JPH011961A - 免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、流体試料中の微量成分測定用分析方法に係り
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を分析するた
めの免疫学的測定法に関する。

〔従来の技術〕

生物学的流体試料中に含まれる極微量含有される物質を
検出する方法として、各種分析法の開発がなされてきた
。その分析法は、主として免疫反応をその原理とするも
のである。上記原理を用いる測定法として、種々のもの
が開発されてきたが、最も精度の高いものとして、免疫
測定法が知られている。

免疫測定法は、１９５８年、ベルソン（Ｂ　ｅｒｓｏｎ
）とイア　０　”７　（Ｙ　ａｌｌｏｗ）が、放射性ヨ
ードで標識した、ウシインシュリンと糖尿病患者血清中
の抗インシュリン抗体を用いて、血清中のインシュリン
を測定することに成功して以来、放射免疫測定法が広く
用いられている。

これ以後標識化合物として、放射性同位元素以外のもの
が種々開発されてきた。他の標識化合物としては例えば
、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオ
７アーノ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機
補欠分子族、化学発光性反応体及び蛍光性分子等が挙げ
られるが、最近、放射性物質を使用しなくても、同様の
感度が得られる酵素標識免疫測定法の使用が増加してい
る。

この測定方法には、抗原抗体反応生成物と未反応物の分
離繰作（Ｂ／Ｆ分離）を必要とするヘテロジニアス酵素
免疫測定法とＢ／Ｆ分離を必要としないホモジニアス酵
素免疫測定法がある。

ヘテロジニアス酵素免疫測定法は、Ｂ／Ｆ分離操作を必
要とするため操作が煩雑である欠点があるが測定対象の
範囲が広く、測定感度も高い長所を有している。一方ホ
モジニアス酵素免疫測定法はＢ／Ｆ分離が不要のため操
作が容易であり大量の検体を処理できる長所を有してい
るが測定対象が限定され（ハプテン等の低分子量物質）
、感度も比較的低い欠点を有している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

このように、酵素免疫測定法においては、感度が不十分
であったり、Ｂ／Ｆ分離のような煩雑な繰作が必要であ
ったりして感度、操作性、正確性等に問題があった。

よって本発明の目的は、低分子量物質から高分子量物質
までの幅広い測定対象に適応可能で、高感度で測定でき
、しかも操作が簡便な流体試料中の特定成分の測定方法
を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記目的は、流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａ
またはその類縁体と特異的に結合する物質Ｂを用いて測
定する方法において、 ｉ）該物質Ｂと特異的に結合するが、特定成分Ａとは結
合しない物質Ｃ１ １ｉ）標識物質りと特異的に結合し、かつ結合によって
該標識物質りに起因する信号を変ｙ４させる物質Ｅ を用いることにより達成された。

本発明の測定原理について、第１図を用いて説明する。

この図は、特定成分Ａを競合法によって測定する場合で
あり、かつ予め物質Ｂに、物質Ｃと特異的に結合する物
質Ｆが結合している場合である。

特定成分Ａと標識物質りとの結合物１と、物質Ｂと物質
Ｆとの結合物２は、特定成分Ａと物質Ｂの部位で特異的
に結合し複合体Ｉを形成する。複合体Ｉは更に物ｆＩＣ
と複合体■中の物質Ｆの部位で特異的に結合し、複合体
■を形成する。複合体■は立体的に大きいため、その立
体障害等によって複合体■中の標識物質りと物質Ｅとの
結合反応は起こりにくい。この場合、立体障害による反
応阻止をより効果的にするため物質Ｅも高分子化しであ
る。従って複合体Ｈによって標識物質りと物質Ｅとの結
合反応に起因する標識物質りの信号変調は起こらない。

実際の特定成分Ａの測定にｈいては、特定成分Ａが存在
するため、特定成分Ａと結合物１は、競合的に結合物２
と結合反応を行う。よって、結合物１の一部は、複合体
Ｉを形成できずにフリーの状態で存在する。このフリー
の結合物１は、立体的に大きくないため、容易に物質Ｅ
と結合し、標識物質りの信号を変調する。従って流体試
料中の特定成分の濃度と標識物質り全体の信号強度の間
には、関数関係が成立する。そこで予め特定成分Ａの濃
度がわかっている流体試料（標準試料）を数種類用いて
検量線を作成しておけば、未知の液体試料中の特定成分
Ａの濃度を知ることができる。

前記本発明の態様に於ては、前記したように物質Ｃに特
異的に結合する物質Ｆを、予め物質Ｂに結合させた結合
物２を用いることが好ましく、また標識物質りの信号を
結合することによって変調させる物質Ｅを固定した分析
素子を用いることが好都合である。

次に本発明を具体的に詳細に説明する。

本発明において、流体試料としては、あらゆる形態の溶
液、コロイド溶液が使用しうるが、好ましくは生物由来
の流体試料例えば、血液、血漿、血清、脳を髄液、唾液
、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。

本発明により測定しうる流体試料中での特定成分Ａとは
、その存在又は、その流体試料中での量が測定され、そ
の特定成分に特異的に結合する物質が得られる物質又は
物質群である。すなわち、ポリペプチド、タンパク質、
複合タンパク質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホル
モン類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げら
れる。

具体的には、下記の物質、または物質群を挙げることが
できるが、これらに限定されるものではなり１　。

〈タンパク質、複合タンパク質〉 プレアルブミン、アルブミン、α１−酸性糖タンパク質
、α１−アンチトリプシン、ａ、−糖タンパク質、トラ
ンスコルチン、α１−アンチキモトリプシン、α１−リ
ポタンパク質、チロキシン結合グロブリン、セルロプラ
スミン、Ｚｎ−α２−糖タンバク質、Ｇｃ−グロブリン
、インターα−トリプシンインヒビタ、α１−マクログ
ロブリン、α２−Ｈ５−糖タンパク質、α２−マクログ
ロブリン、ハプトグロビン、α２−Ｉノボタンパク質、
ヘモベキシン、トランスフェリン、β−リポタンパク質
、β２−糖タンパク質、β２−マクログロブリン、Ｃ−
反応性タンパク質、ミオグロビン、エリトロマイシン、
免疫グロブリン（ＩｇＧ＋ＩｇＭ＊ＩｇＡｙＩｇＤ＊Ｉ
ｇＥ）、補体系成分（ＣＩｑａＣ１ｒ　１　Ｃ１ｓ　Ｉ
　Ｃ２ｇ　Ｃ３ｇ　Ｃ４＠　Ｃ５ＨＣ６ｙ　Ｃ７ＨＣ＠
　Ｉ　Ｃｇ等）フィブリノーゲン、ヘモグロビン、グリ
コヘモグロビン、血ａ凝固因子、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗
体、酵素（例えば、酸性ホス７７ターゼ、アルカリ性ホ
スファターゼ、アルカリ性ホス７７ターゼアイソエンザ
イム、α−アミラーゼ、アミラーゼアイソエンザイム、
アルドラーゼ、コリンエステラーゼ、クレアチンホスホ
キナーゼ、クレアチンホスホキナーゼアイソエンザイム
、トランスアミナーゼ（Ｇ。

Ｔ　、Ｇ　Ｐ　Ｔ　）、乳酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵
素アイソエンザイム、γ−ＧＴＰ、リパーゼモノアミン
オキシダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、ブドウ糖
６リン酸脱水素酵素等）等。

〈ホルモン及びホルモン様物ｉ＞ 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体刺激ホルモン（ＬＨ
Ｌ成艮成用ホルモン　Ｈ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡｃＴＨ）、メラニン刺
激ホルモン（Ｍ　Ｓ　Ｈ）、バリプレッシン、オキシト
シン、インシュリン、グルカゴン、７ンギオテンシンＩ
及び■、プロラクチン、セクレチン、ドーパミン、セロ
トニン、ソマトスタチン、サイロキシン（Ｔ、Ｌ　　）
リョードサイロニン（Ｔ、）、〃ストリン、フルチゾー
ル、アルドステロン、カテコラミン、エストロゲン、プ
ロプステロン、テストステロン、胎盤性ゴナドトロピン
、胎盤性ラクトーデン、下垂体ホルモン放出因子（ＴＲ
Ｈ，ＦＳＨ−ＲＨ，ＣＲＨ，ＬＨ−ＲＨ等）等。

くビタミン類〉 ビオチン、チアミン、ビタミンＡ、ビタミンＢ２、ビタ
ミンＢ　Ｓ、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ１ビタミンＤ
１ビタミンＥ、ビタミンに１葉酸等。

＜ＩＩ瘍マーカ〉 α−７ヱトプロテイン、癌胎児性抗原、７エリチン、ポ
リアミン、膵臓癌胎児抗原、塩基性７エトプロテイン、
Ｍ−タンパク、前立腺酸性ホスファターゼ、糖鎖性抗原
（ＣＡ　１９−９、ＣＡ　１２５等）、〃ングリオサイ
ズ。

く各種の薬剤及び代謝産物〉 ペンゾイルエクゴニン、コカイン、コデイン、デキスト
ロメトロ７７ン、ヘロイン、リセルグ酸、モルヒネ、キ
ニジン、キニーネ、デンタマイシン、カナマイシン、ネ
オマイシン、トブラマイシン、アクチノマイセチン、カ
ロイマイシン、クロラムフェニコール、クロロマイセチ
ン、クロルテトラサイクリン、エリトロマイシン、オキ
シテトラサイクリン、ペニシリン、ポリミキシン８１テ
ラマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、
シ７ヱニルヒダントイン、エトスクシミド、７エ／パル
ビタール、プリミドン、セコバルビクール、アセタミノ
７工ン、アミカシン、７ミトリプチリン、カルバマゼピ
ン、ジゴキシン、ノソピラミド、リドカイン、メントレ
キセー）、Ｎ−７セチルプロカイナミド、７ヱニトイン
、プロカイナミド、プロゲラ１０−ル、テオフィリン、
カナビ／−ル、テトラヒドロ力ナビ７−ル、コリン抑制
薬剤、抗ヒスタミン剤、アトロビン、ブチロフェノン、
カフェイン、クロロプロマシン、エピネフリン、グリセ
オフルビン、イミプラミン、Ｌ−ドーパ、メペリジン、
メプロバメート、メタトン、ナルセイン、ノルトリブチ
リン、オキサゼパン、パパベリン、プロスタグランジン
、テグレトール、バルプロン酸等及１これらの代謝産物
。

〈微生物表面マーカ〉 バクテリア抗原、　　菌類抗原 寄生虫抗原、　　　　フィルス抗原 〈農薬〉 ハロゲン化ビフェニル、リン酸エステル類、チオホスフ
ェート類、及びこれらの代謝産物。

〈その他〉 血液型物質、カルノオリビン、アレルデン、本発明に使
用しうる流体試料中の特定成分Ａま゛たはその類像体と
特異的に結合する物質Ｂとしては、測定対象により抗体
、抗原、レクチン、プロティンＡ、特定酵素の阻害物質
などが挙げられるが、該特定成分と該結合物質の結合反
応が抗原−抗体反応である場合が特に好ましい。本発明
で使用する抗体は、その由来を特に限定されるものでは
なく、哺乳動物等に抗原を投与、免疫して得られる抗血
清、腹水液をそのままが、あるいは従来公知の方法であ
る硫酸ナトリウム沈殿法、硫酸アンモニワム沈殿法、セ
ファデックスデルによるデル濾過法、イオン交換セルロ
ールクロマトグラフィー法、電気泳動法等（右田俊介編
「免疫化学」中山書店第７４〜８８頁参照）で精製して
用いることができる。

あるいは抗原で感作した哺乳動物等（例えばマウス）膵
臓細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ）とから雑種細胞（ハ
イプリドーマ）を得てモノクローナル抗体をつくっても
良い。

また、これらの抗体はＩｇＧ、ＩｇＭＳ　ＩｇＡＩｇＤ
、ＩｇＥ各分各企画いることができ、あるいはこれらの
抗体を酵素処理してＦ　ａｂ、　Ｆ　ａｂ’又はＦ（ａ
ｂ’）といった活性抗体フラグメントにして使用しても
よい。更にこれらの抗体は単一で使用しても、複数の抗
体を組み合わせて使用してもかまわない。流体試料中の
特定成分と特異的に結合する物質として抗体又は抗原を
用いた場合、本発明の測定原理は免疫測定法に属しその
反応型式としでは、競合法、２抗体法、サンドインチ法
があげられる。本発明の測定方法は免疫測定法において
特に好ましく使用できるので、以下免疫測定法を例にと
って本発明の詳細な説明するが、本発明はこの説明内容
に限定されるものではなく、種々の応用が可能であるこ
とは以上に述べてきた内容がらも明らかである。

本発明において、物質と特異的に結合するが、特定成分
Ａとは結合しない物質Ｃは、プロティンＡ５物質Ｂに対
する抗体があげられる。また、物質Ｂにあらかじめ結合
させておく物質Ｆと物質Ｃとの組み合わせとしては、 酵　素　二　基質（生成物） 阻害剤 補欠分子族 補酵素 アロステリックエフ７クタ 抗　　体　　：　　抗原 プロティンＡ レクチン：　多糖類 糖タンパク質 核　酸　：　相補性の塩基配列 ヒストン 核酸 ポリメラーゼ ホルモン：　受容体 ビオチン＝　アビジン（ストレプトアビジン）があげら
れ、好ましくは、抗体と抗原、またはビオチン類とアビ
ジン類であり、更にこの中で好ましいのは、ビオチン類
とアビジン類である。

本発明に適用しうる標識物質りとしては、例えば、酵素
、酵素基質、酵素及び酵素前巧体の活性を変化させる物
質（酵素阻害物質、補酵素、補欠分子族、酵素前駆体を
活性化する物質など）、酵素前駆、体、アポ酵素、蛍光
物質などが挙げられ、その代表的な例としては下記に示
した物質を挙げることができる。好ましくは下記に開示
された酵素及び蛍光物質が用いられる。更に好ましくは
、下記に開示された酵素である（これらの標識に起因す
る信号については後述する。） ｒＪ識初物質具体例： １、酵素 ＥＣ１，１，１，１アルコールデヒドロゲナーゼ１．１
．１．６　　　グリセロールデヒドロゲナーゼ １．１，１．８　　　グリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼ（ＮＡＤ”） １．１，１．２７　　　乳酸デヒドロゲナーゼ１．１．
１．３７　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１．１，１．
４０　　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ”） １．１．１．４７　　　グルコースデヒドロゲナーゼ１
．１．１．４８　　　、？ラクトースデヒドロゲナーゼ １．１．１．４９　　　グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼ １．１．２．３　　　乳酸デヒドロゲナーゼ（千トクロ
ーム） １．１．３．１　　　グリコール酸オキシダーゼ１．１
．３．２　　　乳酸オキシダーゼ１．１，３．４　　　
グルコースオキシダーゼ１．１．３．６　　　コレステ
ロールオキシダーゼ１．１．３．９　　　、？ラクトー
スオキシダーゼ１．１．３．１７　　　コリンオキシダ
ーゼ１．１．３．−　　　　Ｌ−α−グリセロリン酸オ
キシダーゼ １．２，１．１　　　ホルムアルデヒトデヒドロデナー
ゼ １．２．１．１２　　　グリセルアルデヒドリン酸デヒ
ドロゲナーゼ １．２．３．２　　　キサンチンオキシダーゼ１．２．
３．３　　　ピルビン酸オキシダーゼ１．２，３．４　
　　オキサル酸オキシダーゼ１．３．３．−　　アシル
ＣｏＡオキシダーゼ１．４．１．１　　　アラニンデヒ
ドロゲナーゼ１．４．１．３　　　グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　（Ｐ　）″） １．４．１．４　　　グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（
Ｎ　　Ａ　Ｄ　　Ｐ　十） １．４，３，２　　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ１．４
．３．３　　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１．４．３．
４　　　アミンオキシダーゼ（７ラビン含有） １．４，３．６　　　アミンオキシダーゼ（銅含有）１
．５，１．３　　　テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ １．５，３．１　　　ザルコシンオキシダーゼ１．６．
４．２　　　グルタチオンレグクターゼ（Ｎ　Ａ　Ｄ　
（Ｐ　）Ｈ） １．６，４．３　　　ノヒドロリボアミドレグクターゼ
（ＮＡＤ”）（ジアホラー ゼ） １．７．Ｌ３　　　尿酸オキシダーゼ １．１１．１．６　　　カタラーゼ １．１１．１．７　　　ベルオキシダーゼ１．１３．１
２．４　　乳酸−２−モノオキシデナーゼ １．１３．１２．５　　　Ｒｅｎ１ｌｌａルシフェリン
−２−モノオキシデナーゼ １．１３，１２．６　　　Ｃｙｐｒｉｄｉｎａルシフェ
リン−２−モノオキシデナーゼ １．１３．１２．７　　　Ｐ　ｈｏｔｉｎｕｓルシフェ
リン−４−モノオキシデナーゼ （Ａ　Ｔ　Ｐ加水分解） １．１４．１３．２　４−ヒドロキシ安息香酸３−モノ
オキシデナーゼ １．１４．９９，２１　　Ｌ　ａｔｉａルシ７エリンモ
ノオキシデナーゼ ２．１，３．１　　　メチルマロニルＣｏＡカルボキシ
トランスフェラーゼ ２．３，２，２　　　γ−グルタミルトランス７エラー
ゼ ２．７．１．１　　　へキソキナーゼ ２．７．１．２　　　グルコキナーゼ ２．７．１．１５　　　リボキナーゼ ２．７，１．２８　　　）リボキナーゼ２．７．１．．
４０　　　ピルビン酸キナーゼ２．７．５．１　　　ホ
スホグルコムターゼ３．１．１．３　　　アリルエステ
ラーゼ３．１．１．４　　　ホスホリパーゼＡ２３．１
．１．７　　　アセチルコリンエステラーゼ３．１．１
．８　　　コリンエステラーゼ３．１．３．１　　　ア
ルカリホスファターゼ３．１．３．２　　　酸ホスファ
ターゼ３．１．３．９　　　グルコース−６−ホスファ
ターゼ ３．１．３．１１　　　フルクト−スジホスファターゼ ３．１，３．２１　　　グリセロール−１−ホスファタ
ーゼ ３．１．４．１　　　ホスホジェステラーゼｒ３．１，
４．３　　　ホスホリパーゼＣ３，２，１，１α−アミ
ラーゼ ３．２．１．２　　　　β−アミラーゼ３．２，１．１
７　　　ライソザイム ３．２．１．１８　　　フイラミニグーゼ３．２．１．
２０　　　α−Ｄ−グルコシグーゼ３．２，１．２１　
　　β−Ｄ−グルフシグーゼ３．２，１．２３　　　β
−Ｄ−、ｆラクトシグーゼ３．２，１．３５　　　ヒア
ルロノグルコサミニグーゼ ３．４．１１．６　　　フルギニンアミ／ベプチグーゼ ３．４．２２．４　　　プロメライン ３．５．１．１　　　アスパラギナーゼ３．５，１．５
　　　ウレアーゼ ３．５，４，２　　　アデニンデアミナーゼ３．５．４
．４　　７デノシンデアミナーゼ３．５．４．６　　　
ＡＭＰデアミナーゼ４．１．１．３　　　オキサロ酢酸
デカルボキシラーゼ ４．１．１．４１　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキ
シラーゼ ４．１．２．１３　　　フルクトースニリン酸アルドラ
ーゼ ４．２，１．２０　　　）リプト７アンシンセグーゼ５
．３．１．９　　　グルコースリン酸イソメラーゼ ６．３．４．１４　　　ビオチンカルボキシラーゼ６．
４，１．１　　　ピルビン酸カルボキシラーゼ６．４，
１．２　　７セチルーＣｏＡカルボキシラーゼ ６．４，１．３　　　プロピオニル−ＣｏＡカルボキシ
ラーゼ（Ａ　Ｔ　Ｐ−加水分 解） ６．４．１．４　　　メチルクロトニル−ＣｏＡカルボ
キシラーゼ ６．４．１．５　　　プラノイル−ＣｏＡカルボキシラ
ーゼ ２．１＆質（発光物資を含む） ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−がラクトシト０−二ト口
フェニル−β−Ｄ−〃ラクトシト４−メチルウンベリフ
ェロン−β−Ｄ−、ｆラクトシトｐ−ニトロフェニルホ
ス７エート コルチゾール−２１−ヘミスクシネート　ウンベリフェ
ロン　フンツユゲート ルミノール インルミノール Ｎ−（４−７ミノプチル）−Ｎ−エチル　イソルミノー
ル　ヘミスクシンアミド Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノー
ル Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチル　インルミノー
ル ルシデニン アクリノニウム　フェニル　カルボキシレート ロフィン ピロガロール 没食子酸 シロキシン ビス（２，４，６−）リクロロフェニル）オキサレート
及びその誘導体 ３．　酵素阻害物質 フィソスチグミン メチオニン　スルホキシミン ワイルドファイア（ｕｎｉ　Ｉｄｆ　１ｒｓ）ブルーデ
キストラン ０−ノアニシジン−セルロース ０−ノアニジノン−デキストラン ２−プロピニルアミン ２−クロロアリルアミン フェニルグリシン ｐ−ニトロフェニルグリシン アミノアセト二トリル ２−７ミノー３−ヒドロキシプロピル −１，３’　−力ルボキシ−３′−７ミノ＝１′−プロ
ペニル−１エーテル Ｌ−２−アミノ−４−メトキシ−トランス−３−ブテン
酸 エタノールアミン−〇−サル７エート フルビジイン アザセリン ノアジオキソノルロイシン ジアゾオキソノア７ルノイリン Δ３−７−アミ７セ７７０スボ１Ｊン酸ミモシン ２−７ミ／−４−ペンチン酸 ２−７ミノー４−クロロ−４−ペンテン酸３．３−ジク
ロロアラニン ３．３．３−トリクロロアラニン ローシクロセリン ２−ヒドロキシル−３−ブチン酸 Ｎ、Ｎ−トリメチル−２−プロピニルアミンβ−アミノ
プロピオニトリｌし ２−ブロモエチルアミン ３−デシノイル−Ｎ−アセチルシステアミン２．３−デ
カノイノイルーＮ−７セチルシステアミン β−クロロ−し−アラニン Ｌ−セリン−〇−サルフェート β−フルオロアラニン Ｌ−ビニルグリシン Ｄ−ビニルグリシン プロパｌレイｌレグリシン がバクリン ５−ニトロ−し−ノルバリン Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチル−２−プロピニルアミン ３−ジメチルアミノ−１−プロピン グリセロール ジイソプロビルホスホロフルオライド フェニルメタンスルホニルフルオライドクラプラン酸 アロプリノール ブチルチン ヨード酢酸 ヨードアセトアミド ベスタチン ピリドキサールリン酸 ヒドラジンとその誘導体 ニトロ７ランとその誘導体 ニトロベンゼンとその誘導体 プリン誘導体 キレート化削 フェニル水銀とその誘導体 ４、　補酵素・補欠分子族 Ｆ　Ａ　Ｄ　（７ラビン、アデニン、ノヌクレオチド） Ｆ　Ｍ　Ｎ　（７ラビン、モノヌクレオチド）ヘム Ｓ−７デノシルメチオニン Ｔ　ＨＦ　（テトラヒドロ葉酸） ＴＰＰ（チアミンニリン酸） ＣｏＡ（補酵素　Ａ） Ｕ　Ｄ　Ｐ　−Ｇ　１ｃ（ウリノンニリン酸グルコース
）ＰＬＰ（ピリドキサールリン酸） ＡＴＰ（アデノシン三リン酸） ビオチン ＣｏＩにコチンアミドアデニンノヌクンオチド） Ｃｏｌ　にコチンアミドアデニンノヌクレオチド　　リ
　　ン　酸　） アゾ／シルコバラミン メチルコバラミン ＣｏＭ（２，２’　−ノチオノエタンスルホン酸）Ｃｏ
Ｑ（ユビキノン） ５、　　アポ酵素 アポグルタチオン還元酵素 アポチトクローム還元酵素 アポＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｔ（デヒドロデナーゼアポグルコ
ース・オキシダーゼ アポリボアミド・デハイドロデナーゼ アボビリドキシン・ホスフェート・オキシダーゼ アボベルオキシグーゼ アポチトクロームＣ アボキサンチンオキシグーゼ アポ酵母乳酸デヒドロデナーゼ アボサルフシンオキングーゼ アポｐ−ヒドロキシ安息６酸ヒドロキシラーゼ アポアシル−ＣｏＡデヒドロデナーゼ アボノヒドロリボ酸デヒドロデナー・ゼアボコハク酸デ
ヒドロデナーゼ アポホモシスティンメチルトランス７エラーゼ アポグルタミン酸ホルミルトランス７エラーゼ アポトランスケトラーゼ アボコリンアセチルトランス７エラーゼアポグリコーゲ
ンシンターゼ アポアラニンアミノトランスフェラーゼアポへキソキナ
ーゼ ６、　酵素前駆体を活性化させる物質 エンテロベプチグーゼ ストレプトキナーゼ プロティンキナーゼ 酵素前駆体の各種プロテアーゼ ７、　酵素前駆体 トリブシ７−デン キモトリブシ７−デン プロテア−ゼ プロホスホリパーゼ プロレニン プロカルボキシペプチダーゼＡ プロカルボキシペプチダーゼＢ キニノーゲン プロエラスターゼ アンギオテンシ／−デン プロインシュリン プロパラチロイドホルモン プログルカゴン プロコラーデン（可溶性） 凝集図？−ＸＩ、ｆｆ、Ｘ■ プロエラスターゼ プロフコーナーゼ ブレカリクレイン ベプシノーデン プラスミ／−デン フイプリ７−デン プロトロンビン プラスミノーデンプロアクチベータ プロアクロジン ８、　蛍光物質 ７ルオレセイン　インチオシアナート （ＦＩＴＣ） テトラメチルローダミン　インチオシアナ−）（ＴＲＩ
ＴＣ） ローダミンＢ　イソチオシアナート （ＲＢＩＴＣ） リサミンローダミン−８２００スルホリル　クロライド
（ＲＢ　２００Ｓ　Ｃ） クンベリ７ヱロン ４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）フルオレセイン
チオフルバミル（Ｆ　Ｔ　Ｃ）フルオレセインチオカル
バミル−ジフェニルグリシン（Ｆ　Ｔ　Ｃ−Ｄ　Ｐ　Ｇ
　）テトラメチルローダミン（Ｔ　Ｍ　Ｒ）５−（（４
，６−シクロロトリアノンー２−イル）−アミノコフル
オレセイン ツメチルアミツナ７タレンー５−スルホニルクロライド
（ＤＮＳ’−ＣＩ＞ フルオラム ２−メトキシ−２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−７ラ
ノン（ＭＤＰＦ） ７−クロロ−４−二トロベンゾ−２−オキサ−１゜３−
ジアゾール（Ｎ　Ｂ　Ｄ　−（１）１−アニリ／−８−
す７タレンスルホン酸（Ａ　Ｎ　Ｓ　） Ｎ−（３−ピレン）−マレイミド（ＮＰＭ）Ｎ−（７−
ノメチルアミノー４−メチル−２−オキシ−３−クロロ
メチル）−マレイミド（ＤＡＣＭ） Ｎ−（ｐ　−２−＜ンスイミダゾイルーフェニル）−マ
レイミド（ＢＩＰＭ） アントラセンイソチオシアナート フルオロアンチルマレイミド（ＦＡＭ）希土類元素を含
む各種キレート及びそれらの誘導体 本発明の測定方法で使用される特定成分Ａ及１その類縁
体と標識物質りとの化合物１、及び特定成分Ａと特異的
に結合する物質Ｂと物質Ｆとの結合物２は、前記物質の
特異的に結合する能力及び標識物質の信号を発する能力
を保持したまま化学的手段等で、直接または間接的に両
物質を結合することによって得られる。これらの結合物
は、当業者間で良く知られている公知の試薬と公知の方
法で結合させることにより得ることができ、更にくわし
く言えば石川栄治、河合　忠、宮井　潔編［酵素免疫測
定法（第２版）］（医学書院、１９７８年刊）や日本臨
床病理学全編「臨床病理」臨時増刊特集第５３号「臨床
検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病
理刊行会、１９８３年刊）などに記載された方法を参考
にすることができる。本発明の理解を助けるため以下に
具体的方法例を挙げるが、これは本発明を限定するもの
ではない。

（１）互に結合させようとする物質を下記のような架橋
剤と反応させる方法。

■　　２．４．６−）　　リ　クロ　ロー１　．３．５
　−）　　リ　７ノン ■　トルエン−２，４−ジイソシアナート■　Ｎ、Ｎ’
−ジシクロへキシルカルボジイミド■　１−（３−ツメ
チルアミノプロピル）−３−エチルカルボッイミド ■　ビスシアシー〇−ジアニンジン ■　グルタルアルデヒドなど （２）互いに結合させようとする物質のうち少なくとも
どちらかが糖鎖を有している時、該糖鎖を過ヨウ素酸で
処理し、生じたアルデヒド基を結合すべき相手物質の７
′ミ／基と反応させる方法。

必要に応じて、過ヨウ素酸処理の際の不要な結合の形成
を阻止するために１−フルオロ−２，４−ノニトロベン
ゼン等で互いに結合させようとする物質の一方を前処理
しておくか過ヨウ素酸処理反応のｐＨを４〜５に制御す
る、あるいは互いに結合させようとする物質の間で形成
されたシッフ塩基による結合を、水素化硼素ナトリウム
やエタノールアミン等で処理し安定化する、といった処
置をとってもよい。

（３）　互いに結合させようとする物質がチオール基を
有しているか、あるいは還元等により千オール基を生ず
るあるいは適当な化合物で処理することによりチオール
基を導入できる場合、マレイミド試薬として知られてい
る種々の架橋剤と該チオール基と反応させる方法。

ここでチオール基を導入する化合物としては次のような
例が挙げられる。

■　無水　Ｓ−７セチルメルカブトスクシン酸■　メチ
ル−３−メルカプトプロビオンイミグート ■　メチル−４−メルカプトプチルイミダート■　２−
イミノチオラン ■　３−（２’　−ピリジルノチオ）プロピオン酸Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル ■　メチル３−（４’　−ジチオピリノル）ブロビオン
イミダートなど また、前述のマレイミド試薬としては次のような例が挙
げられる。

■　ＮＵＮ’　−ｏ−フェニレンジマレイミド■　Ｎ、
Ｎ’−ｐ−フェニレンジマレイミド■　Ｎ、Ｎ’−ｍ−
フェニレンジマレイミド■　Ｎ、Ｎ’−オキシジメチレ
ンジマレイミド■　Ｎ−スクシンイミノルーＮ−マレイ
ミドアセタート ■　Ｎ−スクシンイミノルー４−（Ｎ’−マレイミド）
ブチラード ■　Ｎ−スクシンイミジル−５−（Ｎ−マレイミド）へ
ブタ／アート ■　Ｎ−スクシンイミジル−６−（Ｎ−マレイミド）ヘ
キサノアート ■　Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシラード ［株］　Ｎ−スクシンイミノルーｍ−（Ｎ−マレイミド
）ベンゾアート ク］）Ｎ−スクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マレイミドフ
ェニル）−４−ブチラード ■　Ｎ−スルホスクシンイミノルー４−（Ｎ−マレイミ
ドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラード ■　Ｎ−スルホスクシンイミノルーｍ−（Ｎ−マレイミ
ド）ベンゾアート ■　Ｎ−スルホスクシンイミノルーｐ−（Ｎ−マレイミ
ドフェニル）−４−ブチラード ■　Ｎ−スクシンイミノルー４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）ベンゼン−１−カルボキシラードなど （４）互いに結合させようとする物質にビリツル・ジス
ルフィド基を導入し結合すべき相手化合物に導入した、
あるいはもともと存在するチオール基と反応させる方法
。

チオール基のピリジル・ジスルフィド基への変換は、４
，４′−ノチオジビリノンなどにより行うことができる
。

（５）互いに結合させようとする物質に存在するまたは
導入したアミ７基又はチオール基と、ｐ−ベンゾキ７リ
ンを反応させる方法。

（６）　モノヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルを、互いに結合させようとする物質に存在する
または導入したチオール基に反応させる方法。

本発明に使用する標識物質りと特異的に結合して、該標
識物質に起因する信号を変ｙＡさせる物質Ｅは、使用す
る標識物質に対応して選ばれるべきものであり、下記の
ような物質を例に挙げることができる。

１、標識物質が「酵素」である場合 ・標識物質に起因する信号 該酵素活性による基質の減少、生成物の増加、エネルギ
ーの放射及びそれらに起因する変化、 ・好ましい物質 該酵素に対する阻害剤（前述した阻害物質から該酵素に
対応するものを選んで使用できる。） 該酵素に対する抗体で、酵素に結合してその活性に影響
を与えるもの。

２、標識物質が「酵素基質」である場合・標ａ物質に起
因する１３号 該基質が分析素子中に添加された酵素と反応することに
より生ずる生成物の増加、エネルギーの放射及びそれら
に起因する変化 ・好ましい物質 該基質に対する抗体で、基質に結合することにより該酵
素反応を阻害するもの。

該基質を不可逆的阻害剤として取り込む酵素。

該基質を基質とする酵素で、その反応により本来検出し
ようとしている信号を発しないもの。

３、標識物質が「補酵素」又は「補欠分子族」である場
合 ・標識物質に起因する信号 分析素子中に添加された該標識物質を必要とする酵素の
反応による基質の減少、生成物の増加、及びそれらに起
因する変化・好ましい物質 該標識物質に対する抗体で、該標識物質に結合してその
活性に影響を与えるもの、該標識物質を吸収又は消費す
るが、その活性により本来検出しようとしている信号を
発しないもの。

４、標識物質が「７ボ酵素」である場合・標識物質に起
因する信号 該標識物質はそのままでは信号を発しない。後述の物質
と結合して酵素活性を発現し、その活性による基質の減
少、生成物の増加及びそれらに起因する変化を測定でき
る。

・好ましい物質 該標識物質の酵素活性を発現させる補欠分子族。（前述
した補欠分子族から該標識物質に対応するものを選んで
使用できる。）５、標識物質が［酵素前駆体を活性化さ
せる物質］である場合 ・標識物質に起因する信号 該標識物質が、分析素子中に添加された酵素前駆体を活
性化し、その活性による基質の減少、生成物の増加、及
びそれらに起因する変化 ・好ましい物質 該物質に対する抗体で、該物質に結合してその活性に影
響を与えるもの。

該物質が酵素である場合、その阻害剤。

６、標識物質が「酵素前駆体」である場合・標識物質に
起因する信号 該標識物質はそのままでは信号を発しない。後述の物質
にいったん結合後分子の一部が切断され酵素活性を発現
し、その活性による基質の減少、生成物の増加及びそれ
らに起因する変化を測定できる。

・好ましい物質 該標識物質の酵素活性を発現さ物質 ７、標識物質が「蛍光物質」である場合・標識物質に起
因する信号 該蛍光物質に励起光をあてた際に発する蛍光、 ・好ましい物質 該標識物質に対する抗体及びその誘導体で、該標識物質
の蛍光波長・強度を変化させるもの。

上記の各種物質の具体例はいずれも当業者によく知られ
ており、あらためて開示するまでもないが本発明に理解
を助けるために、代表的な例を以下に示す。

本発明に使用しうる酵素と阻害剤の組み合せとしては、
フェニル水銀誘導体とＳＨ＃素（グルツースオキシダー
ゼ、コリンオキシダーゼ、グリコール酸オキシダーゼ、
グリセロール−３−リン酸ジヒドロデナーゼ、リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、グルタル酸デヒドロデナーゼ、乳酸デ
ヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ、など）、及びβ−〃ラクトシダーゼイソ７タル酸
誘導体とグルタル酸デヒドロデナーゼ、α−アミラーゼ
とアミラーゼインヒビター、エステラーゼとベスタチン
、ビオチン酵素（ピルビン酸カルボキシラーゼ、アセチ
ルＣｏ−Ａカルボキシラーゼ、プロピオニル−ＣｏＡカ
ルボキシラーゼ、メチルマロニル−ＣｏＡカルボキシラ
ーゼなど）とアビジン、ペルオキシダーゼと０−ノアニ
シン−デキストラン、乳酸オキシダーゼと２−ヒドロキ
シル−３−ブチン酸、モノアミンオキシダーゼとＮ　、
Ｎ−）リフチル−２−プロピニルアミン又はβ−アミノ
プロピオニトリルなどが挙げられ、更にジャーナル　オ
プ　ジ　アメリカン　ケミカルソサイティ−（Ｊ、Ａｍ
、Ｃｈｅｖｓ、５ａｃ）１５８０巻、第４５６頁（１９
５８年）二同第８２巻、第５９６頁（１９６０年）＝７
カウンツ　オブケミカルリサーチ（Ａ　ｃｃ、　　Ｃｈ
ｅｍ、　　Ｒｅｓ）第９巻、３１３頁（１９７６年）：
　サイエンス（３（Ｂｉｅｎｃｅ）第１８５巻３２０頁
（１９７４年）：化学工業１９８５ｆｉ′Ｓ２１頁（１
９８５年）などに記載された、若しくは引用された酵素
・阻害剤の組合せも好ましく用いることができる。

本発明における標識物質りと特異的に結合し、かつ結合
によって該１ｇ、識物質りに起因する信号を変調させる
物質Ｅは、本末の状態で用いてもよいが、立体障害等の
効果をより高めるために、物質Ｅを高分子化したり適当
な担体に化学的、物理的に固定化させて用いることが好
ましい。

物質Ｅを高分子化する方法としては、物質Ｅを反応性基
を有する高分子に結合させる方法、あるいは、反応性基
を有する単量体単位に結合させた後高分子化する方法が
あげられる。

上記の反応性基を有する高分子としては、エポキシ基、
アノリジル基、ホルミル基、ヒドロキシメチル基、イン
シアネート基、チオール基、カルバモイル基、ヒドロキ
シル基、活性メチレン基、ハロエチルスルホニル基、ビ
ニルスルホニル基すどの反応性基を有する単量体を含む
ものであればよい。また物質Ｅを化学的物理的に固定化
させる担体としては、デキストランポリマ、アガロース
、セルロース、ゼラチン、アクリルアミド、がラスビー
ズ、ポリスチレンビーズ１、特開昭５５−９０８５９号
の輸送用粒状構造物、特開昭５７−１０１７６０号、同
５７−１０１７６１号、同５８−７０１６３号に記載さ
れている自己結合型粒子結合体、＃！＆維質多質多孔性
材料あげられる。

これらの担体に物質Ｅを固定化する方法としては、種々
の公知の方法により物質Ｅを７フイニテイクロマトグラ
フイ、固定化酵素、免疫学的測定法に用いられる担体の
表面に物理的に吸着させるか、化学反応により直接ある
いは間接的に結合させることにより作成される。その際
、該物質の該特定成分に対する特異的結合性が失われな
いように留意する必要があり、例えば石川栄治、河合忠
、宮井潔Ｈｉ［酵素免疫測定法（第２版）」（医学書院
、１９７８年刊）や千畑一部、土佐哲也、松尾雄志者［
実験と応用アフイニティクロマトグラフイ」（講談社、
１９７６年刊）に記載されている方法を好ましい方法の
例として挙げることができる。また上記の方法以外に、
固定化酵素の製法に用いられる方法、例えば千畑一部編
「固定化酵素」（講談社、１９８１年刊）も挙げられる
。

本発明を溶液系で実施する場合を競合法で概説すると、
特定成分Ａ及び結合物１と物質Ｂを結合反応させた後、
物質Ｃを添加させるか、前者の三成分と同時に添加し、
次いで物質Ｅ（好ましくは、担体に固定化された状態）
を前１己反応液に添加するか又は、物質Ｅを含有する溶
液に反応液の一定量を添加する。次いで複合体■中の標
識物質りに起因する信号を推測することにより特定成分
Ａの量を測定することができる。

本発明に用いられる標識物質りに起因する信号の測定方
法は、標識物質の種類によって異なる。

例えば標識物質が蛍光物質であれば励起光をあて、蛍光
強度を測定すればよい。標識物質が酵素であれば適当な
基質、必要ならば酵素、発色系を含む溶液を添加し、一
定時間インキュベートした後に該発色系に適合した波長
の光（基質の種類によっては蛍光強度、発色強度）を測
定することにより信号強度を測定できる。このような目
的で用いられる基質、発色系は、標識物質として用いる
酵素の種類に従って公知の方法から適当なものを選択で
きる。

本発明の測定方法は、緩和なｐＨで実施される。

一般に特定成分の濃度変化に対する応答、各結合反応、
酵素反応等の検出反応が起こりやすいｐＨに近いｐＨで
行なわれる。ｐＨの１１！！整に用いられる材料として
は、適当に緩衝させた水溶液、固定化物、標識酵素の基
質などである。

水性媒体には、他の極性溶媒（アルコール、エーテルな
ど）を含有していてもよく、これらの１は重量２０％以
下である。水性媒体のｐＨは５〜１０の範囲であり、好
ましくは６〜８．５の範囲である。所望のｐＨを達成し
、測定中にこのｐＨを維持するのに各種の緩衡剤の例に
は、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビター
ル、グツド緩衡剤などがある。測定温度は４〜４５℃で
行うが、通常は、１５〜４５°Ｃである。

本発明の測定方法は、競合法の他にサンドイツチ法、二
抗体法においても適用が可能である。

次に本発明の測定方法を分析素子で用いる場合について
説明する。この場合、少なくとも一層以上の多孔質反応
層を有しかつ物質Ｅを多孔質反応層または、別の府中に
含有させた分析素子である。

本発明に用いる多孔質反応層とは、特定成分Ａと物質Ｂ
との結合反応、物質Ｂまたは物質Ｆと物質Ｃとの結合反
応、標識物質りと物質Ｅとの結合反応を行う層であり、
物質Ｅは反応層の一部または全部に固定化されている必
要がある。

また、反応時間中流体試料を保持するために、反一応層
の一部若しくは全部に、流体試料と自由に接触し得る相
互連絡空隙孔（短径５μＩ１１〜３００μｍが好ましい
）を有する多孔性構造が存在していることが必要である
。

上記の条件を満たしていれば、該多孔質反応層の素材は
特に限定されない。

好ましい例としてはサイズ１０μｍ乃至３５０μｍの粒
状体あるいは４０万至４００メツシユの繊維から１、　
つ以上選ばれた素材により構成される構造体が挙げられ
る。該粒状体の材料としては、ケイソウ土、□二酸化チ
タン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロ
ース、ケイ砂、ガラス、シリカゲル、架橋デキストラン
、架橋ポリアクリルアミド、アブロース、架橋アガロー
ス、各種合成樹脂　（ポリスチレンなと）などの他、次
のような反応性基を持つ化合物から成る自己結合型粒子
が挙げられる。

例示化合物 （１）ポリ（スチレンーコーグワシノル／タクリンー）
　　）　（９０／１０　）　　。

（２）ポリ（スチレンーコーメチルアクリレートーコー
グリシノルメタクリレート） ［８０／１５１５　］。

（３）ポリ（スチレンーフー〇−プチルメタクリレート
ーコーグリシノルメタクリレート） （７５／１５／１０　）。

（４）ポリ（スチレンーコービニルベンジルクロライド
ーコーグリシジルメタクリレート） （８０／１０／１０　）。

（５）ポリ（スチレンーコージビニルベンゼンーコーグ
リシジルアクリレート） （９０／２／８　）。

（６）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコークリシノルメタ
クリレート）　［９０／１０　〕。

（７）ポリ（メタクリレート−コーグリシジルメタクリ
　し　−　ト　）　（８０／２０　）　　。

（８）ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミノエ
チルメタクリレート）　Ｃ９５１５）。

（９）ポリ（スチレンーコー７ノリシルエチルメチクリ
　　し　−　　ト　　）［９５１５）　　。

（１０）ポリ（スチレンーフーメチルアクリレートーコ
ーアクロレイン）　（９０１５１５）。

（ｉｉ）ポリ（スチレンーコーアクリルアミド）（９５
１５）（１２）ポリ（スチレンーコービニルチオール）
（９５１５）（１３）ポリ（スチレンーコーメチロール
化アクリル７ミ　ド　）（９５１５）　　。

（１４）ポリ（スチレンーコーし一ブチルアクリレート
ーグリシジルメタクリレート）　（９０１５１５）（１
５）ポリ（スチレンーコービニルイソシアネート）［９
５１５］。

（１６）　ポリ（メチルアクリレートーコースチレンー
フーＮ−メチロールアクリルアミド） （５０／３５／１５　）。

（１７）ポリ（スチレンーコーグリシジルメタクリレー
トーコーＮ、Ｎ−ノメチルアミノエチルメチク　リ　し
　−　ト　）　（９０１５１５）　　。

（１８）ポリ（スチレンーコーメタクリルＲ−コーアク
リルアミド）　（９５／２／３　）。

（１９）ポリ（スチンンーコーＮ−メチａ−ルアクリル
アミドーコーアクリル酸メトキシエチル）←（９０１５
１５）。

（２０）ポリ（ｐ−ビニルトルエン−ニーＮ−メチロー
ルアクリルアミド−ツーアクリル酸） （９０／８／２　）。

（２１）ポリ（メチルメタクリレ−トーコーグリシジル
メタクリレートーコーｔ−ブチルアク リ　　し　−　　ト　　）　　（８０／１０／１０　　
）　　。

（２２）ポリ（スチレンーコーｐ−ビニルペンジルクロ
ライドーコーアクリル酸−コーアクリル酸ウレイドエチ
ル’）　（７５／１０１５／１０　）。

（２３）ポリ（スチレンーコーメタクロレインーコーα
−ヒドロキシエチルメタクリレート） （９０１５１５）。

（２４）ポリ（スチレンーコー７クロレインーコ−７セ
トアセトキシエチルメチクリレート） （８５１５／１０　）。

（２５）ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ジメチルアミン
エチルアクリレートーコービニルスルホニルエチルメタ
クリレート）　［９０１５１５）。

（２６）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーアミ／スチレ
ン−コービニルスルホニルエチルメタクリレー　ト　）
　　Ｃ８５／１０１５　〕　。

（２７）ポリ（スチレンーツーＮ。Ｎ−ジメチルアミノ
エチルメタクリレート）　Ｃ９０／１０　）。

（２８）ポリ（スチレンーコーアクリル酸）　Ｃ９７／
３　）。

（２９）ポリ（スチレン−ツーアクリルアミド）　Ｃ９
７／３　）。

（３０）ポリ（ｐ−ビニルトルエンーコーｔ　−７’チ
ルアク　リ　し　−　ト　）　　Ｃ９５１５）　　。

（３１）ポリ（メチルアクリレートーコーメタクリルア
ミ　ド　）　（９５１５）　　。

（３２）ポリ（スチレン−ツーＮ−メチロールアクリル
アミ　ド　）　Ｃ９５１５）　　。

（３３）ポリ（ｐ−ビニルベンノルクロライドーコーＮ
−メチロールアクリルアミド）　Ｃ９６／４　］。

（３４）ポリ（スチレンーコーイタフン酸）　Ｃ９８／
２　）。

（３５）ポリ（スチレン−ツーｔ−ブチルアクリレート
）（９２７８）。

（３６）ホｌ）　（メチルアクリレートーコースチレン
ーコーアクロレイン）　（３０／６５１５　）。

（３７）ポリ（メチルメタクリレートーコースチレンー
コー２−ヒドロキシエチルメタクリレート）［：　２５
／７０１５　］。

（３８）ポリ（スチレンーコービニルスルホニルエチル
アクリレート）　Ｃ８０／２０　）。

（３９）ポリ（スチレンーコーＮ、Ｎ−ツメチルアミ／
エチルアクリレート）　（９０／１０　）。

（４０）ポリ（スチレンメチルアクリレートーコーアセ
トアセトキシエチルアクリレート） （９０１５１５）。

（４１）ポリ（スチレンーコーメタクリル酸）［９５１
５）。

各例示化合物の後の括弧内は重合反応に用いた単量体の
重量％を示す。

あるいは、これらの粒子数種を混合して用いることもで
きる。

また、本発明の多孔質反応層に用いる繊維としては、パ
ルプ、粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン
、セルロースエステル、ビスコースレーヨン、嗣アンモ
ニアレーヨン、ポリアミド（６−ナイロン、６ローナイ
ロン、８．１０−ナイロンなど）、ポリエステル（ポリ
エチレンテレフタレートなど）、ポリオレフィン（ポリ
プロピレン、ビニロンなど）、ガラス繊維、石綿など植
物性、動物性、鉱物性２合成、半合成、再生の繊維を用
いることができ、あるいはこれらを混合して用いても良
い。

あるいは別の態様としては吸水性の洋紙、和紙、濾紙、
プラッシュポリマ、あるいはプラスａＭ！、鉱物性４！
＆維（石綿など）、植物性繊維（木綿、麻、パルプなど
）、動物性ｔ＆　４４１：　（羊毛、絹など）、合成繊
維（各種ナイロン、ビニロン、ポリエチレンテレフタレ
ート、ポリプロピレンなど）、再生繊維（レーヨン、セ
ルロースエステルなど）などを単独あるいは混訃して製
造した織物、不織布、合成紙などを該多孔質反応層に用
いることもできる。

このような粒状体、繊維、あるいは粒状体と繊維の混合
物を塗布及び／又は！！！！模することにより、流体試
料と自由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性情
造が存在する多孔質反応層を形成する。自己結合性を有
しない粒子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着す
る形で５８！膜することができ、例えば特開昭４９−５
３８８８号、同５５−９０８５９号、同５７−６７８６
０号各公報の方法を適用することができる。自己結合性
を有する有機ポリマー粒子はｖｆｒＮ昭５７−１０１７
６０号、同５７−１０１７６１号、同５８−７０１６３
号各公報に記載の方法により同様に製膜できる。Ｉａ、
維又は繊維及び粒子の混合物については特開昭５７−１
２５８４７号、同５７−１９７４６６号公報ニ記ａ３れ
な［を分散液を塗布することにより多孔質反応層を形成
できる。また特開昭６０−１７３４７１号明細書で行な
われている方法のようにゼラチンやポリビニルピロリド
ンのような水溶性バインダーを使用した繊維分散液を塗
布することも可能である。このような分散液を製造する
ためには、多くの方法を単独または組合わせて用いるこ
とが可能である。例えば有用な方法の一つとして界面活
性剤を液体キャリヤーへ添加し粒状体および／又は、繊
維の分散液中における分布および安定化を促進すること
ができる。

使用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライト
ン■Ｘ　−１００（ロームアンドハース社製；オクチル
フェノキシポリエトキシエタ／−ル）サーファクタント
ＬＯＧ■（オリーン社製；＝ルフ・７キシポリグリシド
ール）等の非イオン性界面活性剤がある。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、粒状体および／又は繊維の重量に対して１
０重量パーセント乃至０．００５重量パーセント好まし
くは６重量パーセント乃至０．０５重量パーセント用い
ることができる。更に別の方法として該粒子単位と液体
キャリアの音波処理、物理的混合、および物理的撹拌処
理、ｐＨ１！Ｉ整がある。これらは前記の方法と組合わ
せることにより、さらに有用である。

また繊維や粒状体等ね固定化された物質Ｅの標識物質り
と特異的に結合し、標識物質りの信号を変調させる能力
を保持し多孔質反応層または後述の層中に含有させるた
めに、特開昭６１−１７７９９７号に記載されている方
−法を用いることができる。また、必要に応じて免疫反
応における非特異的反応を排除する目的で、測定すべき
特異的反応に関与しないタンパク質を担持することが可
能である。それらの代表的な例としては、哺乳動物の正
常血清タンパク質、アルブミン、ゼラチン及びそれらの
分解物等が挙げられる。

物質Ｅの多孔質反応層への固定化は、種々の公知の方法
により、該物質を該多孔質の反応層の表面に物理的に吸
着させるか、化学反応より直接あるいは間接的に結合さ
せることにより達成される。

その際、該物質の該特定成分に対する特異的結合性が失
われないように留意する必要があり、例えば石川栄治、
河合　志、宮井　潔ＭｉＵ酵素免疫より定法（第２版）
］（医学書院、１９７８年刊）や千畑一部、土佐哲也、
松属雄志Ｍ［実験と応用　アフイニテイクロマトグラフ
イー］（講談社：１９７６年刊）に記載されている方法
を、好ましい方法の例として挙げることができる。また
多孔質反応層へのこれらの物質の固定化は、特異結合部
位が保持されでおり、かつ流体試料中に遊離、溶解した
状態でなければよ（、流体試料中に不溶の状態で分散さ
れていてもよい。またカラー写真で用いられるカプラの
分散に用いられる方法（例えば日本写真学会Ｓ［写真工
学の基礎、銀塩編」（コロナ社１９７８年刊）、脂質二
分子膜中に含有させる方法等も使用できる。

これらの固定化の振作は、前述の粒状体あるいは繊維に
あらかじめ行っておいた後、多孔質反応層を形成した後
に、該固定化操作を行うことも可能である。

前者の場合、前記物質を固定化した粒状体または繊維の
他に前述の特異的反応に関与しないタンパク質みを固定
化した粒状体または繊維を調節のために加えることも可
能である。

次に物質Ｅを非多孔質層に含有させる場合について説明
する。本発明における非多孔質とは、物質Ｅを含有する
バインダー均一層である。また非多孔質層とは、前記、
相互連絡空隙孔（短径５μｍ〜３００μｍ〕を有する多
孔性構造が存在する多孔質反応層と区別するために用い
た用語であり、短径５μｍ以下の空隙孔は有していても
よい。該非多孔質層を形成するバインダーとしては、特
に限定されないが、好ましい例としては、例えば、ゼラ
チン、ゼラチン誘導体、多糖類（アガロースなど）、カ
ルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロー
スなどの親水性高分子物質、あるいはビニルピロリドン
、アクリル酸およびその誘導体、メタクリル酸およびそ
の誘導体、ビニルアルコール、スチレンおよびその誘導
体などをモノマーとしたホモポリマーあるいはコポリマ
ーなどの合成高分子さらにポリマーラテックス分散粒子
などを用いることができる。

本発明による非多孔質層中に、物質Ｅを含有させるには
、前記バインダ塗布液中に、溶解または分散し、塗布す
ることにより含有させることができる。非多孔質層中に
含有された物質Ｅは、洞定時、多孔質反応層に拡散する
と検出すべき信号をも変調してしまうため、多孔質反応
層への拡散を防止するように含有させるべきである。こ
のような方−法としては、例えばカラー写真で用いられ
るカブラの分散に多用されているオイルプロテクト分散
法（前記、日本写真学会編［写真工学の基礎、銀塩編］
など、）または、脂質給二分子膜中に含有させる方法が
使用できる。

また前述したように物質を高分子化したり、または物質
Ｅにカラー写真で用いられているカプラーの拡散防止に
用いられているｉｔ　＃：故性基を導入した後含有させ
る方法が使用できる。

さらに、物質Ｅを物質Ｅに対して媒染剤様の作用を有す
る物質とあわせて含有させることもできる。

上記耐拡散性基としては、耐拡散効果のある有機基であ
れば任意であり、例えば特開昭５０−２３６２７号およ
び特開昭５６−１９０４９号に記載されているカブラの
耐拡散性基などが挙げられる。物質Ｅを含むバイング塗
布液を１８！遺するためには、非多孔質層形成のみなら
ず、該物質の安定化のために、前記界面活性剤を添加す
ることが有用である。

本発明の分析素子に用いられる標識物質りに起因する信
号の測定方法は前述の方法で行うことができる。

標識物質りとして酵素を用いる場合、過酸化水素及びＮ
ＡＤＨ，ＮＡＤＰＨが関与する酵素反応系の酵素、発色
系が好ましく用いられる。過酸化水素が関与する酵素反
応系の酵素は次のようなものがあげられる。

ＥＣ１，１，３，１グリコール酸オキシダーゼ］、、１
．３．２　　　乳酸オキシダーゼ１．１，３．４　　　
グルコースオキシダーゼ１．１，３．６　　　コレステ
ロールオキシダーゼ１．１−．３．９　　　ガラクトー
スオキシダーゼ１．１．３．１７　　コリンオキシダー
ゼ１．１．３．−　　　Ｌ−α−グリセロリン酸オキシ
ダーゼ １．１１．１．１７　　ペルオキシダーゼ１．２．３．
２　　　キサンチンオキシダーゼ１．２．３．３　　　
ピルビン酸オキシダーゼ１．２．３．４　　　シュウ酸
オキシグーゼ１．３．３．−　　アシルＣｏＡオキシダ
ーゼ１．４，３．２　　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ１
．４．３．３　　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ１．４．
３．６　　　アミンオキシダーゼ（銅含有）１．５，３
．１　　　ザルコシンオキシダーゼ１．７．３．３　　
　尿酸オキシダーゼ等 ペルオキシダーゼ以外の酵素は、過酸化水素発生酵素な
ので、発生した過酸化水素を検出可能な形（例えば、比
色、蛍光、発光等で検出）に変換する物質、例えば白金
、銀、鉄等の金属、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ等の
酵素等が挙げられる。

特にペルオキシダーゼを用い、比色で測定することが好
ましく、この場合次のような基質が挙げられ、それらの
物質のうち１種もしくは数種選んで用いられる。

１）　　ｏ−ノアニジノン又はその塩 ２）ｏ−）リジン又はその塩 ３）　グアヤク ４）　アドレナリン ５）　７エ７−ル７タレン ６）　フェロシアン化物 ７）　４−アミノアンチピリン及びその誘導体又はそれ
らの塩と、７エ／−ル又はナフトール又はそれらの誘導
体との組み合わせ ８）　アニリン及びその誘導体 ９）　　ｏ−）ルイノン、ｐ−トルイジン等のモノアミ
ン類 １０）　　ｏ−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチル
−ｐ−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ−ジエチルフェニレ
ンジアミン、ベンジジン、ジアニシジン等のジアミン類 ｉｉ）フェノール、チモール、０−ｌｍ−及びｐ−クレ
ゾール、α−ナフトール、β−す７トール等の７二ノー
ル類 １２）　　カテコール、グアヤコール、オルシノール、
ピロブロール、１）ＩＩ）’−ノヒドロキシノフェニル
、タロログルシノールのようなポリフェノール類１３）
　　サリチル酸、ピロカテキン酸、没食子酸のような芳
香族のような酸 １４）　　ロイコマカライドクリーン、ロイコ７エ／−
ルフタレンのようなロイコ染料 １５）　　２．６−ジクロロ７エ／−ルインド７工／−
ルのような着色染料 １６）　　エピネフリン、７ラボン類、チロシン、ジヒ
ドロキシフェニルアラニン、トリプトファンのような種
々の生化学物質 Ｌ７）　　２．２’　−アジツノ（３−エチル−６−ス
ル＋ボンゾチアゾリン）又はその塩及び３，３′−ノア
ミノベンジジンのような特殊染料 １８）　　２−（４−ヒトしキシ−３−メトキシフェノ
ール）−４，５−ビス（ｐ−ジメトキシアミノフェニル
）イミダゾール １９）ｐ−アニシノンと８−ヒドロキシアニリンの組み
合わせ ２０）３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾンと
Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリンの組み合わせ２１）　　その
池、グアヤコム、グアヤコン酸、ヨウ化カリウム、ヨウ
化ナトリウム及び他の水溶性ヨウ化物、並びにビリルビ
ンのような物質等。

ＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨが関与する酵素反応系の酵素とし
ては、次のようなものがあげられる。

ＥＣ１，１，１，１アルコールデヒドロデナーゼ１．１
．１．６　　　グリセロールデヒドロデナーゼ １．１，１．２７　　乳酸デヒドロゲナーゼ１．１，１
．３７　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ１．１．１．４０
　　リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（オキサロ酢酸−説炭素
） （Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　”） １．１．１．４７　　グルコースデヒドロデナーゼ１．
１．１．４８　　ｗラクトースデヒドロデナーゼ １、１．１．４９　　グルコース−６−リン酸デヒドロ
デナーゼ １．２．１．１　　　ホルムアルデヒドデヒドロデナー
ゼ １．２．１．１２　　グリセルアルデヒド“ノン酸テヒ
ドロデナーゼ １．４．１．１　　　アラニンデヒドロデナーゼ１．４
．１．３　　　グルタミン酸デヒドロデナーゼ（Ｎ　Ａ
　Ｄ　（Ｐ　）＋） １．４．１．４　　　グルタミン酸デヒドロデナーゼ（
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　ａ １．５．１．３　　　テトラヒドロ葉酸デヒドロゲナー
ゼ ＮＡＤＨあるいはＮＡＤＰＨの定量は、ＮＡＤＨあるい
はＮＡＤＰＨを直接３４０ｎｍで比色定量してもよいし
、または、適当な物質を用いてＮＡＤＨあるいはＮＡＤ
ＰＨを発色色原体、蛍光前駆体、発光体等と作用させ、
比色、蛍光、発光等で定量してもよい。ここでの適当な
物質とは′Ｎ　Ａ　Ｄ　ＨあるいはＮＡＤＰＨを酸化し
、発色色原体、蛍光前駆体、発光体等を還元する反応を
触媒する物質をさし、具体的には、５−メチル７エナジ
ニウムメチルサル７エート、（１−メトキシ）−５−メ
チル７エナジニウムメチルサル７エート（以下Ｍｅｎ−
ＰＭＳと略記する）、メルトラブル−（すなわち、９−
ツメチルアミノベンゾ−α−７エナゾキトニウムクロラ
イド）などの化合物や、ジヒドロリボアミドレダクター
ゼ（ＮＡＤ）、ＮＡＤＨデヒドロデナーゼ、ＮＡＤＰＨ
デヒドロデナーゼ（キノン）、ＮＡＤＰＨデヒドロデナ
ーゼ（キノン）などの酵素を用いることができる。

この場合好ましい発色色原体の例として３−（ｐ−ヨー
ドフェニル）−２−（ｐ−二トロフェニル）−５−７二
二ルー２水素テトラシリツムクロライド、３−（４゜５
−ジメチル−２−チオアゾリル）−２，５−ジ７工二ル
ー２水素テトラゾリウムブロマイド、３．３’−（４４
Ｊ−ビフェニレン）−ビス（２，５−ノフェニルー２水
素テトラゾリウムクロライド）（Ｎ　ｅｏ−Ｔ　Ｂ　）
、３゜３’−（３，３’−ジメトキシ−４，４′−ビフ
ェニリレン）−ビス（２−（ｐ−ニトロフェニル）−５
−７二二ルー２水素テトラゾリウムクロライド）　（Ｎ
　１ｔｒｏ−ＴＢ）、３．３’−（３，３’　　−ジメ
ト′キシ−４，４′　−ビフェニリレン）−ビス（２，
５−ジフェニル−２水素テトラゾリウムクロライド）（
ＴＢ）、３．３’−（３，３′−ジメトキシ−４，４′
−ビフエニリレン）−ビス〔２，５−ビス（ｐ−ニトロ
フェニル）−２水素テトラゾリウムクロライド）（ＴＮ
ＴＢ）等が挙げられる。

標識酵素に起因した信号は、吸光度法（比色法）、蛍光
法または、発光法で検出することができ、′測定法とし
ては信号の経時的変化を測定するレート測定法または一
定時間後の信号を測定するエンドポイント測定法で測定
することができる。吸光度法（比色法）では、紫外光、
可視光、近赤外光を利用することができ、例えば流体試
料として血清を用いる場合には、血清による吸光の影響
を小さくするために緑色光、赤色光または、近赤外光を
利用するのが好ましい。

本発明の分析素子の形態は分析を行いうるちのであれば
よく、特に制＠されるものではないが、製造上及び操作
・測定上、フィルム状あるいはシート状であることが好
ましい。

本発明の分析素子の理解を助けるために、−例をあげて
原理を説明する。

第２図は、本発明による分析素子のもっとも単純な態様
の断面図の一例である。この場合は、多孔質反応層１の
みで分析素子が構成されており、物質Ｅが固定化されて
多孔質反応層に含有されている。

本発明の分析素子は前述の多孔質反応層が最低必要植成
要素であるが、発明の効果をより一層発揮するために種
々の補助層を設けることができる。

ｆ：ｔＳ３図〜第８図に本発明に分析素子の実施の態様
を表す断面概略図第９図に斜視図を示す。

第３図に示した本発明の分析素子は光透過性支持体３の
上に多孔質反応層１が積層されており、支持体の存在に
より素子の取扱−・性が向上して−・る。このような目
的で使用し得る支持体は、例えば酢酸セルロース、ポリ
エチレンテレフタレート、ポリカーボネート及びポリビ
ニル化合物（例えばポリスチレン）のような高分子化合
物、ある−・はガラスのような透明黒磯化合物が挙げら
れる。該多孔性反応層はこのような支持体の上で直接塗
布及び／又は製膜するか、あるいはいったん多孔質反応
層を別に形成した後に前述の支持体に貼りつけても良い
。第３図レニホした態様の場合、流体試料は反応層側か
ら滴下する必要があるが、信号の測定は両側から行うこ
とが可能である。

第４図に示した本発明の別の態様では、光反射性支持体
の上に反応層が設けられている。この態様では、試料等
の滴下、信号測定とも多孔性反応ＮｇＡから行い、信号
を反射濃度で測定する際に光反射性支持体がそれを容易
にしている　（信号を蛍光強度で測定する際は黒色の吸
光性支持体を同じように用いることで同様な効果を得る
ことができる。） 二のような目的で使用し得る支持体の材質としては前述
の支持体の材質に加えてセラミックス、金属、あるいは
円相被覆等で防水処理を施した紙等が挙げられ、これら
の材質に必要ならばＴｉＯ２゜ＤａＳＯいマイカなどの
白色顔料等を塗布するか含有させることにより目的を果
たすことができる。

ｔＰＪ５図の態様も同様な目的によるもので、光透過性
支持体０の上に多孔質反応層１、光反射層２が順に積層
されている。この態様では試料等は光反射層側から滴下
され、信号測定は光透過性支持体側から行われる。光反
射層は公知の分析素子及びその類似品に用いられていた
ものをいずれも使用できるが、好ましくは多孔質反応層
に用いられるのと同様な粒子及び繊維に前述の白色顔料
等を含有させたものを塗布又は製膜するか貼りつけるこ
とができる。更に好ましくは内部に白色顔料を含有する
粒子の表面に多孔質反応層に用いる時と同様に物質Ｅを
固定化し、上層の多孔質反応層と同様の８！能を持たせ
た光反射層を設けることができる。このような特殊な光
反射層を用いると、光反射層内に多くの未反応標識物質
が残ることを防止できる。

第６図の態様では、光透過性支持体０上に、発色試薬Ｗ
Ｉ３が設けられており、その上に物質Ｅを含有した層１
、更にその上に物質Ｃを含有した層４が設けられでおり
、最上層には、流体試料を滴下した時に均一に延展し、
流体試料を均一に下層に供給するための展開層５が設け
られている。展開層５に用いられる素材としては、多孔
質反応層と同様のものが用いられ、塗布製膜又は、貼付
により設けられる。

前述までの素子構成では、特に展開層５は設けられてい
ないが、多孔質反応層又は光反射層がこの機能を兼ねて
いる。

物質Ｃ含有層は、多孔質媒体に面積濃度が一定となるよ
うに物質Ｃを含有させた層であり、流体試料の一定量及
び測定に必要な物質を含有した溶液を滴下すると一定量
の物質Ｃが溶出され、多孔質反応層に試料と共に拡散す
るものである。素材としては多孔質反応層と同様のもの
を塗布、製膜貼付しても良く、あるいは吸水性の洋紙、
和紙、！紙、プラッシュポリマ、あるいは〃フスＩ＆維
、鉱物性繊維（石綿など）、植物性ｗＬ維（木綿、麻、
パルプなど）、動物性ａｍ（羊毛、絹など）、合成ａｍ
　＜各種ナイロン、ビニロン、ポリエチレンテレフタレ
ート、ポリプロピレンなど）、可成繊維（レーヨン、セ
ルロースエステル 独あるいは混合して製造した織物、不繊布、合成紙など
で作成した物質Ｃ含有層を貼付しても良い。

物質Ｃ含有層の位置は、必要に応じて種々選択でき本態
様のように物質Ｃ含有層が最上層以外の部分にある場合
、ｖＩＪ貿Ｃ含有層に用いる素材としては前述のものの
他にゼラチン、ゼラチン誘導体、多糖Ｍ（アｌｆａ−ス
など）、カネポキンメチルセルロース、ヒドロキシエチ
ルセルロースなどの親水性高分子物質、あるいはビニル
ピロリドン、アクリル酸誘導体、メタクリル酸誘導体、
ビニルアルコース、スルホニルスチレンなどをモノマと
したホモポリマあるいはコポリマといった連続バインダ
を塗布して用いる方法がある。発色試薬層は、酵素活性
測定に必要な基質、発色試薬を含有させた少なくとも一
層の親水性コロイドから成る。

基質や発色試薬は親水性コロイドから成るバインダ中に
溶解、あるいは分散し塗布液とすることができる．特に
疎水性化合物の分散には写真業界で多用されているオイ
ルプロテクト分散法、直接分散法等種々の公知の分散法
を用いることができる。

更に本発明に係る発色試薬層に用いられる親水性コロイ
ドは、ゼラチン、７タル化ゼラチン等のゼラチン誘導体
、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ
ビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル
酸ナトリウム等の合成高分子、ヒドロキシエチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等のセ
ルロース誘導体の多糖類糖が挙げられる。そして好まし
くはゼラチン、７タル化ゼラチン等のゼラチン誘導体が
挙げられる。

更に本発明に係る発色試薬層のバインダは、その膜物性
、例えば膨潤度や熱による溶解性の改良のだめに一部を
他の水分散性高分子重合体、即ち高分子ラテックスと置
換することができる。好ましい高分子ラテックスの例と
しては、例えば特開昭５７−１１６２５８号、同５８−
９９７５２号記載のものが有用である。これらの高分子
ラテックスは、親水性コロイドバインダの最大７０パー
セントを置換することが可能であるが、好ましくは約５
５パーセント以下の置換である。

該発色試薬層には他の添加剤、例えば緩衝剤、保恒剤、
界面活性剤、媒染剤等を目的に応じて添加することがで
きる。また、その膜厚は約３乃至約５０ミクロン、好ま
しくは約３０乃至５ミクロンである。ｍ衝剤は、特異的
結合反応、酵素反応、発色反応等に適したｐＨするため
に含有される。用いることができる緩衝剤としては日本
化学全編「化学便覧基礎編」（東京、丸善（株）　１９
６６）　ｐｐ１３１２−　１３２０、Ｎ，Ｅ，（Ｇｏｏ
ｄ）等、バイオケミストリ　（Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｓＬｒｙ）、５，４６７　（１９６６）、合
材、斎藤、化学の領域３０（２ン７９　（１９７６）、
ｌ１１．Ｊ７アーギユソン（Ｆｅｒ−ｇｕｓｏｎ）　　
等、　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｂｅｍ．、１０４，３００　
　（１９８０）等の文献に記載されているものをあげる
ことができる．具体的な例としては、ホウ酸塩、リン酸
塩、炭１１ｍ塩、）リスバルビッール、グリシン、グツ
ド緩衝剤等があげられる。これらの緩衝剤は必要に応じ
て発色試薬層以外の層に含有させてもよい。

保恒剤は、基質発色試薬の保存安定化のために含有され
、酸化防止剤などがある。また二種の固定化物や結合物
、および標識体を層中に含有させる場合の活性保持のた
めに、固定化酵素、アフイニテイクロマトグラフイの吸
着体、固定化抗体、及びタンパク質や酵素等の保存に用
いられる保恒剤を含有される。その物質としては、日本
生化学会！ｉ［生化学実験講座１，タンパク質の化学ｌ
」（東京化学同人（株）　１９７６）　ＰＰ６６〜６７
、前述の実験と応用「アフイニテイクロマトグラフイＪ
　ＰＰＩＯ３〜１０４、特開昭８０−１４９９２７合等
に記載されているものがあげられる。

具体的な例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、７ル
プミン、ＢＳＡ，　　シクロデキストリン類、非還元糖
類（シェフロース、トレハロース）、ボリエチレングリ
コール、アミノ酸、各種イオン、７ノ化ソーダ等が挙げ
られる。

これらの保恒剤は固定化された物や結合物及び酵素標識
体の近傍に存在させることが好ましい。

硬膜剤としては、写真業界で多用されている物質を用い
ることができ、Ｔ、ｌｌノエイムス　（Ｔ、Ｉ＋、Ｊａ
ｍｅｓ）　＆　ｒザ・セオリー・オブ・ザ・７オトグラ
フイノクプロセス」（丁ｈｅ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　ＰｏｔｏｇｒａｐｈｉｃＰｒｏｃｅｓｓ）　（ｍ
　４版）　ＰＰ７７−８７に記載されているものをあげ
ることができる。具体的な例としては、アルデヒド類、
活性オレフィン類、活性エステル類等があげられる。

界面活性剤としては、前述のものがあげられる。

その池の府中に含有される試薬としては、溶解助剤、ブ
ロッカ−試薬などがある。これらの添加剤は、必要に応
じて適当量添加する。媒染剤は、酵素活性測定のための
検出物質を、発色試薬層に集中的に集めたり、検出物質
が色素の場合、吸光度係数を高めたり、波長をシフトさ
せる物質であり検出物質と強い相互作用を示めす６カチ
オン性ポリマ、アニオン性ポリマ及びこれらのポリマの
ラテックスが用いられる。

＠７図は、特定成分Ａよたは物質Ｂと標識物質の結合物
、及び物質Ｂまたは物質Ｂと物質Ｆの結合物も分析素子
中に含有されている例である。第６図と層構成としては
同様であるが、最上層の多孔質層中に、特定成分Ａまた
は物質Ｂと探ａ物質の結合物、及び物質Ｂまたは物質Ｂ
と物質Ｆの結合物が含有されている。これらの物質が、
分析素子の！！遺や保存中に結合反応を生じさせないた
めに、例えばクリニカルケミストリ　（Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２７巻１４９９真（１９８
１年）記載の方法等を用いることができる。

第８図及びｖＩ９図は、本発明の好ましい態様の１例に
ついて断面図、斜視図を示したものである。

分析素子の取扱いが容易になるよう、全体がプラスチッ
ク製のマウント１７で覆われており、マウント上部に試
料注入孔、下部に信号測定孔が開いている。

本発明の分析素子は更に、流体試料中を素子に適用した
際に流体試料が血液（全血）の際に必要となることがあ
る血球分離層、必要に応じて設ける接着層、保護層、タ
イミング層といった補助層を設けることができる。

これらの補助層及び前述の発色試薬層、結合物または標
識物体含有層、タイミング層は独立して設けても良く、
あるいは複数の機能を併わせもった層として設けても良
い。これらの層はその機能に応じて設けられるべき位置
が容易に決定できる。

（実施例） 以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明する
が、本発明は、これら実施例によって限定されるもので
はない。

実施例１ （１）標識体（グルタミン酸デヒドロデナーゼ標識ヒト
ＩｇＧ）の作成 ヒトＩｇＧ（米国カッペル社製）　１０ｎＢを０．１Ｍ
リンｌ’！２！１衝液（門１６，５）　　１　ｍｌに溶
解し、これに１２ｍｇ／ｍ　１３Ｑ度のＳ−アセチルメ
ルカプト無水コハク酸のツメチルホルムアミド７ｉＳａ
２０μｐを加えて、室温で３０分反応後、これにＯ，Ｉ
ＭＥＤＴ＾４０μ！、０．１Ｍ）リス−塩酸緩衝液（Ｐ
Ｈ７，０）　２００μ！および１Ｍヒドロキシルアミン
塩酸塩（Ｐ）１７．０）　２００μｌを加えて、３０°
Ｃで５分放置した。次に、０．１Ｍリン酸緩衝液（Ｐ　
Ｈ６゜０．５ｍＭＥＤＴ八含有）でへ衡化したセファデ
ックスＧ−２５カラムでデル濾過を行ない、メルカプト
基を導入したヒトＩｇＧを得た。

また、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．０）で透析し
たグルタミン酸デヒドロデナーゼ　（ＥＣＩ、４．１．
４東洋紡社製）６ＩＩ１ｇに７．５ｍＨ／＋ａ　Ｉ濃度
のＮ−（ε−マレイミドカプロイロキシ）サクシイミド
のツメチルホルムアミド溶液１２μｍを加えて、室温で
３０分反応後、上記のセファデックスＧ−２５カラムで
ゲル濾過を行ない、マレイミド基を導入したグルタミン
酸デヒドロデナーゼを得た。

このようにして合成したメルカプト基を導入したヒトＩ
ｇＧ（３０口ｍｏｌ／＋＋＋ｌ）　　と、マレイミド基
を導入したグルタミン酸デヒドロデナーゼ（３０ｎｍｏ
　ｉ　７ｍりとを混合し、４°Ｃで２４時間反応後、０
．１Ｍメルカプトエチルアミンを加えて３０°Ｃｌ２Ｏ
分放置した。次に、０．０５Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（
Ｐ１１７．８．５働ＨＥＤＴ＾含有）で平衡化したウル
トロデル＾Ｃ＾３４カウムにより分離・精製し、グルタ
ミン酸デヒドロデナーゼ標識したヒ）ＩｇＧを作成した
。

（２）　ビオチン化抗ヒ）　ＩｇＧ抗体の作成りギ抗ヒ
）ＩｇＧ抗体（米国カッペル社製）　１０＋＋＋８を、
０．０１Ｍリン酸緩衝液　（ＰＨ７，４，０，１５８塩
化ナトリウム含有）５ｍ１に溶解し、これに、５０ｍｇ
／ｍｌ濃度のビオチニル−Ｎ−ヒドロキシサクシイミド
エステル（ベーリンが一社製）のジメチルホルムアミド
溶液０．５ｍｌを加えて、室温で３時間反応させた。

析出した白色沈澱物を０．２２μｍのフィルターで濾別
シタ後、０．０ＩＮＩＪン酸緩衝＊　　（Ｐ１１７，４
０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有）で透析して、ビオチン
化抗ヒトＩｇＧ抗体を作成した。

（３）高分子化したアビジンの作成 アビジン　（和光純薬社！Ｉｔ）１５１８を、０．ＩＮ
ＩＪン酸緩衝液（ＰＨ６，８）　５　ｍｌに溶解し、こ
れに１％グルタルアルデヒド水溶液１００μｍを加えて
、３時間反応後、０．０μＭリン酸緩衝液（ＰＩ＋７．
４０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有）で透粧し、０．１Ｍ
１ｊン酸促衝＠　（ＰＨ７゜４）で平衡化したウルトロ
デル＾Ｃ＾３４により分取して高分子化したアビジンを
作成した。

（４）ｐ−７ミノフエニルマーキユリツクアセテー）　
　（１５￥素阻害剤）固定化粉末濾紙りの作成粉末濾紙
Ｄ　（東洋ｍ紙社製）　１００ｇを、エビクロロヒドリ
ン３０ｍ　ｌと０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液４３０
ｍ　ｌとの混合液中に懸濁し、４０°Ｃにて６時間攪拌
して反応後濾取し、純水２！で洗浄、さらにアセトン１
１で洗浄し乾燥させ、エポキシ基を導入した粉末濾紙り
を得た。

この官能基を有する粉末濾紙Ｄ　５０ｇを１０％ジメチ
ルスルホキシド水溶ｗ１５００ｍｌ中に懸濁し、これに
ジメチルスルホキシド１００ｍ　ｌに溶解したｐ−アミ
ノフェニルマーキュリツクアセテート１０ｇと０．５Ｍ
炭酸緩衝液（ＰＨＩＯ）　３２ｍ１を加エテ、室温テ２
０時間攪拌して反応後、これを濾取し、５０％ジメチル
スルホキシド水溶液２１で洗浄、さらに純水２！で洗浄
後、乾燥させて、ｐ−７ミノフ工ニルマーキユリツクア
セテート固定化粉末濾紙りを作成した。

（５）　ヒトＩｇＧの測定 ６４０．３２０，１６０，８０，４０，２０．１０およ
びθμｇｅｔｓ　Ｉ濃度のヒトＩｇＧの０．ＯＩＭＩＪ
ン酸緩衝溶液（ＰＨ７，４）各１００μｍを各試験管に
入れ、これらに実施例１−（１）作成したグルタミン酸
デヒドロゲナーゼ標識ヒトＩｇＧ（５μｇ／＋ｎｌ）を
それぞれ１００μｍ加えて混合し、次に実施例１−（２
）で作成したビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体（５０μＨ／
ｍｌ）を１００μｍ、実施例１−（３）で作成した高分
子化したアビジン　（１００μｇ／ｍｌ）を１００μｍ
順次各試験管に加えて、室温で１０分間インキュベーシ
ョンした。さらに、実施例１−（４）で作成したｐ−７
ミ／フエニルマーキユリツクアセテート固定セルロース
繊ｉ５．ｍｇを各試験管に加え、室温で２分間インキュ
ベーション後、下記の組成の基質溶液Ａ３００μｍと基
質溶液Ｂ２５０μＩを加えて３０°Ｃで１５分間インキ
ュベーションした。

次に、９Ｎ硫酸２５０μｍを各試験管に加えて発色反応
を停止後、４．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分離し、上清
の吸光度（測定波長５００ｍｍ　）を測定した。その結
果を第１表に示す。

蒸Ｊｕ１蔦コ■ グリシン　　　　　　　　３．７ｇ 水酸化ナトリウム　　　　１．１ｇ ウシ血清アルブミン　　　１．０ｇ アジ化ナトリウム　　　　１．０ｍｇ 水を加えて　　　　　　　１００ｍ１ ＰＨ１０，０に１１！ｌ、さらにノアホラーゼ（東洋醸
造社製）　４００［１を加える。

基」【諮」【１− ト　リ　ト　ン　Ｘ　　−１００７，０ｇクエン酸　　
　　　　　　　０．４ｇ リン酸酸水素ナナトリウム０．５ｇ ＮＡＤＰ”　　　　　　　　　　　１．３ｇＮｅｏ　　
ＴＢ　　　　　　　　　　Ｏ，１ｇアジ化ナトリウム　
　　　１，０ｍｇ 水を加えて　　　　　　　１００ｍ１ ＰＨ５，６に調整する。

（ｉ　）　ＮＡＤＰ”：ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドホス７エート、酸化型 （ｉｉ　）Ｎｅｏ−ＴＢ　；３．３　’　−（４，４’
　−ビフェニレン）−ビス　（２，５−ジフェニル−２
Ｈ−テトラゾリウムクロライド） 第　１　表 第１表に示したように、本発明による測定方法によりＢ
／Ｆ分離を必要とせず、簡便な操作でヒ）　［ｇＧを測
定することができた。

実施例２ （１）試薬層の作成 厚さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタ
レートフィルムの上に、下記の組成の発色試薬層を、塗
布・乾燥により作成した。

Ｌ−グルタミン酸モノナトリウム塩　　３．０ｇ／Ｉｌ
＋２’）　７　ホラ−セ２５００Ｖ／１ｏ２ＮＡＤＰ”
　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０ｇ／＋２８
ｇｏ−ＴＢ　　　　　　　　　　　　　　　　１．２ｇ
／ｍ２１．２−ビス（ビニルスルホニル）エタン　０．
２Ｆｉ／Ｌ１１２ト　リ　ト　ン　Ｘ　　　　１００　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．Ｏｇ
／ｍ　２脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　２５．Ｏ
Ｅ＋／＋１２（２）　　多孔質反応層の作成 実施例１−（４）で作成したｐ−アミ／フェニルマーキ
ュリツクアセテート固定粉末濾紙りを、実施例２−（１
）で作成した試薬層の上に、下記の組成の分散液を用い
て塗布・乾燥し、多孔質反応層を作成した。

ｐ−７ミノフエニルマーキユリ・ツクアセテート固定粉
末ｌｔ紙Ｄ　　　　　　　　　　６．０μト　リ　ト　
ン　Ｘ　　−１０００，６ｇポリビニルピロリドン　　
　　　　　　０，６ｇｎ−ブタ／−ル　　　　　　　　
　　２５．Ｏｇこれを、２Ｘ２ｃｍの大きさに裁断し、
分析素子とした。

（３）　　ヒト■ｇＧの測定 ６４０、３２０．１６０．８０．４０．２０．１０お上
１０ｇｇ／ｍ！濃度のヒトＩｇＧの０．０μＭリン酸緩
衝溶液（ｐＨ７，４）各１００μｌを各試験管に入れ、
これらに実施例１−（１）で作成したグルタミン酸デヒ
ドロデナーゼ標識ヒト１８Ｇ　（１０ｇｇ／ｍｌ＞をそ
れぞれ５０μ！加えて混合し、次に実施例１−（２）で
作成したビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体　（１００μｇ／
＋ｅｊりを５０μ１１　およびアビジン（２００μｇ／
＋ａＮ）を５０μりを順次各試験管に加えて、室温で５
分間インキュベーションした後、０．６Ｍグリシン−水
酸化ナトリウム　（ｐＨｉｏ、０）１５０μｌを加えて
混合し、その１０μｌを、実施例２−（２）で作成した
分析素子に滴下し、３７℃で１０分間密閉状態でインキ
エベションした後、支持体側から５４６ｎｍで反射濃度
を測定した。その結果を第２表 上表のように、簡便な操作により、ヒ）　ＩｇＧを測定
することができた。

実施例３ （１）ｐ−アミノフェニルマーキュリツクアセテート固
定化アビセルの作成 アビセル（旭化成社製）５０ｇをエビクロロヒドリン１
５−１と０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２５０１ＩＩ
ｊ！どの混合液中に懸濁し、４０℃にて６時間撹拌した
後、濾取し、純水１１およびアセトン１１で洗浄し、乾
燥させた。この官能基を持つアビセル２５ｇを１０％ツ
メチルスルホキシド水溶液２５０ｍ１中に入れ、さらに
ジメチルスルホキシド５０ｍ１に溶解したｐ−アミノフ
ェニルマーキュリツクアセテート５．０ｇと、０゜５Ｍ
炭酸緩衝液（ｐＨ１０）　１６＋ｆを加えて、室温にて
２０時間撹拌した。これを濾取し、５０％ジメチルスル
ホキシド水溶液１１および純水１１で洗浄し、乾燥させ
、ｐ−７ミ／フエニルマーキユリツクアセテート固定化
アビセルを作成した。

（２）分析素子の作成 実施例２−（１）で作成した試薬層の上に、上記ｐ−７
ミノフエニルマーキユリツクアセテート固定化アビセル
を下記の組成の塗布液を用いて塗布・乾燥した。

ｐ−７ミ／フエニルマーキユリツク アセテート固定化アビセル　　　３．６ｇト　リ　ト　
ン　Ｘ　　−１０００，１２ｇポリビニルピロリドン　
　　　　　０．６ｇｎ−ブタ／−ル　　　　　　　　　
　１２．０゜さらに、ｐ−アミノフェニルマーキエリッ
クアセテート固定化７ビセル層の上に、実施例１−（２
）で作成したビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体お上びアビジ
ンを含有した多孔質反応層を、下記の組成の塗布液を用
いて、塗布・乾燥した。

粉末ｉｔ紙Ｄ　　　　　　　　　　　６．０ｇト　リ　
ト　ン　Ｘ　　−１０００，６ｇポリビニルピロリドン
　　　　　　０．６ｇビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体　　
　２．０ｉｇアビジン　　　　　　　　　　　　４．０
ｍｇウシ血清アルブミン　　　　　　１．０ｇｎ−ブタ
ノール　　　　　　　　　　２５．Ｏｇこれを２Ｘ２ｃ
ｍの大きさに裁断し、分析素子とした。

（３）　　ヒトｒｇｃの測定 ６４０＊　３２０−　１６０−８０−４０，２０，１０
＃　ヨＶ　０１’　ｇ／ｍｌ濃度のヒトＩｇＧの０，０
１Ｍリン酸緩衝溶液（ｐｌ＋７．４）各１００μｌを、
各試験管に入れ、これらに実施例１−（１）で作成した
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ標識ヒトＩｇＧ　（１０
＃’ｇ／ｍｆ）　ヲ、＋ｉぞれ５０μｆ加えて混合し、
さらに０．６Ｍグリシン−水酸化ナトリウム　（ｐＨｌ
Ｏ，Ｏ）　２５０μｐを加え、その１０μｌを、爽施例
３−（２）で作成した分析素子に滴下し、３７℃で１０
分間密閉状態でインキュページタンした後、支持体側か
ら５４６ｎｍで反射濃度を測定した。その結果を第３表
に示す６ ｆＩＳ３表 上表に示したように、ヒ）　ＩｇＧ溶液と標識体とを混
合して、分析素子に滴下するというより簡便な操作によ
り、ヒ）　ＩｇＧの測定をすることができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の測定例の原理説明図である。 また第２図乃至第８図は本発明に係る分析素子例の断面
図、第９図は斜視図である。 ０−ｍ−支持体　　　　　１−ｍ−多孔質反応層２−−
−光反射層　　　　３−−一発色試薬層４−−−物質Ｃ
含有層　　５−−一展開層６−−−要素物質含有多孔質
層。 出願人　小西六写真工業株式会社 第１図 ＯＡ ○　Ｄ ・　　　Ｆ 口　　　　　Ｃ 第２図 二二二５１ 第４図 第６図 第８図 第３図 ［− 第５図 第７図 第９図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）流体試料中の特定成分Ａを、該特定成分Ａまたは
   その類縁体と特異的に結合する物質Ｂを用いて測定する
   方法において、 ｉ）該物質Ｂと特異的に結合するが特定成分Ａとは結合
   しない物質Ｃ ｉｉ）標識物質Ｄと特異的に結合しかつ結合によって該
   標識物質Ｄに起因する信号を変調させる物質Ｅ を用いることを特徴とする流体試料中の特定成分Ａの免
   疫学的測定方法。
2. （２）前記物質Ｃと特異的に結合する物質Ｆを、あらか
   じめ前記物質Ｂに結合させておくことを特徴とする特許
   請求範囲第一項記載の免疫学的測定方法。
3. （３）少なくとも一層以上の多孔質反応層を有し、かつ
   前記物質Ｅを該多孔質反応層または非多孔質層に含有さ
   せた分析素子を用いることを特徴とする特許請求範囲第
   一項または第二項記載の免疫学的測定方法。