JPS628056A - 特異的結合分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、特異的結合分析法に関し、更に詳しくは、血
清等の液性媒体中のリガンドを簡便かつ高感度に検出す
ることができる特異的結合分析法に関する。

［従来技術及びその問題点］ 従来、液性媒体中のリガンドを測定するための特異的結
合分析法としては、受身赤血球凝集法。

ラジオイムノアッセイ、酵素抗体法が知られている。

受身赤血球凝集法は、抗原又は抗体を固定赤血球等の担
体に人工的に結合させて、対応する抗体又は抗原を凝集
反応によって検出する方法である０本法は簡便で安定な
方法であるが、感度が低く、また被検血清原液から８倍
希釈位まで非特異　　　□的凝集が生じてしまうためそ
れ以上の希釈を必要とするという欠点を有する。　　　
　−ラジオイムノアッセイは、放射性同位元素を抗原又
は抗体に結合させて、対応する抗体又は抗原をガンマ−
カウンター、ベーターカウンターで測定する方法である
０本法は現在の免疫学的測定法のうち最も高感度な方法
であるが、放射性同位元素を用いるために特別な検査施
設を必要とし、また放射性同位元素の半減期が短いこと
などから費用がかかるという欠点を有する。

酵素抗体法は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ等の酵素を抗原又は抗体に結合させて、対応する抗
体又は抗原を発色基質を用いての呈色反応で検出する方
法である０本法はラジオイムノアッセイにほぼ匹敵する
感度を示すが、反応条件が厳格で、比色計等の機器を必
要とし、また試薬の費用がラジオイムノアッセイ程では
ないが高価であるという欠点を有する。

［発明の目的］ 従来法の欠点を克服し、簡便性、高感度、安定性、低費
用等の諸条件を満たす特異的結合分析法を提供すること
を目的とする。

［発明の構成］ 本発明の特異的結合分析法は、液性・媒体中のリガンド
を測定するための特異的結合分析法であって、該リガン
ドの特異的結合の対応体を結合させたＵ型又はＶｆｉの
マイクロプレ−トに該液性媒体を所定時間接触させた後
、洗浄し、次いで該マイクロプレートに、該リガンド又
はその特異的結合の類縁体を結合させた担体粒子を所定
時間接触させた後、該マイクロプレートの底部の凝集像
を観察することを特徴とするものである。

本発明において、分析対象となるリガンドとしては、α
−フェトプロティン、　ＨＢｇ抗原、　ＨＢｅ抗原など
の抗原：抗体、薬物、毒物、細菌、ウィルス、癌のマー
カー；エリスロボエチンなどのホルモン：リセプター等
が挙げられる。

本発明に用いるマイクロプレートとしては、Ｕ型又はＶ
型のものであれば如何なるものでもよいが、通常はプラ
スチックを主成分とするもの、例えばポリスチレン、ポ
リ塩化ビニル、ポリアクリレートからなるものを用いる
。かかるマイクロプレートとしては、　ＮＳＣプレート
（バイオチック社製）、へ）レイ８８Ｕ（テルモ社製）
、イムノアッセイプレート（大日本製薬■製）等が市販
されている。

前記マイクロプレートに結合させる。前記リガンドの特
異的結合の対応体とは、該リガンドと特異的に結合する
ものであれば如何なるものでもよく、例えば、リガンド
が、抗原又はハプテンである場合は対応する抗体を、抗
体である場合は対応する抗原又はイディオタイプ抗体を
いう、該対応体が抗体である場合には、モノクローナル
抗体を用いてもよい。

マイクロプレートと対応体との結合は、例えば次のよう
にして行うことができる。即ち、対応体が蛋白質の場合
は、通常、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（以下ｆＰＢ
ｓＪという）、ホウ酸緩衝液等、好ましくは０．１５Ｍ
ホウ酸緩衝液（ｐ）１８．４）を用いて、対応体を約Ｉ
　ＩＬｇ／ａＪの濃度で２５ＩＬｌずつ各穴に滴下し、
−晩４℃で静置することにより行うことができる。また
、対応体が蛋白質以外の場合は、とトアルブミン、ウシ
アルブミン等を該対応体と混合して結合させ、これを各
穴に滴下し、−晩４℃で静置することにより行うことが
できる。

本発明において、リガンドの特異的結合の類縁体とは、
リガンドの特異的結合の対応体の結合親和力に関して実
質的に同一の挙動を示す物質をいう、該類縁体も、担体
粒子に結合させるものとして、リガンドと同様に用いる
ことができる。

本発明に用いる担体粒子としては、ヒト又は動物の血球
、細菌、ラテックス、ゼラチン、リボゾーム等が挙げら
れる。該担体粒子とリガンド又はその特異的結合の類縁
体との結合は、常法に従って行うことができる０例えば
、赤血球と抗体との結合は、カップリング剤としてタン
ニン酸、グルタルアルデヒド、塩化クロム等を用いるこ
とにより行うことができる。担体粒子にリガンドを結合
させたものは、種々市販されており、これらの市販品を
用いてもよい。

前記対応体を結合させたマイクロプレートと液性媒体と
の接触時間は、通常３０分〜２時間である。

該接触後、洗浄処理を行うが、ここで用いる洗浄液とし
ては、水道水、脱イオン水、蒸留水を用いてもよいが、
特にトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　ヲ含有するＰＢＳ
を用いることが好ましい。

次いで、リガンド又はその特異的結合の類縁体を結合さ
せた担体粒子を接触させるが、ここでの接触時間は１通
常２〜４時間である。

以上のようにして処理したマイクロプレートの底部の凝
集像を観察すると、マイクロプレートの底部がＵ型又は
Ｖ型に傾斜しているので１反応陰性の場合には担体粒子
が重力に従って底部の中心に落下しボタン状の凝集像を
呈し、一方１反応陽性の場合には担体粒子が底部まで落
下しないで斜面に付着し拡散した凝集像を呈する。従っ
°て、該凝集像を観察することにより、反応の陽性・陰
性を肉眼で判定することができる。

［発明の効果１ 本発明の特異的結合分析法は、簡便性、安定性、低費用
の諸条件を満たし、かつ、ラジオイムノアッセイにほぼ
匹敵する感度を有する。

［発明の実施例］ 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は１本発明の範囲を何ら制限するものでは
ない。

実施例１　α−フェトプロティンの測定家兎由来の抗α
−フェトプロティン精製抗体を生理食塩水に溶解してマ
イクロプレートＵ型（ベトレイ８６Ｕ（テルモ社製））
の各穴に　ｌＩＬｇ／−の濃度で２５ル交ずつ滴下し、
４℃で一晩静置した。

トウィーン２０を０．０５％含有するＰＢＳ（以下「ト
ウイーン２Ｏ−ＰＢＳＪ　という）でプレートを洗浄後
、トゥイーン２Ｏ−ＰＢＳを各穴に２５経文ずつ加えた
０次いで、被検血清をＰＢＳで希釈して、各穴に２５終
交ずつ滴下し、室温で１時間感作した。プレートをトゥ
イーン２Ｏ−ＰＢＳで５回洗浄後、抗α−フェトプロテ
ィン家兎特異抗体結合ヒツジ赤血球（三共■製）を０．
１％の濃度で各穴に２５ＩＬｌずつ加え、室温で約３時
間静置した後、管底像を判定した。比較対照として、酵
素抗体法（三井製薬■製酵素抗体法キット使用）を行っ
た。α−フェトプロティン量は、標準試料との比較によ
り換算した。結果を表１に示す０表１において、α−フ
ェトプロティン量の単位はｒ１８／−である。

表１から１本発明方法は、酵素抗体法と同程度の感度及
び再現性を有することがわかる。

実施例２　　８Ｂｓ抗原の測定 モルモット由来の抗ＨＢｓ精製抗体を生理食塩水に溶解
してマイクロプレートＵ型（ベトレイ９Ｂυ（テルモ社
製））の各穴に　１　ｇ　ｇ／ｊの濃度で２５ＩＬｉず
つ滴下し、４℃で一晩静置した。トゥイーン２Ｏ−ＰＢ
Ｓでプレートを洗浄後、トウィーン２Ｏ−ＰＢＳを各穴
に２５ル見ずつ加えた６次いで、被検血清をＰＢＳで希
釈して、各穴に２５終文ずつ滴下し、室温で１時間感作
した。プレートをトゥイーン２Ｏ−ＰＢｓで５回洗浄後
、抗ＨＢｓ家兎特異抗体結合ヒツジ赤血球（山之内製薬
■製）を０．１％の濃度で各穴に、２５ＩＬＩＬずつ加
え、室温で約３時間静置した後、管底像を判定した。比
較対照として、ラジオイムノアッセイ　（グイナボット
社製ラジオイムノアッセイキット使用）を行った。ラジ
オイムノアッセイの判定基準は、カットφオフ値（正常
人血清５木の平均値Ｘ２．１）の２倍以上を陽性とした
。結果を表２に示す。

表２から、本発明方法はラジオイムノアッセイと同程度
の感度及び再現性を有することがわかる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 液性媒体中のリガンドを測定するための特異的結合分析
   法であって、該リガンドの特異的結合の対応体を結合さ
   せたＵ型又はＶ型のマイクロプレートに該液性媒体を所
   定時間接触させた後、洗浄し、次いで該マイクロプレー
   トに、該リガンド又はその特異的結合の類縁体を結合さ
   せた担体粒子を所定時間接触させた後、該マイクロプレ
   ートの底部の凝集像を観察することを特徴とする特異的
   結合分析法。