JPH0358273B2

JPH0358273B2 -

Info

Publication number: JPH0358273B2
Application number: JP22678684A
Authority: JP
Inventors: Mamoru Kikuchi; Katsumi Yuasa; Kyoshi Mizusawa
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1984-10-30
Filing date: 1984-10-30
Publication date: 1991-09-04
Also published as: JPS61108393A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、微生物によるピロガロールの製造法
に関するものである。ピロガロールは、皮膚病の外用薬、写真の現像
薬、分析用試薬等として、あるいは工業薬品の中
間体として極めて有用な化合物である。従来、微生物によるピロガロールの製造法とし
ては、例えば、シトロバクター（Citrobacter）
属の細菌（特開昭57−138393号公報）、ペニシリ
ウム（Penicillium）属のカビ〔バイオヒミカ・
エト・バイオフイジカ・アクタ（Biochimicaet
Biophysica Acta）、第28巻、21頁（1958年）及
び科学、第26巻、42頁（1959年）〕若しくはクレ
ブシエラ属（Klebsiella）の細菌〔アントニーバ
ン・リーブウエンホーク（Antonievan
Leevwenhoek）、第35巻、325頁（1969年）〕等に
よりピロガロールを製造する方法が知られている
に過ぎない。そこで本発明者等は、上記とは別に、広く自然
界からピロガロールを生産し得る微生物の検索を
行なつた結果、森林土壌中より新たに分離して得
たエアロモナス（Aeromonas）属又はエルビニ
ア（Erwinia）属に属する２新菌種が、加水分解
型タンニンあるいは没食子酸よりピロガロールを
極めて効率良く生産すること等の知見を得、本発
明を完成した。すなわち本発明は、エアロモナス属又はエルビ
ニア属に属し、ピロガロール生産能を有する微生
物、その含有物若しくは菌体処理物を、加水分解
型タンニン及び／又は没食子酸に作用させてピロ
ガロールを生成せしめ、該化合物を採取すること
を特徴とするピロガロールの製造法である。以下本発明を具体的に説明する。先ず、本発明に使用する菌としては、エアロモ
ナス属又はエルビニア属に属し、加水分解型タン
ニン及び／又は没食子酸からピロガロールを生産
する微生物であれば、如何なる菌でも良く、ま
た、これら菌の変種もしくは変異株であつてもよ
い。そして、上記微生物の具体例としては、夫々エ
アロモナスsp.631及びエルビニアsp.932等が挙げ
られ、それらの菌学的性質は、以下に示すとおり
である。実験方法は、「微生物の分類と同定」、長谷川武
治編、初版を参考として、同定は、バージエイ
ズ・マニユアル・オブ・デイターミネイテイブ・
バクテリオロジー（Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology）、第８版、（1974
年）に基づいて行なつたものである。エアロモナスsp.631の菌学的性質 (a) 形態顕微鏡的観察（ブイヨン培地で、30℃、
16時間培養）細胞の形及び大きさ： 0.5〜1.0×0.6〜4.0μｍの短桿菌である。細胞の多形性の有無：認められない。運動性の有無：１〜２本の極鞭毛を有し、
運動性を有する。胞子の有無：形成せず。グラム染色性：陰性。抗酸性：陰性。 (b) 各培地における生育状態肉汁寒天平板培養：温度30℃、24時間の培
養により、正円形、淡黄色で半透明のコロニ
ーを形成する。コロニーの表面は、滑らかで
光沢を有するが、色素は、生産しない。肉汁寒天斜面培養：生育は、拡布状に良好
に生育する。肉汁液体培養：全体に良好に生育し、沈査
を生成する。肉汁ゼラチン穿刺培養：穿刺線に沿つて生
育し、液化されない。リトマスミルク：６日目では、変化は認め
られないが、11日目では弱アルカリ化する。 (c) 生理的性質硝酸塩の還元：還元しない。脱窒反応：陰性。 MRテスト：陰性。 VPテスト：微陽性。インドールの生成：陰性。硫化水素の生成：酢酸鉛試験紙法：陽性。 TSI寒天法：陰性。デンプンの加水分解：陰性。クエン酸の利用：クリステンセン
（Christensen）及びコーザー（Koser）培地
で共に利用する。無機窒素源の利用：アンモニウム塩及び硝
酸塩を、共に僅かに利用する。色素の生成：陰性。〓〓螢光の有無：陰性。〓〓ウレアーゼ：陽性。〓〓オキシダーゼ：微陽性。〓〓カタラーゼ：陽性。〓〓生育の範囲：至適温度：10〜38℃ 至適PH：５〜９〓〓酸素に対する態度：通性嫌気性。〓〓Ｏ−Ｆテスト：発酵的に生酸する。〓〓糖類から酸及びガスの生成

【表】 (d) その他の性質リジンの脱炭酸：陰性。炭素源としてのアミノ酸の利用：Ｌ−アルギニン：陽性。Ｌ−アスパラギン：陽性。Ｌ−ヒスチジン：陽性。Ｌ−セリン：陰性。Ｌ−アラニン：陽性。Ｌ−グルタミン酸：陽性。フエニルアラニンデアミナーゼ：陽性。ペクチン分解：陰性。カゼイン分解：陰性。 DNase：陰性。グルコン酸酸化：陽性。シヨ糖還元物質の生成：陰性。（０／129）テスト：２，４−ジアミノ−６，７−ジイソプロピル
プテリジンに対する感受性：陰性。上記エアロモナスsp.631は、オキシダーゼは、
不明瞭であるが、極鞭毛を有し、ビブリオ科そし
て、曲がつた細胞及び球形の細胞が存在せず、螢
光がなく、食塩無添加の肉汁培地でも増殖し、ま
た、２，４−ジアミノ−６，７−ジイソプロピル
プテリジン（２，４−diamino−６，７−
diisopropylpteridine）に感受性を有しないこと
等の特徴からエアロモナス属に属するものと同定
した。そして、温度37℃でも生育し、グルコースから
発酵的にアセトインを生成することからエアロモ
ナス・ハイドロフイラ（Aeromonas
hydrophilia）に近縁であるが、デンプンを分解
せず、ゼラチンを液化せず、ウレアーゼ陽性で、
インドール陰性及び7.5％食塩水中で生育する点
で、本菌株は、エアロモナス・ハイドロフイラと
は相違し、バージエイズ・マニユアル・オブ・デ
イターミネイテイブ・バクテリソロジー、第８
版、（1974年）にも、本菌株と一致する種の記載
がなく、本菌株を新種とみなしエアロモナス
sp.631と命名した。なお、エアロモナスsp.631は、工業技術院微生
物工業技術研究所に、微工研菌寄第7899号
（FERM Ｐ−7899）として寄託されている。エルビニアsp.932の菌学的性質 (a) 形態顕微鏡的観察（ブイヨン培地で、30℃、
16時間培養）細胞の形及び大きさ： 0.5〜0.8×0.6〜2.5μｍの短桿菌である。細胞の多形性の有無：認められない。運動性の有無：周鞭毛を有し、運動性を有
する。胞子の有無：形成せず。グラム染色性：陰性。抗酸性：陰性。 (b) 各培地における生育状態肉汁寒天平板培養：温度30℃、24時間の培
養により正円形、淡黄色で半透明のコロニー
を形成する。コロニーの表面は、滑らかで光
沢を有し、培地は、淡黄色に変化する。肉汁寒天斜面培養：生育は、拡布状に良好
に生育する。肉汁液体培養：全体に生育するが、生育
は、やゝ不良であり、沈査を生成する。肉汁ゼラチン穿刺培養：穿刺線に沿つて生
育し、４週間目で弱く液化された。リトマスミルク：変化は認められない。 (c) 生理的性質硝酸塩の還元：肉汁培地：３日間の培養では還元しない
が、５日間の培養では還元する。コハク酸ナトリウム培地：還元する。脱窒反応：陰性。 MRテスト：陰性。 VPテスト：微陽性。インドールの生成：陰性。硫化水素の生成：酢酸鉛試験紙法：陽性。 TSI寒天法：陰性。デンプンの加水分解：陰性。クエン酸の利用：クリステンセン
（Christensen）及びコーザー（Koser）培地
で、共に未利用。無機窒素源の利用：アンモニウム塩及び硝
酸塩を、共に僅かに利用する。色素の生成：陰性。螢光の有無：陰性。ウレアーゼ：陽性。オキシダーゼ：陰性。カタラーゼ：陽性。生育の範囲：至適温度：10〜37℃ 至適PH：５〜９酸素に対する態度：通性嫌気性。Ｏ−Ｆテスト：発酵的に生酸する。糖類から酸及びガスの生成

【表】 (d) その他の性質リジンの脱炭酸：陰性。炭素源としてのアミノ酸の利用：Ｌ−アルギニン：陽性。Ｌ−アスパラギン：陽性。Ｌ−ヒスチジン：陽性。Ｌ−セリン：陰性。Ｌ−アラニン：陽性。Ｌ−グルタミン酸：微陽性。フエニルアラニンデアミナーゼ：陽性。ペクチン分解：陰性。カゼイン分解：陰性。 DNase：陰性。グルコン酸酸化：陽性。シヨ糖還元物質の生成：陰性。（０／129）テスト：２，４−ジアミノ−６，７−ジイソプロピル
プテリジンに対する感受性：陰性。上記エルビニアsp.932は、オキシダーゼ陰性、
周鞭毛を有し、グルコースより発酵的に生酸する
ことによりエンテロバクター科
（Enterobacterioceae）に属することは明白であ
る。そして、生育の最適温度が、30℃であること、
ウレアーゼ陰性、ベンゾエイト（Benzoate）、オ
キザレイト（Oxalate）及びプロピオネイト
（Propionate）を炭素源として利用せず、糖より
のガスの生成並びにデンプンの加水分解が陰性で
あることによりエルビニア（Erwinia）属に属す
るものと同定された。更に、生育因子がなく、温度36℃でも生育する
こと、肉汁寒天斜面培地上で１週間の培養により
淡黄色を呈すること等よりエルビニア・ハービコ
ーラ・グループ（Erwinia herbicola group）に
属するものと思われるが、ゼラチン液化が微弱で
あること、糖類がらの酸の生成、すなわち、イノ
シツト、メリビオース、麦芽糖、アドニトール、
セロビオース、グリセリン、ソルビツトにおいて
相違し、本菌株と一致する種の記載が、バージエ
イズ・マニユアル・オブ・デイターミネイテイ
ブ・バクテリオロジー、第８版（1974年）にもな
く、本菌株を新種となみしエルビニアsp.932と命
名した。なお、エルビニアsp.932は、工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第7900号（FERM
Ｐ−7900）として寄託されている。そして、本発明において、加水分解型タンニン
及び／又は、没食子酸に上記微生物、その含有物
若しくはその菌体処理物を作用させるには、加水分解型タンニン及び／又は没食子酸を含
有する培地に、前記微生物を接種、培養し、微
生物の培養と並行してピロガロールを培養物中
に生成蓄積させる方法。上記微生物を、予め培地に接種、培養して得
られた培養物、すなわち、該微生物含有物と加
水分解型タンニン及び／又は没食子酸を接触作
用させることによりピロガロールを生成させる
方法。上記微生物を、予め培地に接種、培養して得
られた培養物から分離した菌体又は菌体処理物
と加水分解型タンニン及び／又は没食子酸とを
接触作用させる方法等が挙げられる。なお、加水分解型タンニンとしては、如何なる
ものでもよく、例えば、ガロタンニン、五倍子タ
ンニン、没食子タンニン、タラタンニン等が挙げ
られ、没食子酸は、如何なる由来、製法等による
ものであつてもよい。前記の方法では、倍地は、通常の炭素源、窒
素源、無機塩、微量栄養源等以外に加水分解型タ
ンニン及び／又は没食子酸を含有するものであれ
ば、如何なるものでもよく、炭素源としては、グ
ルコース、ガラクトース、フラクトース、マンノ
ース、アラビノース、キシロース、リボース、マ
ンニツト、イノシツト、グリセリン等が挙げら
れ、窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉
エキス、カザミノ酸、コーンステイープリカー、
アミノ酸類等の天然窒素源、アンモニウム塩等の
無機窒素源等を、単独または、組み合せて用いる
ことができる。更に、微量栄養源としては、ビタミン類、核酸
塩基類、アミノ酸類等のものが挙げられる。倍地の初発PHは、5.0〜9.0、好ましくは、5.0〜
6.0であり、培養温度は、使用する微生物が生育
しえる温度であればよく、通常、15〜37℃、好ま
しくは20〜30℃である。本微生物の培養は、固体培養法でもよいが、通
常液体培養法を採用するのが有利であり、具体的
には、通常撹拌培養、振盪培養あるいは静置培養
等により、通常24〜72時間、好ましくは、24〜48
時間培養して培地中にピロガロールを生成、蓄積
させる。前記の方法においては、微生物を培養する培
地は、前記と同様な培地が使用され、本微生物
は、加水分解型タンニン及び／又は没食子酸を含
有しない培地でも充分生育させることができる
が、加水分解型タンニン及び／又は没食子酸を培
地中に少量添加することにより加水分解型タンニ
ン及び／又は没食子酸からピロガロールを生成す
る能力の増大した菌体を得ることができる。また、培地のPH、培養温度及び培養方法は、前
記と同様でよいが、培養時間は、菌の生育が対
数増殖期に入つた頃から、ピロガロールへの生成
する能力を示すので、前記における培養時間よ
り短くてもよい。この方法においては、加水分解型タンニン及
び／又は没食子酸を培養物に直接添加してもよ
く、培養物の濃縮等を行なつた培養処理物に、加
水分解型タンニン及び／又は没食子酸を添加して
もよい。添加する該タンニン及び／又は没食子酸の濃度
は、特に制限はないが、通常は、培養物中又は培
養処理物中の濃度が、0.2〜10重量％とすること
が好ましい。反応のPHは、例えば、3.0〜8.0、好
ましくは4.0〜6.0であり、反応温度は、反応が進
行する温度であれば、如何なる温度でもよく、通
常は、20〜40℃程度であつて、振盪、撹拌あるい
は静置することによつてピロガロールを生成、蓄
積させることが好ましい。前記の方法においては、微生物は、前記の
方法と同様にして培養され、培養終了後、培養物
より、例えば、遠心分離、濾過等の通常の手段に
よつて菌体を分離することができる。の方法で使用される菌体は、分離後の未処理
菌体でもよく、また、超音波処理、ホモゲナイザ
ー、ブレンダー、ビブロゲンセルミル、ダイノー
ミル等の機械的破壊手段あるいはトリトンＸ・
100等の界面活性剤、リゾチーム等の酵素を使用
する方法、凍結融解、自己消化等の化学的破壊手
段等により破壊処理された菌体処理物でもよく、
これらの処理後、通常の酵素分離法を用いて分取
した酵素等も適宜用いられる。また、菌体又は酵素を、通常の固定化法に従つ
て固定化したものを用いて連続的にピロガロール
を生産することも可能である。このようにして生成、蓄積されたピロガロール
は、公知の方法で採取することができ、例えば、
ジエチルエーテルを用いて抽出したものを、活性
炭等により脱色して濃縮し、昇華する方法等によ
りピロガロールを単離することができる。以上の如く本発明によれば、従来エアロモナス
属又はエルビニア属の細菌としては、加水分解型
タンニン及び／又は没食子酸よりピロガロールを
生産することが未公知で、かつまた極めて効率よ
く本化合物を生産することができるので、本発明
は、産業上極めて有意義である。以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。実施例１肉汁ブイヨン培地〔肉エキス0.3％（ｗ／ｖ）、
ペプトン１％（ｗ／ｖ）、NaCl0.5％（ｗ／ｖ）、
PH7.0〕を分注した綿栓付き試験管に、エアロモ
ナスsp.631株（FERM Ｐ−7899）及びエルビニ
アsp.932株（FERM Ｐ−7900）を、夫々１白金
耳ずつ接種し、温度30℃で18時間振盪培養して得
た前培養液全体を、ガロタンニンあるいはタラタ
ンニン４％（ｗ／ｖ）、リン酸１アンモニウム0.2
％（ｗ／ｖ）、リン酸１カリウム0.3％（ｗ／ｖ）、
硫酸マグネシウム0.1％（ｗ／ｖ）、PH5.5の液体
培地100ml中に接種し、温度30℃で30時間振盪培
養し、得られた培養物中のピロガロールの生成量
を高速液体クロマトグラフイー（日本分光・社・
製、トウインクル（Twincle）型HPLC）を用い
て測定した結果を下表に示した。

【表】実施例２没食子酸1.5％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン１％
（ｗ／ｖ）、グルコース５％（ｗ／ｖ）、酸母エキ
ス0.2％（ｗ／ｖ）、リン酸１カリウム0.2％
（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム0.1％（ｗ／ｖ）、PH
5.0の液体培地100ml中に、前記実施例１と同様の
前培養液を接種し、温度30℃で24時間振盪培養
し、得られた培養物中のピロガロールの生成量
を、実施例１と同様にして測定して得た値、ま
た、没食子酸からの転換率を夫夫下表に示した。

【表】実施例３没食子酸0.5％（ｗ／ｖ）、ガザミノ酸１％
（ｗ／ｖ）、グルコース1.0％（ｗ／ｖ）、酸母エキ
ス0.2％（ｗ／ｖ）、リン酸１カリウム0.2％
（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム0.1％（ｗ／ｖ）、PH
5.5の液体培地100ml中に、前記実施例１と同様の
前培養液を接種し、温度30℃で10時間培養して得
た培養物を、12000r.p.m.で15分間遠心分離処理
して菌体を分離し、該菌体を、２％（ｗ／ｖ）没
食子酸及び0.05M（モル）MES〔２−（Ｎ−
Morpholino）ethane sulfonic acid，
monohydrate〕緩衝液（PH＝5.0）を含有する液
に添加し、温度30℃で16時間ゆるく撹拌したの
ち、反応終了液中のピロガロール生成量を、実施
例１と同様にして測定した結果を、下表に示し
た。

【表】実施例４実施例２の方法で得た培地105mlの培養液を、
12000r.p.m.で15分間遠心分離処理して上清液100
mlを得、該上清液のPHを塩酸を用いてPH2.0に調
整したのち、２回100mlのジエチルエーテルを用
いて抽出し、該エーテル層を常法により蒸発乾固
し、得られた乾燥粉末を、常法により減圧下で昇
華させて結晶550mgを得た。このようにして得られた結晶の融点は、131〜
134℃であり、薄層クロマトグラフイー（展開溶
媒ベンゼン：ジオキサン：酢酸＝90：25：４）の
Rf値は、ピロガロールと一致し、IRスペクトル
は、ピロガロールのそれと完全に一致したため、
本結晶をピロガロールと同定した。

Claims

【特許請求の範囲】

１エアロモナス属又はエルビニア属に属し、ピ
ロガロール生産能を有する微生物、その含有物若
しくは菌体処理物を、加水分解型タンニン及び／
又は没食子酸に作用させてピロガロールを生成せ
しめ、該化合物を採取することを特徴とするピロ
ガロールの製造法。