JPH0595781A - 新菌株およびそれを用いたテオブロミンの製造方法 - Google Patents
新菌株およびそれを用いたテオブロミンの製造方法Info
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- JPH0595781A JPH0595781A JP3112471A JP11247191A JPH0595781A JP H0595781 A JPH0595781 A JP H0595781A JP 3112471 A JP3112471 A JP 3112471A JP 11247191 A JP11247191 A JP 11247191A JP H0595781 A JPH0595781 A JP H0595781A
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- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 微生物を用いてカフェインからテオブロミン
を効率的に生産する方法を提供する。 【構成】 カフェイン資化能を有するシュードモナス属
細菌を変異改良することにより、カフェインを構成的に
代謝する変異株を得、さらに変異改良することにより生
成したテオブロミンを７−メチルキサンチンへと脱メチ
ル化する能力を欠失した二重変異株を得、これを用いる
ことによって、効率よくカフェインをテオブロミンに変
換し、蓄積する。
を効率的に生産する方法を提供する。 【構成】 カフェイン資化能を有するシュードモナス属
細菌を変異改良することにより、カフェインを構成的に
代謝する変異株を得、さらに変異改良することにより生
成したテオブロミンを７−メチルキサンチンへと脱メチ
ル化する能力を欠失した二重変異株を得、これを用いる
ことによって、効率よくカフェインをテオブロミンに変
換し、蓄積する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、テオブロミンの製造方
法に関し、詳しくはカフェイン資化能を有する微生物を
改良することによりカフェインのテオブロミンへの変換
を効率よく行い、大量に生産する方法に関するものであ
る。
法に関し、詳しくはカフェイン資化能を有する微生物を
改良することによりカフェインのテオブロミンへの変換
を効率よく行い、大量に生産する方法に関するものであ
る。
【０００２】テオブロミン（Ｔｈｅｏｂｒｏｍｉｎｅ、
化学名 ３，７−ジメチルキサンチン）は、カフェイン
（Ｃａｆｆｅｉｎｅ、同 １，３，７−トリメチルキサ
ンチン）の脱メチル化合物であり、利尿剤並びに医薬品
中間体として有用な物質である。
化学名 ３，７−ジメチルキサンチン）は、カフェイン
（Ｃａｆｆｅｉｎｅ、同 １，３，７−トリメチルキサ
ンチン）の脱メチル化合物であり、利尿剤並びに医薬品
中間体として有用な物質である。
【０００３】
【従来の技術】従来、テオブロミンはカカオ豆よりの抽
出あるいは３−メチル尿素からの合成法によって製造さ
れてきた。一方、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、ステムフィリウム・
エスピー（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓｐ．）、アスペ
ルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅ
ｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌
などの微生物がカフェインを代謝分解することは知られ
ている〔Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，２７巻，４８１頁
（１９７１）；日本農芸化学会誌，４５巻，３７８頁
（１９７１）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２３巻，
１０８８頁（１９７５）；Ｈｏｏｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’
ｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，３５８巻，
８０７頁（１９７７）：同誌，３６１巻，１７６３頁
（１９８０）〕。
出あるいは３−メチル尿素からの合成法によって製造さ
れてきた。一方、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、ステムフィリウム・
エスピー（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ ｓｐ．）、アスペ
ルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅ
ｒ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌
などの微生物がカフェインを代謝分解することは知られ
ている〔Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，２７巻，４８１頁
（１９７１）；日本農芸化学会誌，４５巻，３７８頁
（１９７１）；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２３巻，
１０８８頁（１９７５）；Ｈｏｏｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’
ｓ Ｚ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，３５８巻，
８０７頁（１９７７）：同誌，３６１巻，１７６３頁
（１９８０）〕。
【０００４】微生物を用いた実用的なカフェインからテ
オブロミンへの転換方法としては、土壌より分離したシ
ュードモナス属菌をニッケルイオン存在下にカフェイン
と接触作用させてテオブロミンを生成する方法（特開昭
５９−２１０８９６号）がある。
オブロミンへの転換方法としては、土壌より分離したシ
ュードモナス属菌をニッケルイオン存在下にカフェイン
と接触作用させてテオブロミンを生成する方法（特開昭
５９−２１０８９６号）がある。
【０００５】さらにカフェイン資化能を有する微生物の
変異体を用いたカフェインからテオブロミンへの変換も
試みられている〔Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５巻，３３４頁（１９８
７）〕。
変異体を用いたカフェインからテオブロミンへの変換も
試みられている〔Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２５巻，３３４頁（１９８
７）〕。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記先行技術
（特開昭５９−２１０８９６号）においてはテオブロミ
ンへの変換効率が充分ではなくカフェインが残留し、テ
オブロミンの生成量が約１５ｍｇ／ｍｌであることや、
転換効率を挙げるためにニッケルイオンを添加するた
め、テオブロミン生成後に廃液中のニッケルを回収しな
ければならないことなど、工業的規模で行うには多くの
問題点があった。
（特開昭５９−２１０８９６号）においてはテオブロミ
ンへの変換効率が充分ではなくカフェインが残留し、テ
オブロミンの生成量が約１５ｍｇ／ｍｌであることや、
転換効率を挙げるためにニッケルイオンを添加するた
め、テオブロミン生成後に廃液中のニッケルを回収しな
ければならないことなど、工業的規模で行うには多くの
問題点があった。
【０００７】また、変異体を用いたカフェインからテオ
ブロミンへの変換も、テオブロミンの生成量は０．２ｍ
ｇ／ｍｌと僅かでありさらに、ヘテロキサンチンも同時
に生成するなど、工業的にテオブロミンを生成する目的
にはほど遠いものであった。
ブロミンへの変換も、テオブロミンの生成量は０．２ｍ
ｇ／ｍｌと僅かでありさらに、ヘテロキサンチンも同時
に生成するなど、工業的にテオブロミンを生成する目的
にはほど遠いものであった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、前記先行技術（特
開昭５９−２１０８９６号）におけるニッケルイオンの
効果はテオブロミンから７−メチルキサンチンへの変換
を阻害することにあり、その結果テオブロミンが著量蓄
積したと推察された。
な事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、前記先行技術（特
開昭５９−２１０８９６号）におけるニッケルイオンの
効果はテオブロミンから７−メチルキサンチンへの変換
を阻害することにあり、その結果テオブロミンが著量蓄
積したと推察された。
【０００９】そこで新たに自然界から分離したカフェイ
ン資化能を有するシュードモナス属菌のカフェイン代謝
系を調べたところ、カフェインはテオブロミン、７−メ
チルキサンチン、キサンチンの順に脱メチル化されてい
くことが推察された。さらに栄養培地にカフェインを加
えて培養した場合、７−メチルキサンチンを加えると、
より早くカフェインが代謝された。即ち本菌株のカフェ
イン代謝系は、７−メチルキサンチンにより誘導される
ことを見い出した。
ン資化能を有するシュードモナス属菌のカフェイン代謝
系を調べたところ、カフェインはテオブロミン、７−メ
チルキサンチン、キサンチンの順に脱メチル化されてい
くことが推察された。さらに栄養培地にカフェインを加
えて培養した場合、７−メチルキサンチンを加えると、
より早くカフェインが代謝された。即ち本菌株のカフェ
イン代謝系は、７−メチルキサンチンにより誘導される
ことを見い出した。
【００１０】以上の知見をもとに自然界から分離したカ
フェイン資化能を有するシュードモナス属細菌を変異改
良することにより、カフェインを構成的に代謝する変異
株を得、さらに変異改良することにより生成したテオブ
ロミンを７−メチルキサンチンへと脱メチル化する能力
を欠失した二重変異株を得、これを用いることによっ
て、ニッケルイオンを添加することなく、効率よくカフ
ェインをテオブロミンに変換し、蓄積することが可能と
なった。
フェイン資化能を有するシュードモナス属細菌を変異改
良することにより、カフェインを構成的に代謝する変異
株を得、さらに変異改良することにより生成したテオブ
ロミンを７−メチルキサンチンへと脱メチル化する能力
を欠失した二重変異株を得、これを用いることによっ
て、ニッケルイオンを添加することなく、効率よくカフ
ェインをテオブロミンに変換し、蓄積することが可能と
なった。
【００１１】さらに、本菌株を使用してカフェインのテ
オブロミンへの変換にともなうカフェインの減少に対し
て、カフェイン或いはカフェインを含有する培地成分を
連続して加えていくことにより、カフェインからテオブ
ロミンへの変換が連続して安定に行われ、著量のテオブ
ロミンを培養中に生成蓄積させることが可能となった。
オブロミンへの変換にともなうカフェインの減少に対し
て、カフェイン或いはカフェインを含有する培地成分を
連続して加えていくことにより、カフェインからテオブ
ロミンへの変換が連続して安定に行われ、著量のテオブ
ロミンを培養中に生成蓄積させることが可能となった。
【００１２】即ち、本発明はカフェインをテオブロミン
に変換する能力を持つシュードモナス属に属する微生物
を変異誘起し、構成的にカフェインをテオブロミンに変
換する変異体であり、なおかつ、テオブロミンの脱メチ
ルを行う系を遺伝的に失った変異体であることを特徴と
する微生物、及びこの微生物を用いてカフェインを順次
投入することによりテオブロミンを著量生成蓄積するこ
とを特徴とするカフェインのテオブロミンへの変換方法
に関するものである。
に変換する能力を持つシュードモナス属に属する微生物
を変異誘起し、構成的にカフェインをテオブロミンに変
換する変異体であり、なおかつ、テオブロミンの脱メチ
ルを行う系を遺伝的に失った変異体であることを特徴と
する微生物、及びこの微生物を用いてカフェインを順次
投入することによりテオブロミンを著量生成蓄積するこ
とを特徴とするカフェインのテオブロミンへの変換方法
に関するものである。
【００１３】以下、本発明について詳しく説明する。本
発明に使用する微生物の親株としては、微生物でカフェ
インに耐性を持ち、カフェインをテオブロミンに変換す
る能力を有する微生物であり、前記性質を持つ種々の微
生物が使用できる。より好ましくはシュードモナス属に
属する微生物で、本発明にはこれらの親株の変異株が使
用できる。
発明に使用する微生物の親株としては、微生物でカフェ
インに耐性を持ち、カフェインをテオブロミンに変換す
る能力を有する微生物であり、前記性質を持つ種々の微
生物が使用できる。より好ましくはシュードモナス属に
属する微生物で、本発明にはこれらの親株の変異株が使
用できる。
【００１４】具体例としては親株として、土壌より分離
したシュードモナス・プチダＩＦ−３（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＩＦ−３）株を使用した変異
株があげられる。
したシュードモナス・プチダＩＦ−３（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＩＦ−３）株を使用した変異
株があげられる。
【００１５】微生物の変異誘導は既知の方法によって行
うことができる。例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（以下、「ＮＴＧ」という）を変
異誘起剤として使用する化学的手段によって行うことが
できる。
うことができる。例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（以下、「ＮＴＧ」という）を変
異誘起剤として使用する化学的手段によって行うことが
できる。
【００１６】２−アミノプリン、５−ブロムウラシル、
エチルメタンスルホネート、ジメチルサルフェート、ア
クリフラビン、アクリジンオレンジ、ヒドラジン、４−
ニトロキノリン−Ｎ−オキシド、塩化マンガン等も変異
誘起剤として使用できる。さらに紫外線照射、Ｘ線、γ
線等の放射線照射を使用する物理的方法によっても行う
ことができる。
エチルメタンスルホネート、ジメチルサルフェート、ア
クリフラビン、アクリジンオレンジ、ヒドラジン、４−
ニトロキノリン−Ｎ−オキシド、塩化マンガン等も変異
誘起剤として使用できる。さらに紫外線照射、Ｘ線、γ
線等の放射線照射を使用する物理的方法によっても行う
ことができる。
【００１７】変異株の分離方法についても公知の手法が
適用できる。つまり、変異処理した菌株を培養し、形成
されたコロニーについて変異の有無を検討する直接的な
方法、或いはこの方法を改良したレプリカ法、ペニシリ
ン等の抗生物質を使用する濃縮法、特殊な基質を用いる
自殺基質処理法ならびにこれらを適宜に組み合わせた方
法などが適用できる。
適用できる。つまり、変異処理した菌株を培養し、形成
されたコロニーについて変異の有無を検討する直接的な
方法、或いはこの方法を改良したレプリカ法、ペニシリ
ン等の抗生物質を使用する濃縮法、特殊な基質を用いる
自殺基質処理法ならびにこれらを適宜に組み合わせた方
法などが適用できる。
【００１８】本発明においては、以下のようにして行っ
た。即ち、バクトトリプトン１．０％、バクトイースト
エキストラクト０．５％、塩化ナトリウム０．５％、カ
フェイン２．０％を含む寒天培地に生育する、カフェイ
ン耐性株約１００株を土壌より分離し、該菌株をカフェ
イン０．３％、硫酸アンモニウム０．３％、リン酸二カ
リウム０．５％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム０．２％を含む寒天培地（ｐＨ７．０）に接種
し、３０℃で３日間培養し、生育の良好な菌株を得た。
た。即ち、バクトトリプトン１．０％、バクトイースト
エキストラクト０．５％、塩化ナトリウム０．５％、カ
フェイン２．０％を含む寒天培地に生育する、カフェイ
ン耐性株約１００株を土壌より分離し、該菌株をカフェ
イン０．３％、硫酸アンモニウム０．３％、リン酸二カ
リウム０．５％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム０．２％を含む寒天培地（ｐＨ７．０）に接種
し、３０℃で３日間培養し、生育の良好な菌株を得た。
【００１９】本菌株の菌学的性質は次の通りである。 （ａ）形態的性質 （１）グラム染色：陰性 （２）細胞の形及び大きさ：約０．８×２〜３μｍの桿
菌 （３）運動性の有無：有 （４）鞭毛：＞１ （５）胞子の形成：無
菌 （３）運動性の有無：有 （４）鞭毛：＞１ （５）胞子の形成：無
【００２０】（ｂ）生理学的性質 （１）Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ法）：
好気的に酸を生成する （２）溶血性：陽性 （３）酸素に対する態度：好気性 （４）糖類から酸の生成の有無： Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−キシロース ＋ マンニトール − 乳糖 − ショ糖 − Ｄ−マルトース − Ｄ−フラクトース − Ｌ−アラビノース ＋ ラフィノース − イヌリン − サルシン − セファロース − Ｄ−ソルビトール − Ｄ−ガラクトース ＋ グリセロール − （５）カタラーゼ試験：陽性 （６）オキシダーゼ試験：陽性 （７）マッコンキー培地での生育：生育する （８）ＳＳ寒天培地での生育：生育する （９）ＤＢＨの加水分解：なし （１０）ＰＨＢの蓄積：なし （１１）クエン酸の利用：あり （１２）尿素の分解：なし （１３）硝酸塩の還元：あり （１４）硝酸塩のガス生成：なし （１５）耐熱性（６０℃、３０分）：なし （１６）生育温度：５℃ 生育する ２５℃ 生育する ３７℃ 生育する ４２℃ 生育しない （１７）ゼラチンの分解性：なし （１８）リトマスミルクにおける反応：陽性 （１９）デンプンの加水分解：なし （２０）カゼイン加水分解：なし （２１）レクチナーゼ反応：陰性 （２２）リジンの脱炭酸反応：陰性 （２３）アルギニン・ジヒドロラーゼ：陽性 （２４）オルニチンの脱炭酸反応：陰性 （２５）エスクリンの加水分解：なし （２６）ＮａＣｌ耐性：０％ 耐性あり ４％ 耐性あり ６％ 耐性なし ７％ 耐性なし （２７）アシルアミダーゼ：陰性 （２８）グルコン酸の酸化：なし （２９）ＤＮＡａｓｅ：陰性 （３０）色素の生成：キングＡ培地 なし キングＢ培地 あり （３１）ＴＷ−８０の分解性：なし （３２）ＮＡＣ培地での生育：陽性 （３３）寒天加水分解：なし （３４）ショ糖からのレバンの形成：なし （３５）フェニールアラニン脱アミノ反応：陰性 （３６）メチレンブルーミルクでの生育： メチレンブルーの減少 陽性 メチレンブルーの凝固 陰性 メチレンブルーでのペプトン化 陰性 （３７）ＴＳＩから酸：陰性／陰性 （３８）ＴＳＩ培地での硫化水素の生成：なし （３９）馬尿酸ナトリウムの加水分解：あり （４０）ＭＲテスト：陰性 （４１）ＶＰテスト：陰性
好気的に酸を生成する （２）溶血性：陽性 （３）酸素に対する態度：好気性 （４）糖類から酸の生成の有無： Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−キシロース ＋ マンニトール − 乳糖 − ショ糖 − Ｄ−マルトース − Ｄ−フラクトース − Ｌ−アラビノース ＋ ラフィノース − イヌリン − サルシン − セファロース − Ｄ−ソルビトール − Ｄ−ガラクトース ＋ グリセロール − （５）カタラーゼ試験：陽性 （６）オキシダーゼ試験：陽性 （７）マッコンキー培地での生育：生育する （８）ＳＳ寒天培地での生育：生育する （９）ＤＢＨの加水分解：なし （１０）ＰＨＢの蓄積：なし （１１）クエン酸の利用：あり （１２）尿素の分解：なし （１３）硝酸塩の還元：あり （１４）硝酸塩のガス生成：なし （１５）耐熱性（６０℃、３０分）：なし （１６）生育温度：５℃ 生育する ２５℃ 生育する ３７℃ 生育する ４２℃ 生育しない （１７）ゼラチンの分解性：なし （１８）リトマスミルクにおける反応：陽性 （１９）デンプンの加水分解：なし （２０）カゼイン加水分解：なし （２１）レクチナーゼ反応：陰性 （２２）リジンの脱炭酸反応：陰性 （２３）アルギニン・ジヒドロラーゼ：陽性 （２４）オルニチンの脱炭酸反応：陰性 （２５）エスクリンの加水分解：なし （２６）ＮａＣｌ耐性：０％ 耐性あり ４％ 耐性あり ６％ 耐性なし ７％ 耐性なし （２７）アシルアミダーゼ：陰性 （２８）グルコン酸の酸化：なし （２９）ＤＮＡａｓｅ：陰性 （３０）色素の生成：キングＡ培地 なし キングＢ培地 あり （３１）ＴＷ−８０の分解性：なし （３２）ＮＡＣ培地での生育：陽性 （３３）寒天加水分解：なし （３４）ショ糖からのレバンの形成：なし （３５）フェニールアラニン脱アミノ反応：陰性 （３６）メチレンブルーミルクでの生育： メチレンブルーの減少 陽性 メチレンブルーの凝固 陰性 メチレンブルーでのペプトン化 陰性 （３７）ＴＳＩから酸：陰性／陰性 （３８）ＴＳＩ培地での硫化水素の生成：なし （３９）馬尿酸ナトリウムの加水分解：あり （４０）ＭＲテスト：陰性 （４１）ＶＰテスト：陰性
【００２１】上記の菌学的性質は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅ
ｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＭＩＭＢ）、微生物同
定法（衛生技術会）及び微生物の分類と同定（下巻）
（学会出版センター）に基づいて検討した。
ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅ
ｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＭＩＭＢ）、微生物同
定法（衛生技術会）及び微生物の分類と同定（下巻）
（学会出版センター）に基づいて検討した。
【００２２】以上の諸菌学的性質からＧｕｉｄｅ ｔｏ
Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙの記載に基
づいて検討したところ、鞭毛の本数、４２℃での生育、
ゼラチン及びＴＷ−８０の分解性、トレハロース及びマ
ンニットよりの酸の産生などの結果から本菌株はシュー
ドモナス・プチダと同定し、本菌株シュードモナス・プ
チダＩＦ−３と命名した。
Ｐｒｅｓｕｍｐｔｉｖｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙの記載に基
づいて検討したところ、鞭毛の本数、４２℃での生育、
ゼラチン及びＴＷ−８０の分解性、トレハロース及びマ
ンニットよりの酸の産生などの結果から本菌株はシュー
ドモナス・プチダと同定し、本菌株シュードモナス・プ
チダＩＦ−３と命名した。
【００２３】本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第１２１７２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１７
２）として寄託されている。
微工研菌寄第１２１７２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１７
２）として寄託されている。
【００２４】シュードモナス・プチダＩＦ−３株は高濃
度のカフェインに対して耐性を示すと同時に、カフェイ
ンの資化能をも有している。さらにテオブロミン、７−
メチルキサンチンを唯一の炭素源として生育するが、１
−メチルキサンチン、３−メチルキサンチン、テオフィ
リンを唯一の炭素源として生育することはできなかっ
た。このことから、本菌のカフェイン代謝は、カフェイ
ンからテオブロミン、７−メチルキサンチン、キサンチ
ンへという経路を経て行われると推定された。
度のカフェインに対して耐性を示すと同時に、カフェイ
ンの資化能をも有している。さらにテオブロミン、７−
メチルキサンチンを唯一の炭素源として生育するが、１
−メチルキサンチン、３−メチルキサンチン、テオフィ
リンを唯一の炭素源として生育することはできなかっ
た。このことから、本菌のカフェイン代謝は、カフェイ
ンからテオブロミン、７−メチルキサンチン、キサンチ
ンへという経路を経て行われると推定された。
【００２５】さらにＩＦ−３株を変異処理して得たテオ
ブロミンから７−メチルキサンチンへの脱メチル化反応
を行わない菌株を、カフェインを含む培地において培養
してもカフェインの変換は認められないが、同培地に７
−メチルキサンチンを加えて培養を行うとカフェインか
らテオブロミンへの変換が進行し、テオブロミンの蓄積
が認められた。このことからＩＦ−３株のカフェインデ
メチラーゼは、７−メチルキサンチンより誘導される誘
導型酵素であることが判明した。
ブロミンから７−メチルキサンチンへの脱メチル化反応
を行わない菌株を、カフェインを含む培地において培養
してもカフェインの変換は認められないが、同培地に７
−メチルキサンチンを加えて培養を行うとカフェインか
らテオブロミンへの変換が進行し、テオブロミンの蓄積
が認められた。このことからＩＦ−３株のカフェインデ
メチラーゼは、７−メチルキサンチンより誘導される誘
導型酵素であることが判明した。
【００２６】以上の知見をもとに、本発明者らは、シュ
ードモナス・プチダＩＦ−３株を親株として変異処理し
て、カフェインをテオブロミンに構成的に変換するが、
テオブロミンから７−メチルキサンチンへの変換を行わ
ない性質を有している変異株シュードモナス・プチダＩ
Ｆ−３−９Ｃ−２１株（以下、「９Ｃ−２１」という）
を構築・分離した。
ードモナス・プチダＩＦ−３株を親株として変異処理し
て、カフェインをテオブロミンに構成的に変換するが、
テオブロミンから７−メチルキサンチンへの変換を行わ
ない性質を有している変異株シュードモナス・プチダＩ
Ｆ−３−９Ｃ−２１株（以下、「９Ｃ−２１」という）
を構築・分離した。
【００２７】本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第１２１７３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１７
３）として寄託されている。
微工研菌寄第１２１７３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１７
３）として寄託されている。
【００２８】９Ｃ−２１株をカフェイン０．９％、バク
トトリプトン１．０％、バクトイーストエキストラクト
０．５％からなる培地（ｐＨ６．７）にて３０℃、一晩
培養すると培養液中にキサンチン誘導体としてはテオブ
ロミンのみが７．５７ｍｇ／ｍｌ生成していた。
トトリプトン１．０％、バクトイーストエキストラクト
０．５％からなる培地（ｐＨ６．７）にて３０℃、一晩
培養すると培養液中にキサンチン誘導体としてはテオブ
ロミンのみが７．５７ｍｇ／ｍｌ生成していた。
【００２９】このように高変換率でカフェインをテオブ
ロミンに変換することができたが、さらにテオブロミン
の蓄積量を増大させるべく検討した結果、菌体増殖後、
培養液中にカフェインを順次添加し、連続的にカフェイ
ンからテオブロミンの変換反応を行い、著量のテオブロ
ミンを蓄積させることが可能となった。
ロミンに変換することができたが、さらにテオブロミン
の蓄積量を増大させるべく検討した結果、菌体増殖後、
培養液中にカフェインを順次添加し、連続的にカフェイ
ンからテオブロミンの変換反応を行い、著量のテオブロ
ミンを蓄積させることが可能となった。
【００３０】本発明の変異株を培養する栄養培地は、カ
フェインのほかに他の炭素源を加えることができ、さら
に窒素源、無機塩類および変異株が必要とする場合には
他の栄養物質、補助的成分（ｐＨ調製剤、乳化剤、消泡
剤など）等通常の成分を含有した天然培地又は合成培地
のいずれも使用できる。例えば他の炭素源としては、グ
ルコース、キシロース、アラビノースなどの糖類、グリ
セロール、ソルビトールなどの糖アルコール、クエン
酸、フマル酸などの有機酸が用いられる。窒素源として
は、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素源、肉エキ
ス、酵母エキス、トリプトン、カルチベータなどの有機
窒素源が用いられる。また無機塩類としてはリン酸カリ
ウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、リン酸ナトリウム、硫酸第一鉄などが用いられる。
フェインのほかに他の炭素源を加えることができ、さら
に窒素源、無機塩類および変異株が必要とする場合には
他の栄養物質、補助的成分（ｐＨ調製剤、乳化剤、消泡
剤など）等通常の成分を含有した天然培地又は合成培地
のいずれも使用できる。例えば他の炭素源としては、グ
ルコース、キシロース、アラビノースなどの糖類、グリ
セロール、ソルビトールなどの糖アルコール、クエン
酸、フマル酸などの有機酸が用いられる。窒素源として
は、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素源、肉エキ
ス、酵母エキス、トリプトン、カルチベータなどの有機
窒素源が用いられる。また無機塩類としてはリン酸カリ
ウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、リン酸ナトリウム、硫酸第一鉄などが用いられる。
【００３１】培地中のカフェイン濃度は０．１〜２．５
％、好ましくは０．５〜１．０％である。培養条件とし
ては温度１０〜４０℃、ｐＨ約４．５〜９．０、より好
ましくは温度２０〜３０℃、ｐＨ６．５〜７．５におい
て培養し、培養開始後５〜２０時間培養するのが望まし
い。グルコース、キシロースなどの炭素源及び肉エキ
ス、酵母エキス、グルタミン酸ナトリウムなどの窒素源
を含む培地を連続的に加えていくと同時に培地中のカフ
ェイン濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、より
好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌとなるように
適宜カフェインを添加することによりカフェインからテ
オブロミンへの変換反応を継続させる。添加するカフェ
インは固体のままでも、水に溶解して使用してもよい。
％、好ましくは０．５〜１．０％である。培養条件とし
ては温度１０〜４０℃、ｐＨ約４．５〜９．０、より好
ましくは温度２０〜３０℃、ｐＨ６．５〜７．５におい
て培養し、培養開始後５〜２０時間培養するのが望まし
い。グルコース、キシロースなどの炭素源及び肉エキ
ス、酵母エキス、グルタミン酸ナトリウムなどの窒素源
を含む培地を連続的に加えていくと同時に培地中のカフ
ェイン濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、より
好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌとなるように
適宜カフェインを添加することによりカフェインからテ
オブロミンへの変換反応を継続させる。添加するカフェ
インは固体のままでも、水に溶解して使用してもよい。
【００３２】本発明法には上記の培養法によって得られ
た培養物そのもの、もしくは菌体又は培養ろ液、菌体の
破砕物、凍結乾燥菌体、菌体のエタノール、トルエン、
エーテルなどの溶剤による処理物、菌体の固定化処理物
のいずれも使用可能である。上記培養物などとカフェイ
ンを水性媒体中で接触作用せしめることによりカフェイ
ンがテオブロミンに転換される。カフェインは固体のま
ま添加してもよく、また水に溶解して使用してもよい。
反応液中でのカフェインの濃度は、カフェインの溶解度
である２１．７ｍｇ／ｍｌ（常温）を越えて懸濁状態で
存在してもよい。培養物などとカフェインの接触は回分
方式でもよく、またカラムを使用した連続方式も可能で
ある。
た培養物そのもの、もしくは菌体又は培養ろ液、菌体の
破砕物、凍結乾燥菌体、菌体のエタノール、トルエン、
エーテルなどの溶剤による処理物、菌体の固定化処理物
のいずれも使用可能である。上記培養物などとカフェイ
ンを水性媒体中で接触作用せしめることによりカフェイ
ンがテオブロミンに転換される。カフェインは固体のま
ま添加してもよく、また水に溶解して使用してもよい。
反応液中でのカフェインの濃度は、カフェインの溶解度
である２１．７ｍｇ／ｍｌ（常温）を越えて懸濁状態で
存在してもよい。培養物などとカフェインの接触は回分
方式でもよく、またカラムを使用した連続方式も可能で
ある。
【００３３】このような培地成分及びカフェインを上記
条件下において５０〜８０時間通気攪拌を行って、好気
的条件下にて変換反応を続ける。生成したテオブロミン
は培地中に結晶となって析出する。上記方法により生成
したテオブロミンの同定、定量は薄層クロマトグラフィ
ー、液体クロマトグラフィーなどを用いて行った。
条件下において５０〜８０時間通気攪拌を行って、好気
的条件下にて変換反応を続ける。生成したテオブロミン
は培地中に結晶となって析出する。上記方法により生成
したテオブロミンの同定、定量は薄層クロマトグラフィ
ー、液体クロマトグラフィーなどを用いて行った。
【００３４】以下、本発明を実験例、実施例に基づいて
詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。
詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものでは
ない。
【００３５】実験例 特開昭５９−２１０８９６記載の菌株（シュードモナス
ｓｐ．１８８−１） （ＦＥＲＭ Ｐ−７０７３）のニッケルイオンの影響 上記菌株をカフェイン０．３５％、硫酸アンモニウム
０．１％、リン酸一カリウム０．５％、硫酸マグネシウ
ム・７水塩０．０１％、酵母エキス０．３％を含む培地
を用いて２８℃で培養し、カフェイン含量が０となった
後に表１記載の各条件でカフェイン及びニッケルイオン
を添加したときのカフェインの残存量及びテオブロミン
の蓄積量を検討した。尚、カフェインの添加量は１．７
ｇ、ニッケルイオンの添加量は１ｍＭとし、その他の栄
養源としてグルタミン酸ナトリウム０．５ｇ、リン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌを添加し、２５℃で４０時間
振盪反応する。（培養液量４５ｍｌ）
ｓｐ．１８８−１） （ＦＥＲＭ Ｐ−７０７３）のニッケルイオンの影響 上記菌株をカフェイン０．３５％、硫酸アンモニウム
０．１％、リン酸一カリウム０．５％、硫酸マグネシウ
ム・７水塩０．０１％、酵母エキス０．３％を含む培地
を用いて２８℃で培養し、カフェイン含量が０となった
後に表１記載の各条件でカフェイン及びニッケルイオン
を添加したときのカフェインの残存量及びテオブロミン
の蓄積量を検討した。尚、カフェインの添加量は１．７
ｇ、ニッケルイオンの添加量は１ｍＭとし、その他の栄
養源としてグルタミン酸ナトリウム０．５ｇ、リン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌを添加し、２５℃で４０時間
振盪反応する。（培養液量４５ｍｌ）
【００３６】
【表１】
【００３７】表１より明らかなように、ニッケルイオン
を添加したときの方が添加しないときと比べるとテオブ
ロミンの蓄積量が大きい。
を添加したときの方が添加しないときと比べるとテオブ
ロミンの蓄積量が大きい。
【００３８】但し、ニッケルイオンを添加しない時のカ
フェインの残存量がニッケルイオンの添加時よりも小さ
いことより、本菌株はニッケルイオンが存在することに
よってテオブロミンに対する脱メチル化反応が阻害され
た結果として反応液中にテオブロミンが蓄積したものと
考えられる。
フェインの残存量がニッケルイオンの添加時よりも小さ
いことより、本菌株はニッケルイオンが存在することに
よってテオブロミンに対する脱メチル化反応が阻害され
た結果として反応液中にテオブロミンが蓄積したものと
考えられる。
【００３９】
【実施例】 実施例１ シュードモナス・プチダＩＦ−３株（ＦＥＲＭ Ｐ−１
２１７２）をＴＹ培地（ディフコ社製、バクトトリプト
ン１．０％、バクトイーストエキストラクト０．５％）
で対数増殖期まで培養した後、遠心分離により集菌、洗
浄を行った後、５ｍｌの５０ｍＭトリス−マレイト緩衝
液（ｐＨ６．０）に懸濁した。
２１７２）をＴＹ培地（ディフコ社製、バクトトリプト
ン１．０％、バクトイーストエキストラクト０．５％）
で対数増殖期まで培養した後、遠心分離により集菌、洗
浄を行った後、５ｍｌの５０ｍＭトリス−マレイト緩衝
液（ｐＨ６．０）に懸濁した。
【００４０】この菌体懸濁液にＮＴＧを１００μｇ／ｍ
ｌになるように加えた後、３０℃で３０分間放置した。
ＭＴＧ処理後、０．９％塩化ナトリウムで２回洗浄した
後、ＴＹ培地に懸濁し、３０℃で一夜振盪培養を行っ
た。遠心分離により集菌しさらに０．９％塩化ナトリウ
ムにて２回洗浄した後、５ｍｌのカフェイン最少培地
（硫酸アンモニウム０．３％、リン酸二カリウム０．５
％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水
塩０．２％、カフェイン０．１％、ｐＨ７．０）にて３
０℃、６時間培養した後、カフェイン最少寒天培地（硫
酸アンモニウム０．３％、リン酸二カリウム０．５％、
塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水塩
０．２％、カフェイン０．１％、寒天１．５％、ｐＨ
７．０）に希釈してまき、３０℃、２日間培養後、生育
の良好な菌株を選択した。
ｌになるように加えた後、３０℃で３０分間放置した。
ＭＴＧ処理後、０．９％塩化ナトリウムで２回洗浄した
後、ＴＹ培地に懸濁し、３０℃で一夜振盪培養を行っ
た。遠心分離により集菌しさらに０．９％塩化ナトリウ
ムにて２回洗浄した後、５ｍｌのカフェイン最少培地
（硫酸アンモニウム０．３％、リン酸二カリウム０．５
％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水
塩０．２％、カフェイン０．１％、ｐＨ７．０）にて３
０℃、６時間培養した後、カフェイン最少寒天培地（硫
酸アンモニウム０．３％、リン酸二カリウム０．５％、
塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水塩
０．２％、カフェイン０．１％、寒天１．５％、ｐＨ
７．０）に希釈してまき、３０℃、２日間培養後、生育
の良好な菌株を選択した。
【００４１】得られた変異菌株をＬＫＣ培地（バクトト
リプトン１．０％、バクトイーストエキストラクト０．
５％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸二カリウム０．
５％、カフェイン０．１％、ｐＨ７．０）に接種し、３
０℃、８時間培養した後、培地中のカフェイン濃度を測
定し、親株に比較してカフェインの減少が多いと認めら
れた株をカフェイン資化の構成変異株９Ｃ株として分離
した。
リプトン１．０％、バクトイーストエキストラクト０．
５％、塩化ナトリウム０．５％、リン酸二カリウム０．
５％、カフェイン０．１％、ｐＨ７．０）に接種し、３
０℃、８時間培養した後、培地中のカフェイン濃度を測
定し、親株に比較してカフェインの減少が多いと認めら
れた株をカフェイン資化の構成変異株９Ｃ株として分離
した。
【００４２】さらに、９Ｃ株を前記の方法と同様にＮＴ
Ｇ処理を行い、洗浄菌体を得た後、テオブロミン最少培
地（テオブロミン０．３％、無機塩はカフェイン最少培
地と同一）にカルベニシリン（３００μｇ／ｍｌ）を加
えて３０℃で一夜振盪培養後、０．９％ＮａＣｌにて２
回洗浄した後、ＬＴ寒天培地（バクトトリプトン１．０
％、バクトイーストエキストラクト０．５％、テオブロ
ミン０．３％、寒天１．５％、ｐＨ６．８）に希釈して
まき、３０℃で２日間培養してコロニーを形成させ、コ
ロニーの周辺のテオブロミンを分解しない株を２５株得
た。
Ｇ処理を行い、洗浄菌体を得た後、テオブロミン最少培
地（テオブロミン０．３％、無機塩はカフェイン最少培
地と同一）にカルベニシリン（３００μｇ／ｍｌ）を加
えて３０℃で一夜振盪培養後、０．９％ＮａＣｌにて２
回洗浄した後、ＬＴ寒天培地（バクトトリプトン１．０
％、バクトイーストエキストラクト０．５％、テオブロ
ミン０．３％、寒天１．５％、ｐＨ６．８）に希釈して
まき、３０℃で２日間培養してコロニーを形成させ、コ
ロニーの周辺のテオブロミンを分解しない株を２５株得
た。
【００４３】得られた菌株のカフェイン、テオブロミ
ン、７−メチルキサンチンの資化能を調べ、７−メチル
キサンチンのみを資化する９Ｃ−２１株を分離した。９
Ｃ−２１株はカフェイン資化に対して構成的であると同
時にテオブロミンから７−メチルキサンチンへの変換が
行われない二重変異体である。
ン、７−メチルキサンチンの資化能を調べ、７−メチル
キサンチンのみを資化する９Ｃ−２１株を分離した。９
Ｃ−２１株はカフェイン資化に対して構成的であると同
時にテオブロミンから７−メチルキサンチンへの変換が
行われない二重変異体である。
【００４４】実施例２ カフェイン１．０％、バクトトリプトン１．０％、バク
トイーストエキストラクト０．５％、塩化ナトリウム
０．５％、グルコース０．１％、リン酸二カリウム０．
３％からなる組成の培地（ｐＨ６．７）７５ｍｌの入っ
た５００ｍｌ容の坂口フラスコに９Ｃ−２１株（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２１７３）を接種し、３０℃で前培養を一夜
行った後、５ｌ容ミニジャーで３ｌの前記培地に１％接
種した。培養条件は下記に示す。
トイーストエキストラクト０．５％、塩化ナトリウム
０．５％、グルコース０．１％、リン酸二カリウム０．
３％からなる組成の培地（ｐＨ６．７）７５ｍｌの入っ
た５００ｍｌ容の坂口フラスコに９Ｃ−２１株（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１２１７３）を接種し、３０℃で前培養を一夜
行った後、５ｌ容ミニジャーで３ｌの前記培地に１％接
種した。培養条件は下記に示す。
【００４５】培養温度： ３０℃ 通気攪拌： １ ｖ．ｖ．ｍ．６００ｒｐｍ 培養時間： ９時間 反応時間： ３９時間 攪拌翼 ： ６枚ディスクタービン付平型攪拌翼 ２
段 流加培地： グルコース２５％、グルタミン酸ナトリウ
ム２．５％ 流加速度： １２ｍｌ／時間 カフェイン添加： ９時間培養後、培養液中のカフェイ
ン濃度をＨＰＬＣで測定しながら、カフェイン濃度が
０．５ｍｇ／ｍｌ〜２．５ｍｇ／ｍｌを維持するように
適宜添加した。
段 流加培地： グルコース２５％、グルタミン酸ナトリウ
ム２．５％ 流加速度： １２ｍｌ／時間 カフェイン添加： ９時間培養後、培養液中のカフェイ
ン濃度をＨＰＬＣで測定しながら、カフェイン濃度が
０．５ｍｇ／ｍｌ〜２．５ｍｇ／ｍｌを維持するように
適宜添加した。
【００４６】上記培養条件にて培養した結果、１６５ｇ
のカフェインを投入し、１３３ｇのテオブロミンが生成
した。カフェイン及びテオブロミンの培養終了時の濃度
はテオブロミン３９．８ｇ／ｌ、カフェイン０．３ｇ／
ｌとなり、投入したカフェインの９９％以上が消費され
ており、カフェインからテオブロミンへの変換率は８８
％であった。
のカフェインを投入し、１３３ｇのテオブロミンが生成
した。カフェイン及びテオブロミンの培養終了時の濃度
はテオブロミン３９．８ｇ／ｌ、カフェイン０．３ｇ／
ｌとなり、投入したカフェインの９９％以上が消費され
ており、カフェインからテオブロミンへの変換率は８８
％であった。
【００４７】
【発明の効果】本発明により、カフェインをテオブロミ
ンに変換する能力を持つ微生物を変異誘起し、構成的に
カフェインをテオブロミンに変換する異性体であり、な
おかつ、テオブロミンの脱メチル化を行う系を遺伝的に
失った変異体を提供し、さらにこの微生物を使用するこ
とによって、テオブロミンを効率よく生産する方法が提
供される。
ンに変換する能力を持つ微生物を変異誘起し、構成的に
カフェインをテオブロミンに変換する異性体であり、な
おかつ、テオブロミンの脱メチル化を行う系を遺伝的に
失った変異体を提供し、さらにこの微生物を使用するこ
とによって、テオブロミンを効率よく生産する方法が提
供される。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年４月１３日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】この菌体懸濁液にＮＴＧを１００μｇ／ｍ
ｌになるように加えた後、３０℃で３０分間放置した。
ＮＴＧ処理後、０．９％塩化ナトリウムで２回洗浄した
後、ＴＹ倍地に懸濁し、３０℃で一夜振盪培養を行っ
た。遠心分離ににより集菌しさらに０．９％塩化ナトリ
ウムにて２回洗浄した後、５ｍｌのカフェイン最少倍地
（硫酸アンモニウム０．３％、リン酸二カリウム０．５
％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水
塩０．２％、カフェイン０．１％、ｐＨ７．０）にて３
０℃、６時間培養した後、カフェイン最少寒天培地（硫
酸アンモニウム０．３％、リン酸二カリウム０．５％、
塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水塩
０．２％、カフェイン０．１％、寒天１．５％、ｐＨ
７．０）に希釈してまき、３０℃、２日間培養後、生育
の良好な菌株を選択した。 ─────────────────────────────────────────────────────
ｌになるように加えた後、３０℃で３０分間放置した。
ＮＴＧ処理後、０．９％塩化ナトリウムで２回洗浄した
後、ＴＹ倍地に懸濁し、３０℃で一夜振盪培養を行っ
た。遠心分離ににより集菌しさらに０．９％塩化ナトリ
ウムにて２回洗浄した後、５ｍｌのカフェイン最少倍地
（硫酸アンモニウム０．３％、リン酸二カリウム０．５
％、塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水
塩０．２％、カフェイン０．１％、ｐＨ７．０）にて３
０℃、６時間培養した後、カフェイン最少寒天培地（硫
酸アンモニウム０．３％、リン酸二カリウム０．５％、
塩化ナトリウム０．１％、硫酸マグネシウム・７水塩
０．２％、カフェイン０．１％、寒天１．５％、ｐＨ
７．０）に希釈してまき、３０℃、２日間培養後、生育
の良好な菌株を選択した。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年６月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研条寄第３８２４号（ＦＥＲＭＢＰ−３８２４）と
して寄託されている。
微工研条寄第３８２４号（ＦＥＲＭＢＰ−３８２４）と
して寄託されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研条寄第３８２５号（ＦＥＲＭＢＰ−３８２５）と
して寄託されている。
微工研条寄第３８２５号（ＦＥＲＭＢＰ−３８２５）と
して寄託されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】
【実施例】 実施例１ シュードモナス・プチダＩＦ−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３８２４）をＴＹ培地（ディフコ社製、バクトトリプト
ン１．０％、バクトイーストエキストラクト０．５％）
で対数増殖期まで培養した後、遠心分離により集菌、洗
浄を行った後、５ｍｌの５０ｍＭトリス−マレイト緩衝
液（ｐＨ６．０）に懸濁した。
３８２４）をＴＹ培地（ディフコ社製、バクトトリプト
ン１．０％、バクトイーストエキストラクト０．５％）
で対数増殖期まで培養した後、遠心分離により集菌、洗
浄を行った後、５ｍｌの５０ｍＭトリス−マレイト緩衝
液（ｐＨ６．０）に懸濁した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】実施例２ カフェイン１．０％、バクトトリプトン１．０％、バク
トイーストエキストラクト０．５％、塩化ナトリウム
０．５％、グルコース０．１％、リン酸二カリウム０．
３％からなる組成の培地（ｐＨ６．７）７５ｍｌの入っ
た５００ｍｌ容の坂口フラスコに９Ｃ−２１株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３８２５）を接種し、３０℃で前培養を一夜
行った後、５ｌ容ミニジャーで３ｌの前記培地に１％接
種した。培養条件は下記に示す。
トイーストエキストラクト０．５％、塩化ナトリウム
０．５％、グルコース０．１％、リン酸二カリウム０．
３％からなる組成の培地（ｐＨ６．７）７５ｍｌの入っ
た５００ｍｌ容の坂口フラスコに９Ｃ−２１株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３８２５）を接種し、３０℃で前培養を一夜
行った後、５ｌ容ミニジャーで３ｌの前記培地に１％接
種した。培養条件は下記に示す。
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成４年４月１０日
【旧寄託機関の名称】 工業技術院微生物工業技術研
究所
究所
【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１２１７２ ＦＥＲＭ Ｐ−１２１７３
【新寄託機関の名称】 工業技術院微生物工業技術研
究所
究所
【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−３８２４ ＦＥＲＭ ＢＰ−３８２５
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:40）
Claims (4)
- 【請求項１】 カフェインからテオブロミンを生成せし
める能力を持つシュードモナス属に属する微生物で、テ
オブロミンの分解能が実質的に欠失した変異株。 - 【請求項２】 カフェインからテオブロミンを生成せし
める能力を持つシュードモナス属に属する微生物で、ニ
ッケルイオンの影響を受けない変異株。 - 【請求項３】 シュードモナス属に属する微生物で、テ
オブロミンの分解能が実質的に欠失した変異株によりカ
フェインからテオブロミンを生成せしめることを特徴と
するテオブロミンの製造方法。 - 【請求項４】 シュードモナス属に属する微生物で、ニ
ッケルイオンの影響を受けない変異株によりカフェイン
からテオブロミンを生成せしめることを特徴とするテオ
ブロミンの製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3112471A JPH0595781A (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | 新菌株およびそれを用いたテオブロミンの製造方法 |
| EP19920303484 EP0509834A3 (en) | 1991-04-17 | 1992-04-16 | Novel bacterial strain and method for producing theobromine using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3112471A JPH0595781A (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | 新菌株およびそれを用いたテオブロミンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0595781A true JPH0595781A (ja) | 1993-04-20 |
Family
ID=14587472
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3112471A Pending JPH0595781A (ja) | 1991-04-17 | 1991-04-17 | 新菌株およびそれを用いたテオブロミンの製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0509834A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0595781A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022270498A1 (ja) * | 2021-06-22 | 2022-12-29 | サントリーホールディングス株式会社 | カフェイン分解能を有する微生物 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4316882A1 (de) * | 1992-05-20 | 1993-11-25 | Amano Pharma Co Ltd | Ein Koffein-demethylase-Gen enthaltende DNA-Fragment und mikrobielles Verfahren zur Herstellung von 3-Methyl-7-alkylxanthin |
| DE19523560A1 (de) * | 1995-06-28 | 1997-01-02 | Suedzucker Ag | Saccharose-Stoffwechsel-Mutanten |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4228191A (en) * | 1978-10-02 | 1980-10-14 | General Foods Corporation | Microbiological decaffeination of aqueous liquids |
-
1991
- 1991-04-17 JP JP3112471A patent/JPH0595781A/ja active Pending
-
1992
- 1992-04-16 EP EP19920303484 patent/EP0509834A3/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022270498A1 (ja) * | 2021-06-22 | 2022-12-29 | サントリーホールディングス株式会社 | カフェイン分解能を有する微生物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0509834A3 (en) | 1993-06-09 |
| EP0509834A2 (en) | 1992-10-21 |
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