JPH04178334A - 大理石骨病治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子
（以下Ｍ−Ｃ８Ｆと記載する）を有効成分として含有す
る大理石骨病治療剤に関し、詳しくはヒト単球−マクロ
ファージコロニー刺激因子が破骨細胞に作用して、破骨
細胞の増殖を刺激することにより大理石骨病の治療に著
効を有する薬剤に関するものである。

［従来技術］ コロニー刺激因子（以下Ｃ３Ｆと略記する）は、哺乳動
物の造血組織、例えば骨髄等に存在する造血幹細胞の分
化・増殖を刺激する造血因子であり、多くのＣ３Ｆは糖
蛋白質からなっている。従来、単球−マクロファージ系
幹細胞に作用する因子（Ｍ−Ｃ８Ｆ又はＣ３Ｆ−１）　
、顆粒球−単球系幹細胞に作用する因子（ＧＭ−ＣＳ　
Ｆ）　、顆粒球系幹細胞に作用する因子（Ｇ−ＣＳＦ）
、及び顆粒球、単球、赤血球、巨核球に共通な多能性幹
細胞に作用する因子［Ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ又はインター
ロイキン−３（ＩＬ−３）］の４種の因子が知られてい
る。

その中で単球−マクロファージ系幹細胞に作用する因子
の一つＭ−ＣＳＦは、本願出願人等によりヒト尿から最
初に単離され（特許第１．３０４．１４０号。この発明
においてＭ−Ｃ３Ｆに副作用がなく、長期間連続投与で
きることが証明されている）、その後本願出願人等によ
り癌免疫補助剤（特開平１−１９３２２７号公報）、血
小板減少症治療剤（特開平１−２（１７２４４号公報）
、造血器疾患治療剤（特願平１−２２１３２２４号）、
抗悪性腫瘍剤（特開平２−２２５４１１１号公報）、悪
性腫瘍治療剤（特願平１−８５６５１２号）、高脂血症
治療剤（特願平１−１１７３７３号）、骨髄異形成症候
群治療剤（特願平１−１５００８７号）等の用途が出願
されている。

骨代謝は、骨形成と骨吸収の２つのプロセスからなって
いる。即ち、破骨細胞によって古い骨が吸収され、一方
では遺骨細胞により新しい骨が形成されている（これは
骨組織のりモデリングと呼ばれている）。

骨代謝異常は、骨組織に存在する細胞数及びその活動性
の異常によって惹起される。骨には骨芽細胞、骨細胞及
び遺骨細胞の３種の細胞があり、間葉細胞から前骨芽細
胞→骨芽細胞→骨細胞、及び間葉細胞から前破骨細胞→
破骨細胞のように分化、発生する。

大理石前肩は、骨折しやすいこと、造血障害及び脳神経
症状を１徴とする遺伝性疾患であり、骨代謝の異常によ
り長幹骨に好発する骨梁増大及び軟骨の石灰化を伴う先
天的骨形成過剰であり、骨髄腔減少による貧血及び破骨
細胞の減少が認められる。

従来、この疾患に対する治療は対症療法が主流であり、
感染症には抗生物質の投与、貧血には輸血とコルチゾン
の投与、神経圧迫には外科的除圧手術等が採用されてい
る。一方、破骨細胞の増加又はその作用亢進の可能性が
ある薬剤として、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、甲
状腺ホルモン等が知られているが、これらの薬剤は副作
用があるので、長期間連続して患者に投与できない。

Ｍ−Ｃ３Ｆが前記のように骨髄幹細胞に作用して単球及
びマクロファージへの分化・誘導促進効果を有すること
は従来から知られているが、Ｍ−Ｃ３Ｆが破骨細胞増殖
効果を有することは文献未記載であり、従来知られてい
ない。

［発明が解決しようとする課題］ 上記のような天理石骨病治療の現状に鑑み、副作用がな
く、長期間連続して患者に投与し得る薬剤の開発が待望
されていた。

本発明者等は、Ｍ　−ＣＳ　Ｆの用途開発について鋭意
研究を行っていたか、Ｍ−Ｃ３Ｆに破骨細胞を増加させ
る作用かあることを見出だし、本発明を完成した。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、 ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有効成分
として含宵することを特徴とする大理石前肩治療剤； ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子が破骨細胞
に作用して、破骨細胞の増殖を刺激する大理石前肩治療
剤； ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子が、ヒト尿
、ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子産生細胞
の培養液、又はヒト単球−マクロファージコロニー刺激
因子を発現し得る遺伝子組換え細胞の培養液から得られ
る大理石前肩治療剤；ヒト単球−マクロファージコロニ
ー刺激因子が次の理化学的性質を有することを特徴とす
る大理石前肩治療剤、に関する。

ａ）分子量 同一のサブユニットからなるホモ２量体であって、ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で測定した分子量が７０１０００〜９０．０００ダルト
ンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させたサ
ブユニットについてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法で測定した分子量が３５１００
０〜４５，０００ダルトンであることｂ）サブユニット
のアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、次ぎに示
す２１４個のアミノ酸からなるヒト尿由来、又はアミノ
酸２２３個からなる遺伝子組換えヒト単球マクロファー
ジコロニー刺激因子であること Ｇｌｏ７Ｇｌｕ−Ｖａｌ−３＋＋−Ｇｌｕ−Ｔ７＋−Ｃ
ｙｓ−３＋＋−Ｈｉ＋−Ｍｅｌ−１１ｅ−Ｇ１７−５ｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌ＋＋−５ｅｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｎ−Ａｉｐ−Ｌｅｕ−１１ｅ−＾ｓｐ−３ｅｔ
−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｂｒ−３ｅ＋−Ｃｙｌ−
Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｔｂｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖ
ａｌ−＾＋ｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌ７
ｓ−Ａｉｐ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｃｙｌ−Ｔｙ＋−Ｌｅ
ｕ−Ｌ７＋−Ｌｙ＋−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｖａ　１−Ｇｌｎ−Ａｉｐ−１１ｅ−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　
ｌ　ｕ−Ａｓ　ｐ−Ｔｂｒ−Ｍｅ　Ｉ−Ａ　ｒ　ｇ−Ｐ
ｂ　ｔ−Ａ　ｒｇ−人＋ｐ−Ａｓｎ−Ｔｈ＋−Ｐ＋ｏ−
＾５ｎ−Ａｌａ７１１ｅ−Ａｌａ−１１ｅ−１１ａｌ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−３＋＋−Ｌ
ｅｕ−＾Ｂ−Ｌｅｕ−Ｌｙ＋−３＋＋−Ｃ７＋−Ｐｈｅ
−Ｔｈｒ−Ｌ７＋−Ａｉｐ−Ｔｙ＋−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−
Ｈｉ　＋−Ａ＋ｐ−Ｌ７ｓ−Ａｌａ−Ｃｙ＋４ａｌ−Ａ
ｉｐ−Ｔｂｒ−Ｐｂｅ−Ｔｙ「−Ｇｌｕ−Ｔｂｒ−Ｐ＋
ｏ−Ｌｅｕ−Ｊｎ−Ｌｅｖ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｌｙｓ
−Ｖａ　１−ＬＨ−＾＋ｎ−ＹａｋＰｈｅ−Ａ＋ｎ−Ｇ
ｌｏ−Ｔｂｒ−Ｌｙｓ−人＋ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓ
ｐ−ＬＨ−＾５ｐ−Ｔ＋ｐ−Ａ＋ｎ−１１ｅ−Ｐｈｅ−
Ｓｅ＋−Ｌ７ｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｌ−Ａ＋ｎ−Ａｉｎ−３
ｅ＋−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｃ７＋−Ｓｅ＋−３ｅ
ｔ−Ｇｌｎ−Ａｉｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｂｒ−Ｌｙｓ
−Ｐｒｏ−Ａｉｐ−Ｃｙｓ−Ａｉｎ−Ｃ７＋−Ｌｅｏ−
Ｔ７＋−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｓ
ｅ＋−３ｅｔ−Ａｉｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅ＋−Ｖａ
ｌ−３＋＋−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−３ｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−
Ｖａ　１−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｂｒ−Ｔ＋ｐ−
Ｇｌｕ−人＋ｐ−３＋＋−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈ＋−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−５ｅｔ−３ｅ＋−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ
−Ｔｂｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ− 又は Ｇｌｕ−Ｇｌｕ４ａｌ−５ｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙ＋−Ｃ７
ｓ−５ｅ＋−１（ｉｓ−Ｍｅｆ−１１ｅ−Ｇｌｙ−３ｅ
＋−Ｇ１７−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｓｅ＋−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−ＡＢ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−＾＋ｐ−３ｅ＋−Ｇ
ｌｎ−Ｍｅｌ−Ｇｌｕ−Ｔｂｒ−３ｅｔ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｎ−１１ｅ−Ｔｂｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ
−Ａｉｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−
Ａｉｐ−Ｐｒｏ−Ｖａ　１−Ｃｙｓ−Ｔ７＋−Ｌｅｕ−
Ｌｙｓ−Ｌ７ｉ−Ａｌａ−Ｐｈ＋−Ｌ＋ｕ−Ｌｅｕ４ａ
ｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−１１ｔ−ＭｅｉＧｌｕ−Ａｉｐ−
Ｔｂｒ−Ｍｅｔ−＾＋ｇ−Ｐｈｅ−Ａ＋ｇ−Ａｓｐ−Ａ
＋ｎ−Ｔｂｒ−Ｐｒｏ−Ａｉｎ−Ａｌａ−ｌｌｅ−Ａｌ
ａ−１１ｅ４ａｌ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−
Ｌｅｕ−３ｅ＋−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌ＋ｕ−ＬＨ−３ｅ
＋−Ｃｙｓ−Ｐｈ＋−Ｔｂｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｙ＋
−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｉｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−
Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａ；ｇ−Ｔｂｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙ＋−Ｇ
ｌｕ−Ｔｂｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｏ−Ｌｅ
、ｕ−Ｇｌｕ−ＬＨ４ａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ４ａｌ−Ｐ
ｈｅ−Ａｉｎ−Ｇｌｕ−Ｔｂｒ−Ｌ７＋−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｉｐ−Ｔ＋ｐ−Ａｓｎ
−１１ｅ−Ｐｈｅ−３ｅ＋−Ｌ７ｉ−Ａｉｎ−Ｃｙｓ−
Ａｉｎ−Ａｓｎ−３ｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｏ−Ｃ
Ｈ−３ｅｒ−３ｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｉｐ−Ｖａ１４ａｌ−
Ｔｂｒ−Ｌ７＋−Ｐｒｏ−Ａｉｐ−Ｃｙｓ−＾＋ｎ−Ｃ
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙ＋−Ｐ＋ｏ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−１１
ｅ−Ｐｒｏ−３ｅｔづ［「−Ａｌｌｌ−ＰＩＯ−Ａｌａ
−Ｓｅ＋−Ｖａｌ−Ｓｅ＋−？ｏ−）１ｉ＋−Ｇｌｎ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｍｅｆ−Ａ
ｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈ
＋−Ｔ＋ｐ−Ｇｌｕ−Ａｉｐ−３ｅ＋−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ｔｂｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−３ｅｔ−５ｅｔ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｐｔａ−Ｇｌｌ−Ｇｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｔａ−Ｌ
ｅｕ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｉｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
ｙ−３ｅ＋−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ− 本発明のＭ−ＣＳ　Ｆ　（Ｗｏｎｇ、　Ｇ、Ｇ、　　ｅ
ｔ　ａｌ；５ｃｉｅｎｃｅ、２３５巻、１５０４ページ
、１９８７年）は、公知のＣ８Ｆ　−１（Ｋａｗａｓａ
ｋｉ、　　Ｅ、Ｓ、、　　ｅｔ　　ａｌ、５ｃｉｅｎｃ
ｅ　　％　　２３０巻、２９１ページ、１９８５年）と
同様糖鎖を含む２本のポリペプチドがジスルフィド結合
し、生物学的に活性なホモ２量体から構成され、その分
子量は７０．０００〜９０，０００ダルトンであり、Ｃ
３Ｆ−１の分子量よりも大きい。更にＭ−ＣＳＦを構成
しているサブユニットのポリペプチドは、２１４又は２
２３個のアミノ酸からなり、分子量は２Ｌ４００ダルト
ンであり、Ｃ３Ｆ−１のそれの１４．０００〜１７．０
００よりも大きい。又、サブユニットのアミノ酸配列を
Ｃ３Ｆ−１と比較すれば、Ｎ−末端の１番目から１４９
番目までのアミノ酸配列は、同一であるが、１５０番目
から２１４又は２２３番目までのアミノ酸配列は、Ｃ３
Ｆ−１のｃＤＮＡから推定されるものと異なり、Ｃ３Ｆ
−１遺伝子上にコードされていなかった。従って、Ｍ−
Ｃ３Ｆは、公知のＣ３Ｆ−１と別個な因子であることが
判明した。又、前記公知の糖蛋白質、ＧＭ　−ＣＳ　Ｆ
　（Ｗｏｎｇ、　　Ｇ、Ｇｅｌ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ
　、　２２８巻、８１０ページ、１９８５年）とは生物
学的活性及び理化学的性状が全（異なっている。

本発明のＭ−Ｃ３Ｆは、ヒト尿から化学的方法により単
離することもでき、又、Ｍ−Ｃ３Ｆ産生細胞の培養液あ
るいはＭ−Ｃ３Ｆを発現し得る遺伝子組換え細胞の培養
液から単離することもてきる。ヒト尿から化学的方法に
より単離する一例（柳井延也等：基礎と臨床、２２巻、
２０００ページ、１９８８年）を示せば次のとおりであ
る。

健康な人の尿をｐＨ８，０〜９．０の範囲に調整し、尿
中の粘性物質を沈殿させて除去し、その上澄を分子量１
０．０００〜５０．０００ダルトンを通過する限外濾過
膜を用いて濃縮及び脱塩する。少なくとも２００倍以上
［蛋白質濃度として１％（重量／容量。以下特に断りの
ない限り同じ）以上］に濃縮し、のちｐＨを６，５〜７
５に調整し、６０℃で１０時間加熱しくウィルスを不活
化する）、生成した沈殿物を遠心して除去し、陰イオン
交換体（例えば、ＤＥＡＥ−セルロース等）に有効成分
を吸着させる。

次いで０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（ｐ）１６．５〜７
．５）で該イオン交換体を洗浄し、のち０２〜０．４Ｍ
の緩衝液（ｐ’Ｈ６，５〜７５）で有効成分を溶出する
。該溶出液を必要に応じ限外濾過膜で濃縮し、１〜４Ｍ
の塩類（例えば、硫酸アンモニウム、食塩等）を含有す
る緩衝液（ｐＨ６，５〜７．５＞で平衡化したゲル濾過
剤［例えば、セファクリールＳ−３００（登録商標。フ
ァルマシア社製）等］でゲル濾過し、分子量範囲が７０
，０００〜１５０．０００ダルトンの画分を回収する。

次いで該画分を上記１〜４Ｍの塩類含有緩衝液で平衡化
した疎水性親和体［例えば、フェニル・セファロース（
登録商標。ファルマシア社製）等］に吸着させ、０５〜
１．０Ｍの塩類含有緩衝液（ｐＨ６，５〜７．５）で溶
出する。該溶出液を限外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル
濾過カラム［例えば、ＴＳＫＧ−３０００ＳＷ　　（東
洋曹達社製）等］でゲル濾過し、分子量範囲７０，００
０〜１５０．０００ダルトンの画分を回収する。該画分
を再度濃縮し、０．１％トリフルオロ酢酸溶液（ｐＨ１
〜２）で平衡化した高速液体クロマトグラフ用逆相カラ
ム［例えば、）Ｉｉ−Ｐｏｒｅ　２１４ＴＰ　（登録商
標。バイダック社製）等コに吸着させ、０．１％トリフ
ルオロ酢酸溶液を含む溶剤（例えば、アセトニトリル、
イソプロパツール等）の直線濃度勾配溶出法により溶出
し、活性画分を回収し、凍結乾燥する。

この活性画分は比活性１×１０８単位／■・蛋白質以上
のＭ−Ｃ８Ｆを含有する純粋な物質であり、−例を示せ
ば次のような理化学的性質を有している。

ａ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（ｐｌ
）は３１〜３７である。

ｂ）糖鎖の構成単糖 加水分解したのち高速液体クロマトグラフィーで分析し
て同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラクト
ース、Ｎ−アセチル力ラクトサミン及びＮ−アセチルノ
イラミン酸である。

Ｃ）円二色性スペクトル 円二色性分散針による遠紫外部ＣＤスペクトルは、波長
２０８ｎｍ及び２２２ｎｍにそれぞれ極小ピークがあり
、α−へリックス構造を含んでいる。

ｄ）熱安定性 ６０±０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失われ
ない。

ｅ）赤外線吸収スペクトル 波数１６８０ａｎ−’、１２００ａｎ−’、及びｌｌ３
０ａｎ−’に強度吸収、波数１５４０ａｎ−’、１４３
０ｃｍ−’、及び１０７０Ｃ！ｎ−’に中度吸収を示す
。

Ｍ−Ｃ３Ｆを、Ｍ−Ｃ３Ｆを発現し得る遺伝子組換え細
胞の培養液から単離する方法（特願平ｌ−１１７３７２
号）を例示すれば次のとおりである。

Ｍ−Ｃ３Ｆ遺伝子組換え細胞（ＣＨＯ細胞）の培養液か
ら精製したＭ−Ｃ８Ｆをウサギに免疫して得た抗Ｍ−Ｃ
３Ｆ抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中で透
析し、濃度を調整する。該抗体溶液を予め蒸留水及び０
，１Ｍリン酸緩衝液で洗浄したフオルミルーセルロファ
インに加え、室温で攪拌し、水素化シアノホウ素ナトリ
ウムを加え、更に攪拌し、フォルミルーセルロファイン
と抗Ｍ−Ｃ３Ｆ抗体を結合させ抗体結合支持体を調製す
る。次いで、０．２ｉ１Ｊスー塩酸緩衝液で洗浄し、更
に水素化シアノホウ素ナトリウムを含むトリス緩衝液を
加え、室温で攪拌し、未反応基を不活化する。のち抗体
結合支持体を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する０、０
２ＭＩＪン酸緩衝液で十分洗浄する。

Ｍ−Ｃ８Ｆを発現し得る遺伝子組換え細胞（ＣＨＯ細胞
）の培養液を限外が過濃縮機で濃縮し、脱塩し、ＤＥＡ
Ｅ−セルロースに吸着させ、非吸着の夾雑物質を除去し
、０．３Ｍ塩化すｈ　ＩＪウム水溶液で溶出し、該溶出
液に塩化ナトリウムを加えてその濃度を調整し、Ｍ−Ｃ
８Ｆを含有する溶液を調製する。上記抗体結合支持体に
このＭ−Ｃ３Ｆを含有する溶液を加え、１０６Ｃ以下で
攪拌し、バッチ式クロマトグラフィー処理を行う。ガラ
スフィルターで濾過し、抗体結合支持体を集め０．５Ｍ
塩化ナトリウムを含有する００２Ｍリン酸緩衝液で該抗
体結合支持体を十分に洗浄し、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ２，５）を加え、１０°Ｃて攪拌し、Ｍ−ＣＳＦを溶
出する。溶出液のｐＨを７０に調整し、限外濾過膜で濃
縮及び脱塩し、Ｍ−Ｃ３Ｆ分画を得る。この分画を逆相
カラムで０．１トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
０〜１００％（ｐＨ２，０）の直線濃度勾配による高速
液体クロマトグラフィーにかけ、Ｍ−Ｃ３Ｆを集め、凍
結乾燥し、Ｍ−ＣＳＦを得る。

以上のようにして得たＭ−Ｃ３Ｆに安定剤としてヒト血
清アルブミン及び糖類を含む緩衝液（ｐｌ（６，５〜７
５）を添加して溶解し、無菌濾過し、無菌的に凍結乾燥
し、大理石前症治療剤を製造する。

尚、ヒト血清アルブミン及び糖類の他、薬理学的に許容
される成分、更には従来から大理石前肩治療に使用され
ている薬剤と併用することもできる。

このようにして製造された大理石前症治療剤は、後記す
る実施例から明らかなように少なくとも３０μｇ／ｍ　
ｌの濃度でＭ−Ｃ８Ｆを含有している。

次に試験例を示して本発明を詳述する。

試験例１ この試験は、Ｍ−Ｃ３Ｆの効果及び有効投与量を調べる
ために行われた。

（１）試料の調製 実施例１と同一の方法により大理石前症治療剤を調製し
た。

（２）試験方法 大理石前肩の病態モデルマウスである生後１１日齢の０
１１１０１１マウス（典型的な大理石病の病態を有し、
破骨細胞及び腹腔マクロファージの数が極端に不足して
いる）４０頭を５群に分け、本発明の大理石前症治療剤
を１日当り０（対照群）、１μｇ（第１群）、２．５μ
ｇ（第２群）、５μｇ（第３群）、及び７５μｇ（第４
群）の量で２回、又は３回に分けて皮下投与法により１
４日間投与した。

マウス末梢血は、麻酔を施した後、眼窟から採取し、有
核細胞数はへモサイトメータにより計測した。

分化した各細胞数は、Ｍａｙ−Ｇ＋ｕｎｗａｌｄ／Ｇｉ
ｅｍｓａ染色により計測した。

脛骨及び大腿骨は４°Ｃて２時間、２％パラホルムアル
デヒド及び２％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコ
ジル酸緩衝液（ｐＨ７，４）で固定した。緩衝液を洗い
流した後、標本をエタノールで脱水し、Ｊ　Ｂ−４培地
に包埋し、切片を調製した。、 厚さ４ミクロンの切片を、トリジンブルーで染色し、組
織の一般的状態及び１ａＮＩ２１２−ｕｓｉｓｔｉｎｔ
ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｌａｓｅ（以下ＴＲＡＣＰと
記載する）活性を光学顕微鏡で観察した。

又、他の標本は５％ＥＤＴ＾（ｐｉ（７，２１で脱カル
シウムし、のち１％オスミウム酸で固定し、Ｅｐｏｎ８
１２で包埋し、極薄切片を染色し、電子顕微鏡で観察し
た。

（３）試験結果 この試験の結果は、表１及び第１図〜第３図に示すとお
りであった。第１図及び第３図は、それぞれ対照群及び
第３群マウス脛骨の光学顕微鏡写真であり、第３図は第
３群マウス脛骨の電子顕微鏡写真である。第２図におい
て矢印及び矢頭は、それぞれＴｌ１ＡＣＰ陽性破骨細胞
及びＴＲＡＣＰ陽性単核細胞を示す。

（以下余白） 表１から明らかなように第３群及び第４群のマウスでは
、末梢血中の単球数が著しく増加したが、これらの群の
間には大差のない結果であった。

又、第１図の対照群マウスの脛骨における大理石前肩病
変部と比べて、第２図の第３群マウス脛骨の病変が著し
く改善されることが認められた。即ち、第１図において
は骨柱の増加、髄腔の減少及び破骨細胞のマーカーであ
るＴＲＡＣＰ陽性細胞の存在が認められないのに対して
、第２図においては骨柱の大部分が髄腔で置換され、Ｔ
ＲＡＣＰ陽性破骨細胞（矢印）が残余の骨柱表面に沿っ
て配され、ＴＲＡＣＰ陽性単核細胞（矢頭）が髄腔内に
認められた。

更に、第３図から明らかなように、第３群マウス脛骨に
おいては、よく発達した皺状の境界、透明な領域、及び
ライソゾーム構造等の典型的な破骨細胞の特徴を有する
巨大細胞の出現が認められた。第２群マウス脛骨の光学
顕微鏡観察、及び電子顕微鏡観察では、第３群のそれら
程顕著ではないが、対照群及び第１群のそれらよりも病
変が改善されているのが認められた。これらの結果から
、Ｍ−Ｃ３Ｆが破骨細胞の分化、増殖を促して骨吸収プ
ロセスを促進し、正常な骨代謝を回復させ、大理石前肩
の治療に有効であることを示している。

この効果は１日当り少なくとも２５μｇの投与量で認め
られるので、マウスの平均体重から換算すれば、ヒトの
場合１日当り少なくとも１００　μｇ／ｋｇ体重に相当
するものと推定される。また、Ｍ−Ｃ３Ｆは、通常、静
脈内、動脈内、筋肉内、皮下、腹腔内等の投与ルートに
より投与される。

試験例２（毒性） 実施例２と同一の方法により調製されたＭ−Ｃ３Ｆを用
いて急性毒性をリチャード等の方法（Ｊ。

Ｐｈａ＋ｍａｃｏ１．　　Ｅｘｐ、　Ｔｈｅｍ、　、９
０巻、９９ページ、１９４９年）によりＣ３ＴＢＬ系雄
性マウスで試験した。その結果を表２に示す。

表２ 投与方法　　　ＬＤ、。ｒ単位／　ｋｉ　（ｇ　／ｋｗ
　）コ腹腔内投与　　　　　ｌＸｌ０”　　（４）静脈
内投与　　　　　５Ｘ１０’　　（２）皮下投与　　　
　ｌＸｌ０”　（４） 次に実施例を示して本発明を更に詳述するが、本発明は
以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１ 純化した遺伝子組換えＭ−ＣＳＦをウサギに免疫して得
た抗Ｍ−Ｃ９Ｆ抗体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）中で透析し、濃度を２０ｍｇ／ｍｌ調整し、該抗体
溶液２００ｍ１予め蒸留水及びＯ，ＩＭＩＪン酸緩衝液
で洗浄した１００ｇのフォルミルーセルロファインに加
え、室温で２時間攪拌し、水素化シアノホウ素ナトリウ
ム７００■を加え、更に１６時間攪拌し、フォルミルー
セルロファインと抗Ｍ−Ｃ３Ｆ抗体を結合させ抗体結合
支持体を調製した。のち０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液で
洗浄し、更に水素化シアノホウ素ナトリウム５００■を
含むトリス緩衝液２００ｍ１を加え、室温で４時間攪拌
し、未反応基を不活化し、抗体結合支持体を０，５Ｍ塩
化ナトリウムを含有する０、　０２Ｍリン酸緩衝液で十
分洗浄した。この抗体結合支持体は支持体１ｇ当り３２
．６■の抗Ｍ−Ｃ８Ｆ抗体を結合していた。

Ｍ−Ｃ８Ｆを発現し得る遺伝子組換え細胞（ＣＨＯ細胞
）の培養液＋ＯＬを限外濾過濃縮機で濃縮及び脱塩し、
ＤＥＡＥ−セルロースに吸着させ、非吸着の夾雑物質を
除去し、０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液で溶出し、該溶
出液に塩化ナトリウムを加えて０．５Ｍの濃度に調整し
、Ｍ−Ｃ３Ｆを含有する溶液を調製した。このＭ−Ｃ３
Ｆの比活性は、３×１０６単位／■であった。

上記抗体結合支持体１００ｇに対し、このＭ−Ｃ３Ｆを
含有する溶液（全量５００ｍ１）を加え、１０℃以下で
一夜攪拌し、バッチ式クロマトグラフィー処理を行った
。攪拌後、ガラスフィルターでた過し、抗体結合支持体
を集め、　０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する１１２Ｍ
’Ｊン酸緩衝液で該抗体結合支持体を十分に洗浄した。

洗浄後０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ２、５）　５００　ｍ
ｌを加え、Ｉ　Ｑ　’Ｃで１時間攪拌し、Ｍ−Ｃ８Ｆを
溶出した。溶出液のｐｉ（を７，０に調整し、限外濾過
膜で濃縮及び脱塩し、Ｍ−Ｃ３Ｆ分画を得た。この分画
をＨｉ−Ｐｏｕ＋２１４ＴＰ　（バイダック社、径２．
２Ｘ２５の）の逆相カラムで０１　トリフルオロ酢酸を
含むアセトニトリル０〜１００％（ｐｌ（２，０）の直
線濃度勾配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、
Ｍ−Ｃ３Ｆを集め、凍結乾燥し、Ｍ−Ｃ８Ｆ約２０■を
得た。得られたＭ−ＣＳ　Ｆの比活性は１．９×１０８
単位／■てあり、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法による純度は９８
％以上であった。

得られたＭ−Ｃ３Ｆにマンニトール５．５ｇを含む０、
１５Ｍ塩化ナトリウム含有リン緩衝液（ｐＨ７，２）５
５０ｍｌを添加し、Ｍ−Ｃ３Ｆを溶解し、ニトロセルロ
ース系無菌濾過膜を装着した濾過除菌装置（ミリボア社
製）を用いて除菌し、予め１８０°Ｃて２時間乾熱滅菌
したガラス製バイアル瓶に１　ｍｌずつ無菌的に充填し
、無菌的に凍結乾燥し、バイアル瓶を密封し、大理石前
肩治療剤５００本を得た。

実施例２ 健康なヒトの尿１［）ＯＯＡ’をｐＨ１１，５に調整し
、沈殿物を濾別し、分画分子量５０．ＯＮダルトンの限
外濾過膜（アミコン社製。Ｉ（Ｉ［ｌ　Ｘ５１］）て濃
縮及び脱塩し、濃縮液のｐＨを７０に調整し、密封容器
中で６０’Ｃ５１０時間加熱殺菌し、のち遠心分離（５
，０Ｏ（ｌ　ｘｇで３０分間）して沈殿を除去した。次
いて１１．ｌ］２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡
化したＤＥＡＥ−セルロースと混合し、これに吸着させ
、Ｏ，１１２Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７，２）及びＯ，
［１５Ｍ食塊添加Ｇ、　０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
２）で順次洗浄し、のちＱ、　２５Ｍ食塩添加０．０２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で溶出させ、該溶出液を
限外濾過膜（アミコン社製。ＨＩＯＰＩＯ）で濃縮した
。セファクリールＳ−３００（登録商標。

ファルマシア社製）を充填し−たカラム（直径２０ａｎ
。

長さ８０　ａｎ　）を用い、１Ｍ硫酸アンモニウム添加
緩衝液（ｐＨ７，２）で該濃縮液をゲル濾過し、分子量
範囲７０．０００〜１５０．０００ダルトンの画分を上
記１Ｍ硫酸アンモニウム添加緩衝液（ｐＨ７，２）で平
衡化したフェニル・セファロース４Ｂ（登録商標。ファ
ルマシア社製）カラム（直径１０ａｎ、長さ２１Ｊａｎ
　）に吸着させ、次いでＱ、　！ｉＭ硫酸アンモニウム
添加緩衝液（ｐＨ７，２）で溶出させた。溶出液を限外
濾過膜（アミコン社製。ＨＩＱＰＩＯ）で濃縮し、ＴＳ
ＫＧ−３０００５Ｗ　（東洋曹達社製）カラム（直径２
．５ａｎ、長さ６０ａｎ）をもちいて高速液体クロマト
グラフィーにかけ、分子量範囲７０．０００〜１５０．
０００ダルトンの画分を得た。この画分を再度限外濾過
膜（アミコン社製。ＨＩＯＰＩＯ）で濃縮し、Ｈｉ−Ｐ
ｏｒｅ　２１４ＴＰ　　（登録商標。バイダック社製）
逆相カラム（直径２．５ａｎ。

長さ６０の）で０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセト
ニトリル１〜ＩＯ［ＩＸ　ＣｐＨ２，０）の直線濃度勾
配による高速液体クロマトグラフィーにかけ、Ｍ−Ｃ８
Ｆを溶出させ、溶出液を凍結乾燥し、Ｍ−Ｃ５Ｆ約４■
を得た。この方法を反復し、Ｍ−Ｃ８Ｆ約４０■を得た
。以下、実施例１と同様にして、大理石前肩治療剤５０
０本を得た。

実施例３ セファクリールＳ−３００（登録商標。ファルマシア社
製）をＴＳＫＧ−３０００ＳＷ　　（東洋曹達社製）に
、フェニル・セファロース４Ｂ（登録商標。ファルマシ
ア社製）をＴＳＫフェニル−５ＰＷ　　（東洋曹達社製
）に、それぞれ変更したこと、及び全て高速液体クロマ
トグラフィーにより精製したことを除き、実施例２と同
一の方法により大理石前肩治療剤５００本を得た。

［発明の効果］ 本発明によって奏せられる効果は次ぎのとおりである。

（１）本発明の大理石骨病治療剤により破骨細胞の増殖
が促進される。

（２）本発明の大理石骨病治療剤は、天理石骨病の根本
的治療剤として有効である。

（３）本発明の大理石骨病治療剤は、従来知られている
破骨細胞増殖剤に比へて副作用が少ない利点がある。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は生物の形態を示す写真であって、第１
図は、ｏｐ１０ｐマウス脛骨の顕微鏡写真であり、第２
図は、Ｍ−Ｃ３Ｆ投与後のｏｐｌｏｐ　７ウス脛骨の顕
微鏡写真であり、第３図は、Ｍ−Ｃ３Ｆ投与後の０ｐ１
０ｐマウス脛骨組織の電子顕微鏡写真である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子を有
   効成分として含有することを特徴とする大理石骨病治療
   剤。
2. （２）ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子が破
   骨細胞に作用して、破骨細胞の増殖を刺激する請求項（
   １）記載の大理石骨病治療剤。
3. （３）ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子が、
   ヒト尿、ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子産
   生細胞の培養液、又はヒト単球−マクロファージコロニ
   ー刺激因子を発現し得る遺伝子組換え細胞の培養液から
   得られるものである請求項（１）又は請求項（２）記載
   の大理石骨病治療剤。
4. （４）ヒト単球−マクロファージコロニー刺激因子が次
   の理化学的性質を有するものである請求項（１）乃至請
   求項（３）記載の大理石骨病治療剤。 ａ）分子量 同一のサブユニットからなるホモ２量体の糖蛋白質であ
   って、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
   電気泳動法で測定した分子量が７０，０００〜９０，０
   ００ダルトンであり、還元剤で解離させて生物活性を消
   失させたサブユニットについてドデシル硫酸ナトリウム
   ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した分子量が
   ３５，０００〜４５，０００ダルトンであること ｂ）サブユニットのアミノ酸配列ホモ２量体を構成する
   サブユニット蛋白質は、次ぎに示す２１４個のアミノ酸
   からなるヒト尿由来、又はアミノ酸２２３個からなる遺
   伝子組換えヒト単球マクロファージコロニー刺激因子で
   あること 【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】