JPH0610137B2 - ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤 - Google Patents
ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤Info
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- JPH0610137B2 JPH0610137B2 JP63046705A JP4670588A JPH0610137B2 JP H0610137 B2 JPH0610137 B2 JP H0610137B2 JP 63046705 A JP63046705 A JP 63046705A JP 4670588 A JP4670588 A JP 4670588A JP H0610137 B2 JPH0610137 B2 JP H0610137B2
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- measured
- csf
- stimulating factor
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、造血器疾患治療剤に関し、さらに詳しくは造
血器疾患に対する骨髄移植前後に本発明からなるヒト単
球−マクロファージコロニー刺激因子を投与し、ヒト単
球−マクロファージ系細胞及びその幹細胞に作用して、
単球−マクロファージの分化増殖を促進する造血器疾患
治療剤に関するものである。
血器疾患に対する骨髄移植前後に本発明からなるヒト単
球−マクロファージコロニー刺激因子を投与し、ヒト単
球−マクロファージ系細胞及びその幹細胞に作用して、
単球−マクロファージの分化増殖を促進する造血器疾患
治療剤に関するものである。
［従来技術］ コロニー刺激因子（以下ＣＳＦと略記する）は、哺乳動
物の造血組織、例えば骨髄などに存在する造血幹細胞の
分化・増殖を刺激する造血因子であり、多くのＣＳＦは
糖蛋白質から成つている。これまで、単球−マクロファ
ージ系幹細胞に作用する因子（Ｍ−ＣＳＦ又はＣＳＦ−
１）、顆粒球−単球系幹細胞に作用する因子（ＧＭ−Ｃ
ＳＦ）、顆粒球系幹細胞に作用する因子（Ｇ−ＣＳ
Ｆ）、更に顆粒球、単球、赤血球及び巨核球に共通な多
能性幹細胞に作用する因子（Multi−ＣＳＦ、インター
ロイキン−３又はＩＬ−３）の４種が知られている。
物の造血組織、例えば骨髄などに存在する造血幹細胞の
分化・増殖を刺激する造血因子であり、多くのＣＳＦは
糖蛋白質から成つている。これまで、単球−マクロファ
ージ系幹細胞に作用する因子（Ｍ−ＣＳＦ又はＣＳＦ−
１）、顆粒球−単球系幹細胞に作用する因子（ＧＭ−Ｃ
ＳＦ）、顆粒球系幹細胞に作用する因子（Ｇ−ＣＳ
Ｆ）、更に顆粒球、単球、赤血球及び巨核球に共通な多
能性幹細胞に作用する因子（Multi−ＣＳＦ、インター
ロイキン−３又はＩＬ−３）の４種が知られている。
骨髄移植の目的は免疫適格細胞、造血細胞の欠陥がある
患者に正常に機能する当該細胞の幹細胞（骨髄）を移植
し、機能の再構築を図ろうとするところにある。したが
つて造血組織や免疫適格細胞の原発性、二次性の欠陥、
欠損があるものは勿論対象となるが、最近では悪性腫瘍
に対する免疫抑制療法に際し、損傷をうけたこれらの組
織、細胞を再構築することにより、より強力な抗腫瘍効
果を期待するという目的に広く用いられている。骨髄移
植の対象となる疾患には原発性免不全症、再生不良性貧
血、進行性遺伝性血液細胞機能異常があることは勿論で
あり、造血器腫瘍である急性白血病、慢性白血病、悪性
リンパ腫、形質細胞腫や進行性固形腫瘍などもある。こ
のように今日造血器疾患の治療において、骨髄移植は強
力な手段となつているが、移植された骨髄の機能発揮が
不十分であるため感染症、間質性肺炎、ＧＶＨＤ等の問
題がある。
患者に正常に機能する当該細胞の幹細胞（骨髄）を移植
し、機能の再構築を図ろうとするところにある。したが
つて造血組織や免疫適格細胞の原発性、二次性の欠陥、
欠損があるものは勿論対象となるが、最近では悪性腫瘍
に対する免疫抑制療法に際し、損傷をうけたこれらの組
織、細胞を再構築することにより、より強力な抗腫瘍効
果を期待するという目的に広く用いられている。骨髄移
植の対象となる疾患には原発性免不全症、再生不良性貧
血、進行性遺伝性血液細胞機能異常があることは勿論で
あり、造血器腫瘍である急性白血病、慢性白血病、悪性
リンパ腫、形質細胞腫や進行性固形腫瘍などもある。こ
のように今日造血器疾患の治療において、骨髄移植は強
力な手段となつているが、移植された骨髄の機能発揮が
不十分であるため感染症、間質性肺炎、ＧＶＨＤ等の問
題がある。
骨髄移植後における骨髄機能の発揮を目的とした物質と
してはＨＧＩ−糖蛋白質（正岡徹、特開昭６２−３６３
２６）及びＧＭ−ＣＳＦ（Ａ．Ｗ．Nienhuisら、Journn
al of Clinical Investegation，８０巻、５７３−５７
７頁、１９８７年）が報告されている。
してはＨＧＩ−糖蛋白質（正岡徹、特開昭６２−３６３
２６）及びＧＭ−ＣＳＦ（Ａ．Ｗ．Nienhuisら、Journn
al of Clinical Investegation，８０巻、５７３−５７
７頁、１９８７年）が報告されている。
［発明が解決しようとする問題点］ 造血器疾患に対する骨髄移植療法は、血中の白血球レベ
ルがかなり低い状態で行われ、移植後も白血球の低レベ
ル状態がかなり長期間続く。この間、患者は感染症等の
危険にさらされる。そこで、白血球のレベルを移植後す
ばやく上昇させるため、白血球の産生を促進することを
目的として検討を行った結果、本発明に係るヒト単球−
マクロファージコロニー刺激因子を骨髄移植前後に投与
することによって血中の白血球レベルの正常値への復帰
が早急に起こることを見出して本発明を完成した。
ルがかなり低い状態で行われ、移植後も白血球の低レベ
ル状態がかなり長期間続く。この間、患者は感染症等の
危険にさらされる。そこで、白血球のレベルを移植後す
ばやく上昇させるため、白血球の産生を促進することを
目的として検討を行った結果、本発明に係るヒト単球−
マクロファージコロニー刺激因子を骨髄移植前後に投与
することによって血中の白血球レベルの正常値への復帰
が早急に起こることを見出して本発明を完成した。
即ち、本発明は、ヒト単球−マクロファージコロニー刺
激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤を提供するも
のであり、また、有効成分であるヒト単球−マクロファ
ージコロニー刺激因子が哺乳動物の単球−マクロファー
ジ系細胞及びその幹細胞に作用して、単球−マクロファ
ージの分化・増殖を刺激する造血器疾患治療剤を提供す
るものである。
激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤を提供するも
のであり、また、有効成分であるヒト単球−マクロファ
ージコロニー刺激因子が哺乳動物の単球−マクロファー
ジ系細胞及びその幹細胞に作用して、単球−マクロファ
ージの分化・増殖を刺激する造血器疾患治療剤を提供す
るものである。
更に、本発明は、有効成分であるヒト単球−マクロファ
ージコロニー刺激因子人尿・ヒト単球−マクロファージ
コロニー刺激因子産生細胞の培養液又はヒト単球−マク
ロファージコロニー刺激因子遺伝子組換え細胞の培養液
から得られる造血器疾患治療剤を提供し、更にまた下記
の理化学的性質を有する哺乳動物の単球−マクロファー
ジコロニー形成刺激因子を有効成分とする造血器疾患治
療剤を提供するものである。この因子は本出願人の１人
により既に特許出願（特願昭６２−１７８６９７号）さ
れ、その製造方法及び理化学的性質は同出願に詳細に記
載されている。
ージコロニー刺激因子人尿・ヒト単球−マクロファージ
コロニー刺激因子産生細胞の培養液又はヒト単球−マク
ロファージコロニー刺激因子遺伝子組換え細胞の培養液
から得られる造血器疾患治療剤を提供し、更にまた下記
の理化学的性質を有する哺乳動物の単球−マクロファー
ジコロニー形成刺激因子を有効成分とする造血器疾患治
療剤を提供するものである。この因子は本出願人の１人
により既に特許出願（特願昭６２−１７８６９７号）さ
れ、その製造方法及び理化学的性質は同出願に詳細に記
載されている。
a)分子量 同一のサブユニットから成るホモ２量体であって、ドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で測定した分子量が７０，０００〜９０，０００ダルト
ンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させたサ
ブユニットについてドデシル・硫酸ナトリウムポリアク
リルアミド電気泳動法で測定した分子量は３５，０００
〜４５，０００ダルトンである。
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で測定した分子量が７０，０００〜９０，０００ダルト
ンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させたサ
ブユニットについてドデシル・硫酸ナトリウムポリアク
リルアミド電気泳動法で測定した分子量は３５，０００
〜４５，０００ダルトンである。
b)サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
２１４個のアミノ酸配列を有し、１２２番目及び１４０
番目のアスパラギンはそれぞれアスパラギン（Ａｓｎ）
−ｘ−スレオニン（Thr）／セリン（Ｓｅｒ）で表され
る典型的なＮ−グリコシド結合部位を有する。ここでｘ
は任意のアミノ酸を示す。
２１４個のアミノ酸配列を有し、１２２番目及び１４０
番目のアスパラギンはそれぞれアスパラギン（Ａｓｎ）
−ｘ−スレオニン（Thr）／セリン（Ｓｅｒ）で表され
る典型的なＮ−グリコシド結合部位を有する。ここでｘ
は任意のアミノ酸を示す。
c)等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾等電点電気泳動法で測定した等電点（pI）は
３．１〜３．７である。
ース密度勾等電点電気泳動法で測定した等電点（pI）は
３．１〜３．７である。
d)糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフイーで分析したとこ
ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、アンノース、ガラス
トーク、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチル
ノイラミン酸である。
ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、アンノース、ガラス
トーク、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチル
ノイラミン酸である。
e)円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
０８nm及び２２２nmにそれぞれ極小ピークがありα−ヘ
リックス構造を含んでいる。
０８nm及び２２２nmにそれぞれ極小ピークがありα−ヘ
リックス構造を含んでいる。
f)熱安定性 ６０±０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失われ
ない。
ない。
g)赤外線吸収スペクトル 波数１６８０cm-1、１２００cm-1、及び１１３０cm-1に
強長吸収、波数１５４０cm-1、１４３０cm-1及び１０７
０cm-1に中度吸収を示す赤外線吸収スペクトラムを有す
る。
強長吸収、波数１５４０cm-1、１４３０cm-1及び１０７
０cm-1に中度吸収を示す赤外線吸収スペクトラムを有す
る。
本発明の上記理化学的性質を有するＣＳＦは、ＣＳＦ−
１と同様に糖鎖を含む二本のポリペプチドがジスルフイ
ド結合し、生物学的に活性なホモ２量体から構成されて
いない分子量は、７０，０００〜９０，０００ダルトン
であり、ＣＳＦ−１の分子量より大きい。更に、本発明
のＣＳＦを構成しているサブユニットのポリペプチド
は、少なくとも２１４個のアミノ酸から成り、分子量２
１，４００ダルトンであり、ＣＳＦ−１のそれの１４，
０００〜１７，０００ダルトンよりも大きい。また、サ
ブユニットのアミノ酸配列をＣＳＦ−１と比較すると、
ＮＨ２−末満の１番から１４９番目までのアミノ酸配列
は同じであつたが、１５０番から２１４個までのアミノ
酸配列はＣＳＦ−１のｃＤＮＡから推定されるものと、
異なっており、ＣＳＦ−１遺伝子上にコードされていな
かった。従って、本発明のＣＳＦは、公知のＣＳＦ−１
別個な因子であることが判明した。また、前記公知のＨ
ＧＩ−糖蛋白質、ＧＭ−ＣＳＦとは生物学的活性及び理
化学的性状が全く異なっている。
１と同様に糖鎖を含む二本のポリペプチドがジスルフイ
ド結合し、生物学的に活性なホモ２量体から構成されて
いない分子量は、７０，０００〜９０，０００ダルトン
であり、ＣＳＦ−１の分子量より大きい。更に、本発明
のＣＳＦを構成しているサブユニットのポリペプチド
は、少なくとも２１４個のアミノ酸から成り、分子量２
１，４００ダルトンであり、ＣＳＦ−１のそれの１４，
０００〜１７，０００ダルトンよりも大きい。また、サ
ブユニットのアミノ酸配列をＣＳＦ−１と比較すると、
ＮＨ２−末満の１番から１４９番目までのアミノ酸配列
は同じであつたが、１５０番から２１４個までのアミノ
酸配列はＣＳＦ−１のｃＤＮＡから推定されるものと、
異なっており、ＣＳＦ−１遺伝子上にコードされていな
かった。従って、本発明のＣＳＦは、公知のＣＳＦ−１
別個な因子であることが判明した。また、前記公知のＨ
ＧＩ−糖蛋白質、ＧＭ−ＣＳＦとは生物学的活性及び理
化学的性状が全く異なっている。
［発明の具体的な説明］ (1) 造血器疾患治療剤の製造方法 本発明の上記理化学的性質を有する造血器疾患治療剤
は、例えば次のようにして製造される。健康人の尿をpH
８．０〜９．０に調整し、尿中の粘性物質を沈澱・除去
し、その上澄を分子量１０，０００〜５０，０００ダル
トンを通過させる限外濾過膜を用いて濃縮と脱塩を行
う。少なくとも２００倍以上に濃縮（蛋白質濃度として
１％（ｗ／ｖ）以上）した後pHを６．５〜７．５に調整
し、６０℃で１０時間加熱処理（ウイルス等の不活化）
する。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオン交換
体、例えばＤＥＡＥ−セルロース等に有効成分を吸着さ
せる。
は、例えば次のようにして製造される。健康人の尿をpH
８．０〜９．０に調整し、尿中の粘性物質を沈澱・除去
し、その上澄を分子量１０，０００〜５０，０００ダル
トンを通過させる限外濾過膜を用いて濃縮と脱塩を行
う。少なくとも２００倍以上に濃縮（蛋白質濃度として
１％（ｗ／ｖ）以上）した後pHを６．５〜７．５に調整
し、６０℃で１０時間加熱処理（ウイルス等の不活化）
する。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオン交換
体、例えばＤＥＡＥ−セルロース等に有効成分を吸着さ
せる。
次に０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（pH６．５〜７．５）
で該イオン交換体を洗浄した後０．２Ｍ〜０．４Ｍの緩
衝液（pH６．５〜７．５）で有効成分を溶出する。該溶
出液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、１Ｍ〜４Ｍの塩
数、例えば硫安、食塩等を含有する緩衝液（pH６．５〜
７．５）で平衡化させゲル濾過剤、例えばSephacryl S
-300(Pharmacia社製）でゲル濾過し、分子量範囲が７
０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を回収す
る。次に該画分を上記１Ｍ〜４Ｍ塩含有緩衝液で平衡化
させた疎水性親和体、例えばPhenyl-Sepharose （Phar
macia社製）に吸着させ、０．５Ｍ〜１．０Ｍの塩含有
緩衝液（pH６．５〜７．５）で溶出する。該溶出液を限
外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾過カラム、例えばＴ
ＳＫＧ−３０００ＳＷ（東洋曹達製）でゲル濾過し、分
子量範囲が７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画
分を回収する。該画分を再度、濃縮し、０．１％トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液（pH１〜２）で平衡化した高
速液体逆相カラム、例えばＨｉ−Pore ２１４ＴＰ（バ
イバック社製）に吸着させ、０．１％ＴＦＡを含む溶
剤、例えばアセトニトリル又はイソプロパノールの直線
濃度勾配溶出法により溶出する。活性画分を回収し凍結
乾燥する。このようにして得られた本発明のＣＳＦ剤
は、比活性１×１０８単位mg・蛋白質以上を有する純粋
な物質である。次に凍結乾燥画分に単球−マクロファー
ジ刺激因子の安定剤としての人血清アルブミン、糖類を
含む緩衝液（pH６．５〜７．５）を加え溶解調製し無菌
濾過した後、無菌的に凍結乾燥し造血器疾患治療剤を製
造する。
で該イオン交換体を洗浄した後０．２Ｍ〜０．４Ｍの緩
衝液（pH６．５〜７．５）で有効成分を溶出する。該溶
出液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、１Ｍ〜４Ｍの塩
数、例えば硫安、食塩等を含有する緩衝液（pH６．５〜
７．５）で平衡化させゲル濾過剤、例えばSephacryl S
-300(Pharmacia社製）でゲル濾過し、分子量範囲が７
０，０００〜１５０，０００ダルトンの画分を回収す
る。次に該画分を上記１Ｍ〜４Ｍ塩含有緩衝液で平衡化
させた疎水性親和体、例えばPhenyl-Sepharose （Phar
macia社製）に吸着させ、０．５Ｍ〜１．０Ｍの塩含有
緩衝液（pH６．５〜７．５）で溶出する。該溶出液を限
外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾過カラム、例えばＴ
ＳＫＧ−３０００ＳＷ（東洋曹達製）でゲル濾過し、分
子量範囲が７０，０００〜１５０，０００ダルトンの画
分を回収する。該画分を再度、濃縮し、０．１％トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液（pH１〜２）で平衡化した高
速液体逆相カラム、例えばＨｉ−Pore ２１４ＴＰ（バ
イバック社製）に吸着させ、０．１％ＴＦＡを含む溶
剤、例えばアセトニトリル又はイソプロパノールの直線
濃度勾配溶出法により溶出する。活性画分を回収し凍結
乾燥する。このようにして得られた本発明のＣＳＦ剤
は、比活性１×１０８単位mg・蛋白質以上を有する純粋
な物質である。次に凍結乾燥画分に単球−マクロファー
ジ刺激因子の安定剤としての人血清アルブミン、糖類を
含む緩衝液（pH６．５〜７．５）を加え溶解調製し無菌
濾過した後、無菌的に凍結乾燥し造血器疾患治療剤を製
造する。
本発明の造血器疾患治療剤の製造例を参考例とし、参考
例１より得られた治療剤の生物学的活性を実施例として
次に示す。
例１より得られた治療剤の生物学的活性を実施例として
次に示す。
参考例１ 健常人の尿１０００ＬをpH８．５に調整し、沈澱物を濾
過除去し、分画分子量５０，０００ダルトンの限外濾過
膜（アミコン社、Ｈ１０×５０）で濃縮と脱塩を行っ
た。次に、濃縮液をpH７．０に調整し、密封容器中で６
０℃、１０時間加熱殺菌した。殺菌後、遠心分離）５，
０００×ｇ ３３０分間）して沈澱物を除去した後、
０．０２Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロースと混合し、吸着させた。ＤＥＡＥ−セ
ルロースを０．０２Ｍリン酸緩衝液、０．０５Ｍ食塩添
加０．０２Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）で洗浄した後、
０．２５Ｍ食塩添加リン酸緩衝液（pH７．２）で溶出さ
せた。溶出液を限外濾過膜（アミコン社Ｈ１０Ｐ１０）
で濃縮して、 Sephacryl S−３００（ファルマシン社、直径２０cm×
高さ８０cm）を用い、１Ｍ硫安添加緩衝液（pH７．２）
でゲル濾過した。ゲル濾過での分子量範囲７０，０００
〜１５０，０００ダルトンの画分を上記１Ｍ硫安添加緩
衝液で平衡化したphenyl−Sepharose４Ｂカラム（ファ
ルマシア社製直径１０×長さ２０cm）に吸着させ、次い
で０．５Ｍ硫安添加緩衝液（pH７．２）で溶出させた。
溶出液を限外濾過膜（アミコン社製Ｈ１Ｐ１０）で濃縮
して、ＴＳＫＧ−３０００ＳＷカラム（東洋曹達製、径
２．５×６０cm）で高速液体クロマトグラフイーにか
け、分子量範囲７０，０００〜１５０，０００ダルトン
の画分を得た。この画分を再度濃縮し、Ｈｉ−pore２１
４ＴＰ（バイダック社、径２．２×長さ２５cm）の逆相
カラムで０．１％トリフルオロ酢酸を含む、アセトニト
リル０−１００％（pH２．０）の直線濃度勾配による高
速液体クロマトグラフイにかけＣＳＦを溶出し、凍結乾
燥し本発明のＣＳＦ約４mgを得た。この方法を反復して
実施し本発明のＣＳＦ２０mgを得た。このＣＳＦは前記
した２１４個のアミノ酸配列を有していた。次に凍結乾
燥画分に本発明のＣＳＦの安定剤としての人血清アルブ
ミン、糖類を含むリン酸緩衝液（pH７．２）を加え溶解
調製した後、孔径０．２２μｍのメンブランフイルター
を装着した濾過除菌装置（ミリポア社製）を用いて濾過
して除菌し、あらかじめ１８０℃２時間乾熱滅菌したガ
ラス製バイアル瓶へ１mずつ無菌的に分注し、無菌的
に凍結乾燥し、バイアル瓶を密封し、本発明のＣＳＦを
含む造血器疾患治療剤約５００本を得た。
過除去し、分画分子量５０，０００ダルトンの限外濾過
膜（アミコン社、Ｈ１０×５０）で濃縮と脱塩を行っ
た。次に、濃縮液をpH７．０に調整し、密封容器中で６
０℃、１０時間加熱殺菌した。殺菌後、遠心分離）５，
０００×ｇ ３３０分間）して沈澱物を除去した後、
０．０２Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロースと混合し、吸着させた。ＤＥＡＥ−セ
ルロースを０．０２Ｍリン酸緩衝液、０．０５Ｍ食塩添
加０．０２Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）で洗浄した後、
０．２５Ｍ食塩添加リン酸緩衝液（pH７．２）で溶出さ
せた。溶出液を限外濾過膜（アミコン社Ｈ１０Ｐ１０）
で濃縮して、 Sephacryl S−３００（ファルマシン社、直径２０cm×
高さ８０cm）を用い、１Ｍ硫安添加緩衝液（pH７．２）
でゲル濾過した。ゲル濾過での分子量範囲７０，０００
〜１５０，０００ダルトンの画分を上記１Ｍ硫安添加緩
衝液で平衡化したphenyl−Sepharose４Ｂカラム（ファ
ルマシア社製直径１０×長さ２０cm）に吸着させ、次い
で０．５Ｍ硫安添加緩衝液（pH７．２）で溶出させた。
溶出液を限外濾過膜（アミコン社製Ｈ１Ｐ１０）で濃縮
して、ＴＳＫＧ−３０００ＳＷカラム（東洋曹達製、径
２．５×６０cm）で高速液体クロマトグラフイーにか
け、分子量範囲７０，０００〜１５０，０００ダルトン
の画分を得た。この画分を再度濃縮し、Ｈｉ−pore２１
４ＴＰ（バイダック社、径２．２×長さ２５cm）の逆相
カラムで０．１％トリフルオロ酢酸を含む、アセトニト
リル０−１００％（pH２．０）の直線濃度勾配による高
速液体クロマトグラフイにかけＣＳＦを溶出し、凍結乾
燥し本発明のＣＳＦ約４mgを得た。この方法を反復して
実施し本発明のＣＳＦ２０mgを得た。このＣＳＦは前記
した２１４個のアミノ酸配列を有していた。次に凍結乾
燥画分に本発明のＣＳＦの安定剤としての人血清アルブ
ミン、糖類を含むリン酸緩衝液（pH７．２）を加え溶解
調製した後、孔径０．２２μｍのメンブランフイルター
を装着した濾過除菌装置（ミリポア社製）を用いて濾過
して除菌し、あらかじめ１８０℃２時間乾熱滅菌したガ
ラス製バイアル瓶へ１mずつ無菌的に分注し、無菌的
に凍結乾燥し、バイアル瓶を密封し、本発明のＣＳＦを
含む造血器疾患治療剤約５００本を得た。
参考例２ 参考例１の方法においてSephacrylＳ−３００をTSKG3,0
00SW（東洋曹達製）、phenyl−Sepharose4BをTSK pheny
l−５ＰＷ東洋曹達製）にかえて、全て高速液体クロマ
トグラフイーにより精製した本発明のＣＳＦを実施例１
と同様な方法で無菌濾過、凍結乾燥し、本発明のＣＳＦ
を含む造血器疾患治療剤約５００本を得た。このＣＳＦ
は前記した２１４個のアミノ酸列を有していた。
00SW（東洋曹達製）、phenyl−Sepharose4BをTSK pheny
l−５ＰＷ東洋曹達製）にかえて、全て高速液体クロマ
トグラフイーにより精製した本発明のＣＳＦを実施例１
と同様な方法で無菌濾過、凍結乾燥し、本発明のＣＳＦ
を含む造血器疾患治療剤約５００本を得た。このＣＳＦ
は前記した２１４個のアミノ酸列を有していた。
実施例１ コロニー刺激活性及び比活性 本発明のＣＳＦのコロニー刺激活性は、in vitroのマウ
ス骨髄細胞による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験
法で測定した。試料を０．３％寒天、２０％牛胎児血清
（ＦＣＳ）及びマウス骨髄細胞１×１０５個を含むＭｃ
Ｃｏｙ′ｓ５Ａ培地１mと混合し、７．５％ＣＯ２２
通気下、３７℃で７日間培養した。培養後、５０個以上
の細胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数
を計測した。
ス骨髄細胞による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験
法で測定した。試料を０．３％寒天、２０％牛胎児血清
（ＦＣＳ）及びマウス骨髄細胞１×１０５個を含むＭｃ
Ｃｏｙ′ｓ５Ａ培地１mと混合し、７．５％ＣＯ２２
通気下、３７℃で７日間培養した。培養後、５０個以上
の細胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニー数
を計測した。
コロニー刺激活性は単位で表現し、１単位は１コロニー
を形成させるのに必要なＣＳＦ量と規定した。また比活
性はＣＳＦ蛋白質１mg当り形成されるコロニー数（単
位）で表わした。その結果、本発明のＣＳＦは、１．４
×１０８単位／mg・蛋白質の比活性を有していた。形成
されたコロニーをヘマトキシリン−エオジン染色して形
態学的に分類したところ、９５％以上のコロニーが単球
−マクロファージから形成されていた。
を形成させるのに必要なＣＳＦ量と規定した。また比活
性はＣＳＦ蛋白質１mg当り形成されるコロニー数（単
位）で表わした。その結果、本発明のＣＳＦは、１．４
×１０８単位／mg・蛋白質の比活性を有していた。形成
されたコロニーをヘマトキシリン−エオジン染色して形
態学的に分類したところ、９５％以上のコロニーが単球
−マクロファージから形成されていた。
実施例２ in vivoにおけるマウス骨髄単球−マクロフ
ァージ系幹細胞（ＣＦｕ−Ｍ）増殖促進作用 Ｃ５７ＢＬマウス（５匹／群）に対して体重１kg当り０
（生理食塩液）、８０×１０４単位、１６０×１０４単
位、３２０×１０４単位及び６４０×１０４単位のコロ
ニー刺激活性を有する本治療剤を１日１回、連続３日間
腹腔内に投与した。投与終了の翌日に、各マウスより大
髄骨骨髄及び脾臓を摘出し、骨髄及び脾臓中の単球−マ
クロファージ系幹細胞（ＣＦＵ−Ｍ）数を、１，０００
単位のＣＳＦを刺激因子とする前記軟寒天平板法による
コロニー形成試験で測定した。その結果は第１表及び第
２表に示すとおりであった。
ァージ系幹細胞（ＣＦｕ−Ｍ）増殖促進作用 Ｃ５７ＢＬマウス（５匹／群）に対して体重１kg当り０
（生理食塩液）、８０×１０４単位、１６０×１０４単
位、３２０×１０４単位及び６４０×１０４単位のコロ
ニー刺激活性を有する本治療剤を１日１回、連続３日間
腹腔内に投与した。投与終了の翌日に、各マウスより大
髄骨骨髄及び脾臓を摘出し、骨髄及び脾臓中の単球−マ
クロファージ系幹細胞（ＣＦＵ−Ｍ）数を、１，０００
単位のＣＳＦを刺激因子とする前記軟寒天平板法による
コロニー形成試験で測定した。その結果は第１表及び第
２表に示すとおりであった。
第１表及び第２表に示す如く、８０×１０４単位／kg体
重の薬剤投与により、骨髄及び脾臓でのＣＦＵ−Ｍの増
加が認められ、１６０×１０４単位／kg体重以上の投与
では顕著な増加が認められた。
重の薬剤投与により、骨髄及び脾臓でのＣＦＵ−Ｍの増
加が認められ、１６０×１０４単位／kg体重以上の投与
では顕著な増加が認められた。
実施例３ 骨髄移植マウスに対する回復促進作用ＢＡＬ
Ｂ／ｃマウス（５匹／群）に60Ｃｏを７．８Ｇｙ全身照
射した後同系マウスの骨髄細胞をマウス当り１．０×１
０６個尾静脈よ移植した。本治療剤を60Ｃｏ照射後５日
間マウスに対し体重１kg当り０（生理食塩水）及び６４
０×１０４単位１日１回、腹腔内に投与した。骨髄移植
後７日、１４日、及び２１日目にマウス尾静脈より採血
した末梢白血球数を計測し、また骨髄移植後１４日及び
２１日目に各マウスより大髄骨及び脾臓を摘出し、骨髄
及び脾臓中の単球−マクロファージ系幹細胞（ＣＦＵ−
Ｍ）を数を１，０００単位のＣＳＦを刺激因子とする前
記軟寒天平板法によるコロー形成法で測定した。その結
果は第１図及び第３表に示す。対照群は０単位（生理食
塩水）投与群を示す。
Ｂ／ｃマウス（５匹／群）に60Ｃｏを７．８Ｇｙ全身照
射した後同系マウスの骨髄細胞をマウス当り１．０×１
０６個尾静脈よ移植した。本治療剤を60Ｃｏ照射後５日
間マウスに対し体重１kg当り０（生理食塩水）及び６４
０×１０４単位１日１回、腹腔内に投与した。骨髄移植
後７日、１４日、及び２１日目にマウス尾静脈より採血
した末梢白血球数を計測し、また骨髄移植後１４日及び
２１日目に各マウスより大髄骨及び脾臓を摘出し、骨髄
及び脾臓中の単球−マクロファージ系幹細胞（ＣＦＵ−
Ｍ）を数を１，０００単位のＣＳＦを刺激因子とする前
記軟寒天平板法によるコロー形成法で測定した。その結
果は第１図及び第３表に示す。対照群は０単位（生理食
塩水）投与群を示す。
第１図及び第３表に示す如く本治療剤には骨髄移植した
マウスの白血球数及び骨髄、脾臓中の単球−マクロファ
ージ系幹細胞（ＣＦＵ−Ｍ）の顕著な回復促進作用が認
められた。
マウスの白血球数及び骨髄、脾臓中の単球−マクロファ
ージ系幹細胞（ＣＦＵ−Ｍ）の顕著な回復促進作用が認
められた。
実施例４ 低濃度骨髄移植マウスに対する死亡率低下作
用 ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）に60Ｃｏを全身照射
した後同系マウスの骨髄細胞をマウス当り２×１０４個
尾静脈より移植した。本治療剤を骨髄移植前５日間又は
骨髄移植後５日間マウスに対し体重１kg当り、６４０×
１０４単位１日１回腹腔内投与した。前者を前投与群後
者を後投与群とし、本治療剤を投与しない群を対照群と
した。骨髄移植後１４日間のマウス死亡率を観察した。
その結果を第２図に示す。
用 ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）に60Ｃｏを全身照射
した後同系マウスの骨髄細胞をマウス当り２×１０４個
尾静脈より移植した。本治療剤を骨髄移植前５日間又は
骨髄移植後５日間マウスに対し体重１kg当り、６４０×
１０４単位１日１回腹腔内投与した。前者を前投与群後
者を後投与群とし、本治療剤を投与しない群を対照群と
した。骨髄移植後１４日間のマウス死亡率を観察した。
その結果を第２図に示す。
第２図に示す如く本治療剤を低濃度骨髄移植マウスに骨
髄移植前後投与する事によりその死亡率を著しく低下せ
しめた。
髄移植前後投与する事によりその死亡率を著しく低下せ
しめた。
第１図は60Ｃｏ照射マウスに骨髄移植した後、本発明の
造血器疾患治療剤を投与した場合の白血球回復促進作用
を末梢白血球数を経時的にカウントすることにより示
す。 ○…治療剤投与群 ●…対照（生理食塩水投与群） ・…５％の危険率で有意差のあることを示す。 第２図は、骨髄移植濃度を第１図より少なくした場合、
移植前及び後にそれぞれ本発明の造血器疾患治療剤を投
与した時のマウスの死亡率低下作用を経時的に示す。 ○……前投与群 △……後投与群 ●……対照群。
造血器疾患治療剤を投与した場合の白血球回復促進作用
を末梢白血球数を経時的にカウントすることにより示
す。 ○…治療剤投与群 ●…対照（生理食塩水投与群） ・…５％の危険率で有意差のあることを示す。 第２図は、骨髄移植濃度を第１図より少なくした場合、
移植前及び後にそれぞれ本発明の造血器疾患治療剤を投
与した時のマウスの死亡率低下作用を経時的に示す。 ○……前投与群 △……後投与群 ●……対照群。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−34998（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−2391（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501607（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−501382（ＪＰ，Ａ) 国際公開 87／6954（ＷＯ，Ａ)
Claims (1)
- 【請求項１】以下に示す理化学的性質を有する入尿由来
のヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成
分とする骨髄移植療法と併用される造血器疾患治療剤： a)分子量 同一のサブユニットから成るホモ２量体であって、ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定した分子量が７０．０００〜９０．０００ダトンで
あり、還元剤で解離させて生物活性を消失させたサブユ
ニットについてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミド電気泳動法で測定した分子量は、３５．０００〜４
５．０００ダルトンである； b)サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
２１４個のアミノ酸配列を有する； c)等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾等電点電気泳動法で測定した等電点（pI）は
3.1〜3.7である； d)糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフイーで分析したとこ
ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラク
トース、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−アセチル
ノイラミン酸である； e)円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
０８nm及び２２２nmにそれぞれ極小ピークがありα−ヘ
リックス構造を含んでいる； f)熱安定性 ６０±０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失われ
ない； g)赤外線吸収スペクトル 波数１６８０cm-1、１２００cm-1、及び１１３０cm-1に
強度吸収、波数１５４０cm-1、１４３０cm-1及び１０７
０cm-1に中度吸収を示す赤外線吸収スペクトラムを有す
る。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63046705A JPH0610137B2 (ja) | 1988-02-29 | 1988-02-29 | ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤 |
| CA000592172A CA1336679C (en) | 1988-02-29 | 1989-02-27 | Remedy for hematopoietic tissue diseases comprising human monocytic macrophage colony stimulating factor as active ingredient |
| KR1019890002285A KR890012665A (ko) | 1988-02-29 | 1989-02-27 | 활성성분으로서 사람 단구성 대식세포 콜로니 자극인자를 함유하는 조혈조직질환의 치료제 |
| EP19890103432 EP0331088A3 (en) | 1988-02-29 | 1989-02-27 | Remedy for hematopoietic tissue diseases comprising human monocytic macrophage colony stimulating factor as active ingredient |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63046705A JPH0610137B2 (ja) | 1988-02-29 | 1988-02-29 | ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01221324A JPH01221324A (ja) | 1989-09-04 |
| JPH0610137B2 true JPH0610137B2 (ja) | 1994-02-09 |
Family
ID=12754780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63046705A Expired - Fee Related JPH0610137B2 (ja) | 1988-02-29 | 1988-02-29 | ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分とする造血器疾患治療剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0331088A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0610137B2 (ja) |
| KR (1) | KR890012665A (ja) |
| CA (1) | CA1336679C (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5714140A (en) * | 1989-12-13 | 1998-02-03 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for inhibiting the production of bioactive IL-1 by administering M-CSF |
| DK0456842T3 (da) * | 1989-12-13 | 1996-04-15 | Otsuka Pharma Co Ltd | Medicinske anvendelser af M-CSF |
| WO1994006458A1 (en) * | 1992-09-22 | 1994-03-31 | Genetics Institute, Inc. | Highly concentrated mcsf compositions |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2512453B2 (ja) * | 1985-02-05 | 1996-07-03 | シ−タス コ−ポレ−シヨン | 天然のコロニ−促進因子―１の精製 |
| JPH0753667B2 (ja) * | 1985-08-09 | 1995-06-07 | 新技術開発事業団 | 骨髄移植療法補助剤 |
| MX9203130A (es) * | 1986-05-06 | 1992-07-01 | Genetics Inst | Produccion de m-csf |
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| AU606099B2 (en) * | 1986-12-07 | 1991-01-31 | Japan Science And Technology Corporation | Colony-stimulating factor and method for preparation thereof |
| JPH022391A (ja) * | 1988-02-08 | 1990-01-08 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | ヒトｍ―ｃｓｆ及びその製造法 |
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1988
- 1988-02-29 JP JP63046705A patent/JPH0610137B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-02-27 KR KR1019890002285A patent/KR890012665A/ko not_active Ceased
- 1989-02-27 EP EP19890103432 patent/EP0331088A3/en not_active Withdrawn
- 1989-02-27 CA CA000592172A patent/CA1336679C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CA1336679C (en) | 1995-08-15 |
| EP0331088A3 (en) | 1991-11-13 |
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| JPH01221324A (ja) | 1989-09-04 |
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