒト単球、ヒト赤
血球、ヒト胸腺細胞および非NKヒトT3リンパ
球とは反応性でない モノクローナル抗体とインキユベートする
が、その際、該モノクローナル抗体は細胞傷害
剤と結合している、上記方法。 １３ 上記試料が骨随試料である、特許請求の範
囲第１２項記載の方法。
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