JPH0588784B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分測定用分析素
子に係り、特に生物学的流体試料中の特定微量成
分を分析するための分析素子に関する。 〔従来の技術〕 生物学的流体試料中に含まれる極微量物質を検
出する方法として、免疫測定法（immunoassay）
が広く用いられている。この免疫測定法は、1958
年、ペルソン（Berson）とイアロウ（Yallow）
が、放射性ヨードで標識したインシユリンと抗イ
ンシユリン抗体とを用いて、血清中のインシユリ
ンを測定して以来、数々の発展を遂げてきてい
る。中でも、標識化合物として酵素を用いる酵素
免疫測定法（enzyme immunoa−ssay）が、安
全性、設備の簡便性、感度、精度などの点から、
近年、盛んに用いられてきている。 上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の
１つとして、結合を起した物質（以下、Ｂと略記
する）と起さなかつた物質（以下、Ｆと略記す
る）の分離（以下Ｂ／Ｆ分離と略記する）があ
る。 この問題点を解決するために、各種の改良がな
されてきた（例えば、特開昭53−38619号、同53
−79024号、同55−90859号、同57−67860号、同
57−200862号、同58−18167号、同59−77356号、
及び同59−170768号各公報参照）。しかし、これ
らの方法は、Ｂ／Ｆ分離が不完全である、ノイズ
が多く信号の信頼度に問題がある、測定可能な物
質が低分子物質に限られる、あるいは操作が煩雑
である等の欠点があつた。 更に、この問題を解決するために、２種の固定
相を用いた競合法による免疫測定法が開発されて
いる（例えば、特開昭58−209994号及び同59−
202064号各公報参照）。しかし、これらの測定法
では、両固定相を区別することなく全体の酵素活
性を測定しているため、バツクグラウンドやノイ
ズの問題から、感度、精度及び再現性について満
足な結果が得られていない。 最近免疫測定法の新たな方向として、ウエツト
ケミストリーに対しドライケミストリーが目され
てきている。ドライケミストリーによる免疫測定
法においては、操作性が良好で、再現性に優れ、
また保管、廃棄等の場所をとらないなどのメリツ
トがあり、その１つの形態である分析素子におい
ては、種々の開発が行われてきたが、いまだ充分
な性能を持つものとは言いきれない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明は、前述の従来技術の欠点を改良するた
めになされたものであり、その目的は、分析素子
内で積極的なＢ／Ｆ分離を行い、しかもバツクグ
ラウンドやノイズが少なく、感度、精度及び再現
性に優れた、流体試料中の特定成分を定量するた
めの分析素子を提供することにある。 〔問題点を解するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明は分析素子に関す
る発明であつて、流体試料中の特定成分Ａを、該
特定成分Ａと特異的に結合し得る物質Ｂと、特定
成分Ａ、特定成分Ａの類縁体及び特定成分Ａと特
異的に結合するが該物質Ｂとは異なる物質よりな
る群から選ばれた物質と酵素とが結合した標識物
Ｃと、該標識物Ｃの酵素部位に特異的に結合して
該酵素に起因する信号を変調させる物質Ｄとを用
いて該酵素の活性によつて測定する方法で使用す
る、該物質Ｂ及びＤが同一又は別個の担体に固定
された形でそれぞれ多孔質反応層の一部及び／又
は全部に含有されている分析素子において、該物
質Ｄとして、アリール水銀誘導体を用いてなるこ
とを特徴とする。 本発明において、流体試料としては、あらゆる
形態の溶液、コロイド溶液が使用しうるが、好ま
しくは生物由来の流体試料、例えば、血液、血
漿、血清、脳脊髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、
肉汁等が挙げられる。 本発明により測定しうる流体試料中での特定成
分Ａとは、その存在又は、その流体試料中での量
が測定され、その特定成分Ａに特異的に結合する
物質が得うる物質又は物質群である。すなわち、
ポリペプチド、タンパク質、複合タンパク質、多
糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモン類、ビタ
ミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられる。
具体的には、下記表１の物質又は物質群を挙げる
ことができるが、これらに限定されるものではな
い。 表 １ （タンパク質、複合タンパク質） プレアルブミン、アルブミン、α₁−酸性糖タン
パク質、α₁−アンチトリブシン、α₁−糖タンパク
質、トランスコルチン、α₁−アンチキモトリプシ
ン、α₁−リポタンパク質、チロキシン結合グロプ
リン、セルロプラスミン、Zn−α₂−糖タンパク
質、Gc−グロプリン、インター−α−トリプシ
ンインヒビター、α₁−マクログロブリン、α₂−
HS−糖タンパク質、α₂−マクログロプリン、ハ
プトグロビン、α₂−リポタンパク質、ヘモペキシ
ン、トランスフエリン、β−リポタンパク質、β₂
−糖タンパク質、β₂−マクログロプリン、Ｃ−反
応性タンパク質、ミオグロビン、エリスロポイエ
チン、免疫グロプリン（IgG、IgM、IgA、IgD、
IgE）、補体系成分（C_1q、C_1r、C_1s、C₂、C₃、C₄、
C₅、C₆、C₇、C₈、C₉等）、フイブリノーゲン、ヘ
モグロビン、グリコヘモグロビン、血液凝固因
子、HBs抗原、HBs抗体、酵素（例えば、酸性
ホスフアターゼ、アルカル性ホスフアターゼ、ア
ルカリ性ホスフアターゼアイソエンザイム、α−
アミラーゼ、アミラーゼアイソエンザイム、アル
ドラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチンホス
ホキナーゼ、クレアチンホスホキナーゼアイソエ
ンザイム、トランスアミナーゼ（GOT、GPT）、
乳酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素アイソエンザイ
ム、γ−GTP、リパーゼ、モノアミンオキシダ
ーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ブドウ糖６
−リン酸脱水素酵素等）等 （ホルモン及びホルモン様物質） 卵胞刺激ホルモン（FSH）、黄体刺激ホルモン
（LH）、成長ホルモン（GH）、甲状腺刺激ホルモ
ン（TSH）、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、
メラニン刺激ホルモン（MSH）、バソプレツシ
ン、オキシトシン、インシユリン、グルカゴン、
アンギオテンシン及び、プロラクチン、セク
レチン、ドーパミン、セロトニン、ソマトスタチ
ン、サイロキシン（T₄）、トリヨードサイロニン
（T₃）、ガストリン、コルチゾール、アルドステ
ロン、カテコラミン、エストロゲン、プロゲステ
ロン、テストステロン、胎盤性ゴナドトロピン、
胎盤性ラクトーゲン、下垂体ホルモン放出因子
（TRH、FSH−RH、CRH、LH−RH等）等 （ビタミン類） ビオチン、チアミン、ビタミンＡ、ビタミン
B₂、ビタミンB₆、ビタミンB₁₂、ビタミンＣ、ビ
タミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、葉酸等 （腫瘍マーカー） α−フエトプロテイン、癌胎児性抗原、フエリ
チン、ポリアミン、膵臓癌胎児抗原、塩基性フエ
トプロテイン、Ｍ−タンパク、前立腺酸性ホスフ
アターゼ、糖鎖性抗原（CA19−９、CA125等）、
ガングリオサイズ （各種の薬剤及び代謝産物） ベンゾイルエクゴニン、コカイン、コデイン、
デキストロメトロフアン、ヘロイン、リセルグ
酸、モルヒネ、キニジン、キニーネ、アミカシ
ン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシ
ン、トプラマイシン、アクチノマイセチン、カロ
マイシン、クロラムフエニコール、クロロマイセ
チン、クロルテトラサイクリン、エリトロマイシ
ン、オキシテトラサイクリン、ペニシリン、ポリ
ミキシンＢ、テラマイシン、テトラサイクリン、
ストレプトマイシン、ジフエニルヒダントイン、
エトスクシミド、フエノバルビタール、プリミド
ン、セコバルビタール、アセタミノフエン、アミ
トリブチリン、カルバマゼピン、ジゴキシン、ジ
ソピラミド、リドカイン、メソトレキセート、Ｎ
−アセチルプロカイナミド、フエニトイン、プロ
カイナミド、プロプラノロール、テオフイリン、
カナビノール、テトラヒドロカナビノール、コリ
ン抑制薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロピン、ブチ
ロフエノン、カフエイン、クロロプロマジン、エ
ピネフリン、グリセオフルビン、イミプラミン、
Ｌ−ドーパ、メペリジン、メプロバメート、メタ
ドン、ナルセイン、ノルトリブチリン、オキサゼ
パム、パパベリン、プロスタグランジン、テグレ
トール、バルプロン酸等及びこれらの代謝産物 （微生物表面マーカー） バクテリア抗原、菌類抗原、寄生虫抗原、ウイ
ルス抗原 （農薬） ハロゲン化ビフエニル、リン酸エステル類、チ
オホスフエート類、及びこれらの代謝産物 （その他） 血液型物質、カルジオリピン、アレルゲン、等 本発明に使用しうる流体試料中の特定成分と特
異的に結合する物質としては、測定対象により抗
体、抗原、レクチン、プロテインＡ、特定酵素の
阻害物質などが挙げられるが、該特定成分と該結
合物質の結合反応が抗原−抗体反応である場合が
特に好ましい。本発明で使用する抗体は、その由
来を特に限定されるものではなく、哺乳動物等に
抗原を投与、免疫して得られる抗血清、腹水液を
そのままか、あるいは従来公知の方法である（右
田俊介編「免疫化学」中山書店第74〜88頁参照）、
硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニウム沈殿
法、セフアデツクスゲルによるゲル過法、イオ
ン交換セルロースクロマトグラフイー法、電気泳
動法等で精製して用いることができる。 あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマ
ウス）脾臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とか
ら雑種細胞（ハイプリドーマ）を得てモノクロー
ナル抗体をつくつても良い。 また、これらの抗体はIgG、IgM、IgA、IgD、
IgE各分画を用いることができ、あるいはこれら
の抗体を酵素処理してFab、Fab′、又はＦ（ab′）₂
といつた活性抗体フラグメントにして使用しても
よい。更にこれらの抗体は単一で使用しても、複
数の抗体を組合せ使用してもよい。 流体試料中の特定成分と特異的に結合する物質
として抗体又は抗原を用いた場合、本発明分析素
子の測定原理は免疫測定法に属する。本発明の分
析素子は免疫測定法において特に好ましく使用で
きるので、以下免疫測定法を例にとつて本発明の
構成を説明するが、本発明はこの説明に限定され
るものではなく、種々の応用が可能であることは
以上に述べてきた内容からも明らかである。 本発明において、該標識物Ｃの酵素部位に特異
的に結合して該標識酵素に起因する信号を変調さ
せる物質Ｄとして用いられるアリール水銀誘導体
は、一般式Ｒ（HgX）_oで表わされる有機水銀化合
物である。 一般式において、Ｒはベンゼン又はナフタレン
環を表わし、置換基を有してもよく、その置換基
としては、ハロゲン原子（Ｆ、Cl、Br、Ｉ）、−
CN、−NO₂、−SH、−OR、

【式】− CO₂R¹、−COR¹、

【式】−SO₃R¹、− SO₂R¹、

【式】−OCOR¹、

【式】−NHCOR¹、−NHSO₂R¹、 置換基を有してもよいアルキル基及びフエニル
基、等が挙げられ、R¹、R²は置換基を有しても
よいアルキル基及びフエニル基及び水素原子を表
わす。ベンゼン又はナフタレン環上の置換基の数
は７以下であるが好ましくは３以下である。Ｘは
１価の酸基を表わす。ｎは１又は２の整数を表わ
す。 本発明におけるアリール水銀誘導体の具体例を
以下に示すが、これらに限定されるものではな
い。

【式】

【式】

【式】

【式】

【化】

【化】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【化】

【化】

【化】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

〔ピリジル・ジスルフイド基の導入は３−（2′−ジチオピリジル）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルやメチル−３−（4′−ジチオピリジル）プロピオンイミデートなどで処理すれば良い。またチオール基の導入は(3)項で述べた方法などが利用できる〕

(5) 該物質Ｅ及び該酵素がチオール基を有してい
るか、あるいは還元等によりチオール基を生ず
る、あるいは適当な化合物で処理することによ
りチオール基を導入できる場合、その片方の物
質のチオール基をピリジル・ジスルフイド基に
変換し、結合すべき相手物質のチオール基と反
応させる方法。 （チオール基のピリジル・ジスルフイド基への
変換は、４，4′−ジチオピリジンなどにより行う
ことができる。） (6) 該物質Ｅ及び該酵素に、存在する又は導入し
た、アミノ基又はチオール基と、ｐ−ベンゾキ
ノリンを反応させる方法。 (7) モノヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルを、該物質Ｅ及び該酵素に、存在す
る又は導入した、チオール基に反応させる方
法。 （但し、(3)〜(7)の方法においては、該酵素に存
在する活性に関与するチオール基が該物質Ｅとの
結合にあずからないような条件で、該物質Ｅと該
酵素の結合を行うことはもちろんである。） (8) 該物質Ｅに対する抗体、該酵素に対する抗
体、及び前２者の抗体に共通に特異結合する抗
体を反応させる方法。 (9) 該物質Ｅ、該酵素の片方をアビジンと残りを
ビオチンと結合しておき、両者をビオチン・ア
ビジン結合により結合させる方法。 本発明に適用しうる標識酵素は、アリール水銀
誘導体と結合し、該酵素活性を変化させる酵素で
あり、その代表的な例を表２に挙げる。これらの
酵素の活性は、それぞれの酵素に適した活性測定
法を用いて測定することができる。 表 ２ １、１、１、１ アルコールデヒドロゲナーゼ １、１、１、２ アルコールデヒドロゲナーゼ
（NADP⁺） １、１、１、８ グリセロール−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ １、１、１、10 Ｌ−キシルロースレダクターゼ １、１、１、18 myo−イノシトール−２−デヒ
ドロゲナーゼ １、１、１、22 UDPグルコースデヒドロゲナ
ーゼ １、１、１、26 グリオキシル酸レダクターゼ １、１、１、27 乳酸デヒドロゲナーゼ １、１、１、29 グリセリン酸デヒドロゲナーゼ １、１、１、30 ３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲ
ナーゼ １、１、１、37 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ １、１、１、40 リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（オ
キサロ酢酸−脱炭酸）（NADP⁺） １、１、１、41 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ
（NAD⁺） １、１、１、42 イソクエン酸デヒドロゲナーゼ
（NADP⁺） １、１、１、44 ホスホグルコン酸デヒドロゲナ
ーゼ（脱炭酸） １、１、１、50 3α−ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ １、１、１、95 ホスホグリセリン酸デヒドロゲ
ナーゼ １、１、３、１ グリコール酸オキシダーゼ １、１、３、４ グルコースオキシターゼ １、２、１、１ ホルムアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ １、２、１、４ アルデヒドデヒドロゲナーゼ
（NADP⁺） １、２、１、５ アルデヒドデヒドロゲナーゼ
（NAD(P)⁺） １、２、１、12 グリセルアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ １、４、１、１ アラニンデヒドロゲナーゼ １、４、１、３ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（NAD(P)⁺） １、４、１、４ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（NADP） １、４、３、３ Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ １、５、１、５ メチレンテトラヒドロ葉酸デヒ
ドロゲナーゼ １、９、６、１ 硝酸レダクターゼ（シトクロ
ム） １、13、11、12 リポキシゲナーゼ １、14、13、２ ４−ヒドロキシ安息香酸３−モ
ノオキシゲナーゼ １、14、16、１ フエニルアラニン４−モノオキ
シゲナーゼ ２、１、１、６ カテコールメチルトランスフエ
ラーゼ ２、１、３、２ アスパラギン酸カルバモイルト
ランスフエラーゼ ２、１、３、３ オルニチンカルバモイルトラン
スフエラーゼ ２、３、１、６ コリンアセチルトランスフエラ
ーゼ ２、３、１、７ カルニチンアセチルトランスフ
エラーゼ ２、４、１、１ ホスホリラーゼ ２、４、１、22、ラクトースシンターゼ ２、６、１、19 アミノ酪酸アミノトランスフエ
ラーゼ ２、７、１、１ ヘキソキナーゼ ２、７、１、２ グルコキナーゼ ２、７、１、12 グルコノキナーゼ ２、７、１、19 ホスホリブロキナーゼ ２、７、１、32 コリンキナーゼ ２、７、２、１ 酢酸キナーゼ ２、７、２、２ カルバミン酸キナーゼ ２、７、３、２ クレアチンキナーゼ ２、７、３、３ アルギニンキナーゼ ２、７、４、３ アデニル酸キナーゼ ２、７、４、６ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ ２、７、７、７ DNAヌクレオチジルトランス
フエラーゼ ３、１、１、３ トリアシルグリセロールリパー
ゼ ３、１、１、13 コレステロールエステラーゼ ３、１、３、２ 酸ホスフアターゼ ３、１、４、４ ホスホリパーゼＤ ３、１、31、１ 脾臓エンドヌクレアーゼ ３、２、１、１ α−アミラーゼ ３、２、１、２ β−アミラーゼ ３、２、１、14 キチナーゼ ３、２、１、18 ノイラミニダーゼ ３、２、１、20 α−Ｄ−グルコシダーゼ ３、２、１、21 β−Ｄ−グルコシダーゼ ３、２、１、22 α−Ｄ−ガラクトシダーゼ ３、２、１、26 β−Ｄ−フルクトフラノシダー
ゼ ３、２、１、31 β−Ｄ−グルクロニダーゼ ３、４、11、８ ピログルタミルアミノペプチダ
ーゼ ３、４、14、１ ジペプチジルペプチターゼ ３、４、21、１ キモトリブシン ３、４、22、２ パパイン ３、４、22、３ フイシン ３、４、22、４ プロメライン ３、４、22、６ キモパパイン ３、４、22、８ クロストリパイン ３、５、１、５ ウレアーゼ ３、５、１、24 コロイルグリシンヒドロラーゼ ３、５、２、６ β−ラクタマーゼ ３、５、３、１ アルギナーゼ ３、５、４、４ アデノシンデアミナーゼ ３、６、１、１ インオ−ガニツクピロホスフア
ターゼ ３、６、１、９ ヌクレオドピロホスフアターゼ ４、１、１、１ ピルビン酸デカルボキシラーゼ ４、１、１、39 リプロ−ス二リン酸カルボキシ
ラーゼ ４、１、２、11 ヒドロキシマンデロニトリルリ
アーゼ ４、２、１、24 ホスホビリノーゲンシンターゼ ４、３、１、５ フエニルアラニンアンモニアリ
アーゼ ４、３、２、２ アデニロコハク酸リアーゼ ５、１、３、２ UDPグルコース４−エピメラ
ーゼ ５、３、１、１ トリオースリン酸イソメラーゼ ５、３、１、６ リボースリン酸イソメラーゼ ６、２、１、１ アセチル−CoAシンセターゼ ６、４、１、２ アセチル−CoAカルボキシラ
ーゼ 等 標識酵素に起因した信号は、吸光度法（比色
法）、蛍光法又は、発光法で検出することができ、
測定法としては信号の経時的変化を測定するレー
ト測定法又は、一定時間後の信号を測定するエン
ドポイント測定法で測定することができる。吸光
度法（比色法）では、紫外光、可視光、近赤外光
を利用することができ、例えば流体試料として血
清を用いる場合には、血清による吸光の影響を小
さくするために、緑色光、赤色光又は、近赤外光
を利用するのが好ましい。 本発明における多孔質反応層とは、該特定成分
Ａ、該物質Ｂ、該標識物Ｃ、及び該物質Ｄの間に
起きる結合反応を行う層であり、該物質Ｂ及びＤ
は反応層の一部若しくは全部に固定化されている
必要がある。この固定化は、水不溶性担体に物理
的あるいは化学的に結合することのみならず、該
物質Ｂ及びＤ自身が元々水不溶性か若しくは水不
溶性にさせられて該分析素子内での流動性が押え
られている状態をもさす。また、反応時間中流体
試料を保持するために、反応層の一部若しくは全
部に、流体試料と自由に接触し得る相互連絡空隙
孔（短径5μm〜300μmが好ましい）を有する多孔
性構造が存在していることが必要である。 該物質Ｂ及びＤが水不溶性担体に物理的あるい
は化学的に結合している場合、水不溶性担体すな
わち該多孔質反応層の素材については、上記の条
件を満たしていれば、特に限定されない。この場
合の例を以下に述べる。 好ましい例としてはサイズ10〜350μmの粒状体
あるいは40〜400メツシユの繊維から１つ以上選
ばれた素材により構成される構造体が挙げられ
る。該粒状体の材料としては、ケイ藻土、二酸化
チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結
晶セルロース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架
橋デキストラン、架橋ポリアクリルアミド、アガ
ロース、架橋アガロース、各種合成樹脂（ポリス
チレンなど）などの他、次の表３に示したような
反応性基を持つ化合物から成る自己結合型粒子が
挙げられる。 表 ３ (1) ポリ（スチレン−コ−グリシジルメタクリレ
ート）〔90／10〕。 (2) ポリ（スチレン−コ−メチルアクリレート−
コーグリシジルメタクリレート）〔80／15／
５〕。 (3) ポリ（スチレン−コ−ｎ−ブチルメタクリレ
ート−コ−グリシジルメタクリレート）〔75／
15／10〕。 (4) ポリ（スチレン−コ−ビニルベンジルクロラ
イド−コ−グリシジルメタクリレート）〔80／
10／10〕。 (5) ポリ（スチレン−コ−ジビニルベンゼン−コ
−グリシジルアクリレート）〔90／２／８〕。 (6) ポリ（ｐ−ビニルトルエン−コ−グリシジル
メタクリレート）〔90／10〕。 (7) ポリ（メタクリレート−コ−グリシジルメタ
クリレート〔80／20〕。 (8) ポリ（スチレン−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノエチルメタクリレート）〔95／５〕。 (9) ポリ（スチレン−コ−アジリジルエチルメタ
クリレート）〔95／５〕。 (10) ポリ（スチレン−コ−メチルアクリレート−
コ−アクロレイン）〔90／５／５〕。 (11) ポリ（スチレン−コ−アクリルアミド）
〔95／５〕。 (12) ポリ（スチレン−コ−ビニルチオール）
〔95／５〕。 (13) ポリ（スチレン−コ−メチロール化アクリ
ルアミド）〔95／５〕。 (14) ポリ（スチレン−コ−ｔ−ブチルアクリレ
ート−グリシジルメタクリレート）〔90／５／
５〕。 (15) ポリ（スチレン−コ−ビニルイソシアネー
ト）〔95／５〕。 (16) ポリ（メチルアクリレート−コ−スチレン
−コ−Ｎ−メチロールアクリルアミド）〔50／
35／15〕。 (17) ポリ（スチレン−コ−グリシジルメタクリ
レート−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメ
タクリレート）〔90／５／５〕。 (18) ポリ（スチレン−コ−メタクリル酸−コ−
アクリルアミド）〔95／２／３〕。 (19) ポリ（スチレン−コ−Ｎ−メチロールアク
リルアミド−コ−アクリル酸メトキシエチル）
〔90／５／５〕。 (20) ポリ（ｐ−ビニルトルエン−コ−Ｎ−メチ
ロールアクリルアミド−コ−アクリル酸）
〔90／８／２〕。 (21) ポリ（メチルメタクリレート−コ−グリシ
ジルメタクリレート−コ−ｔ−ブチルアクリレ
ート）〔80／10／10〕。 (22) ポリ（スチレン−コ−ｐ−ビニルベンジル
クロライド−コ−アクリル酸−コ−アクリル酸
ウレイドエチル）〔75／10／５／10〕。 (23) ポリ（スチレン−コ−メタクロレイン−コ
−α−ヒドロキシエチルメタクリレート）
〔90／５／５〕。 (24)ポリ（スチレン−コ−アクロレイン−コ−ア
セトアセトキシエチルメタクリレート）〔85／
５／10〕。 (25) ポリ（スチレン−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノエチルアクリレート−コ−ビニルスルホ
ニルエチルメタクリレート）〔90／５／５〕。 (26) ポリ（ｐ−ビニルトルエン−コ−アミノス
チレン−コ−ビニルスルホニルエチルメタクリ
レート）〔85／10／５〕。 (27) ポリ（スチレン−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ミノエチルメタクリレート）〔90／10〕。 (28) ポリ（スチレン−コ−アクリル酸）〔97／
３〕。 (29) ポリ（スチレン−コ−アクリルアミド）
〔97／３〕。 (30) ポリ（ｐ−ビニルトルエン−コ−ｔ−ブチ
ルアクリレート）〔95／５）〕。 (31) ポリ（メチルアクリレート−コ−メタクリ
ルアミド）〔95／５〕。 (32) ポリ（スチレン−コ−Ｎ−メチロールアク
リルアミド）〔95／５〕。 (33) ポリ（ｐ−ビニルベンジルクロライド−コ
−Ｎ−メチロールアクリルアミド）〔96／４〕。 (34) ポリ（スチレン−コ−イタコン酸）〔98／
２〕。 (35) ポリ（スチレン−コ−ｔ−ブチルアクリレ
ート）〔92／８〕。 (36) ポリ（メチルアクリレート−コ−スチレン
−コ−アクロレイン）〔30／65／５〕。 (37) ポリ（メチルメタクリレート−コ−スチレ
ン−コ−２−ヒドロキシエチルメタクリレー
ト）〔25／70／５〕。 (38) ポリ（スチレン−コ−ビニルスルホニルエ
チルアクリレート）〔80／20〕。 (39) ポリ（スチレン−コ−Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ミノエチルアクリレート）〔90／10〕。 (40) ポリ（スチレン−メチルアクリレート−コ
−アセトアセトキシエチルアクリレート）
〔90／５／５〕。 (41) ポリ（スチレン−コ−メタクリル酸）
〔95／５〕。 各例示化合物の後の括弧内は重合反応に用いた
単量体の重量％を示す。 あるいは、これらの粒子数種を混合して用いる
こともできる。 また、本発明の多孔質反応層に用いる繊維とし
ては、バルブ（粉末紙など）、綿、麻、絹、羊
毛、キチン、キトサン、セルロースエステル、ビ
スコースレーヨン、銅アンモニアレーヨン、ポリ
アミド（６−ナイロン、６，６−ナイロン、６，
10−ナイロンなど）、ポリエステル（ポリエチレ
ンテレフタレートなど）、ポリオレフイン（ポリ
プロピレン、ビニロンなど）、ガラス繊維、石綿
などの植物性・動物性・鉱物性・合成・半合成・
再生繊維を用いることができ、あるいはこれらを
混合して用いても良い。 このような粒状体、繊維、あるいは粒状体と繊
維の混合物を塗布及び／又は製膜することによ
り、流体試料と自由に接触し得る相互連絡空隙孔
を有する多孔性構造が存在する多孔質反応層を形
成する。自己結合性を有しない粒子は適当な接着
剤を用いて粒子同志が点接着する形で製膜するこ
とができ、例えば特開昭49−53888号、同55−
90859号、同57−67860号各公報の方法を適用する
ことができる。自己結合性を有する有機ポリマー
粒子は特開昭57−101760号、同57−101761号、同
58−70163号各公報に記載の方法により同様に製
膜できる。繊維又は繊維及び粒子の混合物につい
ては特開昭57−125847号、同57−197466号各公報
に記載された繊維分散液を塗布することにより多
孔質反応層を形成できる。また特願昭59−28571
号明細書で行われている方法のようにゼラチンや
ポリビニルピロリドンのような水溶性バインダー
を使用した繊維分散液を塗布することも可能であ
る。 このような分散液を製造するためには、多くの
方法を単独又は組合せて用いることが可能であ
る。例えば有用な方法の１つとして、界面活性剤
を液体キヤリヤーへ添加し、粒子及び／又は繊維
の分散液中における分布及び安定化を促進するこ
とができる。 使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、
トライトンＸ−100（ローム アンド ハース社
製、オクチルフエノキシポリエトキシエタノー
ル）、サーフアクタント10G（オリーン社製、ノニ
ルフエノキシポリグリシドール）等の非イオン性
界面活性剤がある。 上記界面活性剤は、広範に選択された量を用い
ることが可能であるが、粒子及び／又は繊維の重
量に対して10重量％〜0.005重量％、好ましくは
６重量％〜0.05重量％用いることができる。更に
別の方法として、該粒子及び／又は繊維と液体キ
ヤリヤーの音波処理、物理的混合、及び物理的か
くはん処理、PH調整などがある。これらは前記の
方法と組合せることにより、更に有用である。 また、繊維や粒子等に固定された該物質Ｂ及び
Ｄ、又は該標識物Ｃの活性を保持し、多孔質反応
層又は後述の層中に含有させるために、特願昭60
−19324号明細書に記載の方法を用いることがで
きる。 あるいは別の態様としては吸水性の洋紙、和
紙、紙、プラツシユポリマー、あるいはガラス
繊維、鉱物性繊維（石綿など）、植物性繊維（木
綿、麻、パルプなど）、動物性繊維（羊毛、絹な
ど）、合成繊維（各種ナイロン、ビニロン、ポリ
エチレンテレフタレート、ポリプロピレンなど）、
再生繊維（レーヨン、セルロースエステルなど）
などを単独あるいは混合して製造した織物、不織
布、合成紙などを該多孔質反応層に用いることも
できる。 該物質Ｂ及びＤの多孔質反応層への固定化は、
種々の公知の方法により、該物質を該多孔質反応
層の表面に物理的に吸着させるか、化学反応によ
り直接あるいは間接的に結合させることにより達
成される。その際、該物質の該特定成分に対する
特異的結合性が失われないように留意する必要が
あり、例えば石川栄治、河合 忠、宮井 潔編
「酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院、1978年
刊）や千畑一郎、土佐哲也、松尾雄志著「実験と
応用 アフイニテイクロマトグラフイー」（講談
社、1976年刊）に記載されている方法を、好まし
い方法の例として挙げることができる。 また多孔質反応層への該物質Ｂ及びＤの固定化
は、特異結合部位が保持されており、かつ流体試
料中に遊離、溶解した状態でなければよく、流体
試料中に不溶の状態で分散されていてもよい。ま
たカラー写真で用いられるカプラーの分散に用い
られる方法（例えば日本写真学会編「写真工学の
基礎、銀塩編」（コロナ社1978年刊）、脂質二分子
膜中に含有させる方法等も使用できる。 また、該特定成分と特異的に結合し得る物質を
固定化した後に、必要に応じて免疫反応における
非特異的反応を排除する目的で、測定すべき特異
的反応に関与しないタンパク質を担持することが
可能である。それらの代表的な例としては、哺乳
動物の正常血清タンパク質、アルブミン、ゼラチ
ン及びその分解物等が挙げられる。 これらの固定化操作は、前述の粒状体あるいは
繊維にあらかじめ行つておいた後、多孔質反応層
を形成しても良く、あるいは多孔質反応層を形成
した後に該固定化操作を行うことも可能である。 前者の場合、該物質Ｂを固定化した粒状体又は
繊維及び該物質Ｄを固定化した粒状体又は繊維の
他に前述の特異的反応に関与しないタンパク質の
みを固定化した粒状体又は繊維を調節のために加
えることも可能である。 該物質Ｂ及びＤの該多孔質反応層における含有
量の設定は、本発明の分析素子の性能に大きな影
響を与える。 例えば、競合法を含む本発明による反応型式を
例にとつて説明すると、該物質Ｂ及びＤの好まし
い含有量は次のように規定される。 流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａと特
異的に結合し得る物質Ｂと、該特定成分Ａ又はそ
の類縁体と標識とが結合した標識物Ｃ、との競合
反応によつて測定するための、該物質Ｂに結合し
ていない該標識物Ｃの標識部位に特異的に結合し
て該標識に起因する信号を変調させる物質Ｄ及び
該物質Ｂが、担体に固定化された形でそれぞれ多
孔質反応層の一部及び／又は全部に含有されてい
る分析素子において、該特定成分Ａを実質上含有
しない流体試料を用いて所定の分析操作を終了し
た時点で、分析素子内の反応に関与した該標識物
Ｃの総量のうち３〜70％、好ましくは５〜50％、
更に好ましくは10〜25％が該物質Ｂと結合し、か
つ0.1〜10％、好ましくは0.1〜５％が該物質Ｂ及
びＤに結合していないように該物質Ｂ及びＤの含
有量を設定するのである。 なぜなら、該物質Ｂの含有量が不足していると
流体試料中の特定成分Ａ及び該標識物Ｃが該物質
Ｂと充分結合せず、また逆に該物質Ｂの含有量が
過剰である場合は該特定成分Ａの量にかかわらず
該標識物Ｃのほぼ一定量が該物質Ｂに結合する現
象が起き、どちらも満足な検量線を与えない。 また、該物質Ｄの含有量が不足していると、該
物質Ｂ又はＤと結合せず分析素子中の流体試料中
に残存する該標識物Ｃが増加することにより信号
のバツクグラウンドが増大する（10％超の場合）。
逆に該物質Ｄの含有量が過剰であると該物質Ｂと
結合する該標識物Ｃが極めて少なくなり、いずれ
の場合も測定が困難となる（0.1％未満の場合）。 特に、該物質Ｂ及びＤに結合していない該標識
物Ｃは、信号の測定の際のバツクグラウンドとな
るので、少ない方が好ましいと予想されるが、実
際には、この該物質Ｂ及びＤに結合していない該
標識物Ｃが、分析素子内の反応に関与した該標識
物Ｃの総量の0.1％未満である場合は検量線の形
状に好ましくない影響を与える点が目される。 本発明の分析素子の形態は分析を行いうるもの
であればよく、特に制限されるものではないが、
製造上及び操作・測定上、フイルム状あるいはシ
ート状であることが好ましい。 本発明の態様は、該物質Ｂ及びＤが多孔質反応
層の同一層に固定化されて含有されている場合、
及び該物質Ｂ及びＤが二層以上の多孔質反応層に
固定化されて含有されている場合を含む。 本発明の理解を助けるために、一例を挙げて原
理を説明する。 第１図、及び第２図に、本発明の分析素子の基
本的な構成の一例を示す。第１図において符号１
は該物質Ｂ及びＤを含む多孔質反応層、第２図に
おいて符号２は該物質Ｂを含む多孔質反応層、符
号３は該物質Ｄを含む多孔質反応層を示す。流体
試料の一定量を量りとり、前述の標識物Ｃの一定
量と混合し、第１図及び第２図の分析素子の多孔
質反応層１あるいは２に滴下する。標識物Ｃが特
定成分Ａあるいは特定成分Ａの類縁体に酵素を標
識したものである場合には、１あるいは２に固定
化された該物質Ｂに対して、特定成分Ａと標識物
Ｃが競争的に反応し、標識物Ｃの一部が固定化さ
れ、未反応の標識物Ｃは１あるいは３に固定化さ
れた該物質Ｄに反応する。また、標識物Ｃが特定
成分Ａとは特異的に反応するが該物質Ｂとは異な
る物質に酵素を標識したものである場合には、１
あるいは２に固定化された該物質Ｂに対して、特
定成分Ａが反応し、固定化され、標識物Ｃは固定
化された特定成分Ａに反応した形で一部固定化さ
れ、未反応の標識物Ｃは該物質Ｄに反応する。そ
の際、特定成分Ａと標識物Ｃの反応は、特定成分
Ａが該物質Ｂと反応し固定化される前でも後でも
よい。ここで、標識物Ｃの標識酵素に起因する信
号の強度を測定する。１あるいは３の該物質Ｄに
反応した標識物Ｃの酵素活性は変化されているた
めに、測定される標識物Ｃの標識酵素に起因する
信号の強度は、流体試料中の特定成分Ａの濃度に
依存する。そこで、あらかじめ特定成分の濃度が
わかつている種々の濃度の流体試料（標準試料）
を用いて検量線を作成しておけば、未知の流体試
料中の特定成分の濃度を知ることができる。信号
の測定方法は、標識酵素の適当な基質（発色色原
体、蛍光前駆体あるいは発光素のいずれか）を添
加し、一定時間インキユベートした後に、発色
体、蛍光体あるいは発光体に適した測定糸を用い
て信号強度を測定すればよい。 また、標識酵素の触媒する反応が直接、発色
体、蛍光体、発光体を生成しない場合には、他の
触媒（酵素を含む）及びその触媒の発色色原体、
蛍光前駆体あるいは発光素を加えることにより、
標識酵素の反応生成物を間接的に発色体、蛍光体
あるいは発光体として測定すればよい。なお、第
２図における２及び３の層構成は逆であつてもよ
い。 本発明の分析素子の特徴は、特定成分Ａと特異
的に結合する物質(B)と直接、あるいは間接的に反
応した標識物と、未反応の標識物とを強制的にミ
クロ的あるいはマクロ的に分離することができる
点にある。更に、分離した未反応の標識物に起因
した信号のみを変調することができるため、煩雑
な操作をすることなく該物質Ｂと反応した標識物
と未反応の標識物を区別できる。このような効果
は、該物質Ｄとしてアリール水銀誘導体を用いる
ことにより確実に達成することができ、バツクグ
ラウンドやノイズを抑えることができるため、感
度、精度に優れた測定が可能となる。 この技術はドライケミストリーを用いる分析系
において新規なもので、分析素子内の限られた空
間の中でのこの様な積極的Ｂ／Ｆ分離が可能であ
ることは驚くべきことである。 本発明の分析素子は前述の多孔質反応層が必要
最低構成要素であるが、発明の効果をより一層発
揮するために種々の補助層を設けてもよい。 第３図には支持体５を設置した分析素子を示
す。符号４は該物質Ｂ及びＤを同一層内にあるい
は別々の層として含む多孔質反応層を示す。支持
体５を設置することにより素子の取扱い性が向上
している。このような目的で使用し得る支持体
は、例えば酢酸セルロース、ポリエチレンテレフ
タレート、ポリカーボネート及びポリビニル化合
物（例えばポリスチレン）のような高分子化合
物、あるいはガラスのような透明無機化合物が挙
げられる。また、光透過性が必要とされない場合
は、セラミツクス、金属、あるいは樹脂被覆等で
防水処理をした紙等も使用できる。該多孔質反応
層はこの様な支持体上で直接塗布及び／又は製膜
するか、あるいは一旦多孔質反応層を別に形成し
た後に前述の支持体に貼りつけても良い。 第４図に示した本発明の別の態様では、支持体
の上に該物質Ｂ及びＤを同一層内にあるいは別々
の層として含む多孔質反応層４、標識物含有層６
が順に積層されている。標識物含有層は多孔性媒
体に面積濃度が一定となるように標識物を含有さ
せた層であり、流体試料の一定量を滴下すると一
定量の標識物が溶出され、多孔質反応層に試料と
共に拡散するものである。素材としては、多孔質
反応層と同様のものが用いられ、これらの素材を
重層塗布、製膜しても良いし、あるいはこれらの
素材を別に塗布、製膜したものあるいは織物、不
織布、合成紙にしたものを標識物含有層として貼
付けてもよい。 更に、第５図に示した別の態様では、支持体５
の上に試薬層７、該物質Ｂ及びＤを同一層内にあ
るいは別々の層として含む多孔質反応層４及び標
識物含有層６が設けられている。この試薬層は、
標識酵素の基質（発色色原体、蛍光前区体、ある
いは発光素）を含有させた少なくとも１層の親水
性コロイドから成る層である。標識酵素の触媒反
応によつて発色体、蛍光体あるいは発光体を生成
しないような標識酵素を用いる場合には、標識酵
素の反応生成物を基質とし、発色体、蛍光体ある
いは発光体を生成させる酵素と、その発色色原
体、蛍光体あるいは発光素を含む。試薬層に含有
される基質や発色色原体等の物質は、親水性コロ
イドから成るバインダー中に溶解、あるいは分散
して塗布液とすることができる。特に疎水性化合
物の分散には、写真業界で多用されているオイル
プロテクト分散法、直接分散法等種々の公知の分
散法を用いることができる。 更に、本発明に係る発色試薬層に用いられる親
水性コロイドは、ゼラチン、フタル化ゼラチン等
のゼラチン誘導体、ポリビニルアルコール、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルイミダゾール、ポ
リアクリルアミド、ポリアクリル酸ナトリウム等
の合成高分子物質、ヒドロキシエチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等
のセルロース誘導体等の多糖類等が挙げられる。
そして好ましくはゼラチン、フタル化ゼラチン等
のゼラチン誘導体が挙げられる。 更に、本発明に係る発色試薬層のバインダー
は、その膜物性、例えば膨潤度や熱による溶解性
の改良のために、一部を他の水分散性高分子重合
体、すなわち高分子ラテツクスと置換することが
できる。好ましい高分子ラテツクスの例として
は、例えば特願昭56−1931号、同56−177596号各
明細書に記載のものが有用である。これらの高分
子ラテツクスは、親水性コロイドバインダーの最
大70％を置換することが可能であるが、好ましく
は約55％以下の置換でよい。 発色試薬層には、他の添加剤、例えば緩衝剤、
保恒剤、硬膜剤、界面活性剤、媒染剤等を、目的
に応じて添加することができる。 また、その膜厚は約３〜50μm、好ましくは約
５〜30μmである。 標識物含有層、更には試薬層を設けることによ
り、流体試料を一定量滴下するだけでその定量が
容易にでき、簡単な操作で再現性の良い結果を得
ることができる。こうした試薬層や標識物含有層
に対する位置関係は、第５図に限定されるもので
はなく、多孔質反応層の信号の測定の障害になら
ない限り、任意の位置に設けることができる。も
し、標識物含有層が最上層以の部分にある場合、
標識物含有層に用いる素材としては前述のものの
他にゼラチン、ゼラチン誘導体、多糖類（アガロ
ースなど）、カルボキシメチルセルロース、ヒド
ロキシエチルセルロースなどの親水性高分子物
質、あるいはビニルピロリドン、アクリル酸誘導
体、メタクリル酸誘導体、ビニルアルコール、ス
ルホニルスチレンなどをモノマーとしたホモポリ
マーあるいはコポリマーといつた連続バインダー
を塗布して用いる方法がある。更に別な態様とし
てはこうした親水性高分子物質やポリマーの膜厚
及び組成を調節することにより標識物含有層から
の標識物溶出速度を制御し、タイミング層の機能
をも兼ねさせることが可能である。 第５図において必要であれば、第６図に示した
様にタイミング層を設けてもよい。第６図は、下
から順に支持体５、試薬層７、タイミング層８、
該物質Ｂ及びＤを同一層あるいは別層に含む多孔
質反応層４および、標識物含有層６を示してい
る。タイミング層は写真化学の分野で広く知られ
ている技術であり、例えば硬膜度を適当に調節し
たゼラチン層などが用いられる。 この態様の素子に流体試料の一定量を滴下する
と、特定成分と標識物が特定成分の量に応じて該
物質ＢあるいはＤに反応する。充分に該反応が進
行した時点でタイミング層が溶解することによ
り、試薬が拡散し、特定成分Ａの量に応じた標識
物の検出が可能となる。このタイミング層を設け
ることによつて該反応中に生ずる標識物による発
色（あるいは蛍光、発光）を抑えることができる
ため、バツクグラウンドを最小限にとどめること
ができる。 本発明の分析素子は更に、流体試料を素子に適
用した際にその展開を補助する展開層、流体試料
が血液（全血）の際に必要となることがある血球
分離層、必要に応じて設ける接着層、保護層とい
つた補助層を設けることができる。これらの補助
層及び前述の発色試薬層、標識物含有層、タイミ
ング層は独立して設けても良く、あるいは複数の
機能を伴わせもつた層として設けても良い。これ
らの層はその機能に応じて設けられるべき位置が
容易に決定できる。 また、必要に応じて、緩衝剤、保恒剤、界面活
性剤、媒染剤などの添加剤をこれらの層に含有さ
せてもよい。 緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反
応等に適したPHとするために使用される。使用可
能な緩衝剤の例としては、日本化学会編、「化学
便覧 基礎編」〔丸善(株)1966年刊〕第1312〜1320
頁、N.E.グツド（N.E.Good）ほか、バイオケミ
ストリー（Biochemisty）第５巻第467頁
（1966）、今村、斉藤、化学の領域、第30巻(2)第79
頁（1976）W.J.フアーグソン（W.J.Ferguson）
ほかアナリチカル バイオケミストリー（Anal.
Biochem.）第104巻第300頁（1980）等の文献に
記載されているものを挙げることができる。具体
的な例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、
トリス（tris）バルビタール、グリシン、グツド
緩衝剤等が挙げられる。これらの緩衝剤は、必要
に応じて、発色試薬層以の層に含有させてもよ
い。 保恒剤は、基質、発色試薬の保存安定化のため
に含され、酸化防止剤などがある。 また、固定化された物質ＢがＤ、及び酵素標識
物Ｃの活性保持のために、固定化酵素、アフイニ
テイクロマトグラフイーの吸着体、固定化抗体、
及びタンパク質や酵素等の保存に用いられる保恒
剤を含有される。その物質としては、日本生化学
会編「生化学実験講座１、タンパク質の化学」
〔東京、東京化学同人(株)1976年刊〕第66〜67頁、
前述の「実験と応用アフイニテイクロマトグラフ
イー」第103〜104頁、特開昭60−149927号公報等
に記載されているものが挙げられる。 具体的な例としては、ゼラチン、ゼラチン分解
物、アルブミン、ウシ血清アルブミン（BSA）、
シクロデキストリン類、非還元糖類（スクロー
ス、トレハロース）、ポリエチレングリコール、
アミノ酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げら
れる。これらの保恒剤は、固定化された物質Ｂ，
Ｄ及び酵素標識Ｃの近傍に存在させることが好ま
しい。 硬膜剤としては、写真業界で多用されている物
質を用いることができ、T.H.ジエイムス（T.H.
James）編「ザ．セオリー・オブ・ザ・フオトグ
ラフイツク・プロセス」（The Theory of the
Photographic Process）（第４版）第77〜87頁に
記載されているものを挙げることができる。具体
的な例としては、アルデヒド類、活性オレフイン
類、活性エステル類等が挙げられる。 界面活性剤としては、前述のものが挙げられ
る。 媒染剤は、酵素活性測定のための検出物質を、
発色試薬層に集中的に集めたり、検出物質が色素
の場合、吸光度係数を高めたり、波長をシフトさ
せる物質であり、検出物質と強い相互作用を示
す。カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー及
びこれらのポリマーのラテツクスが用いられる。 また、TiO₂、BaSO₄、マイカなどの白色顔料
等を含有させることにより、光反射層の機能を持
たせることができる。 その他の層中に含有させる試薬としては、溶解
助剤、ブロツカー試薬などがある。これらの添加
剤は、必要に応じて適当量添加する。 第７図及び第８図は、本発明の好ましい態様の
１例について断面図、その斜視図を示したもので
ある。分析素子の取扱いが容易になるよう、全体
がプラスチツク製のマウント９で覆われており、
マウント上部に試料注入孔、下部に信号測定孔が
開いている。 〔実施例〕 以下、本発明を実施例によつて更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例によつて限定さ
れるものではない。 実施例 １ ア 試薬層の作成 厚さ180μmの透明な下引き済ポリエチレンテレ
フタレートフイルムの上に、下記の組成の発色試
薬層を塗布、乾燥により作成した。 グルコース 0.80ｇ／m² 西洋ワサビペルオキシダーゼ 15000U／m² ４−アミノアンチピリン 1.80ｇ／m² １，７−ジヒドロキシナフタレン 1.40ｇ／m² リン酸水素二ナトリウム・二水和物0.72ｇ／m² リン酸二水素ナトリウム・水和物 0.13ｇ／m² 脱イオン化ゼラチン 16.00ｇ／m² ビスビニルスルホニルメチルエーテル
0.06ｇ／m² イ 標識物（グルコースオキシダーゼ標識ヒト
IgG）の作成 アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）
由来のグルコースオキシダーゼ10mgを、1.25％の
グルタルアルデヒドを含む0.1Mリン酸緩衝液
（PH6.8）0.2mlに加え、室温にて10時間ゆるやか
にかくはんして反応させた。これをあらかじめ
0.15M塩化ナトリウム溶液で平衡化したセフアデ
ツクスＧ−25カラム（1.0×55cm）に通し、グル
タルアルデヒド活性化グルコースオキシダーゼ画
分を回収した。この画分1.0mlに、ヒトIgG（米国
カツペル社製）を５mg含む0.15M塩化ナトリウム
溶液1.0ml及び1M炭酸ナトリウム緩衝液（PH9.5）
0.1mlを加え、４℃24時間反応させた。この溶液
に0.2Mリジンを0.1ml加え、更に４℃にて２時間
反応させた後、0.15M塩化ナトリウムを含む
0.01Mリン酸緩衝液（PH7.6）で平衡化したウル
トロゲル（Ultrogel）AcA−34カラム（1.5×100
cm）に通し、グルコースオキシダーゼ標識ヒト
IgGを得た。 ウ 標識物含有層の作成 １−イ）で得た標識物を１−ア）の試薬層の上
に下記の処方でブタノール塗布、乾燥し、標識物
含有層を作製した。 グルコースオキシダーゼ標識ヒトIgG 35mg／m² BSA 260mg／m² コポリ（酢酸ビニル−ビニルピ ロリドン） 1.2ｇ／m² エ 抗ヒトIgG抗体のセルロース繊維への固定化 粉末紙Ｄ（東洋紙社製）100ｇを、ブタンジ
オールジグリシジルエーテル（米国アルドリツチ
社製）250mlと、２mg／mlの水素化ホウ素ナトリ
ウムを含む0.6M水酸化ナトリウム水溶液250mlと
の混合液中に懸濁し、40℃にて5.5時間振とうか
くはんした後、純水５で洗浄し、乾燥させた。 この官能基を持つ粉末紙D10ｇを、100mgの
抗ヒトIgG（米国カツペル社製）を含む0.5M炭酸
ナトリウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（PH
10.0）100mlに懸濁し、40℃にて12時間振とうか
くはんした。これを過し、ペレツトを純水500
ml、0.5M塩化ナトリウムを含む0.1M炭酸水素ナ
トリウム溶液500ml、0.5M塩化ナトリウムを含む
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（PH4.1）500mlにて
交互に洗浄した後、1Mトリス−塩酸緩衝液（PH
8.5）300mlに懸濁し、25℃24時間振とうかくはん
して未反応基をブロツクした。これを過し、ペ
レツトを純水約２で洗浄し、抗体固定化粉末
紙Ｄを得た。 オ 多孔質反応層の作成 １−エ）で作成した抗ヒトIgG抗体固定化粉末
紙Ｄ、及びｐ−クロロマーキユリーアニリンを
アガロースに固定化したアフイゲル−501（バイオ
ーラツド社製）を、下記の組成の分散液にて塗
布、製膜し、１−ウ）で作成した標識物含有層の
上に接着した。これを２×２cmの大きさに裁断
し、分析素子とした。 抗体固定化粉末紙Ｄ 3.00ｇ アフイゲル−501 10ml コポリ（スチレン−グリシジル メタクリレート〔90／10〕 0.75ｇ オクチルフエノキシポリエトキシ エタノール 0.5ｇ キシレン 10ml カ ヒトIgGの測定 ヒトIgG溶液〔０〜640μg／ml、0.01Mリン酸
ナトリウム緩衝液（PH7.6）〕10μlを１−オ）で作
成した分析素子に滴下し、37℃10分間密閉状態で
インキユベートした後、支持体側から540nmの反
射濃度を測定した。その結果を表４に示す。

【表】 実施例 ２ ア 試薬層の作成 厚さ180μmの透明な下引き済ポリエチレンテレ
フタレートフイルムの上に、下記の組成の発色試
薬層を、塗布、乾燥により作成した。 グルタミン酸 30.0ｇ／m² １−メトキシ−５−メチルフエ ナジニウムメチルサルフエート 60mg／m² 酸化型ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチドホスフエート 4.0ｇ／m² Nitro−TB^* １，２−ビス（ビニルスルホニ ル）エタン 820mg／m² ｐ−オクチルフエノキシポリエ トキシエタノール 0.2ｇ／m² 脱イオン化ゼラチン 22.0ｇ／m² ＊ Nitro−TB：３，3′−（３，3′−ジメトキ
シ−４，4′−ビフエニレン）−ビス〔２−
（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニルテト
ラゾリウムクロリド〕 イ 標識物（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識
ヒトIgG）の作成 プロテウス スピシース（Proteus species）
由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼを、実施例
１−イ）と同様の方法でヒトIgGに標識し、グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒトIgGを得た。 ウ 標識物含有層の作成 ２−イ）で得た標識物を、２−ア）の試薬層の
上に下記の処方でブタノール塗布、乾燥し、標識
物含有層を作成した。 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 標識ヒトIgG 55mg／m² BSA 260mg／m² コポリ（錘酢酸ビニル−ビニル ピロリドン）〔40／60〕 1.2ｇ／m² エ 多孔質反応層の作成 実施例１−オ）と同様の処方で多孔質反応層を
作成し、２−ウ）で作成した標識物含有層の上に
接着した。これを２×２cmの大きさに裁断し、分
析素子とした。 オ ヒトIgGの測定 ヒトIgG溶液〔０〜640μg／ml、0.01Mリン酸
ナトリウム緩衝液（PH7.6）〕10μlを２−エ）で作
成した分析素子に滴下し、37℃10分間密閉状態で
インキユベートした後、支持体側から580nmの反
射濃度を測定した。その結果を表５に示す。

【表】 実施例 ３ ア 試薬層の作成 実施例１−ア）と同様の方法で発色試薬層を作
成した。 イ 多孔質反応層の作成 実施例１−エ）で作成した抗ヒトIgG抗体固定
化粉末紙Ｄ、及びｐ−クロロマーキユリーアニ
リン をアガロースに固定化したアフイゲル−
501（バイオーラツド社製）を、実施例１−オ）の
組成の分散液にて、３−ア）の試薬層の上に塗
布、製膜した。 ウ 標識物（グルコースオキシダーゼ標識ヒト
IgG）含有層の作成 アスペルギルス ニガ−由来のグルコースオキ
シダーゼを実施例１−イ）と同様の操作でヒト
IgGに標識し、下記の処方で塗布、乾燥させた
後、３−イ）の多孔質反応層の上に接着した。こ
れを２×２cmの大きさに裁断し分析素子とした。 グルコースオキシダーゼ標識ヒトIgG 35mg／m² 粉末紙Ｄ 100ｇ／m² トライトンＸ−100（ローム アンドハース社製） ５ｇ／m² 脱イオン化ゼラチン ２ｇ／m² コポリ（スチレン−グリシジル メタクリレート）〔90／10〕 ２ｇ／m² エ ヒトIgGの測定 実施例１−カ）と同様の方法でヒトIgGを測定
した。その結果を表６に示した。

【表】 なお、実施例３の素子において、多孔質反応層
を塗布、製膜する際に、グルコースオキシダーゼ
標識ヒトIgGを混ぜて塗布、製膜することもでき
る。 実施例 ４ ア 試薬層の作成 実施例２−ア）と同様の方法で試薬層を作成し
た。 イ 抗ヒトIgG抗体固定化多孔質反応層の作成 実施例１−エ）で作成した抗ヒトIgG抗体固定
化粉末紙Ｄを下記処方で分散し４−ア）の試薬
層の上に塗布、乾燥した。 抗体固定化粉末紙 ２ｇ コポリ（スチレン−グリシジル メタクリレート）〔90／10〕 0.25ｇ オクチルフエノキシポリエトキ シエタノール 0.2ｇ キシレン キシレン ウ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤固定化
多孔質反応層の作成 アフイゲル−501を下記の処方で分散し、塗布、
乾燥させた後、４−イ）の多孔質反応層の上に接
着した。 アフイゲル−501 10ml 粉末紙Ｄ 1.0ｇ コポリ（スチレン−グリシジル メタクリレート） 0.5ｇ オクチルフエノキシポリエトキシ エタノール 0.3ｇ キシレン ５ml エ 標識物（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識
ヒトIgG）含有層の作成 実施例２−イ）で作成したプロテウス スピシ
ース由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒ
トIgGを、下記の処方で塗布、乾燥させた後、４
−ウ）の多孔質反応層の上に接着した。 グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 標識ヒトIgG 55mg／m² 粉末紙Ｄ 100mg／m² トライトンＸ−100（ローム アンドハース社製〕 ５ｇ／m² 脱イオン化ゼラチン ２ｇ／m² コポリ（スチレン−グリシジル メタクリレート）〔90／10〕 ２ｇ／m² オ ヒトIgGの測定 インキユベート時間が20分である以外は実施例
２−オ）と同様の方法でヒトIgGの測定を行つ
た。その結果を表７に示した。

【表】 実施例 ５ ア 試薬層の作成 厚さ180μmの透明な下引き済ポリエチレンテレ
フタレートフイルムの上に、下記の組成の発色試
薬層を、塗布、乾燥により作成した。 Ｌ−グルタミン酸ナトリウム 2.5ｇ／m² ジアホラーゼ（東洋醸造社製） 2500U／m² 酸化型ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチドホスフエート 1.7ｇ／m² NeO−TB^* １，２−ビス（ビニルスルホニ ル）エタン 1.2ｇ／m² ｐ−オクチルフエノキシポリエ トキシエタノール 0.2ｇ／m² 脱イオン化ゼラン 12.0ｇ／m² ＊NeO−TB；３，3′−（４，4′−ビフエニレ
ン）−ビス（２，５−ジフエニル−2H−テト
ラゾリウムクロライド イ 緩衝剤含有層の作成 ５−ア）の試薬層の上に下記の組成の緩衝剤含
有層を、ブタノール溶液により塗布、乾燥して作
成した。 トリス（ヒドロキシメチル） アミノメタン 11.5ｇ／m² トリス（ヒドロキシメチル）ア ミノメタン塩酸塩 2.4ｇ／m² コポリ（酢酸ビニル−ビニルピ ロリドン）〔80／20〕 7.5ｇ／m² ｐ−オクチルフエノキシポリエ トキシエタノール 1.0ｇ／m² ウ ｐ−アミノフエニルマーキユリツクアセテー
トのセルロース繊維への固定化 粉末紙Ｄ（東洋紙社製）100ｇを、エピクロ
ロヒドリン（関東化学社製）30mlと0.6M水酸化
ナトリウム水溶液430mlとの混合液中に懸濁し、
40℃にて6.0時間振とうかくはんした後、取し、
純水２で洗浄し、更にアセトン１で洗浄し、
乾燥させた。 この官能基を持つ粉末紙D50ｇを、10％ジメ
チルスルホキシド溶液500ml中に入れ、更に、ジ
メチルスルホキシド100mlに溶解したｐ−アミノ
フエニルマーキユリツクアセテート10ｇと0.5M
炭酸バツフア（PH10.0）32mlを加えて、室温に
て、20時間振とうかくはんした。これを取し、
50％ジメチルスルホキシド１で洗浄後、更に純
水２で洗浄し、乾燥させ、ｐ−アミノフエニル
マーキユリツクアセテート固定化粉末紙Ｄを得
た。 エ 多孔質反応層の作成 １−エ）で作成した抗ヒト1gG抗体固定化粉末
紙Ｄ、及び５−ウ）で作成したｐ−アミノフエ
ニルマーキユリツクアセテート固定化粉末紙Ｄ
を、下記の組成の分散液にて５−イ）の緩衝剤含
有層の上に塗布し、乾燥後、２×２cmの大きさに
裁断し、分析素子とした。 抗体固定化粉末紙Ｄ 5.0ｇ ｐ−アミノフエニルマーキユリ ツクアセテート固定化粉末紙Ｄ 5.0ｇ コポリ（スチレン−グリシジル メタクリレート）〔90／10〕 2.5ｇ ｐ−オクチルフエノキシポリエ トキシエタノール 1.0 キシレン 30ｇ ウシ血清アルブミン 2.0ｇ オ ヒトIgGの測定 ２−イ）で作成したグルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ標識ヒトIgGとヒトIgG溶液〔０〜640μg／
ml、0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.6）〕と
を混合後、その10μlを、５−エ）で作成した分析
素子に滴下し、37℃で15分間密閉状態でインキユ
ベーシヨンした後、支持体側から540nmの反射濃
度を測定した。その結果を表８に示す。

【表】

〔発明の効果〕

以上説明したように、本発明の分析素子によれ
ば、分析素子内でＢ／Ｆ分離を行い、しかもバツ
クグラウンドやノイズがなく、感度、精度及び再
現性良く流体試料中の特定成分を定量分析するこ
とができるという顕著な効果を奏することができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第７図は本発明の分析素子の１実施の
態様における層構成を示す断面概略図、第８図は
第７図の素子の斜視図である。 １：物質Ｂ及びＤを同一層に含む多孔質反応
層、２：物質Ｂを含む多孔質反応層、３：物質Ｄ
を含む多孔質反応層、４：物質Ｂ及びＤを同一層
又は別層に含む多孔質反応層、５：支持体、６：
標識物含有層、７：試薬層、８：タイミング層、
９：マウント。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａと
   特異的に結合し得る物質Ｂと、特定成分Ａ、特定
   成分Ａの類縁体及び特定成分Ａと特異的に結合す
   るが該物質Ｂとは異なる物質よりなる群から選ば
   れた物質と酵素とが結合した標識物Ｃと、該標識
   物Ｃの酵素部位に特異的に結合して該酵素に起因
   する信号を変調させる物質Ｄとを用いて該酵素の
   活性によつて測定する方法で使用する、該物質Ｂ
   及びＤが同一又は別個の担体に固定された形でそ
   れぞれ多孔質反応層の一部及び／又は全部に含有
   されている分析素子において、該物質Ｄとしてア
   リール水銀誘導体を用いてなることを特徴とする
   分析素子。