JPS6345562A - 免疫学的分析素子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分画定用分析素子に係り
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を分析するた
めの分析素子に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に含まれる極微量含有される物質を
検出する方法として、各種分析法の開発がなされてきた
。その分析法は、主として免疫反応をその原理とするも
のである。上記原理を用いる測定法として、種々のもの
が開発されてきたが、最も精度の高いものとして、免疫
測定法が知られている。

免疫測定法は、１９５８年、ベルソン（Ｂｅｒｓｏｎ）
とイアロウ（Ｙａｌｌｏｗ）が、放射性ヨードで標識し
た、ウシインシュリンと糖尿病患者血清中の抗インシュ
リン抗体を用いて、血清中のインシュリンを測定するこ
とに成功して以来、放射免疫測定法が広く用いられでい
る。

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が種種開発されてさた。他の標識化合物としては例えば
、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオ
７７−ノ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機
補欠分子族、化学発光性反応体及び蛍光性分子等が挙げ
られる。

上記免疫測定法に関する技術上の重要な問題の１つとし
て、結合を起した物質（以下、Ｂと略記する）と起さな
かった物質（以下、Ｆと略記する）の分ｊｌｌ（以下、
Ｂ／Ｆ分離と略記する）がある。

従来、免疫測定法における問題点を解決するために各種
の方法が開発されてきた（例えば、特開昭５３−３８６
１９号、同５３−７９０２４号、同５５−９０８５９号
、同５７４７８６０号、同５７−２００８６２号、同５
８−１８１６７号、同５９−７７３５６号及び同５９−
１７０７６８号各公報参照）。

しかし、これらの方法は、Ｂ／Ｆ分離が不完全である、
ノイズが多く信号の信頼度に問題がある、測定可能な物
質が低分子物質に限られる等の欠点があった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

一方、ウェット・ケミストリーにおいて、固定相を用い
た競合法による免疫測定法が開発されて　、いる（例え
ば特開昭５８−２０９９９４号及び同５９−２０２０６
４号各公報参照）。

しかしそれらの測定法では、比較的多量の水溶液中にお
いて、担体に固定相を分離して固定した２種の物質と溶
液中の物質との競合反応を行っているため、意図とした
結合を起こすことな（溶液中に残存する物質が多く、し
かも両固定相を区別することなく全体の酵素活性を測定
しているため、バックグランドやノイズの問題から、感
度、精度及び再現性について満足な結果が得られない。

他方、ドライ・ケミストリーにおいて、ｆ：Ｐ１２抗体
を用いる免疫測定法が開発されている（特開昭５７−８
２７７６号及び同５７−８２７６７号各公報参照）。

しかし、これらは、操作が煩雑であること、再現性の良
い展開を行う技術が必要であること等、改良の余地があ
る。更に、特開昭５９−３４１５５号公報記載の発明で
は、未結合物収納シートを用いる方法が開示されている
。しかし、この方法でも、反応用シートと未結合物収納
シートとを密着させたままで測定を行おうとすると前述
した問題が生じ、また測定時に両シートを分離するのは
煩雑であり、特に測定を自動化する際、障害となる。

本発明は、前述の従来技術の欠点を改良するためになさ
れたものであり、その目的は、分析素子内で積極的なり
／Ｆ分雑を行い、しかもバックグランドやノイズが少な
く、感度、精度及び再現性に優れた、流体試料中の特定
成分を定量するための分析素子を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明は分析素子に関する発明で
あって流体試料中の特定成分と結合しない生物活性物質
（以下生物活性物質と略）又は該生物活性物質と特異的
１こ結合し得る物質及び標識物質と特異的に結合して、
該標識物質に起因する信号を変調させる物質が、同一又
は別々の担体に固定化された形で、それぞれ多孔質反応
層の一部または全部に含有されている分析素子を用いる
ことを特徴とする流体試料中の特定成分を測定する方法
であり、流体試料中の特定成分と該特定成分と特異的に
結合する物質との結合反応とこの結合反応によって生成
した結合反応生成物と未反応成分の分８！Ｌ（いわゆろ
Ｂ／Ｆ分離）すなわち２ｍの固定化物（生物活性物質、
又は該生物活性物質と特異的に結合する物質の固定化物
、標識物質と特異的に結合し、標識物質に起因する信号
を変調される物質の固定化物）との結合反応を一回の操
作で段階的に行う方法である 本発明において爪いられる生物活性物質及び該生物活性
物質と特異的に結合する物質の組み合せとしては、 酵　素　：　基質（生成物） 阻害剤 補欠分子族 補酵素 アロステリ７クエ７Ｔクター 抗　　体　　：　　抗原 プロティンＡ レクチン：　多糖類 糖タンパク質 核　酸　：　相補性の塩基配列 ヒストン 核酸 ポリメラーゼ ホルモン：　受容体 ビオチン：　アビノン（ストレプトアビノン）が挙げら
れ、好ましくは抗体と抗原、またはビオチン類とアビノ
ン類であり、更に好ましくはビオチン類とアビノン類で
ある。

これらの生物活性物質及び生物活性物質と特異的に結合
する物質は、後述する測定しようとする流体試料中の特
定成分及び該特定成分と特異的に結合する物質や測定に
用いる標識物質と結合反応や相互作用しない物質が用い
られる。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液が使用しうるが、好ましくは生物白米
の流体試料例えば、血液、血漿、血清、脳を髄液、唾液
、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しうる流体試料中での特定成分とは、
その存在又は、その流体試料中での量が測定され、その
特定成分に特異的に結合する物質が得うる物質又は物質
群である。すなわち、ポリペプチド、タンパク質、複合
タンパク質、多糖類、Ｗｉ質、複合面質、核酸、ホルモ
ン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられ
る。具体的には、下記の物質、または物質群を挙げるこ
とができるが、これらに限定されるものではない。

くタンパク質、複合タンパク質〉 プレアルブミン、アルブミン、Ｃ１−酸性糖タンパク質
、ａ、−アンチトリプシン、ａｌ−糖タンパク質、トラ
ンスフルチン、Ｃ１−アンチキモトリプシン、ａｌ−リ
ポタンパク質、チロキシン結合グロブリン、セルロプラ
スミン、Ｚｎ−α２−糖タンパク質、Ｇｃ−グロブリン
、インター−α−トリブンンインヒビター、Ｃ１−マク
ログロブリン、Ｃ２−Ｈ９−糖タンパク質、Ｃ２−マク
ログロブリン、ハプトグロビン、Ｃ２−リポタンパク質
、ヘモベキシン、トランスフェリン、β−リポタンパク
質、β２−糖タンパク質、β２−マクログロブリン、Ｃ
−反応性タンパク質、ミオグロビン、エリスロボイエチ
ン、免疫グロブリン（ＩＢＧ。

ＩＢＭ、ＩｇＡＳ　ＩｇＤ、ＩｇＥ）、補体系成分（Ｃ
ｉ、Ｃ＋ｒ、Ｃｐｓ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ６、
Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、等）フィブリノーゲン、ヘモグロビ
ン、グリコヘモグロビン、血液凝固因子、ＨＢｓ抗原、
ＨＢｓ抗体、酵素（例えば、酸性ホスファターゼ、アル
カリ性ホスファターゼ、アルカリ性ホス７アターゼアイ
ソエンザイム、α−アミラーゼ、アミラーゼアイソエン
ザイム、アルドラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチ
ンホスホキナーゼ、クレアチンホスホキナーゼアイソエ
ンザイム、トランスアミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）、乳
酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素アイソエンザイム、γ−
ＧＴＰ、リパーゼモノアミンオキシグーゼ、ロイシンア
ミノペプチダーゼ、ブドウ糖６リン酸脱水素酵素等）等
。

くホルモン及びホルモン様物質〉 卵胞刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）、黄体刺激ホルモン（
ＬＨ）、成長ホルモン（Ｇ　Ｈ）、甲状腺刺激ホルモン
（Ｔ　Ｓ　Ｈ）、副腎皮質刺激ホルモン（Ａ　ｃＴ　Ｈ
）、メラニン刺激ホルモン（Ｍ　Ｓ　Ｈ）、バリブレラ
シン、オキシトシン、インシュリン、グルカゴン、アン
ギオテンシンＩ及び■、プロラクチン、セクレチン、ド
ーパミン、セロトニン、ソマトスタチン、サイロキシン
（Ｔ、）、）リョードサイロニン（Ｔ、）、〃ストリン
、コルチゾール、アルドステロン、カテコラミン、エス
トロゲン、プロプステロン、テストステロン、胎盤性ゴ
ナドトロピン、胎盤性ラクトーデン、下垂体ホルモン放
出因子（ＴＲＨ。

ＦＳＨ−ＲＨＳ　ＣＲＨ、Ｌ　　Ｈ−ＲＨ等　）ｈ！？
〈ビタミン類〉 ビオチン、チアミン、ビタミンＡ１ビタミンＢ２、ビタ
ミンＢいビタミンＢ　１２、ビタミンＣ１ビタミンＤ１
ビタミンＥ１ビタミンに、ｍ１Ｆ。

く腫瘍マーカー〉 ａ−７エトプロテイン、癌胎児性抗原、７エリチン、ポ
リアミン、臓癌胎児抗原、塩基性７エトプロテイン、Ｍ
−タンパク、前立腺酸性ホスファターゼ、糖鎖性抗原（
ＣＡ　１９−９、ＣＡ　１２５等）、がングリオサイズ
。

く各種の薬剤及び代謝産物〉 ペンゾイルエクゴニン、コカイン、コデイン、デキスト
ロメトロファン、ヘロイン、リセルク酸、モルヒネ、キ
ニゾン、キニーネ、アミカシン、デンタマイシン、カナ
マイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、アクチノマ
イセチン、カロイマイシン、クロラムフェニコール、ク
ロロマイセチン、クロルテトラサイクリン、エリトロマ
イシン、オキシテトラサイクリン、ペニシリン、ポリミ
キシン３１テラマイシン、テトラサイクリン、ストレプ
トマイシン、ジフェニルヒグントイン、エトスクシミド
、フェノパルビタール、プリミドン、セコバルビタール
、アセグミ／フェン、アミカシン、アミシリブチリン、
カルバマゼピン、ジゴキシン、ノンピラミド、すＹカイ
ン、メソトレキセート、Ｎ−７セチルプロカイナミド、
７エ二トイン、プロカイナミド、プロプラｌｏ−ル、テ
オフィリン、カナピノール、テトラヒド口力ナビ７−ル
、フリン抑制薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロビン、フチ
ロフェノン、カフェイン、クロロプロマシン、エピネフ
リン、グリセオフルビン、イミブラミン、Ｌ−ドーパ、
メベリノン、メブロバメート、メタトン、ナルセイン、
／ルトリブチ　　　−リン、オキサゼパン、パパベリン
、プロスタグランジン、テグレトール、バルプロン酸等
及びこれらの代謝産物。

く微生物表面マーカー〉 バクテリア抗原、　　菌類抗原 寄生虫抗原、　　　　ウィルス抗原 く農薬〉 ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル類、チオホスフ
ェート類、及びこれらの代謝産物。

〈その他〉 血液型物質、カルノオリビン、アレルゲン、本発明に使
用しうる流体試料中の特定成分と特異的に結合する物質
としては、測定対象により抗体、抗原、レクチン、プロ
ティンＡ１特定酵素の阻害物質などが挙げられるが、該
特定成分と該結合物質の結合反応が抗原−抗体反応であ
る場合が特に好ましい。本発明で使用する抗体は、その
由来を特に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原
を投与、免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか
、あるいは従来公知の方法である（右田俊介編「免疫化
学」中山書店第７４〜８８頁参照）、硫酸ナトリウム沈
殿法、硫酸アンモニウム沈殿法、セ７アデンクスデルに
よるデルｌＩ＆過法、イオン交換セルロールクロマトグ
ラフィー法、電気泳動法等で精製して用いることができ
る。

あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）牌
ＦＡ細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（
ハイブリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつ（って
も良い。

また、これらの抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡＩｇＤ、
ＩＦｉＥ各分画全分画ることができ、あるいはこれらの
抗体を酵素処理してＦ　ａｂ、　Ｆ　ａｂ’又はＦ（ａ
ｂ’）といった活性抗体７ラグメントにして使用しても
よい。更にこれらの抗体は単一で使用しても、複数の抗
体を組み合わせて使用してもかまわない、流体試料中の
特定成分と特異的に結合する物質として抗体又は抗原を
用いた場合、本発明分析素子の測定原理は免疫測定法に
属しその反応型式としては、競合法、２抗体法、サンド
インチ法があげられる１本発明の分析素子は免疫測定法
においで特に好ましく使用できるので、以下免疫測定法
を例にとって本発明の詳細な説明するが、本発明はこの
説明内容に限定されるものではなく、種々の応用が可能
であることは以上に述べてきた内容からも明らかである
。

本発明に適用しうる標識物質としては、例えば、酵素、
酵素基質、＃素及び酵素前駆体の活性を変化させる物質
（酵素阻害物質、補酵素、補欠分子族、酵素前駆体を活
性化する物質など）、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質
などが挙げられ、その代表的な例としては下記に示した
物質を挙げることができる。好ましくは下記に開示され
た酵素及び蛍光物質が用いられる。更に好ましくは、下
記に開示された酵素である（これらの標識に起因する信
号については後述する。） 標識物質の具体例： １、酵素 ＥＣ１，１，１，１フルコールデヒドロゲナーゼ１．１
．１．６　　　グリセロールデヒドロゲナーゼ １．１．１．８　　　グリセロール−３−１ノン酸デヒ
ドロデナーゼ（ＮＡＤ”） Ｌ、１．１．２７　　　乳酸デヒドロゲナーゼ１．１．
１．３７　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１．１，１．
４０　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ”） １．１．１．４７　　　グルコースデヒドロゲナーゼ１
．１．１．４８　　　、ｆラクトースデヒドロゲナーゼ １．１．１．４９　　　グルコース−６−リン酸デヒド
ロデナーゼ １．１．２．３　　　乳酸デヒドロゲナーゼ（チトクロ
ーム） １．１，３．１　　　グリコール酸オキシダーゼ１．１
．３．２　　　乳酸オキシダーゼ１．１，３．４　　　
グルコースオキシダーゼ１．１．３．６　　　コレステ
ロールオキシダーゼ１．１，３，９　　　、？ラクトー
スオキシダーゼ１．１，３．１７　　　フリンオキシダ
ーゼ１．１．３．−Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダー
ゼ １．２．１．１　　　　ホルムアルデヒトデヒドロデナ
ーゼ １．２．１．１２　　　グリセルアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ １．２．３．２　　　キサンチンオキシダーゼ１．２．
３．３　　　ピルビン酸オキシダーゼ１．２．３．４　
　　オキサル酸オキシダーゼ１．３．３．−　　アシル
Ｃｏ　Ａオキシダーゼ１．４．１．１　　　アラニンデ
ヒドロゲナーゼ１．４．１．３　　　グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　（ｐ）”） １．４，１．４　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　”） １．４．３．２　　　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ１．
４．３．３　　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１．４．３
．４　　　アミンオキシダーゼ（７ラビン含有） １．４，３．６　　　アミンオキシダーゼ（銅含有）１
．５．１．３　　　テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ ！、５．３．１　　　ザルコシンオキシダーゼ１．６．
４．２　　　グルタチオンレグクターゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　
（ｐ）Ｈ） １．６．４，３　　　ジヒドロリボ７ミドレグクターゼ
（ＮＡＤ”）（ノアホラーゼ） １．７．３．３　　　尿酸オキシダーゼ１．１１．１．
６　　カタラーゼ １．１１，１．７　　ベルオキシダーゼ１．１３．１２
．４　　乳酸−２−モノオキシデナーゼ １．１３．１２．５　　　Ｒｅｎ１ｌｌａルシフェリン
−２−モノオキシデナーゼ １．１３．１２．６　　　Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェ
リン＝２−モノオキンデナーゼ １．１３．１２．７　　　Ｐ　ｌ＋ｏｔｉｎｕｓルシフ
ェリン＝４−モノオキシデナーゼ （Ａ　Ｔ　Ｐ加水分解） １．１４，１３．２　４−ヒドロキシ安息＠Ｍ３−モノ
オキシデナーゼ １．１４．９９．２１　　Ｌ　ａｔｉａルシ７エリンモ
７才キンデナーゼ ２．１．３．１　　　　メチルマロニルＣｏＡカルボキ
ントランスフェラーゼ ２．３゜２．２　　７−ゲルタミルトランス７エラーゼ ２．７．１．１　　　へキソキナーゼ ２．７．１．２　　　グルコキナーゼ ２．７，１．１５　　　リボキナーゼ ２．７．１．２８　　　）リオキナーゼ２，７．１．４
０　　　ピルビン酸キナーゼ２．７．５．１　　　ホス
ホグルコムターゼ３．１．１．３　　　アリルエステラ
ーゼ３．１．１．４　　　ホスホリパーゼＡ２３．１，
１．７　　７セチルコリンエステラーゼ３．１．１．８
　　　フリンエステラーゼ３．１，３．１　　　アルカ
リホスファターゼ３．１．３．２　　　酸ホス７７ター
ゼ３．１．３．９　　　グルツース−６一ホス７アター
ゼ ３．１，３．１１　　　フルクトースノホス７アターゼ ３．１，３．２１　　　グリセロール−１−ホスファタ
ーゼ ３．１．４．１　　　ホスホノエステラーゼＩ３．１．
４．３　　　ホスホリパーゼＣ３，２，１，１α−アミ
ラーゼ ３．２．Ｌ２　　　　β−アミラーゼ ３．２．１．１７　　　ライゾザイム ３．２，１．１８　　　フイラミニグーゼ３．２，１，
２０　　　α−Ｄ−グルフシグーゼ３．２．１．２１　
　　β−Ｄ−グルコシグーゼ３．２，１．２３　　　β
−Ｄ−がラクトシグーゼ３．２．１．３５　　　ヒアル
ロ７グルコサミニグーゼ ３．４．１１，６　　７ルギニンアミ／ベプチグーゼ ３．４，２２．４　　　ブロメライン ３．５．１．１　　　アスパラギナーゼ３．５．１．５
　　　ウレアーゼ ３．５．４．２　　７デニンデアミナーゼ３．５．４．
４　　　　アデノシンデアミナーゼ３．５，４．６　　
　ＡＭＰデアミナーゼ４．１．１．３　　　オキサロ酢
酸デカルボキシラーゼ ４．１，１．４１　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキ
ンラーゼ ４．１．２．１３　　　フルクＦ−スニリン酸アルドラ
ーゼ ４．２，１．２０　　　）リプトファンシンセダーゼ５
．３，１．９　　　グルコースリン酸インメラーゼ ６．３，４．１４　　　ビオチンカルボキシラーゼ６．
４．１．１　　　ピルビン酸カルボキシラーゼ６．４．
１．２　　７セチルーＣｏＡカルボキシラーゼ ６．４．１．３　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキシ
ラーゼ（Ａ　Ｔ　Ｐ−加水分 解） ６．４．１．４　　　メチルクロトニル−ＣｏＡカルボ
キシラーゼ ６．４．１．５　　　ブラフイル−Ｃｏ　Ａカルボキシ
ラーゼ ２、　　基質（発光物質を含む） ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−４ラクトシト０−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−、ｆ？クトンド４−７チルウンベリ
７エロンーβ−Ｄ　−１ｆ　５クトシド ｐ−二トロフェニルホス７エート コルチゾール−２１−ヘミスクシネート　クンベリ７エ
ロン　コンノエデート ルミノール イソルミノール Ｎ−（４−７ミノプチル）−Ｎ−エチル　イソルミノー
ル　ヘミスクシンアミド Ｎ−（６−７ミ／ヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノー
ル Ｎ−＜４−７ミノプチル）−Ｎ−エチル　イソルミノー
ル ルシデニン アクリノニワム　フェニル　カルボキシレート ロフィン ピロブロール 没食子酸 シロキシン ビス（２，４，６−）リクロロフェニル）オキサレート
及びその誘導体 ３、　酵素阻害物質 フィソスチグミン メチオニン　スルホキシミン ワイルドファイア（ｗｉｌｄｆｉｒｓ）プループキス）
ラン ０−ノアニジノン−セルロース ０−ノアニジノン−デキストラン ２−プロピニルアミン ２−クロロアリルアミン フェニルグリノン ロー二トロフェニルグリシン アミノアセトニトリル ２−７ミノー３−ヒドロキシプロピル −１，３’　−力ルボキシー３′−７ミ／−１′−プロ
ペニル−１エーテル Ｌ−２−７ミノー４−メトキシ−トランス−３−ブテン
酸 エタノールアミン−〇−サル７エート フルビジイン アザセリン ジアゾオキソノルロイシン ジアゾオキソノアノルバリン Δ３−７−アミツセ７７０スポリン酸 ミモシン ２−７ミノー４−ペンチン酸 ２−７ミ／−４−クロロ−４−ペンテン酸３．３−ノク
ロロアラニン ３．３．３−　）リクロロアラニン Ｄ−シクロセリン ２−ヒドロキシル−３−ブチン酸 Ｎ　、Ｎ　−）リフチル−２−プロピニルアミンβ−ア
ミ７プロピオニトリル ２−ブロモエチルアミン ３−デシメイル−Ｎ−７セチルシステアミン２．３−デ
カシイフィル−Ｎ−７セチルシステアミン β−クロロ−し−アラニン Ｌ−セリン−０−サルフェート β−フルオロアラニン Ｌ−ビニルグリシン Ｄ−ビニルグリシン プロパルギルグリシン 〃バクリン ５−ニトロ−Ｌ−ノルバリン Ｎ−ベンツルーＮ−／チル−２−プロピニルアミン ３−ジメチルアミ／−１−プロピン グリセロール シイソフロビルホスホロフルオライド フェニルメタンスルホニルフルオライトクラプラン酸 アロプリノール ブチルチン ヨード酢酸 ヨードアセト７ミド ベスタチン ピリドキサールリン酸 ヒドラジンとその誘導体 ニトロ７ランとその誘導体 ニトロベンゼンとその誘導体 プリン誘導体 キレート化剤 フェニル水銀とその誘導体 ４、　袖Ｍ、素・補欠分子族 ＦＡＤ（７ラビン、アデニン、ノヌクレオチド） Ｆ　Ｍ　Ｎ　（７ラビン、モノヌクレオチド）ヘム Ｓ−アテ゛／シルメチオニン ＴＨＦ（テトラヒドロ葉酸） ＴＰＰ（チアミンニリン酸） ＣｏＡ（補酵素　Ａ） ｔＪＤＰ−Ｏｌｅ（ウリノンニリン酸グルコース）ＰＬ
Ｐ（ピリドキサールリン酸） ＡＴＰ（アデノシン三リン酸） ビオチン ＣｏＩにコチンアミドアテ゛ニンジヌクレオチド） Ｃｏｉｌ　にコチンアミド７デニンノヌクレオチドリン
ｌ！ｌり アデノンルフバラミン メチルコバラミン ＣｏＭ（２，２’−ノチオノエタンスルホンｆｌｌ）Ｃ
ｏＱ（ユビキノン） ５、　　アポ酵素 アポグルタチオン還元酵素 アポチトクローム還元酵素 アポＮＡＤＰＨデヒドロデナーゼ アポグルコース・オキシダーゼ アポリポアミド・デハイドロデナーゼ アボピリドキシン・ホスフェート・オキシダーゼ アボベルオキシグーゼ アポチトクロームＣ アポキサンチンオキシダーゼ アポ酵母乳酸デヒドロデナーゼ アボサルコシンオキシグーゼ アポｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ アポ７シルーＣｏＡデヒドロデナーゼ アボジヒドロリポ酸デヒドロデナーゼ アボコハク酸デヒドロデナーゼ アポホモシスティンメチルトランスフェラーゼ アポグルタミン酸ホルミルトランス７エラーゼ アポトランスケトラーゼ アボコリンアセチルトランス７エラーゼ７ボグリコーデ
ンシンターゼ アポアラニンアミノトランスフェラーゼアポへキソキナ
ーゼ ６、　酵素前駆体を活性化させる物質 エンテロペプチダーゼ ストレプトキナーゼ プロティンキナーゼ 酵素前駆体の各種プロテアーゼ ７、　酵素前駆体 トリプシノーゲン キモトリプシ／−デン プロテア−ゼ プロホスホリパーゼ プロレニン プロカルボキシペプチダーゼＡ プロ力ルボキシベプチグーゼＢ キニノーゲン プロエラスターゼ アンギオテンシ７−デン プロインシュリン プロバラチロイドホルモン プログルカゴン プロコラーゲン（可溶性） 凝集因子　℃、■、Ｘ■ プロエラスターゼ プロココーナーゼ プレカリクレイン ペプシノーゲン プラスミノーダン フイブリ／−デン プロトロンビン プラスミ／−デンプロアクチベータ ブロアクロジン ８、　蛍光物質 フルオレセイン　イソチオシアナート （ＦＩＴＣ） テトラメチルローダミン　インチオシアナ−）（ＴＲＩ
ＴＣ） ローダミンＢ　インチオシアナート （ＲＢＩＴＣ） リサミンローダミン−８２００スルホリル　クロライド
（ＲＢ　２００Ｓ　Ｃ） ウンベリフェロン ４−７チルウンベリ７エロン（４ＭＵ）フルオレセイン
チオフルバミル（ＦＴＣ）フルオレセインチオカルバミ
ル−ジフェニルグリシン（ＦＴＣ−ＤＰＧ） テトラメチルローダミン（Ｔ　Ｍ　Ｒ）５−（（４，６
−ノクロロトリアノンー２−イル）−７ミノ〕フルオレ
セイン ツメチルアミツナ７タレンー５−スルホニルクロライド
（Ｄ　Ｎ　５−ＣＩ） フルオラム ２−メ）キシ−２，４−ノフェニルー３（２Ｈ）−７う
／ン（ＭＤＰＦ） ７−９０ロー４−二トロベンゾ−２−オキサ−１，３−
ノアゾール（Ｎ　Ｂ　Ｄ−Ｃｊり１−７ニリノー８−す
７タレンスルホン酸（Ａ　Ｎ　Ｓ　） Ｎ−（３−ピレン）−マレイミド（ＮＰＭ）Ｎ−（７−
ノメチルアミ／−４−メチル２ｔキシ−３−クロロメチ
ル）−マレイミ　ド（ＤＡＣＭ） Ｎ−（ｐ−２−ベンズイミクソイル−７工二ル）−マレ
イミド（ＢＩＰＭ） ７ントラセンイソチオシ７ナート フルオロ７ンチルマレイミ）ＣＦＡＭ）希土類元素を含
む各種キレート及びそれらの誘導体 本発明の沼定方法で使用される特定成分、該特定成分の
類縁体及び該特定成分にｖｔｎ的に結合する物質と標ａ
ａ！！Ｊ質及１生物活性物質または、該生物活性物質と
特異的に結合する物質との結合物は、前記物質の特異的
に結合する能力及び標ａ物貿の信号を発する能力を保持
したまま化学的手段等で、直接または間接的に両物質を
結合することによって得られる。これらの結合物は、当
業者間で良く知られている公知の試薬と公知の方法で結
合させることにより得ることができ、更にくわしく言え
ば石川栄治、河合　忠、宮井　潔Ｉａ［酵素免疫測定法
（第２版）」（医学書院、１９７８年刊）や日本臨床病
理学会厖「臨床病理」臨時増刊特集第５３号「臨床検査
のためのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊
行会、１９８３年刊）などに記＠された方法を参考にす
ることができる９本発明の理解を助けるため以下に具体
的方法例を挙げるが、これは本発明を限定するものでは
ない。

（１）　互に結合させようとする物質を下記のような架
橋剤と反応させる方法。

■　　　２　．４　．６　−　　）　　リ　り　ロ　ロ
　−１，３，５−）　　リ　アジン ■　４，４′−７フルオロー３，３′−ジニトロジ７エ
ユルスルホン ■　トルエン−２，４−ノイソシアナート■　Ｎ、Ｎ’
−ノシクロへキシルカルボジイミド ■　１−（３−ツメチル７ミノプロビル）−３〜エチル
カルボツイミド ■　とスジタゾー０−ジアニンノン ■　グルタルアルデヒドなど （２）　互いに結合させようとする物質のうち少なくと
もどちらかが糖鎖を有している時、該糖鎖を過ヨウ素酸
で処理し、生じたアルデヒド基を結合すべき相手物質の
７ミノ基と反応させる方法。（必要に応じて、過ヨウ素
酸処理の際の不要な結合の形成を阻止するために１−フ
ルオロ−２，４−ン二トロベンゼン等で互いに結合させ
ようとする物質の一方を前処理しておくか過ヨウ素酸処
理反応のｐＨを４〜５に制御する、あるいは互いに結合
させようとする物質の間で形成されたシフ７塩基による
結合を、水素化硼素ナトリウムやエタノールアミン等で
処理し安定化する、といった処置をとってもよい。）（
３）互いに結合させようとする物質がチオール基を有し
ているか、あるいは還元等によりチオール基を生ずるあ
るいは適当な化合物で処理することによりチオール基を
導入できる場合、マレイミド試薬として知られている種
々の架橋剤と該チオール基と反応させる方法、（ここで
チオール基を導入する化合物としては次のような例が挙
げられる。

■　無水　Ｓ−アセチルメルカプトスクシン酸■　メチ
ル−３−メルカプトブロピオンイミグート ■　メチル−４−メルカプトブチルイミグート■　２−
イミノチオラン ■　３−（２’−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒ
ドロキンスクシンイミドエステル■　メチル３−（４’
−ノチオピリノル）プロビオンイミグートなど まｒこ、前述のマレイミド試薬としては次のような例が
挙げられる。

■　Ｎ、Ｎ’　−０−フェニレンノマレイミド■　Ｎ、
Ｎ’　−ｐ−フェニレンツマレイミド■　Ｎ、Ｎ’　　
　ａａ　　７ｘニレンジマレイミド■　Ｎ、Ｎ’−オキ
シジメチレンシマレイミド■　Ｎ−スクシンイミノルー
Ｎ−マレイミドアセタート ■　Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ’−マレイミド）
ブチラード ■　Ｎ−スクシンイミジル−５−（Ｎ−マレイミド）へ
ブタ／アート ■　Ｎ−スクシンイミジル−６−（Ｎ−マレイミド）ヘ
キサ／アート ■　Ｎ−スクシンイミノルー４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシラード ［株］　Ｎ−スクシンイミノルーａａ　−（Ｎ−マレイ
ミド）ベンゾアート ■　Ｎ−スクシンイミノルーｐ　−（Ｎ−マレイミドフ
ェニル）−４−ブチラード ＠　Ｎ−スルホスクシンイミノル−４−（Ｎ　−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラード ■　Ｎ−スルホスクシンイミノルーｍ　−（Ｎ−マレイ
ミド）ベンゾアート ＠）　Ｎ−スルホスクシンイミノルーｐ−（Ｎ　−マレ
イミドフェニル）−４−ブチラード■　Ｎ−スクシンイ
ミノルー４−（Ｎ−マレイミドメチル）ベンゼン−１−
カルボキシラード など （４）互にい結合させようとする物質にビリノル・ジス
ルフィド基を導入し結合すべき相手化合物に導入した、
あるいはもともと存在するチオール基と反応させる方法
、（チオール基のビリノル・ジスルフィド基への変換は
、４．４’−；／チオノピリジンなどにより行うことが
できる。）（５）互いに結合させようとする物質に存在
するまたは導入したアミ７基又はチオール基と、ｐ−ベ
ンゾキノリンを反応させる方法。

（６）　モノヨード酢ＷＩＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステルを、互いに結合させようとする物質に存在す
るまたは導入したチオール基に反応させる方法。

本発明ｔこ使用する標識物質と特異的１こ結合して、該
標識物質に起因する信号を変調させる物質は、使用する
標Ｗ＆物質に対応して選ばれるべきものであり、下記の
ような物質を例に挙げることができる。

１、標識物質が「６ｙ素」である場合 ・標識物質に起因する信号 該酵素活性による基質の減少、生成物の増加、エネルギ
ーの放射及びそれらに起因する変化、 ・好ましい物質 該酵素に対する阻害剤（＠述した阻害物質から該酵素に
対応するものを選んで使用できる。） 該酵素に対する抗体で、酵素に結合してその活性に影響
を与えるもの。

２、標識物質が「Ｍ、素基質］である場合・標識物質に
起因する信号 該基質が分析素子中に添加された酵素と反応することに
より生ずる生成物の増加、エネルギーの放射及びそれら
に起因する変化、 ・好ましい物質 該基質に対する抗体で、基質に結合することにより該酵
素反応を阻害するもの。

該基質を不可逆的阻害剤としで取り込む酵素。

該基質を基質とする酵素で、その反応により本来検出し
ようとしている信号を発しないもの。

３、標識物質が「補酵素」又は「補欠分子族」である場
合 ・標識物質に起因する信号 分析素子中に添加された該標識物質を必要とする酵素の
反応に上ろ基質の減少、生成物の増加、及びそれらに起
因する変化、・好ましい物質 該標識物質に対する抗体で、該標識物質に結合してその
活性に影響を与えるもの、該標識物質を吸収又は消費す
るが、その活性に上り本来検出しようとしている信号を
発しないもの。

４、標識物質が「アポ酵素」である場合・標識物質に起
因する信号 該標識物質はそのままでは信号を発しない。後述の吸収
物質と結合して＃索活性を発現し、その活性による基質
の減少、生成物の増加及びそれらに起因する変化を測定
できる。

・好ましい物質 該標識物質の酵素活性を発現させる補欠分子族、（前述
しｒ−補欠分子族から該標識物質に対応するものを選ん
で使用できる）５、標識物質が「酵素前駆体を活性化さ
せる物質」である場合 ・標識物質に起因する信号 該標識物質が、分析素子中に添加された酵素前駆体を活
性化し、その活性１こよる基質の減少、生成物の増加、
及びそれらに起因する変化。

・好ましい物質 該物質に対する抗体で、該物質に結合してその活性に影
響を与えるもの。　゛ 該物質が酵素である場合、その阻害剤。

、６．標識物質が「酵素＠足体」である場合・標識物質
に起因する信号 該標識物質はそのままでは信号を発しない、後述の吸収
物質にいったん結合後分子の一部が切断され酵素活性を
発現し、その活性による基質の減少、生成物の増加及び
それらに起因する変化を測定できる。

・好ましい物質 該標識物質のｌＩ￥素活性を発現さ物質７、標識物質が
「蛍光物質」である場合・標Ｗ＆物質に起因する信号 該蛍光物質に励起光をあてた際に発する蛍光、 ・好ましい物質 該標識物質に対する抗体及びその誘導体で、該標識物質
の蛍光波長・強度を変化させるもの。

上記の各種物質の具体例はいずれも当業者に上く知られ
ており、あらためて開示するまでもないが本発明に理解
を助けるために、代表的な例を以下に示す。

本発明に使用しうる酵素と阻害剤の組み合せとしては、
フェニル水銀誘導体とＳＨＮ素（グルコースオキシグー
ゼ、フリンオキシグーゼ、グリコール酸オキシグーゼ、
グリセロール−３−リン酸ノヒドロデナーゼ、リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、グルタル酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロデナ
ーゼ、など）、イソフタル酸誘導体とグルタル酸デヒド
ロゲナーゼ、α−アミラーゼとアミラーゼインヒビター
、エステラーゼとベスタチン、ビオチン酵素（ピルビン
酸カルボキシラーゼ、アセチルＣｏ−Ａカルボキシラー
ゼ、プロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマ
ロニル−ＣｏＡカルボキンラーゼなど）とアとシン、ベ
ルオキシグーゼと０−ノアニノンーデキストラン、乳酸
オキシダーゼと２−ヒドロキシル−３−ブチン酸、モノ
アミンオキシグーゼとＮ、Ｎ−トリメチル−２−プロピ
ニルアミン又はβ−アミノプロピオニトリルなどが挙げ
られ、更にジャーナル　オブ　シ　アメリカン　ケミカ
ルソサイテ（−（Ｊ、Ａｍ、　ＣｈｅＩＩ。

５ｏｃ）第８０巻、ＰＩＳ４５６１　（１９５８年）二
同第８２巻、第５９８頁（１９８０年）：アカウンツ　
オプ　ケミカル　リサーチ（Ａ　ｅｃ、　−Ｃｈｅｍ、
　　Ｒｅｓ）第９巻、３１３頁（１９７６年）：サイエ
ンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）第１８５巻３２０＠　（１９
７４年）：化学工業１９８５第２１頁（１９８５年）な
どに記載された、若しくは引用された酵素・阻害剤の組
合せも好ましく用いることができる。

本発明における多孔質反応層とは、該特定成分と該特定
物質とｖｆ異的に結合する物質との結合反応、標識物質
と該標識物質と特異的に結合し該標識物質に起因する信
号を変調させる物質との結合反応および生物活性物質と
該生物活性物質と特異的に結合する物質との結合反応を
行なう層であり、標識物質と特異的に結合し、該標識物
質に起因する信号を変調させる物質および生物活性物質
または該生物活性物質と特異的に結合する物質は、反応
層の一部若しくは全部に固定化されている必要がある。

また、反応時間中流体試料を保持するために、反応層の
一部若しくは全部に、流体試料と自由に接触し得る相互
連絡空隙孔（短径５μ値〜３００μ−が好ましい）を有
する多孔性構造が存在していることが必要である。

上記の条件を満たしていれば、該多孔質反応層の素材は
特に限定されない。

好ましい例としてはサイズ１０万至３５０ミクロンの粒
状体あるいは４０万至４００メツシユの繊維から１つ以
上選ばれた素材により購成される構造体が挙げられる。

該粒状体の材料としては、ケイソウ土、二酸化チタン、
硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロース、
ケイ砂、プラス、シリカゾル、架橋デキストラン、架橋
ポリアクリル７ミド、アガロース、架橋アガロース、各
種合成樹脂（ポリスチレンなと）などの他、次のような
反応性基を持つ化合物から成る自己結合型粒子が挙げら
れる。

例示化合物 （１）ポリ（スチレンーコーグリシノルメタクリレー　
ト　）　　（，９０／１０　）　　。

（２）ポリ（スチレンーコーメチルアクリレートーコー
グリシノルメタクリレート） （８０／１５１５　）。

（３）ポリ（スチレンーコー〇−プチルメタクリレート
ーコーグリシノルメタクリレート）（７５／１５／１０
　）。

（４）ポリ（スチレンーコービニルベンノルクロフイド
ーコーグリシジルメタクリレート）（８０／１０／１０
　）。

（５）ポリ（スチレンーコーノビニルベンゼンーコーグ
リシジルアクリレー）） （９０／２／８　）　。

（６）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーグリシソルメタ
クリレー）　）　（９０／１０　）。

（７）ポリ（メタクリレートーコーグリシノルメタク　
リ　し　−　ト　）　（８０／２０　）　　。

（８）ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ツメチルアミノエ
チルメタクリレート）（９５１５）。

フ （９）ポリ（スチレンーフーアノリジルエチルメ＋り　
リ　し　−　ト　）［：９５１５Ｌ（１０）ポリ（スチ
レンーフーメチルアクリレートーコーアクロレイン）　
（９０１５１５）。

（１１）ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）（９５
１５）（１２）ポリ（スチレンーコービニルチオール）
　（９５１５）（１３）ポリ（スチレンーコーメチロー
ル化アクリルアミド）（９５１５）。

（１４）ポリ（スチレンーコーし一ブチルアクリレート
ーグリシジルメタクリレ−）　）　（９０１５１５）（
１５）ポリ（スチレンーフービニルイソンアネート）（
９５１５）。

（１６）ポリ（メチルアクリレートーコースチレンーコ
ーＮ−７チロールアクリルアミト）（、５０／３５／１
５　）。

（１７）ポリ（スチレンーフーグリシノルメタクリレー
トーコーＮ、Ｎ−ツメチル７ミノエチタ　　　　　　　
　ノ ルメ奈クリレート）　Ｃ９０１５１５）。

（１８）ポリ（スチレンーコーメタクリル酸−コーアク
リルアミド）　（９５／２／３　）。

（１９）ポリ（スチレンーコーＮ−メチロールアクリル
アミドーフーアクリル酸メ）キシエチル）　（９０１５
１５）　。

（２０）ポリ（ｐ−ビニルトルエン−ツーＮ−メチロー
ルアクリルアミド−ツーアクリル酸）（９０／８／２　
）　。

（２１）ポリ（メチルメタクリレートーコーグリシジル
メタクリレートーコーし一ブチルアクリ　し　−　ト　
）　（８０／１０／１０　）　　。

（２２）ポリ（スチレンーコーｐ−ビニルベンジルクロ
ライドーコーアクリル酸−コーアクリル酸ウレイドエチ
ル）　（７５／１０１５／１０　）　。

（２３）ポリ（スチレンーコ−７タクロレインーコ−α
−ヒドロキシエチルメタクリレート） Ｃ９０１５１５）　。

（２４）ポリ（スチレンーコーアクロレインーコ−７セ
トアセトキシエチルメチクリレート） Ｃ８５１５／１０　）。

（２５）ポリ（スチレンーコーＮｌＮ−ノメチルアミン
エチルアクリレートーコービニルスルホニルエチルメタ
クリレート）　［９０１５１５）　。

（２６）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーアミノスチレ
ンーコービニルスルホニルエチルメタク　リ　し　−　
ト　）　（８５／１０１５　）　　。

（２７）ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ツメチルアミ７
エチルメタクリレート）　（９０／１０　）　。

（２８）ポリ（スチレンーコーアクリル酸）（９７／３
）。

（２９）ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）　［９
７／３　］。

（３０）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーフ−１−ブチルア
クリレ−）　）（９５１５）　。

（３１）ポリ（メチルアクリレート−コニメタクリルア
ミド）　（９５１５）。

（３２）ポリ（スチレン−ツーＮ−メチロールアクリル
アミド）［９５１５）。

（３３）ポリ（ｐ−ビニルベンノルクロライトーコーＮ
−メチロールアクリル７ミド）　［９６／４　）。

（３４）　　ポリ（スチレンーコーイタコン酸）（９８
／２）。

（３５）　　ポリ（スチレンーコーし一ブチルアクリレ
ー　　）　　）（９２／８）　　。

（３６）　　ポリ（メチルアクリレートーコースチレン
ーコーアクロレイン）　（３０／６５１５　）。

（３７）　　ポリ（メチルメタクリレートーコースチレ
ンーコ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート　）　（
２５／７０１５　：ｌ　　。

（３８）　　ポリ（スチレンーコービニルスルホニルエ
チルアクリレー）　）　（８０／２０　）。

（３９）　　ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ツメチルア
ミノエチルアクリレート）　Ｃ９０／１０　）　。

（４０）　　ポリ（スチレンメチルアクリレ−Ｆ−コー
アセトアセトキンエチルアクリレート）（９０１５１５
）　。

（４１）　　ポリ（スチレン−ツーメタクリル酸）　［
９５１５］。

各例示化合物の後の括弧内は重合反応に用いた単量体の
重量％を示す。

あるいは、これらの粒子数種を混合して用いることもで
きる。

また、本発明の多孔質反応層に用いる繊維としては、パ
ルプ、粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン
、セルロースエステル、ビスコースレーヨン、銅アンモ
ニアレーヨン、ポリアミド（６−ナイロン、　６ローナ
イロン、６１０−ナイロンなど）、ポリエステル（ポリ
エチレンテレ７グレートなど）、ポリオレフィン（ポリ
プロピレン、ビニロンなど）、〃ラスＭ＆維、石綿など
の植物性・動物性・鉱物性・合成・半合成・再生繊維を
用いることができ、あるいはこれらを）混合して用いて
も良い。あるいは別の態様としては吸水性の洋紙、和紙
、濾紙、プラッシュポリマー、あるいはガラス繊維、鉱
物性ａ、＄１８（石綿など）、植物性繊維（木綿、麻、
パルプなど）、動物性繊ａ（羊毛、絹など）、合ｒ＆ｈ
Ｉ１．Ｉｋ（各種ナイロン、ビニロン、ポリエチレンテ
レフタレート、ポリプロピレンなと）、再生繊ｍ（レー
ヨン、セルロースエステルなど）などをたんどくあるい
は混合して！Ｉｔａした織物、不織布、合成紙などを該
多孔質反応層に用いることもできる。

このような粒状体、繊維、あるいは粒状体と繊維の混合
物を塗布及び／又は製膜することにより、流体試料と自
由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造が存
在する多孔質反応層を形成する。自己結合性を有しない
粒子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着する形で
！！膜することができ、例えば特開昭４９−５３８８８
号、同５５−９０８５９号、同５７−６７８６０号各公
報の方法を適用することができる。自己結合性を有する
有機ポリマー粒子は特開昭５７−１０１７６０号、同５
７−１０１７６１号、同５８−７０１６３号各公報に記
載の方法により同様に製膜できる。繊維又は繊維及び粒
子の混合物についてはｖｆ閏昭５７−１２５８４７号、
同５７−１９７４６６号公報に記載された繊維分散液を
塗布することにより多孔質反応層を形成できる。また特
開昭６０−１７３４７１号明細書で行なわれている方法
のようにゼラチンやポリビニルピロリドンのような水溶
性バイングーを使泪したＭ＆維分散液を塗布することも
可能である。このような分散液を製造するためには、多
くの方法を単独または組合わせて用いることが可能であ
る０例えば有用な方法の一つとして界面活性剤を液体キ
ャリャーへ添加し粒状体および／又は、４ａ維の分散液
中における分布および安定化を促進することができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライト
ン■Ｘ−１００（ロームアンドバー入社製；オクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール）サーファクタントＩ
ＯＧ■（オリーン社製；＝ルアー７キシボリグリシドー
ル）等の非イオン性界面活性剤がある。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、粒状体お上び／又は繊維の重量に対して１
０重量パーセント乃至０．００５重量パーセント好まし
くは６重量パーセント乃至０．０５重量パーセント用い
ることがでさる。更に別の方法として該粒子単位と液体
キャリーの音波処理、物理的混合、および物理的撹拌処
理、ｐＨ調整がある。これらは前記の方法と組合わせる
ことにより、さらに有用である。

また繊維や粒状体等に固定化れな生物活性物質または該
生物活性物質と特異的に結合する物質及び標識物質と特
異的に結合し、該標識物質に起因する信号を変調させる
物質や特定成分、該特定成分のＭ縁体、該特定成分と特
異的に結合するｖＩＪ質と生物活性物質または該生物活
性物質と特異的に結合する物質および標識物質の結合物
の特異的に結合する能力及び標識物質の信号を発する能
力を保持し多孔質反応層または後述の層中に含有させる
ために、特開昭６１−１７７９９７号に記載されている
方法を用いることができる。生物活性物質または該生物
活性物質と特異的に結合する物質および標識物質と特異
的レニ結合し、該標識物質に起因する信号を変調させる
物質の多孔質反応層への固定化は、種々の公知の方法に
より、該物質を該多孔質の反応層の表面に物理的に吸着
させるか、化学反応により直接あるいは間接的に結合さ
せることにより達成される。その際、該物質の該特定成
分に対する特異的結合性が失われないように留意する必
要があり、例えば石川栄治、河合　志、官井　潔編「醇
素免疫測定法（第２版）」（医学書院、１９７８年刊）
や千畑一部、土佐哲也、松属雄志、ＩＦ［実験と応用ア
フイニテイクロマトグラフイー」（講鱗社：１９７８年
刊）に記載されている方法を、好ましい方法の例として
挙げることができる。また多孔質反応層へのこれらの物
質の固定化は、特異結合部位が保持されており、かつ流
体試料中にｉ離、溶解した状態でなければよく、流体試
料中に不溶の状態で分散されていてもよい、またカラー
写真で用いられるカプラーの分散に用いられる方法（例
えば日本写真学会層「写真工学の基礎、銀塩纒」（コロ
ナ社１９７８年刊）、脂質二分子膜中に含有させる方法
等も使用できる。また、該特定成分と特異的に結合し得
る物質を不動化後に、必要に応じて免疫反応における非
特異的反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に
関与しないタンパク質を担持することが可能である。そ
れらの代表的な例としては、哺乳動物の正常血清タンパ
ク質、フルプミン、ゼラチン及びそれらの分解ｖ！Ｊ￥
？が挙げられる。

これらの固定化繰作は、前述の粒状体あるいは繊維にあ
らかじめ行っておいた後、多孔質反応層を形成しても良
（、あるいは多孔質反応層を形成した後に該固定化操作
を行うことも可能である。

前者の場合、前記物質を固定化した粒状体または繊維の
他に前述の特異的反応に関与しないタンパク質みを固定
化した粒状体または繊維を調節のために加えることも可
能である。

二種の固定化物の混合比は、各々に固定化された特異結
合物質の１と結合定数に応じて定められて、必要に応じ
ては更に、特異的結合物質を固定化しない粒状体又は繊
維を調整のために加えてもよい。

本発明の固定化物の組み合せは、生物活性物質と標識物
質と特異的に結合して該標識物質に起因する信号を変調
させる物質との組合せ、該生物活性物質と特異的に結合
し得る物質と標識物質と特異的に結合して該標識物質に
起因する信号を変調させる物質との組合せである。この
ように二つの固定化物を用いるのは、溶液中でＢ／Ｆ分
離を行うためと、標識物質に起因する信号を変調させる
ためである。

本発明の分析素子の形態は分析を行いうるちのであれば
よく、特に制限されるものではないが、５ｉ！遣上及び
操作・測定上、フィルム状あるいはシート状であること
が好ましい。

本発明の態様は、二種の固定化物が多孔質反応層の同一
層に固定されて含有されている場合お上り該二種の固定
化物が二層以上の多孔質反応層に固定化されて含有され
ている場合を含む。

本発明の分析素子の理解を助けるために、−例を挙げて
原理を説明する。

第１図は本発明による分析素子の最も単純な態様の断面
図の一例である。この場合は多孔質反応／ＩＩＪＯのみ
で分析素子が構成されており、該二種の固定化物が固定
化されて多孔質反応層中に含有されている。

第２図は第１図の拡大図である。第２図１こおいてＡは
生物活性物質または、該生物活性物質と特異的に結合す
る物質が固定化されてた粒状体、Ｂは標識物質と特異的
に結合し該標識物質に起因する信号を変調させる物質が
固定化された粒状体、モしてＣは調整ために添加された
粒状体である。

第２図は粒状体Ａ、Ｂ及びＣが均一に混合され、点接着
することにより多孔質反応層が構成されていることを示
している。

第３図は本発明の測定原理を説明するための楔弐図であ
り、反応型式を競合法に例をとって説明する。

第３１２１において １は特定成分、２は標識物質、３は特定成分と標識物質
の結合物（標識体と略す）、４は特定成分と特異的に結
合する物質、５は生物活性物質（または、生物活性物質
と１８異的に結合する物質）、６は特定成分に特異的に
結合する物質と生物活性物質の結合物、７は生物活性物
質と特異的に結合する物質（または生物活性物質）、８
は標識物質とｖｆ異的に結合し、標識物質に起因する信
号を変調させる物質、９は特定成分と結合物６との結合
反応生成物、１０は結合物３と結合物６との結合反応生
成物、Ａは７の固定化物、Ｂは８の固定化物を表わす。

流体試料の一定量、標識体３を含有する溶液、流体試料
中の特定成分と特異的に結合する物質と生物活性物質と
の結合物６を含有する溶液を順次滴下する（滴下順序は
待に問わない）。

特定成分１．５識体３、結合物６は液相に存在している
ために、これらの結合反応（１と６または３と６）は、
固液反応系固定化物Ａと結合物６の結合反応（結合部位
は５と７）、固定化物Ｂと標識体３の結合反応（結合部
位は２と８）よりも十分に速く起こるために、液相の結
合反応が優先的に起こると考えられる。よって結果的に
は、上記の固液系の反応は起こらず、液相系の反応が十
分量起こった後に、別の固液系の反応が起こる液相系の
結合反応の結果、液相に存在する未反応の結合物３、特
定成分１と結合物６との結合反応生成物９は、それぞれ
未反応の標識体３は固定化物Ｂと結合反応（結合部位は
、２と８）し、結合反応物っけ、固定化物Ａと結合反応
（結合部位は、５と７）する。また１５．ａ体３と結合
物６との結合反応生成物１０は、固定化物ＡまたはＢと
結合反応が可能であるが、５と７の結合力が２と８との
結合力よりも強い組み合せを選択する二とにより、固定
化物Ａと優先的に結合させることが可能である。

このように、特定成分１及び特定成分と標識物質からな
る標識体３の夫々に対する結合物６との結合反応生成物
９と１０は固定化物Ａに、未反応の標識体３は固定化物
Ｂにそれぞれ層内で分離（Ｂ／Ｆ分離）することができ
る、標識体３の標識物質２は、固定化物Ｂと８との結合
により標識物質に起因する信号が変調されるので、流体
試料中の特定成分の濃度と標識物質全体の信号強度の間
には、関数関係が成立する。そこであらかじめ特定成分
Ｉの濃度がわかっている流体試料（標準試料）を数種類
用いて検量線を作成しておけば、未知の液体試料中の特
定成分の濃度を知ることができる。

信号の測定方法は標識の！ｒＩｉ類により異なる。

例えば標識物質が蛍光物質であれば、分析素子に励起光
を当て、蛍光強度を測定すれば良い。標識物質が酵素で
あれば適当な基質、必要ならば酵素や発色系を含む溶液
を添加し一定時間インキユベートした後に、該発色系に
適合した波長の光の反射濃度（基質の種類によっては蛍
光強度、発光強度）を測定することにより信号強度を測
定でさる。

このような目的で用いられる基質・発色系は標識酵素の
種類に従って公知の方法から適当なものを選択できる。

標識物質として酵素を用いる場合、過酸化水素及びＮＡ
ＤＨＳＮＡＤＨＰが関与する酵素反応系の酵素、発色系
が好ましく用いられる。過酸化水素が関与する酵素反応
系の酵素は次のようなものがあげられる。

ＥＣ１，１，３，１グリコール酸オキシダーゼ１．１．
３．２　　　乳酸オキシダーゼ１．１，３．４　　　グ
ルフースオキシグーゼ１．１，３．６　　　コレステロ
ールオキシダーゼ１．１．３，９　　　、ｆラクトース
オキシダーゼ１．１．３．１７　　コリンオキシダーゼ
１．１，３．−Ｌ−α−グリセロリン酸オキシダーゼ １．１１．１．１７　　ペルオキシダーゼ１．２，３．
２　　　キサンチンオキシダーゼ１．２，３．３　　　
ピルビン酸オキングーゼ１．２．３．４　　　シュウ酸
オキシダーゼ１．３．３．−　アシルＣｏ　Ａオキシダ
ーゼ１．４．３．２　　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ１
．４．３．３　　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１．４．
３．６　　　アミンオキシダーゼ（銅含有）１．５，３
．１　　　ザルコンンオキシグーゼ１．７．３．３　　
　尿酸オキシダーゼ等 ペルオキシダーゼ以外の酵素は、過酸化水素発生酵素な
ので、発生した過酸化水素を検出可能な形（例えば、比
色、蛍光、発光等で検出）に変換する物質、例えば白金
、銀、鉄等の金属、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ等の
酵素等が挙げられる。

待にペルオキシダーゼを用い、比色で測定することが好
ましく、この場合次のような基質が挙げられ、それらの
物質のうち１種もしくは数種選んで用いられる。

１）　　Ｏ−ノアニシジン又はその塩 ２）Ｏ−）リジン又はその塩 ３）　グアヤク ４）　アドレナリン ５）　フェノール７タレン Ｇ）７エロシアン化物 ７）　４−アミノアンチピリン及びその誘導体又はそれ
らの塩と、７エ７−ル又はす７トール又はそれらの誘導
体との組み合わせ ８）アニリン及びその誘導体 ９）　〇−トルイノン、ｐ−トルイノン等のモノアミン
類 １０）Ｏ−フェニレンノアミン、Ｎ、Ｎ−ツメチル１］
　　７ｘニレンノアミン、Ｎ、Ｎ−ノエチルフェニレン
ノアミン、ベンツノン、ノアニジノン等のノアミノ類 １１）７エ７−ル、チモール、Ｏ−１ω−及びｐ−クレ
ゾール、α−す７トール、β−す７トール等のフェノー
ル類 １２）　　カテコール、グアヤコール、オルシ／−ル、
ピロガロール、Ｐ、Ｐ−ノヒドロキシノフェニル、クロ
ログルシノールのようなポリフェノール類 １３）サリチル酸、ピロカテキン酸、没食子酸のような
芳香族のような酸 １４）　　ロイツマカライトグリーン、ロイコフェノー
ルフタシンのようなロイコ染料 １５）　　２．６−ノクロロ７エ／−ルインド７工７一
ルのような着色染料 １６）　　エピネフリン、７ラボン類、チロシン、ノヒ
ドロキシフェニルアラニン、トリプト７Ｔンのような種
々の生化学物質 １７）　　２．２’　−７ノ７ノく３−エチル−６−ス
ルホベンゾチアゾリン）又はその塩及び３．３’　−ノ
アミノベンツジンのような特殊染料 １８）　　２−（４−ヒドロキシ−３−メトキン７エメ
ール）−４，５−ビス（ｐ−ノットキシアミ／フェニル
）イミダゾール １９）　　１）−７ニンジンと８−ヒドロキシ７ニリン
の組み合わせ ２０）　　３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾ
ンとＮ、Ｎ−ツメチルアニリンの組み合わせ２１）　　
その池、グアヤコム、グアヤコン酸、ヨウ化カリウム、
ヨウ化ナトリウム及び他の水溶性ヨウ化物、並びにビリ
ルビンのような物質等 ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨが関与する酵素反応系の酵素とし
ては、次のようなものがあげられる。

ＥＣ１，１，１，１アルコールデヒドロデナーゼ１．１
．１．６　　　グリセロールデヒドロデナーゼ Ｌ、１，１．２７　　乳酸ヂヒドロデナーゼ１．１．１
．３７　　　リンゴ酸デヒドロデナーゼ１．１．１．４
０　　　リンゴ酸デヒドロデナーゼ（オキサロ酢酸−説
炭素） （Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　”） １．１．１．４７　　グルフースデヒドロデナーゼ１．
１．１．４８　　、ｆラクトースデヒドロデナーゼ １．１．１．４９　　　グルツース−６−リン酸テ゛ヒ
ドロデナーゼ １．２．１．１　　　ホルムアルデヒドデヒドロデナー
ゼ １．２．１．１２　　グリセルアルデヒドリン酸テヒド
ロデナーゼ １．４．ｉ、１　　　アラニンデヒドロデナーゼ１．４
．１．３　　　グルタミン酸デヒドロデナーゼ（Ｎ　Ａ
　Ｄ　（Ｐ戸） １．４．１．４　　　グルタミン酸デヒドロデナーゼ（
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　＋） １．５．１．３　　　テトラヒドロ葉酸デヒドロデナー
ゼ ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの定量は、ＮＡＤＨあるい
はＮＡＤＰＨを直接３４０ｎｖで比色定量してもよいし
、または、適当な物質を用いてＮＡＤＨあるいはＮＡＤ
ＰＨを発色色原体、蛍光前駆体、発光体等と作用させ、
比色、蛍光、発光等で定量してもよい。ここでの適当な
物質とはＮＡＤＨあるいはＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを酸化し
、発色色原体、蛍光前駆体、発光体等を還元する反応を
触媒する物質をさし、具体的には、５−メチル７エナノ
ニウムメチルサル７エート、（１−メトキシ）−５−メ
チル７エナノニウムメチルサル７エート（以下ＭｅＯ−
ＰＭＳと略記する）、メルトラブル−（すなわち、９−
ツメチルアミノベンゾ−α−７エナゾキトニウムクロラ
イド）などの化合物や、ノヒドロリボアミドレグクター
ゼ（ＮＡＤ）、ＮＡＤＨデヒドロデナーゼ、ＮＡＤＰＨ
デヒドロデナーゼ（キノン）、ＮＡＤＰＨデヒドロデナ
ーゼ（キノン）などの酵素を用いることができる。

この場合好ましい発色色原体の例として３−（ｐ−ヨー
ドフェニル）−２−（ｐ−二トロフェニル）−５−フェ
ニル−２水素テトラゾリウムクロライド、３−（４，５
−ツメチル−２−チオアゾリル）−２゜５−ノフェニル
ー２水素テトラゾリウムブロマイド、３．３　’　−（
４，４’−ビフェニレン）−ビス（２゜５−ジフェニル
−２水素テトラゾリウムクロライド）（Ｎ　ｅｏＴ　Ｂ
　）、３．３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４’−
ビフェニリレン）−ビス（２−（ｐ−二トロフェニル）
−５−フェニル−２水Ｘテｌ？シリツムクロライド）　
（Ｎ　１ｔｒｏ　−Ｔ　Ｂ　）、３．３’　−＜３．３
　’−シメトキンー４，４゛−ビフェニリレン）−ビス
（２，５−ジフェニル−２水素テトラゾリウムクロライ
ド）（ＴＢ）、３．３’　−（３，３’　−７メトキシ
ー４，４′−ビフェニリレン）−ビス［２，５−ビス（
ｐ−ニトロフェニル）−２水素テトラシリツムクロライ
ド］（ＴＮＴＢ）等が挙げられる。

標識酵素に起因した信号は、吸光度法（比色法）、蛍光
法または、発光法で検出することができ、測定法として
は信号の経時的変化を測定するレート測定法または一定
時間後の信号を測定するエンドポイント測定法で測定す
ることができる。吸光度法（比色法）では、紫外光、可
視光、近赤外光を利用することができ、例えば流体試料
として血清を用いる場合には、血清による吸光の影響を
小さくするために緑色光、赤色光または、近赤外光を利
用するのが好ましい。

第４図は、多孔質反応層が二層であり、生物活性物質ま
たは、該生物活性物質と特異的に結合する物質、および
標識物質と特異的に結合し、該標識物質に起因する信号
を変調させる物質は、それぞれ別々の層に固定化されて
含有されている。これらの層は、同様又は別の多孔質反
応層に用いられる素材を塗布、製膜または、貼付けにに
よって得られる。

本発明の分析素子は前述の多孔質反応層が最低必要構成
要素であるが、発明の効果をより一層発揮するために種
々の補助層を設けることができる。

第４図〜第９図に本発明に分析素子の実施の態様を表す
断面概略図を示す。

第５図に示した本発明の分析素子は光透過性支持体１１
の上に多孔質反応ｐＩｉＯがＭｔ層されており、支持体
の存在により素子の取扱い性が向上している。このよう
な目的で使用し得る支持体は、例えば酢酸セルロース、
ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート及１ポ
リビニル化合物（例えばポリスチレン）のような高分子
化合物、あるいはガラスのような透明無機化合物が挙げ
られる。該多孔性反応層はこのような支持体の上で直接
塗布及び／又は製膜するか、あるいはいったん多孔質反
応層を別に形成した後に前述の支持体に貼りつけても良
い。第５図に示した態様の場合、流体試料は反応層側か
ら滴下する必要があるが、信号の測定は両側から行うこ
とが可能である。

第６図に示した本発明の別の態様では、光反射性支持体
１２の上に反応層が設けられている。この態様では、試
料等の滴下、信号測定とも多孔性反応Ｎ側から行い、信
号を反射濃度で測定する際に光反射性支持体がそれを容
易にしている（信号を蛍光強度で測定する際は黒色の吸
光性支持体を同じように用いることで同様な効果を得る
ことができる。） このような目的で使用し得る支持体の材質としては前述
の支持体の材質に加えてセラミックス、金属、あるいは
υｇ脂被被覆で防水処理を施した紙等が挙げられ、これ
らの材質に必要ならばＴｉＯ２、Ｂ　ａｓＯいマイカな
どの白色顔料等を塗布するか含有させることにより目的
を果たすことができる。

第７図の態様も同様な目的によるもので、光透過性支持
体１１の上に多孔質反応ＮＯ１光反射ｉ１３が順に積層
されている。この態様では試料等は光反射１１ｉＩ（ｌ
ＩＩｌから滴下され、信号測定は光透過性支持体側から
行われる。光反射層は公知の分析素子及びその類似品に
用いられていたものをいずれも使用できるが、好ましく
は多孔質反応層に用いられるのと同様な粒子及びａ雑に
前述の白色顔料等を含有させたものを塗布又はＭ膜する
か貼りつけることができる。更に好ましくは内部に白色
顔料を含有する粒子の表面に多孔質反応層に用いる時と
同様に生物活性物質または該生物活性物質と特異的に反
応する物質および該標識物質と特異的に反応し、該標Ｗ
＆物質に起因する信号を変調させる物質を固定化し、下
層の多孔質反応層と同様の機能を持たせた光反射層を設
けることができる。このような特殊な光反射層を用いる
と、光反射層内に多くの未又応標識物質が残ることを防
止できる。

第１２図の態様では、光透過性支持体上に、発色試薬層
１５が設けられている。この発色試薬層は、酸素活性測
定に必要な基質、発色試薬を含有させた少なくとも一層
の親水性コロイドから成る。

基質や発色試薬は親水性コロイドから成るバインダー中
に溶解、あるいは分散し塗布液とすることができる。特
に疎水性化合物の分散には写真業界で多用されているオ
イルプロテクト分散法、直接分散法等種々の公知の分散
法を用いることができる。

更に本発明に係る発色試薬層に朋いられる親水性コロイ
ドは、ゼラチン、７タル化ゼラチン等のゼラチン誘導体
、ポリビニルアルコール、ポリビニルとロリドン、ポリ
ビニルアルコ−ル、ポリアクリルアミド、ポリアクリル
酸ナトリウム等の合成高分子、ヒドロキシエチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等のセ
ルロース誘導体の多糖類等が挙げられる。そして好まし
くはゼラチン、７タル化ゼラチン等のゼラチン誘導体が
挙げられる。

更に本発明に係る発色試薬層のバインダーは、その膜物
性、例えば膨潤度や熱による溶解性の改良のために一部
を他の水分散性高分子重合体。即ち高分子ラティックス
と置換することができる。

好ましい高分子ラテックスの例としては、例乏ば特開昭
５７−１１６２５８号、同５８−９９７５２号記載のも
のが有用である。これらの高分子ラテックスは、親水性
コロイドバイングーの最大７０パーセントを置換するこ
とが可能であるが、好ましくは約５５パーセント以下の
置換である該発色試薬層には他の添加剤、例えば緩衝剤
、保恒剤、界面活性剤、媒染剤等を目的に応じて添加す
ることができる。また、その膜厚は約３乃至約５０ミク
ロン、好ましくは約３０乃至５ミクロンである。４１衝
剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反応等に適した
ｐＨするために含有される。用いることができるｌ衝剤
としては日本化学会ＭＡ「化学便覧基礎編」（東京、丸
善（株）１９６６）ｐｐ１３１２−１３２０、Ｎ、Ｅ、
（Ｃｏｏｄ）等、バイオケミストリ（Ｂｅｏｃｈｅｉ＋
１ｓｔｖｙ）、５，４６７（１９６６）、金材、斎藤、
化学の領域３０（２）７９（１９７８）、Ｉｔ４．Ｊ７
　ｒ−ギュソン（Ｆｅｒ−ｇｕｓｏｎ）等、＾ｎａ　ｌ
　、　Ｂ　１ｏｃｈｅｖ、　、１０４．３００（１９８
０）等の文献に記載されているものをあげることができ
る。

具体的な例としては、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ト
リスバルビッール、グリシン、グツド緩衝剤等があげら
れる。これらの４１１街剤は必要に応じて発色試薬層以
外の層に含有させてもよい。

保恒剤は、基質発色試薬の保存安定化のために含有され
、酸化防止剤などがある。また二種の固定化物や結合物
、および標識体を層中に含有させる場合の活性保持のた
めに、固定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイの吸
着体、固定化抗体、及びタンパク質や酵素等の保存に用
いられる保恒剤を含有される。その物質としては、日本
生化学全編「生化学実験講座１．タンパク質の化学ＩＪ
（東京化学同人（株）１９７６）ＰＰ６６〜６７、前述
の実験と応用「アフイニテイクロマトグラフイＪＰＰ１
０３〜１０４、特開昭６０−１４９９２７号等に記載さ
れているものがあげられる。

具体的な例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、アル
ブミン　ＢＳＡ、シクロデキストリン類、非還元糖類（
シュクロース、トレハロース）、ポリエチレングリコー
ル、７ミ／醗、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げられ
る。これらの保恒剤は二種の固定化された物質や結合物
及び酵素標識体の近傍に存在させることが好ましい。

硬膜剤としては、写真業界で多用されている物質を用い
ることができ、Ｔ、１１ジエイムス（Ｔ、Ｈ，Ｊａｍｅ
ｓ）編「ザ・セオリー・オプ・ザ・７オトグラフイツク
プロセＸ　Ｊ　（Ｔｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ
　ＰｏｔｏＨｒａｐｈｉｃＰｒｏｃｅｓｓ）（第４版）
ＰＰ７７−８７に記載されているものをあげろことがで
きる。具体的な例としては、アルデヒド類、活性オレフ
ィン類、活性エステル類等があげられる。

界面活性剤としては、前述のものがあげられる。

その他の層中に含有される試薬としでは、溶解助剤、プ
ロ７カー試薬などがある。これらの添加剤は、必要に応
じて適当量添加する。ｖ＆染剤は、酵素活性測定のため
の検出物質を、発色試薬層に集中的に集めたり、検出物
質が色素の場合、吸光度係数を高めたり、波長をシフト
させる物質であり、検出物質と強い相互作用を示めす、
カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー及びこれらの
ポリマーのラテックスが用いられる。

以上に述べてきた本発明の態様はいずれも素子中特定成
分と特異的に結合する物質に対する生物活性物質または
該生物活性物質と特異的に結合する物質との結合物（以
下結合物と略）及び標識体を含有していない。これらの
態様に代表される、結合物及び標識体を素子中、に含有
しない本発明の態様は前記両者の束縛を受けない自由な
態様であり、この態様には、特に次のような驚くべき効
果が生じる。

すなわち、従来開発されて米だ免疫的分析素子は、いず
れもある特定の成分を分析するために作成されるもので
あり、特定成分Ｍ１を測定するために作成された分析素
子を特定成分Ｍ１とは異なる特定成分Ｍ２の測定に用い
ることはできないという欠点を有していた。

このため、測定者は測定項目と同数の種類の分析素子を
常備し、毎回測定のたびに目的に合致する分析素子を選
びだすという繰作が必要であった。

一般に有効期限のある分析素子を多種層常備し在庫管理
をするための苦労お上Ｖ経済的負担は膨大であり、しか
も測定のたびに測定項目に対応する種類の分析素子を選
び出す作業は処理能力の低下および分析素子の選択の誤
りによる誤画定の危険の増大を招く、シかも分析繰作の
自動化に際しても、測定項目の数だけ分析素子のカー）
リッツを用意し自動的に切り換える磯構等を必要とする
等、甜定機の大型とコストアップの原因となる。

こうした従来の分析素子の欠点はドライケミストリーの
持つ測定の簡便性を半減するものである。

ところが、本発明のように前記結合物と標識体から自由
な態様の分析素子においては、同一の分析素子を用いて
も、分析の際に流体試料と共に滴下する該結合物及び標
識体を分析目的に応じて適当に選択すれば、任意の特定
成分Ｍｉを測定することができる多目的型態様、従って
多目的型分析素子を構成することができる。また、該結
合物及び標識体の量を調節することにより分析素子の感
度、測定レンジを変更することも可能である。このよう
な多目的に使用できる分析素子は本発明の多目的型！！
様によってはじめて可能となるものである。

しかし、本発明はこの多目的型態様にみの限られるもの
ではなく、分析操作をより簡便にする意図で、該結合物
及び標識体を分析素子中に内蔵することも可能である。

この場合の本発明の態様（以下内蔵型態様と称する）は
、同一の分析素子で測定しうる特定成分の種類が制限さ
れるが、測定の際に該結合物及び／又は該標識体を滴下
する手間を省くことができる。このように需要家の使用
目的に応じて多目的型態様及び内点型態様の分析素子を
供することができるのが本発明の特徴のひとつである。

以下、本発明の内蔵型態様の例を示す。

第８図の態様では、光透過性支持体上に、発色試薬／１
１５が設けられておりその上に特定成分と特異的に結合
する物質と、生物活性物質または該生物活性物質と特異
的に結合する物質との結合物含有／！１ｌ１４多孔質反
応屑の順に積層されている。結合物含有層は多孔性媒体
に面積濃度が一定となるように結合物を含有させた層で
あり、流体試料の一定量及び標識体を含有した溶液を滴
下すると一定量の結合物が溶出され、多孔質反応層に試
料と共に拡散するものである。素材としては多孔質反応
層と同様のものを塗布、製膜貼付しても良く、あるいは
吸水性の洋紙、和紙、Ｉｉ紙、プラッシュポリマー、あ
るいはプラス繊維、鉱物性Ｊａｍ（石綿など）、植物性
繊維（木綿、麻、パルプなど）、動物性ａｍ（羊毛、絹
など）、合成繊維（各種ナイロン、ビニロン、ポリエチ
レンテレフタレート、ホリプロピレンなど）、再成繊維
（レーヨン、セルロースエステルなど）などを単独ある
いは混合して製造した織物、不織布、合成紙などで作成
した結合含有層を貼付しても良い。

結合物含有層の位置は、必要に応じて種々選択でき本態
様のように結合物含有層が最上層以外の部分にある場合
、結合物含有層に用いる素材としては前述のものの他に
ゼラチン、ゼラチン誘導体、多糖類（アガロースなど）
、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセル
ロールなどの親水性高分子物質、あるいはビニルピロリ
ドン、アクリル酸誘導体、メタクリル１ｌｉ２誘導体、
ビニルアルコール、スルホニルスチレンなどをモノマー
としたホモポリマーあるいはコごリマーといった連続バ
イングーを塗布して用いる方法がある。

Ｐｔ５９図は、標識体も分析素子中に含有されている例
である。層構成としては、第８図と同様であるが、多孔
質反応層に標識体が含有されている。

この多孔質反応層には、標識体の標識物質と特異的に結
合し、該標識物質に起因する物質の固定化物が含有され
ているため、分析素子の製造や保存中に標識体との結合
反応を生じさせないために、例えばクリニカル　ケミス
トリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｂｅｍｉ−ｓＬｒｙ）ｔ
ｔＳ２７巻１４９巻真４９９頁１年）記載の方法等を用
いることができる。

結合物、標識体を分析素子中に含有させる池の態様とし
ては、多孔質反応層に結合物を、結合物含有層に標識体
を含有させる方法がある。標識体含有層は、結合物含有
層と同様な方法が適応でき、多孔質反応層に結合物を含
有させる場合も標識体の場合と同じ方法が用いられる。

更に池の態様としては、多孔質反応層に、結合物及び標
識体を含有させる場合があげられる。

第１０図及び第１１図は、本発明の好ましい態様の１例
について断面図、斜視図を示したものである。

分析素子の取扱いが容易になるよう、全体がプラスチッ
ク製のマウント１７で覆われており、マウント上部に試
料注入孔、下部に信号測定孔が開いている。

本発明の分析素子は更に、流体試料中を素子に適用した
際にその展開を補助する展開層、流体試料が血液（全血
）の際に必要となることがある血球分ａ層、必要に応じ
て設ける接着層、保ｖ１層、タイミング層といった補助
層を設けることができる。

これらの補助層及び前述の発色試薬層、結合物または標
識物体含有層、タイミング層は独立して設けても良く、
あるいは複数の機能を併わせもった層として設けても良
い、これらの層はその機能に応じて設けられるべき位置
が容易に決定できる。

〔実施例〕

以下本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、
本発明はこれら実施例によって限定されるものではない
。

実施例　１ （１）試薬層の作成 厚さ１８０μｌの透明な下引き済みポリエチレンテレフ
タレートフィルムの上に、下記の組成の発色試薬層を、
塗布・乾燥により作成した。

本Ｎ１ｔｒｏ−ＴＢ：　３．３’　−（３，３’−ノメ
トキシー４．４′　−ビフェニレン）−ビス［２−（ｐ
−二トロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロ
リド１ （２）標ａ物質（グルタミン酸デヒドロデナーゼ標識ヒ
トＩ！ｌＧ）の作成 グルタミン酸デヒドロデナーゼ（Ｐｒｏｔｅｕｓ　！１
１）。

由来）１０ｍｇを、１．２５％グルタルアルデヒドを含
む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，８）０．２ｍｌに加
え、室温にて１０時間ゆるやかに撹拌して反応させた。

これをあらかじめ０．１５Ｍ塩化す）　１７ウム溶液で
平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１，ＯＸ　
５５ｃｍ）に通し、グルタルアルデヒド活性化グルタミ
ン酸デヒドロデナーゼ画分を回収した。この両分１．Ｏ
ｍｌにヒトＩｇＧ（米国カッペル社製）を５Ｂ含む０．
１５Ｍ塩化ナトリウム溶液１．ＯｍＺ及び、１Ｍ炭酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９，５）０．１ｍｌを加え、４℃
にて２４時間反応させた。この溶液に０．２Ｍリノンを
０．１ｍＮ加え、さらに４℃にて２時間反応させた後、
０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含ｔｒｏ、ＯＩＭ　’）　
７ａａ衝ｆｉ（ｐＨ７，６）で平衡化した旧し−ｒａｇ
ｅ　Ｉ＾Ｃ＾−３４カラム（１，５Ｘ　１００Ｃ閣）ｉ
こ通し、グルタミン酸デヒドロデナーゼ標識ヒトＩｇＧ
を得た。

（３）標識物質含有層の作成 １−（２）（実施例１に於る記述第２項を意味する。以
下同型式で示す、）で得た標識物質を１−（１）の試薬
層の上に下記の処分でブタノール塗布・乾燥し、標識物
質含有層を作成した。

（４）生物活性物質のセルロース繊維への固定化粉末濾
紙Ｄ（東洋濾紙社製）１００．を、ブタンジオールノブ
リシジルエーテル（米国アル−リッチ社製）２５０＋１
と、２　ｍｇ／　ｍｌの水素化ホウ素ナトリウムを含む
０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶１２５（ｌｎＺとの混合
液中に懸濁し、４０℃にて５時間半振盪撹件した後、純
水的５２で洗浄し、乾燥させた。

この官能基を持つ粉末１）１紙Ｄ１０ｇを、１００ｍｇ
のアビジン（米国カッペル社製）を含む０．５Ｍ炭酸ナ
トリウム−炭酸水素ナトリウムｖｌ街液（ｐＨ１０，８
）１００ｍｌ！に懸濁し、４０”Ｃにて１２時間振盪撹
拌した。

これを濾過し、ベレットを純水５００ＩＩ１１！、０．
５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１ＭＲ素水素ナトリウム
溶液５００＋ａｆ、　０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．１Ｍ酢酸すトリウム緩衝液（ｐＨ４，１）　５００ｍ
１にて交互に洗浄した後、ＩＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）　３００ｍ／に懸濁し、２５°Ｃ２４時間振
盪撹拌して未反応基をブロックした。これを濾過し、ベ
レットを純水的２１で洗浄し、アビジン固定化粉末濾紙
りを得た。

（５）多孔質反応層の作成 １−（４）で作成したアビジン固定化粉末濾紙Ｄ、ビオ
チン−抗ヒ）　ＩｇＧ抗体（米国カッペル社製）、及び
アフィゲル−５０１（ｐ−クロロマーキュリ−アニリン
固定化、アガロースバイオ−ラッド社製）を、１−（３
）で作成した標識物質含有層の上に、下記の組成の分散
液にて塗布・乾燥させ多孔質反応層を作成した。

Ｌキシレン　　　　　　　　　　　　　１０ｍｔ’これ
を２　Ｘ　２　ａｍの大きさに裁断し、分析素子とした
。

（６）　ヒトＩｇＧの測定 ヒ）ＩｇＧ溶Ｋ　（０−６４０μ５７ｍ１．０．ＯＩＭ
　’）　ン酸ナトリウム緩１！ｉ　′ｅ、（ｐＨ７，６
）１０μＮ：、１−（５）テｆ［した分析素子に滴下し
、３７℃１０分間密閉状態でインキエベートした後、支
持体側から５８ｏｎ−の反射濃度を測定した。その結果
を表１に示す。

表　　１ この結果から明らかな様に、本素子を用いることにより
、煩雑な繰作なしに素子内でのＢ／Ｆ分離を行うことが
でき、ヒ）Ｉ８Ｇ濃度０〜６４０μｇ／１１１の範囲で
良好な検量線を得ることができた。

実施例　２ （１）試薬層の作成 １−（１）と同様の方法で発色試薬層を作成した。

（２）アビノン固定化物及びアフィゲル−５０１含有多
孔貿反応層の作成 １−（４）で作成した７ビジン固定化粉末濾紙り及び、
アフィゲル−５０１を下記の処方で分散し、２−（１）
の試薬層の上に塗布・乾燥した。

（３）　ビオチン−抗ヒ）ＩｇＧ抗体含有多孔質反応層
の作成 ビオチン−抗ヒ）ＩｇＧ抗体を下記の処方で分散し、塗
布・乾燥させた後、２−（２）の多孔質反応層の上に接
着した。

（４）　標識物質（グルタミン酸デヒドロデナーゼ標識
ヒト１．Ｇ）含有層の作成 １−（２）で作成したグルタミン酸デヒドロデナーゼ標
識ヒトＩｇＧを下記の処方で塗布・乾燥させた後、２−
（３）の多孔質反応層の上に接着した。

（５）　　　ヒ　　ト　　Ｉ　ｇＧ　の　汝１　定１−
（６）と同様の方法でヒトｒｇＧの測定を行なった。そ
の結果を表２に示した。

表　　２ 表２に示した様に、本素子を用いること１こより、煩雑
な操作をすることなく素子内でのＢ／Ｆ分離が行なわれ
、ヒトＩ　［ｌＧ　Ａ７！ｌｅＯ−６４０μｇ／　ｍａ
ｙ＞　’ＭＡ囲で良好な検量線を得ることができた。

実施例３ （１）　試薬層の作成 １−（１）と同様の方法で発色試薬層を作成した。

（２）標識阻害剤固定化微結晶セルロースの作成アビセ
ル■ＳＦ（旭化成社製）ｔｏｏ、を、１−（４）と同様
の方法でブタンノオールノグシジルエーテルと反応させ
、官能基を導入した。

酢酸バラアミ／フェニル水銀２．をジメチルスルホキシ
ドＺＯｗｌに溶解し、これに５％ツメチルスルホキシド
水溶液２００ｘ１およ１０．５Ｍ炭酸ナトリウム・炭酸
水素ナトリウム緩衝？ｊ１　（ｐＨｌｏ、ｏ）１２ｚｊ
！および前述の処理をしたアビセル■１０ｇを加え、４
０℃にで２４時間振盪攪拌した。

これを濾過し、１−（４）と同様の方法で洗浄、未反応
基をブロックした。

（３）生成活性物質固定化繊維の作成 １−（４）と同様の方法で７ビノン固定化粉末濾紙を作
成し、これをウシ血清アルブミン及びシタ糖を含むリン
酸緩衝液（ａｌ１７．８）中に懸濁し、凍結乾燥後、固
形物を粉砕して粉末とした。

（４）標識阻害剤固定化層の作成 ３−（２）で作成した標識阻害剤固定化ｖＩｔＮ晶セル
ロースを下記の処方で分散し、３−（１）の試薬層の上
に塗布・乾燥した。

（５）生物活性物質固定化多孔質反応層の作成３−（３
）で作成した生物活性物質固定化ｋｌ＆維を下記の処方
で分散し、３−（４）の標識阻害剤固定化層の上に塗布
・乾燥した。

これを２　Ｘ　２　ｃｗの大きさに裁断し、分析素子と
した。

（６）標識物質（グルタミン酸デヒドロデナーゼ標識ヒ
トＩｔｔ＾の作成 １−（２）に準じた方法で、グルタミン酸デヒドロデー
ナーゼ楳識ヒ）ｈ＾を作成した。

（７）　ヒトＩｇＧ及びヒト■ｙへの測定種々の濃度で
ヒ）　ｈｆ、及びヒ）１ｇ八を含むサンプル溶液（０，
０１１４リン酸ナトリウム級衝液ｐＨ７，６，６％ＢＳ
＾含有）を作成した１次に、 方法Ａ：該サンプル溶液と１−（２）で作成した標識物
、ビオチン−抗ヒトＩｇＧ抗体（米国カッベル社製）、
０．２５８）リス緩衝液（ｐｌ！８．５）を混合、ただ
ちにその１０μｌを３−（５）で作成した分析素子に滴
下した。

方法Ｂ：該サすプル液液と３−（６）で作成した楳ｎ物
、ビオチン−抗ヒ）Ｉｇ八八木体米国カッペル社製）、
０．２５８　）リス緩衝０（ｐＨ１８，５）を混合、た
だちにその１０μｌを３−（５）で作成した分析に滴下
した。

方式Ａ、Ｂいずれの場合も３７°ＣＩＯ分間インキエベ
ートした後、支持体側から５８０＋＋ｚの反射濃度を測
定した。その結果を表３に示す。

表３ 実施例４ （１）試薬層の作成 １−（１）と同様の方法で発色試薬層を作成した。

（２）標識阻害剤固定化Ｍ＆維の作成 ３−（２）と同様の方法で粉末濾紙Ｄ（東洋濾紙社製）
１００．に官能基を導入後、酢酸パラアミノ７エ二ル水
銀と反応させ、標識＠蓄剤固定化ａＭ１を作成した。

（３）　多孔質反応層の作成 ３−（３）で作成した生物活性物質固定化繊維及び４−
（２）で作成した標識阻害固定化Ｎ＆維を、下記の処方
で分散し、４−（１）の試薬層の上に塗布・乾燥した。

これを２　Ｘ　２　ｃｍの大きさに裁断し、分析素子と
した。

（４）　ヒト■ｇＧ及び■９＾の測定 ３−（７）で作成したサンプル溶液を用いて、次のよう
に測定した。

方式Ｃ：該サンプル溶液、０．５ｔ４　）リス緩衝液（
ｐ１１８．５）にビオチン−抗ヒトＩｇＧ抗体を溶解し
た溶液、及び１−（２）で作成した標識物の溶液を各５
μ！順次滴下した。

方式Ｄ：該サンプル溶液、０．５Ｍ　）リス緩衝液（ｐ
Ｈ８，５）にビオチン−抗体ヒトＩｇ＾抗体を溶解した
溶液、及び３−（５）で作成した標準物の溶液を各５μ
！順次滴下した。

方式ＡＳＢいずれの場合も３７℃１０分間インキュベー
１した後、支持体側から５８０ｒ＋Ｉａの反射濃度を測
定した。その結果を表４に示す。

以乍茶ゝｂ 表４

【図面の簡単な説明】

第１図及び第４図乃至第９図及Ｖ第１２図は本発明の分
析素子のＭ構成の態様例を示す断面図である。 第２図は多孔性反応層の拡大図である。 第３図は本発明の分析素子の測定原理の模式説明図であ
る。 第１０図及び第１１図は夫々本発明の分析素子の新面図
及び斜視図である。 １、特定成分 ２、標識物質（または、標識物質と特異的に結合し、標
識物質に起因する信号を変調させる物質） ３、特定成分と標識物質の結合物 ４、特定成分と特異的に結合する物質 ５、生物活性物’ｌまたは、生物活性物質と特異的に結
合する物質） ６、特定成分と特異的に結合する物質と生物活性物質の
結合物 ７、生物活性物質と特異的に結合する物質（または生物
活性物質） ８、標識物質と特異的に結合し、標識物質に起因する信
号を変調させる物ＴＩ（または標識物質） ９、特定成分と結合物６との結合反応生成物１０、結合
物３と結合物６との結合反応生成物Ａ、７の固定化物 ８．８の固定化物 出願人　小西六写真工業株式会社 第１図　　　第２図 １・・・特定成分 ２・・・標識物質 ４・・・特定成分と特異的に結合する物質５・・・生物
活性物質（または生物活性物質と特異結合する物質）Ａ
及びＢ・・固定化物 第４図　　　第５図 第６図　　　第７図 第８図　　　第９図 第１０図　　　　　第１１図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）流体試料中の特定成分と結合しない生物活性物質
   又は該生物活性物質と特異的に結合し得る物質のいずれ
   か一方及び標識物質と特異的に結合して該標識物質に起
   因する信号を変調させる物質が、同一又は別々の担体に
   固定化された形で、それぞれ多孔質反応層の一部または
   全部に含有されている免疫学的分析素子。
2. （２）前記生物活性物質又は該生物活性物質と特異的に
   結合する物質の固定化されていないいずれか一方を結合
   した、前記流体試料中の特定成分もしくはその類縁体と
   特異的に反応する物質を多孔質反応層の一部又は全部に
   含有することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   免疫学的分析素子。
3. （３）前記流体試料中の特定成分を該特定成分と特異的
   に結合しうる物質に対する、該特定成分又はその類縁体
   に前記標識物質が結合して成る標識体との競合反応によ
   って測定するための素子であることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項または第２項記載の免疫学的分析素子。