DK172110B1

DK172110B1 - Fremgangsmåde til isolation af mutanter af DNA-sekvenser og anvendelsen heraf til identifikation af celleoverfladeproteiner

Info

Publication number: DK172110B1
Application number: DK172589A
Authority: DK
Inventors: Brian Seed; Andrew Peterson
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1988-04-15
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1997-10-27
Also published as: EP0341444A2; EP0341444A3; US6579676B1; DE68919524D1; ATE114821T1; DK172589A; PT90265B; US5411861A; DK172589D0; DE68919524T2; PT90265A; JPH02203787A; EP0341444B1; ES2065933T3; US5955264A

Description

, 2 DK 172110 B1

De tekniske områder, som denne opfindelse bør henregnes til, er molekylær biologi og immunologi. Opfindelsen angår en hidtil ukendt fremgangsmåde til selektion og analyse af mutanter, nærmere bestemt DNA-sekvenser. Opfindelsen angår også anvendelsen af den-5 ne fremgangsmåde til identifikation af antigene områder eller epitoper i proteiner eller polypeptider.

Hvilende humane T-celler binder fareerythrocytter via et T-cel-lespecifikt cellecverfladeprotein på 50 kD, som kaldes CD2 10 (Bach, J.F. et al, Transplantation, bd.8, s.265-280, (1969);

Howard, F.D. et al, J. Immunol., bd.126, s.2117-2122, (1981 )). Dette fænomen har længe været anvendt i praksis, men har indtil for nylig kun haft ringe kendt fysiologisk betydning. Imidlertid har parallelle studier af int.cr.-Kt ionen eller samspillet mellem 15 T-celler og f areerythrocy tter (Hunig, T. , J. Ξ>:ρ. Med., bd.162, s.890-901, (1985); Hunig, T.R., J. Immunol., bc.I36, s.2103-2108, (1986)) og T-celler og disses fysiologiske mål (Shaw, S. et al, Nature, bd.323, s.262-264, (1986)) fert til identifi kationen af en specifik molekylær ligand for CD2, som er et 20 hyppigt forekommende overfladeprotein, der i eet humane tilfælde kaldes LFA-3. CD2/LFA-3-interaktioner formidler cytolytisk mål-konjugering (Shaw, S. et al, Nature, bd.323, s. 262-264 ¢1986)), thymocyt-epithel-sammenhæftning (Vollger et al, (1987)) og den blandede lymphccytreaktion (Martin, P.J. et al, J. Immunol., 25 bd.131, s.180-185, (1983)). Man har desuden foreslået, efter opdagelse af, at visse kombinationer af monoklonale anti-CD2-antistoffer direkte kan aktivere modne T-celler via en antigen uafhængig reaktionsvej, at CD2-antigenet spiller en større rolle .

30

For tiden kræves der ved den mest almindelige fremgangsmåde til kortlægning af proteinepitoper syntese af en række korte, syntetiske peptider, som dækker proteinsekvensen, og anvendelse af disse peptider ved flere bindingsanalyser (Geysen, H.M. et al, Science, bd.235, s.1184-1190, (1987)). For at identificere de særlige grupper, som er vigtige for antistofbindingen, syntetiseres varianter af peptidet med substitutioner i hver _ 2 . DK 172110 B1 position. Denne strategi ved anvendelse af syntetiske peptider har flere begrænsninger. Hvis antistoffets affinitet skyldes et samspil med ganske forskellige dele af polypeptidkæden eller involverende en hidtil ukendt konformation af kæden, vil pepti-5 det ikke være i stand til at efterligne hele proteinets binding til antistoffet. For at identificere de enkelte grupper, som er i kontakt med antistoffet, må der syntetiseres et ekstremt stort antal peptidvarianter. Ved den mest udtommende undersøgelse til dato måtte man analysere mere end 1500 enkelte peptider 10 (Getzoff, E.D. et al, Science, bd.235, s.1191-1196, (1987)).

Monoklonale antistoffer er blevet anvendt til selektion blandt virale kapseldeterminanter (Yewdell, J.W. og Gerhard, W., Ann. Rev. Microbiol, bd.35, s. 185-206, (1981)). Sådanne selektioner 15 er både besværligere og mindre følsomme end ønsket, da de ændringer, som er sket ved mutationen, må ekstraheres fra det virale genom, og da mutationer, som leder til ikke-levedygtige vira, ikke kan påvises.

20 Den foreliggende opfindelse angår en hurtig og enkel fremgangsmåde til kortlægning af proteinepitoper. Ved denne mutationsanalyseteknik selekteres antigen-cDNA-mutationer, som fører til tab af antigen-antistof-reaktivitet. Ved fremgangsmåden anvendes cDNA-epitop-tabs-mutanter, og man får fat i et meget 25 stort antal aminosyresubstitutioner i det native molekyle. Mutationsfrekvensen er med den anvendte mutationsmetode så høj, at sjældne varianter effektivt kan isoleres. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er hurtig og enkel nok og tillader isolering af et meget stort antal mutanter, og den kan anvendes på et 30 hvilket som helst overfladeprotein, blot man har cDNA-materiale og monoklonale antistoffer.

Da man let får et stort antal epitop-tabs-varianter, kan man detaljeret kortlægge proteinernes tilgængelige overflader, iden-35 tificere ligandbindingssteder og designe proteiner, som er mindre antigene, men har større biologisk virkning.

- 3 - DK 172110 B1

Desuden er det ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen muligt direkte at anvende egnede, skræddersyede ligander som negative selektionsreagenser, hvorved man kan få identificeret grupper, som er af betydning for ligand- eller substrat/pro-5 tein-interaktionen, og som kan være anbragt i lommer, hvor de er utilgængelige for antistoffer. En identifikation af ligand-bindingsstederne vil lette strukturstudier, som kan føre til design af nye ligander og lægemidler.

^•0 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har været anvendt til at afgrænse de områder, hvor CD2-antigenet bindes til monoklonale ant i-CD2-antistof fer , og til at afgrænse b i ndi ncssteder ne på CD4-antigenet for HIV (human immunodeficiency virus).

^ CD2-cDNA-mutationer, som fører til tab af CD2-antistofreaktivi-tet, selekteres. Ammosyresubstitutionsmønsteret i mutanterne viser, at der findes tre forskellige epitoper eller omrader i CD2-molekylet: en epitop, som genkendes af antistoffer af grupper I og II, en anden epitop, som genkendes af antistoffer af gruppen III, og en tredje epitop, som genkendes af antistoffer af gruppen IV. Når de aminosyregrupper, som er af betydning for antistofbindingen, og de aminosyregrupper, som er af betydning for LFA-3-bindingen, sammenlignes, viser det sig, at antistoffer af gruppe I og II interagerer med en del af LFA-3-bin-^ dingssædet, at antistoffer af gruppe III interagerer med en anden del af LFA-3-bindingsstedet og at antistoffer af gruppe IV interagerer med en tredje del, som ikke er involveret i bindingen af LFA-3. Desuden tyder den nære overensstemmelse mellem virkningen af enkeltsubstitutioner i bindingsstederne for anti-stoffer af gruppe I og for LFA-3 på, at antistoffer af gruppe I formidler deres virkning på T-celleakt iveringen ved en efterligning af virkningen af LFA-3-bindingen.

Opfindelsen skal i det følgende nærmere beskrives ved hjælp ^ af tegningen, hvor fig. 1 skematisk viser mutant isolationvektoren og den anvendte mutantisolationsprocedure, idet fig. 1A viser vektoren . 4 _ DK 172110 B1 piH3MCD2, som er anvendt ved mutantisolationen, og fig. IB skematisk viser mutantisolationsstrategien. I trin I behandles C0£-celler, som udtrykker mutantmolekyler og vildtypemolekyler, med et monoklonalt antistof, som genkender den epitop, hvis 5 tab man ønsker. De celler, som stadig udtrykker epitopen, binder antistoffet, hvilket efterfølgende leder til komplementfiksering (trin II) og lysering af cellerne. I trin III behandles de resterende celler med et antistof, som genkender en anden epitop (III) af CD2-mclekylet, og man lader disse celler hæfte sig 10 til skåle, som er overtrukket med antisera, der genkender mono-klonale museantistoffer. Kun de celler, som udtrykker den anden epitop, bindes til skålene (IV). Fra disse celler indvindes plasmid-DNA. I det første trin fjernes de molekyler, som stadig udtrykker den epitop, hvis tab man ønsker; i det andet trin 15 forøges metodens effektivitet, og det sikres, at man ikke får værdiløse mutanter.

Tegningens fig. 2 viser placeringen af forskellige epitoper i den primære CD2-sekvens, idet fig. 2A viser den forudsagte 20 sekvens af det fuldstændige CD2-protein. Transmembranområdet er markeret med en mørk understregning. De anvendte antistoffer er vist længst til venstre. Symbolerne under den primære sekvens viser hvert antistofs sensitivitet over for ændringer i den position. Et "0" betyder, at man har fået en mutant med en sub-25 stitution i den position, eller at man ved indirekte immuno- fluorescens af de mutanter, som fremkom med et andet antistof, har vist en sensitivitet over for substitution i denne position. Et "+" betyder, at en substitution i denne position er undersøgt og ikke har vist sig at påvirke antistofreaktiviteten. Et "=" 30 betyder, at kun prolin i den position påvirker reaktiviteten.

Tegningens fig. 3 viser samlingen af mutanter, som afgrænser epitoper i CD2-molekylet. Der er vist den korte strækningssekvens i CD2-polypeptidet, som indeholder begge de to vigtige epitoper. Aminosyresubstitutionsvarianter, som er fremkommet ved mutantselektion, er vist under hver vildtypesekvens. Fig.

3A viser sekvensen for epitop 1 i CD2-polypeptidet. Fig. 3B

_5_ DK 172110 B1 viser sekvensen for epitop 2 i CD2-polypeptidet. Søjlen til højre viser (fra venstre mod højre) det antistof, som er anvendt ved den negative selektion, og det antistof (-stoffer), som er anvendt ved den positive selektion. "Alle 16" betyder, at 5 alle 16 monoklonale antistoffer i fig. 2 er anvendt i kombination ved den positive selektion. "7 andre" betyder, at 7 andre antistoffer end 35.1, som genkendte den første epitop, anvendes i kombination ved den positive selektion. Varianterne lige under CD2-sekvensen er fremkommet ved selektion af mutanter fra en 10 samling af plasmider, som er muteret igennem hele den del af cDNA-materialet, som koder for proteinets ekstracellulære del. Varianterne under skillelinjen er de mutanter, som er fremkommet ved selektion under anvendelse af plasmider, som kun er muteret ved hjælp af oligonucleotider, der dækker området svarende til 15 skillelinjens bredde.

Tegningens fig. 4 viser epitopernes placering i den primære CD4-sekvens. Den forudsagte sekvens for CD4-proteinet er vist sammen med det foreslåede HIV-bindingssted (markeret med en 20 streg over sekvensen), transmembranområdet (understreget) og de aminosyrepositioner, hvor der forekommer mutant substitution (*) .

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til kort-25 lægning af epitoper i celleoverflade-antigener er det muligt at kortlægge epitoper i et hvilket som helst overfladeprotein, blot man har cDNA-materiale og monoklonale antistoffer. Fremgangsmåden er baseret på anvendelsen af cDNA-epitop-tabs-mutan-ter, og ved hjælp heraf får man fat i et stort antal aminosyre-30 substitutionsmutanter af det native (naturligt forekommende) molekyle, og det er således muligt at kortlægge proteiners tilgængelige overflader, identificere ligandbindingssteder og designe proteiner, som er mindre antigene end deres naturlige modstykker, men som også har en større biologisk virkning.

Ved "celleoverfladeantigen" menes et protein, som er til stede på celleoverfladen; i almindelighed transporteres et celleover- 35 _ 6 . DK 172110 B1 fladeantigen igennem det intracellulære membransystem til cellens overflade. Sådanne antigener er sædvanligvis forankret til celleoverflademembranen via et område i den carboxylterminale ende, som indeholder hydrofobe aminosyrer, der ligger i 5 membranens lipiddobbeltlag. Som beskrevet ovenfor har fremgangs måden ifølge opfindelsen været anvendt til identifikation af bindingsstederne for den humane T-cellereceptor (CD2-antigenet) og til identifikation af HIV-bindingsstedet på CD4-antigenet. Dette er vist henholdsvis i fig. 2 og fig. 4.

10

Mutantisolationen udføres som vist i fig. 1. Denne fremgangsmåde omtales her i forbindelse med isolation af CD2-epitop-tabs-mu-tanter. Den har dog været anvendt til identifikation af CD4-epi-top-tabs-mutanter, og den kan i almindelighed anvendes på andre 15 celleoverfladeantigener.

Som vist i fig. 1 isoleres CD2-epitop-tabs-mutanter som følger: COS-celler transfekteres med en samling af mutageniserede plas-mider, som har været dyrket i 48 timer, høstes og behandles 20 efter tur med et monoklonalt anti-CD2-antistof (dvs. med et monoklonalt antistof, som genkender den epitop, hvis tab man ønsker), med et kanin-anti-museimmunoglobulin-antistof og med komplement. Dette trin betegnes som det negative selektionstrin og er vist med I i fig. IB.

25

Da spontane deletionsmutanter ofte opstår i COS-celler (Calos, M.P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, bd.80, s.3015-3019, ( 1983);

Razzaque, A. et al, Proc. Natl. Acad, of Sci., USA, bd.80, s.3010-3014 ( 1983 )), udføres et positivt selektionstrin som 30 følger: de celler, som forbliver upåvirkede efter komplementbehandlingen, behandles med antistof(-fer), som genkender en eller flere forskellige CD2-epitoper, og man lader dem hæfte til skåle, som er overtrukket med gede-anti-museimmunoglobulin-anti-stof; Wysocki, L.J. og Sato, V.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 35 bd.75, s.2844-2848, (1978). De antistoffer, som er anvendt ved isolation af epitop-tabs-mutanterne er vist i tabel 1.

- 7 - DK 172110 B1

Det indvundne plasraid-DNA fra de vedhæftede celler (Hirt, B., J. Mol. Biol., bd.26, s.365-369, (1967)) transformeres derefter over i E. coli, forstærkes og genindføres i COS-celler til flere runder, som det nu er passende. Ved slutningen af selektionspro-5 cessen transfekteres DNA fra enkelte bakteriekolonier ind i COS-celler, som herefter bedømmes ved antistofbindingsforsøg.

TABEL 1 10

Anvendte antistoffer ved isolation af epitop-tabs-mutanter

Antistof Isotop 9.6 IgG2a 15 7E1° IgG2b MT910 IgGj^ MT110 IgGj^ 95-5-49 35.! IgG2a T11/3PT2H9 IgG.

20 1 T11/3T4-8B5 IgG2a

9-2 IgM

Nu-Ter IgG^ CLB-Tll/1 IgGj^ *39B21 IgG~ 25 2a TS1/8.1.1 IgG-j^ F92-3A11 IgGj^ 9.! igG2b

OCH217 IgM

30 ♦Antistoffet 39B21 er et monoklonalt rotteantistof, mens alle andre antistoffer er museantistoffer.

^ Ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til kortlægning af epitoper i CD2-antigenet anvendes vektoren piH3M til isolation af mutanter. Et segment af cDNA, der koder for celleoverfladeantigenet, indsættes i vektoren piH3M, jævnfør US

_ 8 _ DK 172110 B1 patentansøgning nr. 160.416. piH3M indeholder et plasmidreplika-tionsstartsted og et suppressor-tRNA-gen, som tillader replika-tion og selektion i E. coli. Desuden indeholder den replika-tionsstartsteder fra bakteriophag M13 og fra SV40-virus (fig.

5 1A). Herved tillades produktion af en enkeltstrenget version af plasmidet og forstærkning af plasmidet efter indsættelse i celler, som udtrykker de proteiner, der er nødvendige for replikationen af SV40, dvs. COS-abeceller. Ekspressionen af celle-cDNA-overfladeantigener i COS-celler styres af nærområde-10 promotoren fra den humane cytomegalovirus. RNA-splejsnings- og 3’-ende-startsignaler findes efter cDNA-materialet og stammer fra SV40-virus.

Ved isolationen og afgrænsningen af de områder, hvor CD2-celle-15 overfladeepitoperne bindes til de monoklonale anti-CD2-antistof-fer, selekteres cDNA-mutationerne ved de heri beskrevne fremgangsmåder .

Den indledningsvise mutantisolation drager fordel af den høje 20 mutationsfrekvens, som det i vævskulturceller transfekterede DNA udviser (Calos, M.P. et al, se ovenfor; Rassaque, A. et al, se ovenfor; Miller, J.H. et al, EMBO J. bd.3, s.3117-3121, (1984)). En plasmidpopulation, som er muteret ved passage af CCS-celler, udtrykkes i E. coli. Disse mutanter underkastes 25 tre på hinanden følgende selektionsrunder, hvor det monoklonale antistof (Mab) 9.6 anvendes ved den negative selektion, og Mab 35.1 anvendes ved den positive selektion, og der isoleres en enkelt mutant (fig. 2).

30 Den isolerede mutant bærer to nucleotidsubstitutioner, som udskifter Lys48 med Asn og Aspl86 med Glu. (I det følgende benævnes de forskellige mutanter ifølge vildtype-mutant-konventionen, således at betegnelsen Lys48Asn angiver, at lysin i position 48 er blevet erstattet med asparagin.) Når disse to udskiftnin-35 ger separeres ved oligonucleotidmutagenisering, viser det sig, at Lys48Asn som den eneste er ansvarlig for tabet af bindingsevnen til antistoffet 9.6. Yderligere forsøg med andre antistoffer g DK 172110 B1 på at isolere flere mutanter fra denne samling forblev dog resultatløse .

Aminosyresubstitutionsmønsteret i mutanterne afgrænser tre 5 forskellige områder i CD2-molekylet, som omfatter mange sekvensvarianter. Antistoffer, som deltager i aktiveringen, og som blokerer for vedhæftningen af erythrocytter, bindes til et første område; antistoffer, som kun blokerer vedhæftningen, bindes til et andet område; og antistoffer, som deltager i aktiveringen 10 men ikke blokerer vedhæftningen, bindes til et tredje område.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen har man også isoleret og afgrænset de områder, hvor CD4-celleoverfladeepitoper bindes til monoklonale anti-CD4-antistoffer. Ved anvendelse af fremly gangsmåden har man isoleret aminosyresubstitutionsvarianter af CD4. Mutationer, som påvirker HIV-bindingen, findes i en klynge af epitoper, som blandt andet indeholder Leu3a-epitopen.

I den følgende detaljerede beskrivelse vil der blive henvist 20 til diverse metoder, som er velkendte for fagfolk inden for rekombinant genetik.

De generelle principper vedrørende rekombinant-DNA-teknik kan læses i standardværker, som f.eks. Darnell, J.E. et al, Mole-25 cular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., New York, (1986); Lewin, B.M., Genes II, John Wiley & Sons, New York (1985); Old, R.W. et al, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, anden udgave, University of California Press, Berkeley, California, (1981); og i Mania-30 tis, T. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1982).

CD2

Randomiseret mutation og selektion af CD2-epitop-mutanter 35 For at opnå en forhojet mutantisolationssandsynlighed har man udtænkt en almen metode til med høj effektivitet at opnå randomiseret mutation af et hvilket som helst DNA-materiale. Se for _10_ DK 172110 B1 eksempel Botstein, D. og D. Shortle, Science, bd.229, s.1193-1201, (1985). En homogen og ikke-specifik substitution af alle mulige basepar,der koder for det ekstracellulære CD2-område, foretages eller fremstilles ud fra en samling af 20 overlappende 5 oligonucleotider bestående af 33 enheder (33-mere oligonucleo-tider), der er syntetiseret med en blanding bestående af 95% af vildtypebasen i hver position og 1,7% af hver af de andre tre baser. Oligonucleotiderne gøres overlappende, da der ikke på passende vis kan kompenseres for det molekyle, som er bundet 10 til matrixen under syntesen, og da effektiviteten for inkorporering af mutationer netop i oligonucleotidets ende er ukendt.

For at maksimere baseparsubstitutionseffektiviteten anvendes den af Kunkel beskrevne fremgangsmåde til inkorporering af de-15 genererede oligonucleotider i ekspressionsvektoren piH3MCD2 (fig. 1A), jævnfør Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, bd.82, s.488-492, (1985). På basis af oligonucleotidernes dege nerering og disses inkorporeringseffektivitet skønnes det, at omkring 40% af plasmiderne, der fremkommer som resultat af 20 transformeringen ind i E. coli, indeholder mindst en basesubstitution. Tyve særskilte mutageniseringsreaktioner foretages, der transformeres ind i E. coli, og en del af hver af de resterende kulturer samles i en mutantsamling.

25 jyjår en prøve af mutantsamlingen underkastes det selektive system under anvendelse af Mab 9.6 ved den negative selektion og Mab 35.1 ved den positive selektion, finder man, at 10-15% af de indvundne plasmider bærer den ønskede fænotype. Efter to runder udgør de ønskede mutanter omkring 50-75% af plasmidpopulationen. 30 Den samme mutantsamling anvendes ved alle de efterfølgende mutantselektioner.

Mutationernes placering 114 primære mutanter isoleres, hvilket resulterer i en samling 35 på 50 forskellige aminosyresekvensvarianter. Mutantselektionernes resultat er resumeret i fig. 2 og 3. Hele variationen forekommer i tre forskellige områder. Område 1 er centreret omkring DK 172110 B1 - 11 -

Lys48 og indeholder 47 mutationer, idet der er anvendt alle antistoffer af gruppe I (9.6, 7E10, MT110 og MT910), alle på nær et af antistofferne af gruppe II og et antistof af gruppe III (fig. 3A). Område 2 er centreret omkring Gly95. I denne 5 anden epitop eller dette andet område fås 27 mutanter, idet der anvendes fem forskellige antistoffer ved den negative selektion (fig. 3B). Det eneste stimulerende antistof kommer i kontakt med et bredere område end nogen af de andre antistoffer, men der kan ikke skelnes tydeligt på nogen anden måde; hvert antistof giver sit eget enestående mutationsmønster. De fleste af de antistoffer, som genkender område 2, har ringe virkning på T-celleaktiveringen. Område 3 er repræsenteret med en enkelt mutation, som leder til tab af reaktivitet med begge antistofferne af gruppe IV (9.1 og OCH217).

15

Fig. 3A viser den samling af mutanter, som afgrænser område 1. CD2-aminosyrerne nr. 42-56 er vist ovenover de aminosyresub-stitutioner, som er indkodet i mutanterne. Den første søjle til højre viser det antistof, som er anvendt ved den negative 2° selektion. Den anden søjle viser de antistoffer, som er anvendt ved den positive selektion. "Alle 16" angiver, at alle 16 mono-klonale antistoffer i tabel 1 er anvendt i kombination ved den positive selektion. "7 andre" betyder, at de syv andre antistoffer end 35.1, som genkender det første område, er anvendt i

O C

J kombination ved den positive selektion. Varianterne lige under CD2-sekvensen er fremkommet ved selektion af mutanter fra en samling af plasmider, som er muteret i proteinets ekstracellu-lære område. Varianterne under skillelinjen angiver mutanter, som er fremkommet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved 30 anvendelse af plasmider, som kun er muteret ved hjælp af oligo-nucleotider, der dækker et område svarende til skillelinjens længde. Den mutantsamling, der afgrænser område 2, er vist i fig. 3B. CD2-aminosyrerne nr. 86-100 er vist over substitutionsmutanterne. Ellers er fig. 3B magen til fig. 3A.

35 - 12 - DK 172110 B1

Erythrocyt-rosettedannelse

De muterede CD2-proteiners evne til at fremme den LFA-3-mediere-de vedhæftning af humane erythrocytter til transfekterede COS-celler måles ved en kvalitativ erythrocyt-rosette-analyse. Det 5 viser sig, at der er tale om tre fænotyper: En vildtype, en delvis vildtype og en ikke-rosettedannende type. Mange af de mutationer, som leder til ændringer i område 1 og 2 (reaktion med antistoffer af gruppe I, II og III), reducerer dramatisk rosettedannelsen. For at undersøge dette yderligere fremstilles 10 nogle få mutanter ved specifik oligonucleotidmutation. Substitution af lysin med asparagin eller alanin i hver af positionerne 46, 47 og 48 i område 1 demonstrerer en slående korrelation mellem bindingen af antistoffet Mab 9.6 af gruppe I og erythro-cytvedhæftningen; Lys46Asn/Ala viser en moderat effekt på både 15 Mab 9.6- og erythrocytbindingen; Lys47Asn/Ala har ingen effekt på nogen af delene, og Lys48Asn/Ala ophæver fuldstændigt begge interaktioner. På lignende måde kan aminosyre nr. 51 vises at være af betydning for både erythrocytbindingen og bindingen af Mab 9.6. Aminosyre nr. 52 har kun en svag effekt på de to 20 interaktioner.

Efterfølgende undersøgelser med andre antistoffer eller andre mutanter har vist, at Lys48 spiller en vigtig rolle ved interak-tionen mellem CD2 og antistoffer af gruppe I og LFA-3 (fig. 2 25 og 4). For eksempel er mutanten Lys48Gly ikke-reaktiv med alle antistofferne af gruppe I, og ingen af molekylerne med en substitution ved Lys48 har nogen påviselig rosettedannende aktivitet. Den måde, som de molekyler, der er substitueret ved Lys48, opfører sig på, er et af de stærkeste beviser på, at antistoffer 30 af gruppe I efterligner effekten af LFA-3-bindingen ved at provokere T-cellernes proliferation.

Kun et antistof, som deltager i aktiveringen af T-celler, genkender determinanter i det andet område. Substitutioner i dette 35 område er ejendommelige ved at føre til en rosettedannelse uden fuldstændig at eliminere den, hvilket er i overensstemmelse med den antagelse, at mutationer, som er selekteret med anti- . 13 _ DK 172110 B1 stoffer, der frenuner aktiveringen, sædvanligvis er mutationer, som påvirker rosettedannelsen.

Virkningen af enkelte aminosyresubstitutioner 5 Skønt visse aminosyrer direkte kan have indflydelse på antistoffets reaktivitet, lader det til, at der kan findes andre aminosyrer, som er af sekundær betydning for antistofaffiniteten, da disse hyppigt ændres i tilknytning til andre ændringer. For eksempel finder man ofte en Lys46Asn-substitution i mutanter, 10 som ikke binder Mab 9.6, men substitutionen i sig selv leder kun til delvist tab af bindingsevne. Et lignende fænomen er den gentagne isolering af dobbeltmutanter med mutationer i position 51 og 52.

15 i princippet kan aminosyresubstitutioner lede til tab af antistof- eller LFA-3-bindingsevne enten ved eliminering af en særlig interaktion imellem disse eller ved at lede til en lokal denaturering. Nogle antistof- eller LFA-3-bindingsmønstre udgør et argument mod den sidste mulighed. For eksempel binder alle 20 de molekyler, som er substitueret ved Lys48, stadig Mab 35.1, der er følsom over for ændringer ved Ile49. På lignende måde bindes hverken Mab 9.6 eller LFA-3 til Gln5lLeu-varianten, som ikke desto mindre genkendes af antistofferne 7E10 og 9-2. CD2 har en Gln5lArg-substitution, som ikke er reaktiv med 7E10 og 25 9-2, men det binder LFA-3 på en måde, så det ikke kan skelnes fra vildtypen. I den anden epitop leder Tyr9lAsp-mutationen til tab af rosettedannelsesevnen, men bindingen af antistoffet NU-TER påvirkes ikke, selv om mange substitutioner i position 92 eliminerer NU-TER-reaktiviteten.

30 I et tilfælde kan lokal denaturering spille en dominerende rolle ved tab af antistofbindingsevnen. Prolin vides at have en begrænset konformationsfrihed, hvilket ikke er til gavn ved dannelsen af alfahelixen (Chou, P.Y. og Fasman, G.D., Ann. Rev.

35 Biochem., bd.47, s.251-276, (1978)). Gln51Pro-varianter genken des ikke af nogen af antistofferne, som reagerer med det første område, og Gln5lPro isoleres hyppigt ved negativ selektion med „ DK 172110 B1 antistoffer hørende til område 1, hvis der anvendes positiv selektion med alle 16 antistoffer. I det mest ekstreme tilfælde leder negativ selektion med Mab 35.1 udelukkende til Gln5lPro, når alle 16 antistoffer anvendes i kombination ved den positive 5 selektion. For at undgå gentagne isoleringer af Gln5lPro isoleres mange af mutanterne i det første område (fig. 2 og 3) med Mab 35.1 som det eneste positive selektionsantistof.

For at isolere en anden 35.1-mutant end Gln5lPro anvendes kun 10 de antistoffer, som ikke bindes til denne variant ved den positive selektion. Efter tre enrichment-runder fremkommer en enkelt 35.1 Ile49Gln-mutant, som er ændret i alle de tre baser i originalkoden. Denne mutations usædvanlige natur tyder på, at antistoffets 35.1 affinitet skyldes flere egenskaber ved CD21 s kon-^ formation, således at substitution svarende til en enkelt egenskab kun sjældent leder til væsentligt formindsket affinitet. Gln5lPro-mutationen kan eliminere flere af disse interaktioner ved kraftig ændring af den lokale sekundære struktur. Da affiniteten af antistoffet 35.1 er sammenlignelig med affiniteten af antistoffet 9.6 (Martin, P.J. et al, J. Immunol., bd.131, s.180-185, (1983)), lader det til, at dette antistofs usædvanlige mutationsspektrum skyldes en kvalitativt anderledes bindingsmåde og ikke simpelthen en stærkere interaktion. Et andet antistof af gruppe II, T11/3PT2H9, giver også kun Gln5lPro-muta-tioner, når alle 16 monoklonale antistoffer anvendes i kombination ved den positive selektion.

Epitop svarende til antistoffer af gruppe IV

Kun én mutant er fremkommet ved anvendelse af antistoffer af 3° gruppe IV, nemlig en Tyrl40Asn/Glnl4lHis-dobbeltsubstitution.

Imidlertid reagerer antistoffer af gruppe IV kun svagt med CD2-molekylet, som er udtrykt på COS-celler, en situation, som minder om disse antistoffers af gruppe IV svage reaktivitet med CD2 på ikke-aktiverede T-celler (Meuer, S.C. et al, Cell, bd.36, ^ s.897-906, (1984)). Forudgående aktivering af T-celler eller inkubering med et antistof af gruppe I er nødvendig for at tilgængeliggøre epitopen for antistoffet af gruppe IV (Meuer, S.C.

. 15 . DK 172110 B1 et al, se ovenfor). Den hurtige fremkomst af reaktivitet for disse antistoffer af gruppe IV tyder på, at denne skyldes en konformationsændring i molekylet og ikke en de novo syntese af en anden type (Meuer, S.C. et al, se ovenfor; Yang, S.Y.

5 et al, J. Immunol., bd.137, s.1097-1100, (1986)).

Alle de omtalte monoklonale antistoffer har et tilsvarende lineært mutationsvariationsmønster. Alle tre områder er hydrofile, som man ville vente for en fri del af molekylet, der er 10 tilgængelig for antistofbinding (fig. 2). Flere alternative forklaringer kan fremsættes som forklaring på, at kun få, begrænsede dele af molekylet giver anledning til flere uafhængige antistoffer. For eksempel forudsiges en del af den første epitop at danne en alfahelix med hydrofile grupper på den ene side 15 af helixen og hydrofobe grupper på den anden (Chou, P.Y. og Fasman, G.D., Ann. Rev. Biochem., bd.47, s.251-276, ( 1978)).

En sådan helix menes at udgøre et særligt foretrukket antigen, som kan genkendes af T-celler (De Lisi, C. og Berzofsky, J.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bd.82, s.7048, (1985)), og muse- 20 hjælper-T-cellers genkendelse af dette område kan lede til et korrekt indstillet antistofrespons. I det område af rotte-CD2-sekvensen, som svarer til område 2 (fig. 3B), findes tre potentielle N-linkede glycosyleringssæder (Williams, A.F. et al, J. Exp. Med., bd.165, s.368-380, (1987)), som ikke findes i 25 den humane sekvens. Dette kan tjene til at forstærke reaktiviteten med den humane sekvens ved en reduktion af antallet af muse-suppressor-T-celler, som kunne krydsreagere med den humane sekvens. Alternativt kan det begrænsede spektrum af antistofbindingssæder skyldes den forudgående selektion af antistoffer 30 ved erythrocytreceptorreaktiviteten.

CD4

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er anvendt til isolation af aminosyresubstitutionsvarianter af CD4. De mutationer, som på-3^ virker bindingen af HIV, findes i en klynge af epitoper, som indeholder Leu3a-epitopen (fig. 4). Epitopkortlægningsundersø-gelser viser, at de fleste anti-CD4-antistoffer, blandt andet - 16 - DK 172110 B1 de antistoffer, der er mest effektive til at blokere CD4-gpl20-interaktionerne, genkender det aminoterminale område i CD4. Epitopernes placering sammen med ligheden mellem det aminoterminale område af CD4 og områder af immunoglobulin V tillader en 5 afbildning af den overflade på CD4-molekylet, som indgår i in-teraktionen med gpl20.

CD2 kan formidle både celle-celle-vedhæftning og antigenuafhængige aktiveringsreaktioner. HIV-kapselproteinet gpl20 bindes 10 til CD4 med høj affinitet (Kd 10 ^M), hvilket tillader indtrængning af viruset i værtscellen. Celleoverfladeekspression af CD4 er nødvendig for den virale indtrængning og synes i humane celler at være tilstrækkeligt til, at en person er modtagelig for infektionen. Interaktionen mellem CD4 og gpl20 leder også 15 til syncytium-dannelse mellem inficerede celler og ikke-infice-rede celler, der bærer CD4, hvilket i det mindste delvist er årsagen til den cytopathiske effekt, som observeres efter viral infektion in vitro.

20 De funktionelt afgrænsede bindincpsteder, som er påvist ved anvendelsen ifølge opfindelsen, navnlig disse, som er rettet mod CD2- eller CD4-molekylet, kan fremstilles på opløselig form og kan derfor anvendes ved kendte immunodiagnostiske analysemetoder, blandt andet ved radioimmunoassays, enzymimmunoassays 25 og enzyme-linked-immunosorbent-assays (ELISA). Desuden kan de celleoverfladeantigener, som er isoleret ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, fremstilles på opløselig form og indgives alene eller i kombination med andre celleoverfladeantigener fremstillet ifølge opfindelsen ved behandlingen af immunrelaterede forstyr-30 reiser i dyr, blandt andet mennesker. Som eksempel på sådanne tilfælde kan nævnes immundefektsygdomme, AIDS, astma, rheumatoid arthritis, immunopathogene nyreskader, immune endocrinopathier og afstødning af transplanterede væv eller organer.

35 Opløselige former af CD4, som mangler det tredje ekstracellulære disulfidbundne område, såvel som det transmembrane område og det cytoplasmiske område, er i stand til at binde gpl20, Deen, _ 17 DK 172110 B1 K.C. et al, Nature, bd.331, s.82-84, (1988), Dalgleish et al,

The Lancet, 7. november 1987, s.1047-1049. Dette indsnævrer CD4-molekylets HIV-bindingsaktivitet til de to områder nærmest den aminoterminale ende. Områderne nærmest den aminoterminale 5 ende er for en stor del homologe til områder af immunoglobulin V, hvilket tyder på, at gpl20 kan interagere med et immunoglo-bulinlignende område af CD4.

Bindingsstedet for HIV på CD4-molekyler er indirekte lokaliseret 10 ved anvendelse af monoklonale antistoffer under interferens med CD4-gpl20-interaktionerne. To epitoper i CD4 synes at være nær HIV-bindingssædet, den ene er afgrænset af Leu3a-antistoffet og 0KT4A-antistoffet, og den anden er afgrænset af antistofferne MT151 og VIT4. De to epitoper er indbyrdes forskudt for hinan-15 den, de antistoffer, som genkender den ene epitop, intefererer ikke med bindingen af de antistoffer, som genkender den anden epitop. Anti-idiotype-antistoffer, som er rejst mod antistoffet Leu3a, genkender også en bevaret del af gpl20, hvilket viser, at Leu3a-epitopen faktisk omfatter en del af HIV-bindingsstedet.

20

Som resultat af identifikationen af HIV-bindingsstedet på CD4 er det muligt at fremstille peptider, der interfererer med HIV's evne til at inficere humane celler, ved at forhindre viruset i at interagere med CD4-molekylets celleoverfladereceptor. Dette 25 Jean f.eks. gøres ved at fremstille peptider, som bindes til HIV, og således forhindrer det i at blive bundet til celleoverfladereceptoren. Til dette formål er f.eks. et peptid med den samme eller næsten den samme aminosyresekvens som Leu3a-epitopen eller den epitop, som i fig. 4 er markeret med en overliggende 30 linje, særligt anvendelig. Sådan et peptid kan syntetiseres ved anvendelse af kendt teknik og indføres (f.eks. ved intravenøs indgift) i et individ på opløselig form (f.eks. som en del af et andet protein, f.eks. et immunoglobulin) i tilstrækkelig mængde, så det bindes til HIV og interfererer med dettes evne 35 til at inficere celler.

. 18 . DK 172110 B1 Når antigenerne fremstillet ifølge opfindelsen anvendes til irrmunterapi, kan de eventuelt være mærket med et terapeutisk stof. Som eksempel på sådanne stoffer kan nævnes lægemidler, radioisotoper, lektiner og celletoxiner.

5

Opfindelsen skal i det følgende nærmere belyses ved hjælp af nogle eksempler.

EKSEMPEL I 01igonucleotidmutation 10 Degenererede oligonucleotider syntetiseres på et DNA-syntcseap-parat af typen Applied Biosystems under anvendelse af en blanding af phosphoramiditforbindelser, 95% af vildtypesekvensen og 1,7% af hver af de andre tre phosphoramiditforbindelser, i hver position. 600 nucleotider i CD2-sekvensen efter position 15 63, jævnfør Seed, B. og Aruffo, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bd.84, s.3365-3369, (1987), syntetiseres som en samling af 20 33-mere oligonucleotider. Sekvensen fremgår også af US patentansøgning nr. 160.416. Hvert oligonucleotid overlapper den foregående oligonucleotidsekvens med tre baser. Basen nærmest 3’-20 enden kan ikke muteres (syntesen skrider fremad i retningen 3'-5' ud fra en phosphoramiditforbindelse, som er fastgjort til en bærerharpiks); imidlertid kan man få mutanter i form af et oligonucleotid, som er ændret i basen nærmest 5'-enden. Dette medfører, at en overlapning på en base er tilstrækkeligt 25 til at kunne opnå mutationer i alle positioner. Oligonucleoti- derne oprenses efter deprotektion og afsaltning ikke yderligere, men phosphoryleres straks ved anvendelse af polynucleotidkinase (Pharmacia) under de af Maniatis, T. et al i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring 30 Harbor, New York, (1982) beskrevne betingelser. Ti nanogram af hvert phosphoryleret oligonucleotid sættes separat til 500 ng af et enkeltstrenget nucleotid, der fungerer som skabelon. Hver blanding opvarmes kortvarigt til 70°C, afkøles til stuetemperatur, og der tilsættes deoxynucleotidtriphosfater, 10 enheder 35 revers transcriptase (Life Sciences) og revers-transcriptase-puffer, så man får et slutvolumen på 10 ul. Efter en times inkubation ved 37°C tilsættes ATP, dithiotreitol og bovint - 19 - DK 172110 B1 serumalbumin, så man tilnærmelsesvis opnår de anbefalede reaktionsbetingelser for T4-DNA-ligasen (New England Biolabs), som tilsættes (400 enheder), idet der yderligere inkuberes i 15 min. ved 37°C. En femtedel af hver ligationsreaktionsblanding 5 anvendes til transformering af E. coli, hvilket resulterer i omkring 1.000 bakteriekolonier fra hvert oligonucleotid. Kolonierne fra hver plade skrabes af og overføres til en LB-opløsning, og der fremstilles 20 stamopløsninger i glycerol, der hver repræsenterer en population af piH3MCD2, som er muteret et eller 10 andet sted i sekvensen på 33 basepar.

Der fremstilles enkeltstrenget DNA som skabelon i stammen BW313/p3, der er afledt af BW313 (Kunkel, T.A., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, bd.82, s.488-492, (1985)) ved transformation 15 med det RPl-relaterede plasmid p3 (Seed, B., Nuc. Acid Res., bd.ll, s.2427-2445, (1983)). BW313/p3 tillader selektion af plasmider, som indeholder et suppressor-tRNA-gen, ved vækst i medier, som indeholder ampicillin og tetracyclin. Plasmidet piH3MCD2 indføres i BW313/p3, og enkeltstrenget DNA fremstilles 20 ved at inficere den plasmidbærende stamme med vildtypeviruset M13, jævnfør Levison, A. et al, J. Mol. Appl. Genetics, bd.2, s.507-517, (1984). Det enkeltstrengede DNA, som er fremstillet i BW313/p3, har 20-30 uracilmolekyler pr. streng. Dette tillader effektiv selektion af den in vitro fremstillede DNA-streng og 25 således inkorporering af oligonucleotidet (Kunkel, T.A., se ovenfor). Inkorporeringsfrekvensen er omtrent 75%.

Specifikke aminosyreændringer i position 46, 47 og 48 udføres på lignende måde, bortset fra at der anvendes oligonucleotider 30 med et bestemt kodningspotentiale i stedet for degenererede oligonucleotider.

EKSEMPEL II CD2-mutantselektion

Der fremstilles sfæroplaster ud fra bakterier, som indeholder 35 det mutageniserede plasmid piH3MCD2, og disse fusioneres til COS-celler, jævnfør US patentansøgning nr. 160.416. 48 timer efter fusionen frigøres de COS-celler, som udtrykker CD2, fra _ 20 . DK 172110 B1 skålen i PBS/lmM EDTA. COS-cellerne fra seks 60 mm skåle inkuberes så i PBS, 10% kalveserum, 0,02% natriumazid (PBS-FBS) indeholdende en 1/1000-fortynding af ascitesvæske med antistoffet fra den negative selektion. Alle antistofinkubationer udføres 5 i 1 ml PBS-FBS i 30 min. på is og efterfølges af centrifugering gennem et dæklag af 2% Ficoll i PBS. Så inkuberes cellerne med 5 ug/ml kanin-anti-muse-Ig-antistof (Rockland). To ml 50% kaninkomplement (Pel-Freeze) i DME (GIBCO) tilsættes, og der inkuberes ved 37°C i 30 min. med omrøring, så klumpdannelse forhin-10 dres. Komplementet fjernes ved fortynding til 10 ml med PBS/5mM EDTA,og cellerne centrifugeres gennem et dæklag med 5 ml Ficoll. Herefter inkuberes cellerne med en 1/1000-fortynding af antistoffet fra den positive selektion og sættes til skåle, som er overtrukket med fåre-anti-museimmunog]obul in (Cooper Bio-15 medical) (Wysocki, L.J. og Sato, V.L., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, bd.75, s.2844-2848, (1978)), jævnfør også US patentansøg ning nr. 160.416. Efter en times henstand vaskes de ikke-vedhæf-tede celler forsigtigt væk, og man udvinder DNA-materialet fra en Hirt-supernatant af de vedhæftede celler. Det udvundne DNA-20 materiale transformeres over i E. coli MC1061/p3, og de resterende kolonier underkastes enten flere selektionsrunder eller analyseres direkte. Ved den direkte analyse anvendes plasmid-DNA fra enkeltkolonier til transfektion af COS-celler ved en DEAE-dextran-procedure, jævnfør US patentansøgning nr. 160.416.

25 Mutantfænotyperne analyseres ved sekventiel indirekte immuno- fluorescens, hvor man først anvender antistoffet fra den negative selektion og derefter antistoffet fra den positive selektion.

Når hele det ekstracellulære område af CD2-mokelyket skal mute-30 res, kombineres bakterier fra alle 20 prøver, så man får en tilfældigt substitueret præparation. I tilfældet med styret mutation anvendes kun bakterierne fra en eller to prøver.

En partiel liste over monoklonale antistoffer er fremskaffet 35 gennem Third International Workshop on Leukocyte Typing.

. 21 . DK 172110 B1

EKSEMPEL III

DNA-sekvensanalyse og rosettedannelsesevne for CD2-mutanterne Mutanternes DNA-sekvens bestemmes på enkeltstrenget DNA-materia-le på alkalidenatureret plasmid-DNA ved dideoxynucleotidmetoden 5 (Sanger, F. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bd.74, s.5463- 5467, (1977)). For de mutanter, som er fremkommet ved anvendelse af et tilfældigt muteret plasmid piH3MCD2, sekvenseres hele det ekstracellulære område af CD2-molekylet. For mutanter, som er fremkommet ved styret mutagenisering, sekvenseres en 200 10 bp stor del af det cDNA-materiale, som indeholder det muterede område. I alle tilfælde falder mutationerne som forventet inden for et område svarende til et enkelt oligonucleotid.

48 timer efter transfektionen lader man en 2% opslæmning af 15 Peterson-erythrocytter sætte sig på bundne COS-celler ved henstand i en halv time ved stuetemperatur. Overskydende erythro-cytter fjernes forsigtigt, og fænotypen underkastes en mikroskopisk undersøgelse. Alle rosette-fænotyper analyseres ved mindst tre forskellige lejligheder sammen med vildtypen og negative 20 kontrolprøver. I visse tilfælde bekræftes ekspressionen af over-flade-CD2 ved indirekte immunofluorescens efterfulgt af udsættelse for erythrocytter.

Vildtype-rosetter er ejendommelige ved tæt binding af erythro-25 cytter til COS-cellerne. Ved en delvis rosettedannelse er der færre erythrocytter, som er løsere bundet end for vildtype-rosetternes vedkommende. Tab af rosettedannelsesevnen betyder, at mutanten ikke kan skelnes fra en negativ kontrolstamme (dvs. CS8-eksprimerende COS-celler). I tabel 2 er vist de forskellige 30 mutantsubstitutioner, som giver anledning til rosettemønstrene. De med komma adskilte aminosyresubstitutioner findes på samme molekyle.

35 22 DK 172110 B1 TABEL 2

Vildtype-rosette Delvis Ingen rosettedannelse rosettedanneIse 5 Lys47Ala/Asn Lys46Ala/Asn Lys48Ala/Met/Glu

Gln5lArg GlnPhe51-2ArgSer Gln5lLeu

Phe52Val,Glu55Gly Gln52Pro

TyrGlnl40-lAsnHis Tyr9lAsp Thr93Ser,Gly95,Val

Asp92His Asn97lle 10 EKSEMPEL IV CD4-mutantselektion

Den heri beskrevne anvendelse, hvorved overfladeantigen- epitop-tabs-mutanter kan isoleres, or blevet anvendt på CD4-15 antigenet med den modifikation, at spheroplasterne fremstilles ud fra bakterier, som indeholder det muterede plasmid piH3MCD4. CD4-antigenet er af særlig interesse, da det tjener som T-celle-bindingssæde for HIV.

20 Isolationen af epitop-tabs-mutanter udføres som følger: Et CD4-cDNA-materiale, som er isoleret fra HPB-ALL-cellelinjen, muteres ved forening af degenererede oligonucleotider, der er fremstillet som beskrevet i eksempel I, til et deoxyuridinsubstitueret enkeltstrenget nucleotid som skabelon. Den muterede plasmidpopu-25 lation indføres i COS-celler ved spheroplastfusion. To dage efter fusionen høstes cellerne og inkuberes efter tur med et monoklonalt anti-CD4-antistof, kanin-anti-muse-Ig-antisera og kaninkomplement. Dette resulterer i en selektion rettet mod de celler, som bærer determinanter, der genkendes af det mono-30 klonale antistof. For at undgå at isolere gendannelser, som fuldstændigt eliminerer CD4-ekspressionen, inkuberes de celler, som resterer efter komplementlyseringen, med de kombinerede monoklonale anti-CD4-antistoffer, og man lader cellerne hæfte til gede-anti-muse-Ig-overtrukne petriskåle. Plasmid-DNA fra 35 de celler, som hæfter til de antistofovertrukne plader, anvendes til transformering af E. coli, forstærkes og genindføres i COS-celler. Efter tre selektionsrunder i COS-celler transfekteres plasmidpræparationer fra enkelte bakteriekolonier over i COS- _ 23 DK 172110 B1 celler og analyseres to dage senere ved indirekte immunofluor-escens. De plasmider, som har indkodede CD4-molekyler, og som ikke har reageret med det monoklonale antistof, som anvendtes ved komplementfikseringen, men som har bevaret andre CD4-deter-5 minanter, sekvenseres. Fig. 4 viser de aminosyreplaceringer i den primære sekvens, hvor man ved udskiftninger får et tab af evnen til at bindes til de viste antistoffer. Tabel 3 angiver den aminosyre, som i hvert af tilfældene er substitueret. Amino-syrevarianter er benævnt efter konventionen vildtype-position-ny 10 type i tabel 3 og hele vejen igennem teksten, f.eks. betegnes en variant, der bærer tyrosin i stedet for serin, som normalt findes på position 18, Serl8Tyr.

De fleste af de mutanter, som er isoleret, frembyder nucleotid-15 substitutioner. Der er dog også isoleret en insertions- og en deletionsmutant. Disse to sidstnævnte omordninger har tilsyneladende ikke noget at gøre med oligonucleotidmutationen, men skyldes snarere passagen gennem COS-celler. Det er nemlig kendt, at transfektion af COS-celler resulterer i en mutationsfrekvens 20 på omkring 1%. Størstedelen af disse skader er insertioner og deletioner.

Epi topplaceringer

De fleste af mutanterne, blandt andet flere, som er udvalgt 25 ved anvendelse af antistoffer, der kraftigt kan blokere gpl20-CD4-interaktionen, har indkodede aminosyresubstitutioner i den aminoterminale, Ig V-lignende ende af CD4-molekylet. Dette område har flere af de vigtigste egenskaber ved et Ig-område; to cystein-, en arginin- og en glutaminsyregruppe, som i et immuno-30 globulin danner henholdsvis en disulfidbinding og en saltbro, og en bevaret tryptophangruppe, som gør det meget sandsynligt, at den aminoterminale ende af CD4-molekyletfoldes på samme måde som et Ig V-område. På basis af denne hypotese kan der laves en model, der viser placeringen af aminosyresubstitutionerne 35 i βη foldet struktur. Ved hjælp af modellen kan man også forudsige interaktionen af gpl20 med dette område af CD4-molekylet.

_ 24 . DK 172110 B1

Antistoffet 66.1 selekterer mutationer, som forårsager amino-syrevariation i CD4-molekylets aminoterminale ende (fig. 4 og tabel 3). Substitutionerne er adskilt med op til 23 grupper, hvilket tyder på, at 66.1 genkender en epitop, der dannes af 5 proteinets tredimensionale foldningsmønster og ikke af den primære aminosyresekvens. Mutationerne falder i to områder, som svarer til det første og andet hypervariable område i et Ig V-segment. Disse to områder er nær hinanden i det foldede immu-noglobulinmolekyle, skønt de er temmeligt langt fra hinanden 10 i den primære sekvens. Dette resultat bekræfter med stor sandsynlighed ideen om, at CD4-molekylets aminoterminale ende foldes på samme måde som områder i Ig V-molekylet.

Anti-CD4-antistoffers evne til at blokere bindingen af andre 15 anti-CD4-antistoffer bekræfter ligeledes med stor sandsynlighed

Ig-f oldningsmønsteret. For eksempel koder de mutanter, som er selekteret ved anvendelse af antistofferne VIT4 og 13B.8.2, for aminosyresubstitutioner, der ligger omkring 70 aminosyrer væk fra de aminosyrer, der er indkodet i de af antistoffet G19-2 20 selekterede mutanter (fig. 4 og tabel 3). Både 13B.8.2 og VIT4 kan i alt væsentligt blokere bindingen af G19-2; og dette kunne forudsiges fra foldningsmønsteret af Ig.

Antistofferne 66.1 og G19-2 kan ikke blokere CD4-gpl20-interak-25 tionen, selv ikke i en koncentration, der er mange gange højere end mætningskoncentrationen. Dette betyder, at gpl20 interagerer ved CD4-molekylet på en sådan måde, at molekylets front, der dannes af de homologe strenge til B-C-strengen i CD4-molekylet, ikke er involveret. Binding af enten Leu3a eller 0KT4A kan fuld-30 stændigt blokere bindingen af det andet antistof. Ingen af disse antistoffers binding kan effektivt eliminere bindingen af antistofferne 66.1 og G19-2. Den mutant, som er selekteret ved anvendelse af 0KT4A, koder for en substitution af en aminosyre i D-strengen i en Ig-foldning; de mutanter, som er selekteret 35 ved anvendelsen af Leu3a, koder for varianter af C- og C”-

strengene. Konfigurationen af B-, C-, C'-, C"- og D-strengene i en Ig-foldning leder til den forudsigelse, at Leu3a og T4A

25 DK 172110 B1 interagerer med fronten på det område, der dannes af de homologe strenge til D-, E- og C"-strengene i CD4- Både T4A og Leu3A blokerer CD4-gpl20-interaktionen ved en meget lille antistofkoncentration. Hvis 0KT4A og Leu3a blokerer gpl20-molekylets adgang 5 til et sæde på CD4-molekylets aminoterminale ende, må dette sæde være på de homologe strenge til D-, E- og C"-strengene i CD4 .

Binding af antistoffet VIT4 til CD4 interfererer hverken med 10 bindingen af Leu3a eller T4A. Dette er ikke overraskende, når man ser på VIT4-epitopens anbringelse (fig. 4), imidlertid er VIT4 lige så god som Leu3a og T4A til at blokere den CD4-gpl20-afhængige syncytiumdannelse. VIT4 kan indirekte blokere gpl20-molekylets adgang til et bindingssæde på D-, E- og C"-strengen, 15 eller det kan interferere med et andet bindingssæde et stykke væk, enten ved indirekte at blokere adgangen eller ved at optage dette bindingssæde. Det faktum, at G19-2 konkurrerer med VIT4 om binding til CD4, men ikke blokerer CD4-gpl20-interaktionen, tyder på, at VIT4-antistoffets evne til at blokere gpl20 er 20 indirekte. Phylogenetisk bevaring af HIV-følsomheden uden beva ring af VIT4-epitopen understøtter den betragtning, at denne epitop ikke direkte er involveret i HIV-bindingen.

Antistoffet MT151 blokerer interaktioner med CD4 på samme måde 25 SOm VIT4; det blokerer for gpl20-molekylets interaktion, men ikke for binding af 0KT4A eller Leu3a. De substitutioner, der er kodet for i MTl51-epitop-tabs-mutanterne, findes 5 og 77 grupper væk i retning mod den carboxyterminale ende i forhold til den substitution, som er forbundet med tab af VIT4-epitopen. 30 Antistoffet MT151 genkender tydeligvis en epitop, som er dannet ved konformationen af det foldede protein. Denne epitop er overlappende med VIT4- og 13B.8.2-epitoperne, men den indeholder også den carboxyterminale ende af det andet område. MTl51-epito-pen placerer den carboxyterminale ende af det andet disulfid-35 bundne område i CD4-molekylet i umiddelbar nærhed af den carb oxyterminale ende af det område, der ligner den aminoterminale ende af Ig-molekylet, og giver yderligere grobund for den antagelse, at VIT4 og MT151 blokerer CD4-gpl20-interaktionen ved _ 26 . DK 172110 B1 at blokere adgangen til et sæde i det andet område, ikke det første område.

Mutationernes virkning på syncytium-dannelsen 5 Ved hjælp af disse mutanter kan nogle af de forudsigelser, som blev gjort ved epitopplaceringerne, nærmere undersøges. En manifestation af CD4-gpl20-interaktionen er dannelsen af multinu-cleære kæmpeceller, såkaldte syncytia. Disse syncytia er i det mindste delvist ansvarlige for den virale infektionscytopatiske 10 virkning. Syncytia kan dannes af celler, som kun udtrykker HIV-env-genproduktet gpl60, der interagerer med celler, som udtrykker CD4-molekylet. Vi var ikke i stand til at inducere dannelsen af syncytia i transfekterede COS-celler, imidlertid viste HeLa-celler sig at være meget effektive ved celle-celle-fusi oner.

15 Mutanterne er alle undersøgt for deres evne til at samarbejde om dannelse af syncytia ved transfektion af HeLa-celler efterfulgt af infektion med et rekombinant vacciniavirus, som udtrykker HIV-gpl60. Der tilvejebringes HeLa-cellelinjer, som stabilt udtrykker nogle af CD4-mutanterne, ved anvendelse af en retrovi-20 ral vektor, som bærer en resistens over for G-418. Enkelte kloner eller flere i kombination af de G-418-resistente celler opformeres og testes for syncytium-dannelse efter infektion med et vacciniavirus, som udtrykker gpl60. De samme resultater opnås med den transiente analyse, hvor der stabilt udtrykkes 25 enkelte eller flere kloner af G-418-cellelinjer.

De fleste af aminosyrevarianterne er lige så effektive som vild-type-CD4 til at fremme dannelsen af syncytia. I modsætning hertil har udskiftning af aminosyrer nr. 39, 44, 45 og 46 en slå-30 ende virkning på CD4-molekylets evne til at fremkalde syncytia-dannelsen, og det samme gælder en insertionsmutant, som er isoleret ved anvendelse af MTl51-selektion. Man mener om flere af de substitutioner, at de sandsynligvis forårsager en lokal denaturering af proteinet. For eksempel har den variant, som 35 er udvalgt ved anvendelse af T4/18T3A9-antistoffet, en prolin-gruppe, som erstatter den glutamingruppe, der normalt findes i position 39. Prolin har en meget mere ufri rygrad end glutamin _ 27 . DK 172110 B1 og kan forventes at ændre den lokale foldningsstruktur. På lignende måde har de varianter, som er udvalgt ved anvendelse af 0KT4D, nemlig Gly46Arg og Gly46Glu, fået erstattet glycin med store, ladede grupper, som kan risikere at denaturere den homo-5 loge streng til C"-strengen i CD4-molekylet.

Skønt de substitutioner, som påvirker syncytium-dannelsen, kan afbryde proteinfoldningen, tyder flere observationer på, at virkningen på syncytium-dannelsen skyldes ændringer i et lille 10 område eller af kort rækkevidde i proteinstrukturen. Substitutioner, som svarer til de substitutioner, hvor den CD4-medierede syncytium-dannelse elimineres, blot på andre steder, har ikke den samme virkning; Gln39Pro-varianten har kun en moderat reduceret evne til at fremme syncytium-dannelsen, mens varianterne 15 Gly37Glu og Glnl64Pro er lige så effektive som vildtype-CD4 med hensyn til syncytium-dannelse. Lys45Asn, Gly46Val-dobbelt-substitutionen, som er selekteret ved anvendelse af Leu3a, er ikke tydeligt splittende, men eliminerer dog syncytium-dannelsen .

20

Insertionsmutationens virkning, hvor den pågældende mutant er isoleret ved anvendelse af MT151, på CD4-molekylets struktur er svær at vurdere. Mutationen har resulteret i en stor insertion, 13 aminosyrer lang, nær det andet områdes ende. Punktmuta-25 tioner, som er selekteret ved anvendelse af MT151, viser, at CD4 foldes på en sådan måde, at denne del af det andet område er meget nær den carboxyterminale ende i det første område.

Det er muligt, at insertionen har en meget indirekte virkning på foldningen af CD4-molekylet og ændrer det første område.

30

Mutationer, som afbryder syncytia-dannelsen, kan være af mindst to klasser. Det forekommer overvejende sandsynligt, at man ved mutationer, hvor CD4-molekylets evne til at binde gpl20 er elimineret, også har elimineret evnen til at inducere syncytia-dan-35 nelsen. En anden klasse af mutationer er også mulig: nemlig mutationer, hvor syncytia-dannelsen er elimineret, men ikke bindingen .

28 DK 172110 B1

Mutationernes virkning på bindingen af HIV

Mutationernes virkning på CD4-molekylets evne til at binde HIV vurderes ved en indirekte immunofluorescensanalyse. Opkoncentre-rede viruspartikler inkuberes med COS-celler, som udtrykker 5 de forskellige mutationer, og der påvises bundne partikler ved anvendelse af humane sera med en høj anti-gpl20-titer. Bindingen kvantiseres ved celleanalyse på et cytofluorometer. I hvert enkelt tilfælde kvantiseres ekspressionen af CD4 på celleoverfladen sideløbende ved anvendelse af monoklonale anti-CD4-anti-10 stoffer og indirekte immunofluorescens. De variante CD4-moleky-lers evne til at binde virus stemte overens med deres relative effektivitet til induktion af syncytia-dannelsen. Ved de mutationer, hvor syncytia-dannelsen er elimineret, har man også fået elimineret bindingen af viruspartikler. Ved de mutationer, 15 hvor man drastisk har fået reduceres CD4-molekylets evne til at fremme cellefusion, har man ligeledes fået reduceret evnen til at binde gpl20. Dette viser, at den primære virkning af mutationerne går på CD4-molekylets evne til at binde gpl20 og ikke på evnen til at inducere syncytia-dannelsen.

20

Diskussion

Virkningen af de forskellige mutationer på CD4-molekylets evne til at binde gpl20 er i det store og hele i overensstemmelse med de forudsigelser, som blev gjort ved epitopplaceringsunder-25 søgelserne. De mutationer, som sandsynligvis har forårsaget en afbrydelse af C-strengen, opfører sig anderledes i bindings-og syncytia-dannelsesanalyser. De mutationer, som har forårsaget en ændring i C"-strengen, eliminerer CD4-molekylets evne til at binde virus. Den mutant, som er selekteret ved anvendelse 30 af 0KT4A-antistoffet, kunne man have forventet ville opføre sig anderledes end vildtype-CD4 i syncytia-dannelsesanalysen. Denne mutant har indkodet en aminosyreudskiftning i den homologe streng til D-strengen i CD4-molekylets cDNA. Den substitution, som der er kodet for i mutanten, ændrer et sekvensmønster, som 35 er ens i CD4-molekylerne fra mus, rotter og mennesker (muse- SKKG, rotte-SRKN, human-SRRS, 0KT4A-SRRR). Det virker sandsynligt, at denne aminosyreudskiftning ville ændre den forudsagte DK 172110 B1 - 29 - D-streng i CD4-molekylet, men imidlertid ændrer det ikke HIV-bindingen. Desuden bevares OKT4A-epitopen dårligt i primater, som kan inficeres med HIV, hvilket igen tyder på, at OKT4A-anti-stoffets evne til at blokere HIV-bindingen er indirekte og for-5 modentlig kommer i stand ved at blokere adgangen til Leu3a-epi-topen.

VIT4-epitopen er heller ikke så velbevaret som HIV-inficerbar-heden i primater, og den mutation, som er selekteret ved anven-10 delse af dette antistof, påvirker ikke HIV-bindingen. VIT4 blokerer muligvis også HIV-bindingen indirekte ved at forhindre gpl20 i at interagere med sekvenser, som er forskellige fra antistofgenkendelsessædet. De mutationer, som er udvalgt ved anvendelse af dette antistof, falder inden for et område, der 15 ville svare til det fjerde hypervariable område i Ig V-området. Det er muligt, at VIT4 blokerer adgangen til denne del af HIV-bindingssædet, som vi har identificeret som Leu3a-epitopen.

En sådan forklaring er ikke indlysende, set i lyset af den foreslåede sammenhæng mellem de to epitoper og af den grund, at 20 VIT4 ikke interfererer med bindingen af Leu3a og 0KT4A. MT151-epitopen, som overlapper med VIT4-epitopen i det første område, når også den carboxyterminale ende af det andet område. Denne epitop forbinder VIT4-epitopen tættere med det andet område end det første områdes D-, E- og C"-front. VIT4- og MTl51-anti-25 stoffets evne til at blokere gpl20-CD4-interaktionen åbner derfor mulighed for, at der findes et andet HIV-interaktionssæde.

Anti-idiotype-antisera, som genkender antistoffet Leu3a, er i stand til at neutralisere diverse HIV-isolater. Dette har 30 ført til forslag om, at dette antistof genkender en vigtig determinant i HIV-bindingssædet. Overensstemmelsen mellem ekspressionen af Leu3a-epitopen og HIV-følsomheden i primater understøtter antagelsen om, at Leu3a-epitopen er vigtig for HIV-bindingen. Der er tilvejebragt et direkte bevis på identiteten 35 mellem genkendelsessædet for Leu3a og et sæde, som er vigtigt for HIV-bindingen. CD4-varianter, hvis genkendelse af Leu3a er ændret, har også en ændret evne til at binde HIV. Leu3a- . 30 . DK 172110 B1 epitopen findes på det segment af CD4-molekylet, som ville svare til C- og C"-strengene i Ig V-området. Det er sikkert muligt at fremstille stoffer, som efterligner strukturen i denne del af CD4-molekylet. Korte peptider, som omfatter C"-strengen og 5 dennes flankeområder, ville sikkert bindes til gpl20 med en så stor aviditet, at gpl20 ville forhindres i at interagere med CD4. Erstatning af C- og C"-strengen i et autentisk Ig V-område med CD4-beslægtede molekyler ville på lignende måde sikkert resultere i en struktur, som kan interferere med HIV-replikatio-10 nen og/eller -patologien. Sådanne stoffer ville være vigtige lægemidler til behandling af AIDS.

Den primære aminosyresekvens i det humane CD4-protein er vist i fig. 4. Sekvensen nedenunder viser, hvor den tilsvarende 15 musesekvens afviger fra den humane sekvens. Understregningen angiver det transmembrane område i CD4-molekylet. Stregen over sekvensen angiver det foreslåede HIV-bindingssted i CD4-protei- net. De 16 forskellige antistoffer, som er anvendt ved den positive selektion, er vist yderst til venstre. En * over den primæ-20 re sekvens angiver, at en mutant er isoleret, som har en substitution i den position, ved anvendelse af et bestemt antistof. Substitutioner i aminosyrepositionerne nr. 39 og 46 vil påvirke HIV-bindingen. Disse positioner er også vist i fig. 4. I tabel 3 er opstillet en liste over de antistoffer, som er anvendt 25 ved den negative selektion, og over de CD4-mutanter, som er isoleret ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

30 35 _ 31 _ DK 172110 B1 TABEL 3

Anvendt antistof Aminosyreudskiftning ved den negative (oprindelig gruppe/ selektion position/ny gruppe) 5 -

Leu3a K34E1 Lys34Glu

Leu3a N38K og G46D Asn38Lys og Gly46Asp

Leu3a Q39P og T44S Gln39Pro og Thr44Ser jq Leu3a K45N og G46V Lys45Asn og Gly46Val T4 P47S Pro4 7Ser 94bl T44P Thr4 4Pro OKTD G46D Gly46Asp 15 0KT4D G46R Gly46Arg T4/18T3A9 Q39P Gln39Pro F101-5 G37E Gly37Glu G19-2 S18Y Serl8Tyr 2o G19-2 Q19K Glnl9Lys 66.1 Q19H og H26R Glnl9His og His26Arg 66.1 S22G og I23V og Ser22Gly og Ile23Val H26L og His26Leu 13B.8.2 E76K Glu76Lys 25 VIT4 Q78L Gln78Leu 0KT4A S59R Ser59Arg BL/10T4 GllOA GlyllOAla BL/10T4 P121H Prol2lHis 30 OKT4E P121H Prol2lHis 0KT4B Q164P Glnl64Pro NUTH-1 A216G Ala216Gly 35 MT3 21 V325I Val325lle

Der er anvendt enkeltbogstavkoder for aminosyrerne i denne sejle.

Claims

32. DK 172110 B1

1. Fremgangsmåde til isolation af mutanter af DNA-sekvenser, kendetegnet ved at omfatte følgende trin: 5 a. at man transfekterer pattedyrsceller med en vektor, i hvilken der ved ligering er indsat en DNA-sekvens af interesse, b. at man behandler de transfekterede pattedyrsceller med et første monoklonalt antistof, som er rettet imod en 10 epitop i det protein, som DNA-sekvensen koder for, og med komplement under sådanne betingelser, at de celler, som udtrykker epitopen, binder det første monoklonale antistof til sig, og så der sker en komplementfiksering og en lysering af cellerne, som udtrykker 15 epitopen, c. at man behandler de resterende ikke-lyserede pattedyrsceller med et andet monoklonalt antistof, som er rettet mod en anden epitop i DNA-sekvensen, d. at man får de behandlede pattedyrsceller til at hæfte 20 til et substrat, som er overtrukket med antisera, der genkender det andet monoklonale antistof, og e. at man udvinder plasmid-DNA fra de vedhæftede celler.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 25 at pattedyrscellen er en COS-celle.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved,at DNA-sekvensen af interesse koder for et celleoverfladeantigen.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at celleoverfladeantigenet er CD2-antigenet på T-lymphocyter eller CD4-antigenet på T-lymphocyter.

5· Anvendelse af fremgangsmåden ifølge krav 1 til identifikation af 35 epitoper i celleoverfladeproteiner, kendetegnet ved at den anfatter følgende trin:

33. DK 172110 B1 a. at man transfekterer pattedyrsceller med en vektor, i hvilken der ved ligering er indsat en DNA-sekvens af interesse, b. at man behandler pattedyrscellen med et første monoklo- 5 nalt antistof, som er rettet mod en epitop i proteinet, som DNA-sekvensen koder for, og med komplement under sådanne betingelser, at cellerne, som udtrykker epitopen, bindes til det første monoklonale antistof, og så der sker en komplementfiksering og en lysering af cellerne, 10 som udtrykker epitopen, c. at man behandler de resterende ikke-lyserede pattedyrsceller med et andet monoklonalt antistof, som er rettet mod en anden epitop i DNA-sekvensen, d. at man får de behandlede pattedyrsceller til at hæfte til et substrat, som er overtrukket med antisera, der genkender det andet monoklonale antistof, e. at man udvinder plasmid-DNA fra de vedhæftede celler, f. at man forstærker det udvundne plasmid-DNA i en passende værtscelle, 2° g. at man transfekterer pattedyrsceller med en vektor fra trin a, hvor DNA-sekvensen er det forstærkede, udvundne plasmid-DNA, h. at man gentager trin b-g et antal gange, i. at man transfekterer pattedyrsceller med plasmid-DNA- 25 materialet fra trin a-h, og opbevarer de transfekterede celler under betingelser, hvor plasmid-DNA-materialet kan eksprimeres, og j. at man påviser binding af ekspressionsproduktet svarende til det indsatte plasmid-DNA til det forste monoklonale 30 antistof.

6. Anvendelse af en fremgangsmåde ifølge krav 1 til identifikation af epitoper i celleoverfladeproteiner, kendetegnet ved, at den omfatter følgende trin: a. at man transfekterer COS-celler fra aber med vektoren piH3MCD2, hvori der ved ligering er indsat et gen, som koder for i det mindste en del af celleoverfladeproteinet , -34- DK 172110 B1 b. at man dyrker de transfekterede COS-celler i omkring 48 timer, c. at man høster de transfekterede celler og behandler dem efter tur med et negativt selektionsantistof, kanin-anti- 5 muse-immunoglobulinantistof og komplement under passende betingelser for de celler, som udtrykker celleoverfladeproteinet, og for det negative selektionsantistof, så der sker komplementfiksering og lysering af disse celler, d. at man høster de ikke-lyserede celler og behandler dem 10 med et positivt selektionsantistof, e. at man får de ikke-lyserede celler til at hæfte til et substrat, som er overtrukket med fåre-anti-murint-immuno-globulin, f. at man fjerner de ikke-vedhæftede celler, 15 g. at man fremstiller og udvinder et DNA-ekstrakt af de vedhæftede celler, h. at man transformerer det udvundne DNA-ekstrakt over i E. coli MCl001/p3, og i. at man underkaster de resulterende bakteriekolonier flere 20 selektionsrunder som i trin a-h, eller at man direkte analyserer evnen til at bindes til det negative selektionsantistof .

7. Anvendelse ifølge krav 6, kendetegnet ved,at 25 celleoverfladeproteinet er et celleoverfladeantigen fra T-lymphocyter og B-celler.

8. Anvendelse ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det negative selektionsantistof og det positive selektions- 30 antistof er udvalgt fra gruppen bestående af antistofferne i tabel 1. 35