JPH06104065B2 - 酵母菌における異質遺伝子の発現のプロモ−タ−類、それらからなるプラスミド類、およびポリペプチド類の生産 - Google Patents
酵母菌における異質遺伝子の発現のプロモ−タ−類、それらからなるプラスミド類、およびポリペプチド類の生産Info
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- JPH06104065B2 JPH06104065B2 JP60273531A JP27353185A JPH06104065B2 JP H06104065 B2 JPH06104065 B2 JP H06104065B2 JP 60273531 A JP60273531 A JP 60273531A JP 27353185 A JP27353185 A JP 27353185A JP H06104065 B2 JPH06104065 B2 JP H06104065B2
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- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
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- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に異種のポリペプチドの遺伝情報を指定
する遺伝子の酵母菌中の発現（expression）を保証する
ことのできるプロモーターからなる酵母菌DNAの断片に
関する。また、本発明は、前記断片からなるベクターの
プラスミドおよび前記プラスミドにより形質転換された
酵母菌に関する。
する遺伝子の酵母菌中の発現（expression）を保証する
ことのできるプロモーターからなる酵母菌DNAの断片に
関する。また、本発明は、前記断片からなるベクターの
プラスミドおよび前記プラスミドにより形質転換された
酵母菌に関する。
新しい遺伝子工学技術は、異質蛋白質の遺伝情報を指定
する遺伝子の種々の有機体中の発現を可能とする。この
１つの例は、酵母菌サッカロミセス・セレビシアエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）によるヒトインターフェロ
ン類の合成である［R.A.ヒッツマン（Hitzman）ら，サ
イエンス（Science），219,1983,620］。
する遺伝子の種々の有機体中の発現を可能とする。この
１つの例は、酵母菌サッカロミセス・セレビシアエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）によるヒトインターフェロ
ン類の合成である［R.A.ヒッツマン（Hitzman）ら，サ
イエンス（Science），219,1983,620］。
酵母菌中の遺伝子の発現の先要条件は、酵母菌プロモー
ターのその上流の位置であり、その位置は酵母菌RNAポ
リメラーゼIIIにより認識され、そして対応するRNAメッ
センジャーの合成を起こす。いくつかのこのような酵母
菌プロモーターはすでに記載されている。しかしなが
ら、多くの場合において、得られる発現のレベルは、こ
とに前記プロモーターが異質遺伝子の発現に使用される
とき、工業的用途のためには低くかつ実際的ではない
［T.アトキンソン（Atkinson）ら，バイオケミカル・ソ
サイアティ・トランサクションズ（Biochemical Societ
y Transactions）12,1984,215］。
ターのその上流の位置であり、その位置は酵母菌RNAポ
リメラーゼIIIにより認識され、そして対応するRNAメッ
センジャーの合成を起こす。いくつかのこのような酵母
菌プロモーターはすでに記載されている。しかしなが
ら、多くの場合において、得られる発現のレベルは、こ
とに前記プロモーターが異質遺伝子の発現に使用される
とき、工業的用途のためには低くかつ実際的ではない
［T.アトキンソン（Atkinson）ら，バイオケミカル・ソ
サイアティ・トランサクションズ（Biochemical Societ
y Transactions）12,1984,215］。
したがって、プロモーターを実際的目的に使用できるよ
うな方法で、酵母菌を遺伝子操作するためにプロモータ
ーを効率よく配置されることが必須である。
うな方法で、酵母菌を遺伝子操作するためにプロモータ
ーを効率よく配置されることが必須である。
本発明の目的は、このようなプロモーターを提供するこ
とである。他の目的は、前記プロモーターを異種遺伝子
と融合させて前記遺伝子の対応するポリペプチドへの発
現を酵母菌中において保証するベクターのプラスミドを
提供することである。前記プラスミドにより形質転換さ
れた酵母菌は、前記酵母菌により新規なポリペプチドが
生産されるので、本発明の他の目的である。なお他の目
的は、前記形質転換された酵母菌を生長させることによ
りポリペプチドを生産する方法を提供することである。
とである。他の目的は、前記プロモーターを異種遺伝子
と融合させて前記遺伝子の対応するポリペプチドへの発
現を酵母菌中において保証するベクターのプラスミドを
提供することである。前記プラスミドにより形質転換さ
れた酵母菌は、前記酵母菌により新規なポリペプチドが
生産されるので、本発明の他の目的である。なお他の目
的は、前記形質転換された酵母菌を生長させることによ
りポリペプチドを生産する方法を提供することである。
これらの種々の目的は、基本（base）プロモーターとし
て次のヌクレオチド配列： を有する酵母菌DNAの断片、ならびにプロモーター機能
を保持したそれらの突然変異体類および下位断片類を使
用することによって達成される。
て次のヌクレオチド配列： を有する酵母菌DNAの断片、ならびにプロモーター機能
を保持したそれらの突然変異体類および下位断片類を使
用することによって達成される。
基本プロモーターを単離するために使用する方法の原理 本発明の基本プロモーター、以後p415と呼ぶ、の単離に
おいて既知の方法を使用した。それはE.coliのβ−ガラ
クトシダーゼの遺伝情報を指定する遺伝子lacＺが、あ
る条件下で、酵母菌サッカロミセス・セレビシアエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）（以後S.cerevisiaeと呼
ぶ）中で発現されうること、および発色指示体Ｘ−ガル
上で生長させるとき、この発現を酵母菌のコロニーの青
色により監視することができるという観察に頼った［L.
グアランテ（Guarante），メソッズ・イン・エンジモロ
ジー（Meth.Enzymol.）101,1983,181;M.J.カサダバン
（Casadaban）ら,ibid.100,183,293］。この青色は指示
体のβ−ガラクトシダーゼによる加水分解的切離しのた
めであり、そしてこの切離し速度は合成されるβ−ガラ
クトシダーゼの量に依存する。
おいて既知の方法を使用した。それはE.coliのβ−ガラ
クトシダーゼの遺伝情報を指定する遺伝子lacＺが、あ
る条件下で、酵母菌サッカロミセス・セレビシアエ（Sa
ccharomyces cerevisiae）（以後S.cerevisiaeと呼
ぶ）中で発現されうること、および発色指示体Ｘ−ガル
上で生長させるとき、この発現を酵母菌のコロニーの青
色により監視することができるという観察に頼った［L.
グアランテ（Guarante），メソッズ・イン・エンジモロ
ジー（Meth.Enzymol.）101,1983,181;M.J.カサダバン
（Casadaban）ら,ibid.100,183,293］。この青色は指示
体のβ−ガラクトシダーゼによる加水分解的切離しのた
めであり、そしてこの切離し速度は合成されるβ−ガラ
クトシダーゼの量に依存する。
したがって、コロニーの青色はβ−ガラクトシダーゼの
発現の効率に依存し、この効率は、なかでも、使用する
酵母菌プロモーターの力に依存する。こうして、酵母菌
プロモーターの選択のうちで、最強なものは青色をいっ
そう急速に与えることができ、そしてこれはβ−ガラク
トシダーゼの酵素アッセイにより定量的に確かめること
ができる。
発現の効率に依存し、この効率は、なかでも、使用する
酵母菌プロモーターの力に依存する。こうして、酵母菌
プロモーターの選択のうちで、最強なものは青色をいっ
そう急速に与えることができ、そしてこれはβ−ガラク
トシダーゼの酵素アッセイにより定量的に確かめること
ができる。
酵母菌プロモーターを単離するためのプローブの構成 上の方法に従う酵母菌プロモーターの単離のために先要
条件は、酵母菌中において複製しかつ選択することがで
きるベクターであり、このベクターはE.coliのlacＺ遺
伝子を含有するが、適当なプロモーターの不存在のため
に酵母菌中でこれを発現しない。前記ベクターはさらに
次の条件を満足しなくてはならない。それは酵母菌の複
製機構により認識される配列により酵母菌中で複製する
ことができるべきである。それは標識遺伝子の存在のた
めに酵母菌中で選択および維持を行うことができるべき
である。それは、適当なプロモーターが与えられたと
き、酵母菌中でlacＺ遺伝子を潜在的に発現することが
できるべきである。それは、プロモーターを含むと思わ
れる酵母菌DNAの小さい断片の挿入のために、この遺伝
子より上流に独特の制限部位を含むべきである。
条件は、酵母菌中において複製しかつ選択することがで
きるベクターであり、このベクターはE.coliのlacＺ遺
伝子を含有するが、適当なプロモーターの不存在のため
に酵母菌中でこれを発現しない。前記ベクターはさらに
次の条件を満足しなくてはならない。それは酵母菌の複
製機構により認識される配列により酵母菌中で複製する
ことができるべきである。それは標識遺伝子の存在のた
めに酵母菌中で選択および維持を行うことができるべき
である。それは、適当なプロモーターが与えられたと
き、酵母菌中でlacＺ遺伝子を潜在的に発現することが
できるべきである。それは、プロモーターを含むと思わ
れる酵母菌DNAの小さい断片の挿入のために、この遺伝
子より上流に独特の制限部位を含むべきである。
このようなベクターの構成は第１図に概説されている。
２つの既知のプラスミド、pJDB207［J.D.ベッグス（Beg
gs）ら，ネイチャー（Nature）283,1980,835］およびpL
G400［L.グアレンテ（Guarente）ら，細胞（Cell）20,1
980,543］を古典的技術に従い結合した。この結合によ
りプラスミドYEpZ36が得られ、これはpJDB207からの２
−ミクロンの内因性プラスミドの複製源のおかげでS.ce
revisiae中で複製することができる。また、それはLEU
２標識遺伝子を指示し、この遺伝子はleu２−突然変異
体を有する酵母菌中で選択および維持を行うことができ
る。それは独特BamHI部位を有し、ここにMboＩ制限酵素
により発生される小さい断片を挿入できる。
２つの既知のプラスミド、pJDB207［J.D.ベッグス（Beg
gs）ら，ネイチャー（Nature）283,1980,835］およびpL
G400［L.グアレンテ（Guarente）ら，細胞（Cell）20,1
980,543］を古典的技術に従い結合した。この結合によ
りプラスミドYEpZ36が得られ、これはpJDB207からの２
−ミクロンの内因性プラスミドの複製源のおかげでS.ce
revisiae中で複製することができる。また、それはLEU
２標識遺伝子を指示し、この遺伝子はleu２−突然変異
体を有する酵母菌中で選択および維持を行うことができ
る。それは独特BamHI部位を有し、ここにMboＩ制限酵素
により発生される小さい断片を挿入できる。
プロモーターp415からなるプラスミドYEpZ415の構成 前述のプローブを使用する本発明のプロモーターの単離
を、次のようにして実施した。S.cerevisiae KL14−4Aの全体のDNAのMboＩ制限酵素で部
分的に消化して得られたDNA断片［G.フェイジ（Fage）
ら，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol.）99,1975,203］を前述のプラスミドYEpZ
36のBamHI部位に挿入し、そしてこのようにして得られ
た組み換えDNAを使用してS.cerevisiaeGRF18のleu2-菌
株を形質転換した。形質転換された酵母菌のコロニーを
Ｘ−ガル培地上でβ−ガラクトシダーゼの生産について
スクリーニングした。いくつかのコロニーはＸ−ガル培
地へ移したとき陽性に見え、そしてβ−ガラクトシダー
ゼのアッセイにより決定して最も活性なものを本発明の
プロモーターの単離のために選択した。E.coli へ移した後単離したこのクローンからのプラスミ
ドDNAは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の前にEcoRI630b
pを含有する980bpのMboＩインサートを示した。β−ガ
ラクトシダーゼの転写を保証するプロモーターは、EcoR
I部位に先行する350bpの置換がβ−ガラクトシダーゼ活
性に影響を及ぼさないので、この630bpの断片に関連す
る（associate）することが発見された。350bpの断片が
欠失（delete）する構成方法は第２図に詳細に示されて
おり、ここで初期の980bpの断片はp414と呼ぶ。E.coli
のlacＺ遺伝子で開始する630bpの断片のDNA配列は、A.
M.マクサム（Maxam）およびW.ギルバート（Gilbert）の
方法［プロシーディングス・オブ・アカデミック・サイ
エンシズ（Proc.Acad.S ci.）U.S.A.74,1977,560;メソ
ッズ・イン・エンジモロジー（Methods Enzymol.）65,1
980,499］に従い決定し、そして第３図に示す。２つの
転写開始コドン（ATG）は正しいリーディングフレーム
中の位置558および732に存在する。しかしながら、サブ
クローニングの結果は、ATGに近接する（位置732）lac
Ｚのみが活性であることを示した。このATGは酵母菌遺
伝子の開始コドンではなく、pLG400ベクターの構成にお
いて使用したE.colilacＩ遺伝子の部分であることを注
意することは興味があることである［M.ザベアウ（Zabe
au）およびK.K.スタンレイ（Stanley），ユーロピアン
・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼイション・
ジャーナル（EMBO J.），1,1982,1217;およびA.J.ブレ
イク（Brake）ら,PNAS,75,1978,4824］。完結を目的と
して、部位EcoRIと部位PvuIIとの間において構成され、
そして後者のATGからなるこの断片を以後p415プロモー
ターと呼ぶ。
を、次のようにして実施した。S.cerevisiae KL14−4Aの全体のDNAのMboＩ制限酵素で部
分的に消化して得られたDNA断片［G.フェイジ（Fage）
ら，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol.）99,1975,203］を前述のプラスミドYEpZ
36のBamHI部位に挿入し、そしてこのようにして得られ
た組み換えDNAを使用してS.cerevisiaeGRF18のleu2-菌
株を形質転換した。形質転換された酵母菌のコロニーを
Ｘ−ガル培地上でβ−ガラクトシダーゼの生産について
スクリーニングした。いくつかのコロニーはＸ−ガル培
地へ移したとき陽性に見え、そしてβ−ガラクトシダー
ゼのアッセイにより決定して最も活性なものを本発明の
プロモーターの単離のために選択した。E.coli へ移した後単離したこのクローンからのプラスミ
ドDNAは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の前にEcoRI630b
pを含有する980bpのMboＩインサートを示した。β−ガ
ラクトシダーゼの転写を保証するプロモーターは、EcoR
I部位に先行する350bpの置換がβ−ガラクトシダーゼ活
性に影響を及ぼさないので、この630bpの断片に関連す
る（associate）することが発見された。350bpの断片が
欠失（delete）する構成方法は第２図に詳細に示されて
おり、ここで初期の980bpの断片はp414と呼ぶ。E.coli
のlacＺ遺伝子で開始する630bpの断片のDNA配列は、A.
M.マクサム（Maxam）およびW.ギルバート（Gilbert）の
方法［プロシーディングス・オブ・アカデミック・サイ
エンシズ（Proc.Acad.S ci.）U.S.A.74,1977,560;メソ
ッズ・イン・エンジモロジー（Methods Enzymol.）65,1
980,499］に従い決定し、そして第３図に示す。２つの
転写開始コドン（ATG）は正しいリーディングフレーム
中の位置558および732に存在する。しかしながら、サブ
クローニングの結果は、ATGに近接する（位置732）lac
Ｚのみが活性であることを示した。このATGは酵母菌遺
伝子の開始コドンではなく、pLG400ベクターの構成にお
いて使用したE.colilacＩ遺伝子の部分であることを注
意することは興味があることである［M.ザベアウ（Zabe
au）およびK.K.スタンレイ（Stanley），ユーロピアン
・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼイション・
ジャーナル（EMBO J.），1,1982,1217;およびA.J.ブレ
イク（Brake）ら,PNAS,75,1978,4824］。完結を目的と
して、部位EcoRIと部位PvuIIとの間において構成され、
そして後者のATGからなるこの断片を以後p415プロモー
ターと呼ぶ。
プロモーターp415を使用容易とするその配置 上のように単離したp415プロモーターの取扱いの容易さ
を改良するために、両端を一般の使用において独特の制
限部位でフランキング（flanking）する。このようにし
て、それは意図する用途に従い１つのプラスミドから他
のプラスミドに動くことができ、そしてプロモーターか
ら下流の発現用異質遺伝子の挿入は促進される。
を改良するために、両端を一般の使用において独特の制
限部位でフランキング（flanking）する。このようにし
て、それは意図する用途に従い１つのプラスミドから他
のプラスミドに動くことができ、そしてプロモーターか
ら下流の発現用異質遺伝子の挿入は促進される。
次の実施例により、プラスミドYEpZ101を与える構成に
ついて詳述する。ここで本発明のプロモーターはHindII
I断片に対して上流でかつBamHI断片に対して下流におい
て関連し、この後者は、また実施例に記載するように、
異質遺伝子の導入のために使用することができる。しか
しながら、p415プロモーターが他の制限部位、例えば、
EcoRI、ClaＩ、HindIII、SphＩ、SacＩ、PstＩ、Xba
Ｉ、XhoＩがフランキグする他の構成も明らかに考えら
れるであろう。このようにして得られるこのプロモータ
ーの変異種も本発明の範囲内に含まれる。
ついて詳述する。ここで本発明のプロモーターはHindII
I断片に対して上流でかつBamHI断片に対して下流におい
て関連し、この後者は、また実施例に記載するように、
異質遺伝子の導入のために使用することができる。しか
しながら、p415プロモーターが他の制限部位、例えば、
EcoRI、ClaＩ、HindIII、SphＩ、SacＩ、PstＩ、Xba
Ｉ、XhoＩがフランキグする他の構成も明らかに考えら
れるであろう。このようにして得られるこのプロモータ
ーの変異種も本発明の範囲内に含まれる。
プロモーターp415の欠失変異種 種々の欠失により得られるプロモーターp415の他の変異
種は、また、興味ある実際的利点をもたらす。実際的事
柄として、プロモーターp415はそれぞれプラスミドYEpZ
101中に含まれるときある遺伝子、例えば、ATG開始コド
ンを欠失するpMC1587およびYEpZ100lacＺ遺伝子（第４
図）の発現のために有利である。なぜなら、これはBamH
I部位のすぐ上流にプロモーター自体により提供される
からである。しかしながら、すでにそれ自信の開始コド
ンをもつ遺伝子の場合において、プラスミドYEpZ101の
プロモーターp415をそのまま使用することはできない。
真核生物において、メッセンジャーRNAの第1ATGコドン
を含む酵母菌が通常使用されることは事実知られてい
る。こうして、導入される第2ATGコドンは、それがプロ
モーターのATGコドンとともに相内にあるいは相外に存
在するかどうかに従い、２つの効果の１つを有するであ
ろう。後者の場合において、遺伝子により解読されるも
のと完全に異るポリペプチドが生産されるであろう。前
者の場合において、第１および第２のATGの間のコドン
に相当するアミノ酸がアミノ末端においてポリペプチド
へ付加されるであろう。こうして、遺伝子により通常解
読されるものと異るポリペプチドは、多分不活性である
が、得られるであろう；これは天然の生産物のできるだ
け近い代替物が大部分の遺伝子工学の用途において探究
されているので不都合であろう。この場合は、それがま
た、実施例におけるように、形質転換された酵母菌細胞
の外側の輸送を保証するために、天然生産物の信号配列
を使用しようとするとき、ことに不都合である。
種は、また、興味ある実際的利点をもたらす。実際的事
柄として、プロモーターp415はそれぞれプラスミドYEpZ
101中に含まれるときある遺伝子、例えば、ATG開始コド
ンを欠失するpMC1587およびYEpZ100lacＺ遺伝子（第４
図）の発現のために有利である。なぜなら、これはBamH
I部位のすぐ上流にプロモーター自体により提供される
からである。しかしながら、すでにそれ自信の開始コド
ンをもつ遺伝子の場合において、プラスミドYEpZ101の
プロモーターp415をそのまま使用することはできない。
真核生物において、メッセンジャーRNAの第1ATGコドン
を含む酵母菌が通常使用されることは事実知られてい
る。こうして、導入される第2ATGコドンは、それがプロ
モーターのATGコドンとともに相内にあるいは相外に存
在するかどうかに従い、２つの効果の１つを有するであ
ろう。後者の場合において、遺伝子により解読されるも
のと完全に異るポリペプチドが生産されるであろう。前
者の場合において、第１および第２のATGの間のコドン
に相当するアミノ酸がアミノ末端においてポリペプチド
へ付加されるであろう。こうして、遺伝子により通常解
読されるものと異るポリペプチドは、多分不活性である
が、得られるであろう；これは天然の生産物のできるだ
け近い代替物が大部分の遺伝子工学の用途において探究
されているので不都合であろう。この場合は、それがま
た、実施例におけるように、形質転換された酵母菌細胞
の外側の輸送を保証するために、天然生産物の信号配列
を使用しようとするとき、ことに不都合である。
上の考察のために、ATG開始コドンを含まないが、すぐ
下流の制限部位を保持するプロモーターp415の変異種を
有することを必要とした。次の実施例は、部位BamHIか
ら出発して、YEpZ101からのこのような欠失を記載す
る。HindIII末端:p415Δ２、p415Δ４およびp415Δ５か
ら種々の距離においてBamHIを含むプロモーターp415の
いくつかの変異種を得た。これらの変異種におけるBamH
I末端およびHindIII末端は、ちょうどもとのp415プロモ
ーターの場合におけるように、他の制限部位で置換でき
ることは明らかである。
下流の制限部位を保持するプロモーターp415の変異種を
有することを必要とした。次の実施例は、部位BamHIか
ら出発して、YEpZ101からのこのような欠失を記載す
る。HindIII末端:p415Δ２、p415Δ４およびp415Δ５か
ら種々の距離においてBamHIを含むプロモーターp415の
いくつかの変異種を得た。これらの変異種におけるBamH
I末端およびHindIII末端は、ちょうどもとのp415プロモ
ーターの場合におけるように、他の制限部位で置換でき
ることは明らかである。
変異種の１つのp415Δ４は、酵母菌中のニワトリリソチ
ームの遺伝子の発現にとくにすぐれていることが明らか
となった。この結果は、酵母菌中の翻訳および転写の現
在の知識を考慮すると、それ自体驚くべきことであり、
同一の技術により、あるいは生体外または生体内の他の
方法により得られたプロモーターp415の他の変法が本願
に記載する結果に関して改良しうるであろうことを立証
する。このようにして得られる異る変異種は、また、本
発明において構成されるものとして考えられることが明
らかである。
ームの遺伝子の発現にとくにすぐれていることが明らか
となった。この結果は、酵母菌中の翻訳および転写の現
在の知識を考慮すると、それ自体驚くべきことであり、
同一の技術により、あるいは生体外または生体内の他の
方法により得られたプロモーターp415の他の変法が本願
に記載する結果に関して改良しうるであろうことを立証
する。このようにして得られる異る変異種は、また、本
発明において構成されるものとして考えられることが明
らかである。
プロモーターp415またはその変異種からなるベクターの
プラスミドによる酵母菌の形質転換 この分野において知られているように、本発明によるプ
ロモーターは、できるだけ大きい数のコピーに複製する
ことのできるベクターのプラスミド中で発現すべき異種
遺伝子にプロモーターが正しく関連する場合にのみ、酵
母菌中で異種遺伝子を発現するために使用することがで
きる。それゆえ、このベクターは宿主細胞により認識さ
れる複製源、およびまたプロモーターにより効果的に形
質転換された細胞の可視化および選択を可能とする標識
遺伝子からなる。
プラスミドによる酵母菌の形質転換 この分野において知られているように、本発明によるプ
ロモーターは、できるだけ大きい数のコピーに複製する
ことのできるベクターのプラスミド中で発現すべき異種
遺伝子にプロモーターが正しく関連する場合にのみ、酵
母菌中で異種遺伝子を発現するために使用することがで
きる。それゆえ、このベクターは宿主細胞により認識さ
れる複製源、およびまたプロモーターにより効果的に形
質転換された細胞の可視化および選択を可能とする標識
遺伝子からなる。
これらの異る要素からなる多数の発現ベクターを、こと
にS.cerevisiae種の酵母菌の形質転換のために、構成し
た。それらは一般にこの種の大部分の菌株中に存在する
２−ミクロンのプラスミドの複製源からなるか、あるい
は染色体源の自律的ARS複製セグメントからさえなる。
にS.cerevisiae種の酵母菌の形質転換のために、構成し
た。それらは一般にこの種の大部分の菌株中に存在する
２−ミクロンのプラスミドの複製源からなるか、あるい
は染色体源の自律的ARS複製セグメントからさえなる。
必須代謝物、例えば、アミノ酸の合成に参加する酵素の
遺伝情報を指定する遺伝子は、一般に遺伝標識として使
用される。次いで、宿主細胞を、突然変異により前記代
謝物について栄養要求変異種となった酵母菌菌株におい
て使用された。この菌株を前記代謝物を含まない培地上
で生長させると、ミッシング（missing）遺伝子を有す
るプラスミドにより形質転換された細胞のみが生長する
ことができる。このような遺伝標識の典型的な例は、そ
れぞれロイシシおよびトリプトファンの生物合成に参加
する酵素の遺伝情報を指定するLEU２遺伝子またはTRP1
遺伝子である。これらの発現ベクターは、また、１つあ
るいは好ましくはいくつかの制限部位を含むべきであ
り、前記部位において問題の解読部分とそれらの発現を
最適化するために必要な種々の要素：プロモーター、タ
ーミネイター（terminator）および他の制御要素を挿入
する。
遺伝情報を指定する遺伝子は、一般に遺伝標識として使
用される。次いで、宿主細胞を、突然変異により前記代
謝物について栄養要求変異種となった酵母菌菌株におい
て使用された。この菌株を前記代謝物を含まない培地上
で生長させると、ミッシング（missing）遺伝子を有す
るプラスミドにより形質転換された細胞のみが生長する
ことができる。このような遺伝標識の典型的な例は、そ
れぞれロイシシおよびトリプトファンの生物合成に参加
する酵素の遺伝情報を指定するLEU２遺伝子またはTRP1
遺伝子である。これらの発現ベクターは、また、１つあ
るいは好ましくはいくつかの制限部位を含むべきであ
り、前記部位において問題の解読部分とそれらの発現を
最適化するために必要な種々の要素：プロモーター、タ
ーミネイター（terminator）および他の制御要素を挿入
する。
さらに、これらのプラスミドは中間のバクテリア宿主、
例えば、E.coli中の複製および選択を保証することので
きるバクテリアの配列からしばしばなる。このようなシ
ャトル（shuttle）プラスミドの古典的例として、YEp13
［J.R.ブローチ（Broach）ら，遺伝子（Gene）8,1979,1
21］、pEL1−４［M.R.チェバリエール（Cheballier）
ら，遺伝子（Gene）11］、1980,11］、et pJDB207［J.
D.ベッグス（Beggs），アルフレッド・ベンソン・シン
ポジウム（Alfred Benson Symposium）Ｎ°16,ムンクス
ガード（Munksgaard），コペンハーゲン（Copenhagen）
1981,383ページ］を引用することができる。
例えば、E.coli中の複製および選択を保証することので
きるバクテリアの配列からしばしばなる。このようなシ
ャトル（shuttle）プラスミドの古典的例として、YEp13
［J.R.ブローチ（Broach）ら，遺伝子（Gene）8,1979,1
21］、pEL1−４［M.R.チェバリエール（Cheballier）
ら，遺伝子（Gene）11］、1980,11］、et pJDB207［J.
D.ベッグス（Beggs），アルフレッド・ベンソン・シン
ポジウム（Alfred Benson Symposium）Ｎ°16,ムンクス
ガード（Munksgaard），コペンハーゲン（Copenhagen）
1981,383ページ］を引用することができる。
本発明の好ましい実施態様によれば、主として宿主細胞
がS.cerevisiae種に属するとき、使用するプラスミドは
少なくとも２−ミクロンの内因性プラスミド配列のREP
機能からなる。これらの機能は一般に、ことに宿主細胞
がその２−ミクロンのプラスミドについて前もって治療
されている場合、プラスミドによりすぐれた安定性を与
える［C.P.ホレンバーグ（Hollenberg）,Curr.Top.Micr
obiol.Immunol.）96,1982,119;R.M.ワルムスレイ（Walm
sley）ら，モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス（Mol.Gen.Genet.）1983,261］。このような
ベクターの古典的例は、プラスミドpJDB219およびpJDB2
49［J.D.ベッグス（Beggs），ネイチャー（Nature）27
5,1978,104］。この型の他のベクターは下の実施例に記
載する。
がS.cerevisiae種に属するとき、使用するプラスミドは
少なくとも２−ミクロンの内因性プラスミド配列のREP
機能からなる。これらの機能は一般に、ことに宿主細胞
がその２−ミクロンのプラスミドについて前もって治療
されている場合、プラスミドによりすぐれた安定性を与
える［C.P.ホレンバーグ（Hollenberg）,Curr.Top.Micr
obiol.Immunol.）96,1982,119;R.M.ワルムスレイ（Walm
sley）ら，モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
ティックス（Mol.Gen.Genet.）1983,261］。このような
ベクターの古典的例は、プラスミドpJDB219およびpJDB2
49［J.D.ベッグス（Beggs），ネイチャー（Nature）27
5,1978,104］。この型の他のベクターは下の実施例に記
載する。
これらの種々のプラスミドは、ベクターとして、本発明
のプロモーターの上流に適当に位置する異種遺伝子の酵
母菌中の発現を確実にするために使用することができ
る。特定の構成の実施例は本発明の例示として記載する
が、多くの他の可能性が明らかに存在し、そして複製
源、標識遺伝子および他の構造遺伝子の種々の組み合わ
せを明らかに使用して同様な結果を得ることができる。
本発明のプロモーターにより異種遺伝子を発現するため
にこうして構成することができる種々の発現ベクター
は、本発明の範囲内に入るものとして考えなくてはなら
ない。
のプロモーターの上流に適当に位置する異種遺伝子の酵
母菌中の発現を確実にするために使用することができ
る。特定の構成の実施例は本発明の例示として記載する
が、多くの他の可能性が明らかに存在し、そして複製
源、標識遺伝子および他の構造遺伝子の種々の組み合わ
せを明らかに使用して同様な結果を得ることができる。
本発明のプロモーターにより異種遺伝子を発現するため
にこうして構成することができる種々の発現ベクター
は、本発明の範囲内に入るものとして考えなくてはなら
ない。
これらの種々の場合において得られる形質転換された細
胞も本発明の一部である。酵母菌細胞を形質転換するた
めに開発された技術の大部分はほとんどS.cerevisiae種
に適用されてきたが、本発明はまた酵母菌の他の種およ
び属を前述の型の発現ベクターで形質転換することによ
り得られる細胞からなる。他の実施例として、サッカロ
ミコプシス・リポリティカ（Saccharomycopsis Iipolyt
ica）、スキゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosacchar
omyces pombe）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyve
romyces lactis）などを引用することができる。しかし
ながら、本発明の好ましい実施態様によれば、サッカロ
ミセス（Saccharomyces）属から、好ましくはS.cerevis
iae種からの形質転換可能な宿主細胞が使用されるであ
ろう。この種からの形質転換可能な例として、なかでも
AH22およびGRF18を引用することができる。
胞も本発明の一部である。酵母菌細胞を形質転換するた
めに開発された技術の大部分はほとんどS.cerevisiae種
に適用されてきたが、本発明はまた酵母菌の他の種およ
び属を前述の型の発現ベクターで形質転換することによ
り得られる細胞からなる。他の実施例として、サッカロ
ミコプシス・リポリティカ（Saccharomycopsis Iipolyt
ica）、スキゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosacchar
omyces pombe）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyve
romyces lactis）などを引用することができる。しかし
ながら、本発明の好ましい実施態様によれば、サッカロ
ミセス（Saccharomyces）属から、好ましくはS.cerevis
iae種からの形質転換可能な宿主細胞が使用されるであ
ろう。この種からの形質転換可能な例として、なかでも
AH22およびGRF18を引用することができる。
形質転換された酵母菌によるポリペプチドの生産 本発明に従い発現可能なDNA断片は種々の源を有するこ
とができる。それらは、以後の実施例の１つにおいてそ
の発現を記載するE.coliβ−ガラクトシダーゼのよう
に、原核生物の遺伝子であることができる。DNA断片
は、また、酵母菌が断片化遺伝子の転写からメッセンジ
ャーRNAの突然変異を保証することができないので、そ
れがイントロンを含まないかぎり、真核生物であること
ができる。［J.C.ベッグス（Beggs）ら，ネイチャー（N
ature）283,1980,835］。しかしながら、この場合にお
いて、酵母菌中で発現されるニワトリリソチームを示す
他の実施例において後述するように、対応するcDNAを発
現することが可能である。多くの他の遺伝子は、それら
がバクテリア、植物、動物またはヒトの起源であるかに
かかわらず、同様に発現可能である。こうして発現され
るであろう新規なポリペプチドは、また、明らかに本発
明に範囲内に入る。
とができる。それらは、以後の実施例の１つにおいてそ
の発現を記載するE.coliβ−ガラクトシダーゼのよう
に、原核生物の遺伝子であることができる。DNA断片
は、また、酵母菌が断片化遺伝子の転写からメッセンジ
ャーRNAの突然変異を保証することができないので、そ
れがイントロンを含まないかぎり、真核生物であること
ができる。［J.C.ベッグス（Beggs）ら，ネイチャー（N
ature）283,1980,835］。しかしながら、この場合にお
いて、酵母菌中で発現されるニワトリリソチームを示す
他の実施例において後述するように、対応するcDNAを発
現することが可能である。多くの他の遺伝子は、それら
がバクテリア、植物、動物またはヒトの起源であるかに
かかわらず、同様に発現可能である。こうして発現され
るであろう新規なポリペプチドは、また、明らかに本発
明に範囲内に入る。
本発明に従いこれらのポリペプチドの１つまたは他のも
のを生産するように酵母菌菌株を誘導したとき、その生
長に最も好適な条件下にそれを増殖させることが必要で
ある。当業者は、宿主として使用する酵母菌菌株に特有
の特性に従いこれらの条件を容易に決定するであろう。
形質転換された酵母菌はほとんどの場合において人口的
に構成されたプラスミドを失う重要な傾向を多少有する
ので、それらの正の選択圧力（positive selection pre
ssure）を及ぼすような培地を使用することが有利であ
る。菌株が１つまたは他の必須代謝物に対して栄養要求
突然変異体であるとき、そして使用するベクターのプラ
スミドが菌株のプロトトロピーを回復することのできる
標識遺伝子、例えば、前述のLEU２またはTRP1遺伝子で
あるとき、この選択圧力は前記培地から前記代謝物を省
略することによって及ぼすことができる。これと反対
に、プラスミドが酵母菌に生長阻害剤、例えば、G418の
ような抗生物質［J.ジメネズ（Jimenez）およびJ.ダビ
エス（Davies），ネイチャー（Nature）287,1980,869］
またはジウロン（diuron）のような除草剤（本出願人へ
のベルギー国特許899,607号）に対する多少顕著な抵抗
を付与することのできる遺伝子を標識として含む場合、
形質転換された酵母菌の好適な選択圧力を、この阻害剤
を補充した培地中でそれを生長させることによって加え
ることができる。同一の結果を与えかつ本発明を実施す
るために同様に使用することができる他の手段が存在す
る。
のを生産するように酵母菌菌株を誘導したとき、その生
長に最も好適な条件下にそれを増殖させることが必要で
ある。当業者は、宿主として使用する酵母菌菌株に特有
の特性に従いこれらの条件を容易に決定するであろう。
形質転換された酵母菌はほとんどの場合において人口的
に構成されたプラスミドを失う重要な傾向を多少有する
ので、それらの正の選択圧力（positive selection pre
ssure）を及ぼすような培地を使用することが有利であ
る。菌株が１つまたは他の必須代謝物に対して栄養要求
突然変異体であるとき、そして使用するベクターのプラ
スミドが菌株のプロトトロピーを回復することのできる
標識遺伝子、例えば、前述のLEU２またはTRP1遺伝子で
あるとき、この選択圧力は前記培地から前記代謝物を省
略することによって及ぼすことができる。これと反対
に、プラスミドが酵母菌に生長阻害剤、例えば、G418の
ような抗生物質［J.ジメネズ（Jimenez）およびJ.ダビ
エス（Davies），ネイチャー（Nature）287,1980,869］
またはジウロン（diuron）のような除草剤（本出願人へ
のベルギー国特許899,607号）に対する多少顕著な抵抗
を付与することのできる遺伝子を標識として含む場合、
形質転換された酵母菌の好適な選択圧力を、この阻害剤
を補充した培地中でそれを生長させることによって加え
ることができる。同一の結果を与えかつ本発明を実施す
るために同様に使用することができる他の手段が存在す
る。
形質転換された酵母菌が問題のポリペプチドの最良の生
産を保証する条件下で生長されたとき、このポリペプチ
ドはなお回収しなくてはならない。当業者が各場合にお
いて組み合わせて所望のポリペプチドの最良の回収率お
よび最大の純度を得ることのできる多くの技術が存在す
る。しかしながら、本発明の好ましい実施態様によれ
ば、プロモーターp415またはその変異種の１つの介在で
発現される遺伝子は、形質転換された細胞のプラスミド
膜を通す生産物を輸送を確実にすることのできる信号ペ
プチドの遺伝情報を指定する先導配列を有することが好
ましい。この場合において、形成されたポリペプチドを
古典的方法、例えば、吸着および／または沈殿、により
回収する培地中にそれが遊離されるか、あるいはそれを
他の方法で分離しなくてはならないであろう酵母菌壁へ
それが会合（association）してとどまるかにかかわら
ず、形成されたポリペプチドの分離は事実かなり容易で
あろう。
産を保証する条件下で生長されたとき、このポリペプチ
ドはなお回収しなくてはならない。当業者が各場合にお
いて組み合わせて所望のポリペプチドの最良の回収率お
よび最大の純度を得ることのできる多くの技術が存在す
る。しかしながら、本発明の好ましい実施態様によれ
ば、プロモーターp415またはその変異種の１つの介在で
発現される遺伝子は、形質転換された細胞のプラスミド
膜を通す生産物を輸送を確実にすることのできる信号ペ
プチドの遺伝情報を指定する先導配列を有することが好
ましい。この場合において、形成されたポリペプチドを
古典的方法、例えば、吸着および／または沈殿、により
回収する培地中にそれが遊離されるか、あるいはそれを
他の方法で分離しなくてはならないであろう酵母菌壁へ
それが会合（association）してとどまるかにかかわら
ず、形成されたポリペプチドの分離は事実かなり容易で
あろう。
次の実施例により、本発明の種々の面を例示する。
実施例１ 1.YEpZ415によるS.cerevisiae中のE.coliβ−ガラクト
シダーゼの発現 この構成が、前述のように、本発明のプロモーターp415
の単離に寄与する、プラスミドYEpZ415を使用して、S.c
erevisiae GRF18（leu-またはHis-）酵母菌菌株を形質
転換し、ロイシンに対してプロトトロープのクローンを
選択した。
シダーゼの発現 この構成が、前述のように、本発明のプロモーターp415
の単離に寄与する、プラスミドYEpZ415を使用して、S.c
erevisiae GRF18（leu-またはHis-）酵母菌菌株を形質
転換し、ロイシンに対してプロトトロープのクローンを
選択した。
これらのクローンの特異的β−ガラクトシダーゼ活性
を、M.クラビール（Crabeel）ら［ユーロピアン・モレ
キュラー・バイオロジー・オーガニゼイション・ジャー
ナル（EMBO J.）2,1983,205］により修正されたM.J.ミ
ラー（Miller）［分子遺伝学における実験（Experiment
s in Molecular Genetics）,1972,コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Lab
oratory），コールド・スプリング・ハーバー，ニュー
・ヨーク］の方法により細胞抽出物について測定した。
他方において、抽出物の蛋白質濃度はM.M.ブラッドフォ
ード（Bradford）の方法［アナリティカル・バイオケミ
ストリー（Anal,Biochem.）72,1976,1948］の方法によ
り決定した。特異的活性は7733β−ガラクトシダーゼ単
位であり、抽出の合計の蛋白質の2.57％に相当した。
を、M.クラビール（Crabeel）ら［ユーロピアン・モレ
キュラー・バイオロジー・オーガニゼイション・ジャー
ナル（EMBO J.）2,1983,205］により修正されたM.J.ミ
ラー（Miller）［分子遺伝学における実験（Experiment
s in Molecular Genetics）,1972,コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Lab
oratory），コールド・スプリング・ハーバー，ニュー
・ヨーク］の方法により細胞抽出物について測定した。
他方において、抽出物の蛋白質濃度はM.M.ブラッドフォ
ード（Bradford）の方法［アナリティカル・バイオケミ
ストリー（Anal,Biochem.）72,1976,1948］の方法によ
り決定した。特異的活性は7733β−ガラクトシダーゼ単
位であり、抽出の合計の蛋白質の2.57％に相当した。
２、プラスミドYEpZ101によるS,cerevisiae中のE.coli
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現 この実施例において、本発明によるプロモーターp415を
遺伝子工学において普通に使用される２つの制限部位
（HindIIIおよびBamHI）によりフランキング（flankin
g）し、そしてこの形態で使用してYEpZ101と呼ばれるプ
ラスミド中でE.coliのlacＺ遺伝子を発現させた。この
操作はいくつかの工程で実施し、２つの中間プラスミ
ド:YEpZ100およびpJ04、の構成を必要とした。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現 この実施例において、本発明によるプロモーターp415を
遺伝子工学において普通に使用される２つの制限部位
（HindIIIおよびBamHI）によりフランキング（flankin
g）し、そしてこの形態で使用してYEpZ101と呼ばれるプ
ラスミド中でE.coliのlacＺ遺伝子を発現させた。この
操作はいくつかの工程で実施し、２つの中間プラスミ
ド:YEpZ100およびpJ04、の構成を必要とした。
２、1YEpZ100（第４図）はpMC1587［M.J.カサダバン（C
asadaban）ら、メソッズ・イン・エンジモロジー（Meth
ods in Enzymology）100,1983,293］およびYEpZ415から
構成した;YEpZ415はいくつかの利点を兼備する；それは
lacＺ遺伝子の開始およびpMC1587の制限部位EcoRI、Sma
ＩおよびBamHIの群を有する；それはYEpZ415のlacＺ遺
伝子の末端を有し、これによりプラスミドの大きさを無
用に増大するpMC1587のlacＹおよびlacＺ遺伝子が排除
されている；それはさらにpJDB207から誘導されるプラ
スミド、例えば、YEpZ415［E.エアハルト（Erhart）お
よびC.P.ホレンバーグ（Hollenberg），ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）156,1983,625］
に対する大きい数のコピー特性を保持する。
asadaban）ら、メソッズ・イン・エンジモロジー（Meth
ods in Enzymology）100,1983,293］およびYEpZ415から
構成した;YEpZ415はいくつかの利点を兼備する；それは
lacＺ遺伝子の開始およびpMC1587の制限部位EcoRI、Sma
ＩおよびBamHIの群を有する；それはYEpZ415のlacＺ遺
伝子の末端を有し、これによりプラスミドの大きさを無
用に増大するpMC1587のlacＹおよびlacＺ遺伝子が排除
されている；それはさらにpJDB207から誘導されるプラ
スミド、例えば、YEpZ415［E.エアハルト（Erhart）お
よびC.P.ホレンバーグ（Hollenberg），ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）156,1983,625］
に対する大きい数のコピー特性を保持する。
２、2pJO4（第５図）はプロモーターp415のRsaＩ−PvuI
I断片（第３図）をプラスミドpMC1587のSmaＩ部位に導
入することにより構成した。この操作は３つの結果を有
する： （ｉ）部位PvuIIに対してすぐ上流のATG開始コドンが保
持される； （ii）p415のPvuII部位およびpMC1587のSmaＩ部位が破
壊される； （iii）BamHI部位はATG開始コドンのすぐ下流に導入さ
れる。この部位はしばしば異質遺伝子のクローニングに
使用されている。
I断片（第３図）をプラスミドpMC1587のSmaＩ部位に導
入することにより構成した。この操作は３つの結果を有
する： （ｉ）部位PvuIIに対してすぐ上流のATG開始コドンが保
持される； （ii）p415のPvuII部位およびpMC1587のSmaＩ部位が破
壊される； （iii）BamHI部位はATG開始コドンのすぐ下流に導入さ
れる。この部位はしばしば異質遺伝子のクローニングに
使用されている。
2.3次いで、YEpZ101は、３つの結合事象を含む方法（第
６図）により、前述のプラスミドの３つからのDNA断片
を結合することにより構成した。この構成において、la
cＺ遺伝子、ampR遺伝子、E.coli中の複製起源、LEU２遺
伝子、およびS.cerevisiae中の複製起源（２−ミクロン
のプラスミドから）のすべてはYEpZ100から誘導され
た。プロモーターp415は２つの部分から無傷に再構成さ
れる:YEpZ415のHindIII−ClaＩ断片の５′末端の半分、
およびpJO4からのClaＩ−BamHI断片からの３′隣接半
分。これらの操作の結果は、次の通りである：プロモー
ターp415はここで上流の独特HindIII部位および下流の
独特BamHI部位により境界されており、後者は後述する
ように異質遺伝子の導入使用することができる。
６図）により、前述のプラスミドの３つからのDNA断片
を結合することにより構成した。この構成において、la
cＺ遺伝子、ampR遺伝子、E.coli中の複製起源、LEU２遺
伝子、およびS.cerevisiae中の複製起源（２−ミクロン
のプラスミドから）のすべてはYEpZ100から誘導され
た。プロモーターp415は２つの部分から無傷に再構成さ
れる:YEpZ415のHindIII−ClaＩ断片の５′末端の半分、
およびpJO4からのClaＩ−BamHI断片からの３′隣接半
分。これらの操作の結果は、次の通りである：プロモー
ターp415はここで上流の独特HindIII部位および下流の
独特BamHI部位により境界されており、後者は後述する
ように異質遺伝子の導入使用することができる。
２、４ちょうど上に述べたように構成されたプラスミド
YEpZ101を使用して酵母菌を形質転換した。前の実施例
に記載するように操作することによって、プラスミドYE
pZ415により与えられるものと同一の特異的β−ガラク
トシダーゼ活性が得られた。
YEpZ101を使用して酵母菌を形質転換した。前の実施例
に記載するように操作することによって、プラスミドYE
pZ415により与えられるものと同一の特異的β−ガラク
トシダーゼ活性が得られた。
３、プラスミドplysΔ49およびplysΔ59によるS.cerevi
siae中のニワトリリソチーム遺伝子の発現 ニワトリリソチーム遺伝子を酵母菌中で発現されるため
に、ベルギー国特許901,223号に記載されているような
それ独自のATGコドンをもつニワトリリソチームの完成
された完全cDNAからなるプラスミドplysΔ９は入手可能
であった。このcDNAは、なお、前の実施例においてβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子について記載したように、酵母
菌プロモーターと適当に結合しなくてはならなかった。
しかしながら、上に与えた理由のため、前記cDNAはそれ
独自のATG開始コドンを含むので、この構成はそれ自体A
TGコドンを含むプロモーターp415からなるYEpZ101のよ
うなプラスミドを使用することは不可能であった。それ
ゆえ、このATGを含まないこのプラスミドの変異種を必
要とした。
siae中のニワトリリソチーム遺伝子の発現 ニワトリリソチーム遺伝子を酵母菌中で発現されるため
に、ベルギー国特許901,223号に記載されているような
それ独自のATGコドンをもつニワトリリソチームの完成
された完全cDNAからなるプラスミドplysΔ９は入手可能
であった。このcDNAは、なお、前の実施例においてβ−
ガラクトシダーゼ遺伝子について記載したように、酵母
菌プロモーターと適当に結合しなくてはならなかった。
しかしながら、上に与えた理由のため、前記cDNAはそれ
独自のATG開始コドンを含むので、この構成はそれ自体A
TGコドンを含むプロモーターp415からなるYEpZ101のよ
うなプラスミドを使用することは不可能であった。それ
ゆえ、このATGを含まないこのプラスミドの変異種を必
要とした。
３、1YEpZ101の部位BamHIから出発する酵素Ba131を使用
して、１連の単一方向の欠失をつくった。次いで、この
ように短縮したプラスミドを独特PstＩ部位において切
離し、そしとPstＩ部位とBa131により消化された末端と
の間の断片をプラスミドYEpZ100のPstＩ部位とSmaＩ部
位との間に挿入した（第７図）。この操作は２つの結果
を有する： （ｉ）YEpZ101のBamHIのすぐ上流のATG開始コドンは破
壊される； （ii）BamHI部位はまた破壊されるが、欠失した末端の
点をプラスミドYEpZ100中のBamHI部位に隣接するSmaＩ
部位と融合することにより回復された。
して、１連の単一方向の欠失をつくった。次いで、この
ように短縮したプラスミドを独特PstＩ部位において切
離し、そしとPstＩ部位とBa131により消化された末端と
の間の断片をプラスミドYEpZ100のPstＩ部位とSmaＩ部
位との間に挿入した（第７図）。この操作は２つの結果
を有する： （ｉ）YEpZ101のBamHIのすぐ上流のATG開始コドンは破
壊される； （ii）BamHI部位はまた破壊されるが、欠失した末端の
点をプラスミドYEpZ100中のBamHI部位に隣接するSmaＩ
部位と融合することにより回復された。
このようにして実施した欠失は、それぞれプラスミドYE
pZ101Δ２、YEpZ101Δ４およびYEpZ101Δ５により支持
されるプロモーターp415Δ２、p415Δ４およびp415Δ５
（第８図）を生じた。
pZ101Δ２、YEpZ101Δ４およびYEpZ101Δ５により支持
されるプロモーターp415Δ２、p415Δ４およびp415Δ５
（第８図）を生じた。
３、２このようにして得られたプロモーターは、なお、
適当な構成を通して、プラスミドplysΔ９により支持さ
れるニワトリcDNAと会合させなくてはならなかった。プ
ロモーターp415Δ２の場合において、この構成は５つの
次の断片を同時に結合することによりつくった： （ａ）プラスミドYEpZ101Δ２からの、プロモーターp41
5Δ２からなるHindIII−BamHI断片； （ｂ）plysΔ９からの、リソチームの完全なcDNAからな
るSphＩ−BamHI断片； （ｃ）断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として使用
すべきプラスミドpK01からのEcoRI−SphＩ断片［K.マク
ケニー（McKenny）ら，「遺伝子の増幅および分析（Gen
e amplification and analysis）」,J.G.クリリクジャ
ン（Chririkjan）およびT.パナス（Panas）編，エルセ
ビーア／ノース・ホランド（Elsevier/North Hollan
d），ニューヨーク,1981,383ページ］； （ｄ）プラスミドYEpZ415からの、複製起源およびpBR32
2のβ−ラクタマーゼ遺伝子の一方の半分からなるPstＩ
−EcoRI断片；および （ｅ）pJDB207からの、２−ミクロン−LEU２セグメント
およびβ−ラクタマゼーゼ遺伝子の他方の半分からなる
HindIII−PstＩ断片。
適当な構成を通して、プラスミドplysΔ９により支持さ
れるニワトリcDNAと会合させなくてはならなかった。プ
ロモーターp415Δ２の場合において、この構成は５つの
次の断片を同時に結合することによりつくった： （ａ）プラスミドYEpZ101Δ２からの、プロモーターp41
5Δ２からなるHindIII−BamHI断片； （ｂ）plysΔ９からの、リソチームの完全なcDNAからな
るSphＩ−BamHI断片； （ｃ）断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として使用
すべきプラスミドpK01からのEcoRI−SphＩ断片［K.マク
ケニー（McKenny）ら，「遺伝子の増幅および分析（Gen
e amplification and analysis）」,J.G.クリリクジャ
ン（Chririkjan）およびT.パナス（Panas）編，エルセ
ビーア／ノース・ホランド（Elsevier/North Hollan
d），ニューヨーク,1981,383ページ］； （ｄ）プラスミドYEpZ415からの、複製起源およびpBR32
2のβ−ラクタマーゼ遺伝子の一方の半分からなるPstＩ
−EcoRI断片；および （ｅ）pJDB207からの、２−ミクロン−LEU２セグメント
およびβ−ラクタマゼーゼ遺伝子の他方の半分からなる
HindIII−PstＩ断片。
結合の前に、これらの種々の断片を使用し、そして、そ
れらは異る末端および相補的接着末端を有するので、こ
の結合からただ１つの生存しうるプラスミドが生じた:p
lysΔ29（第９図）。
れらは異る末端および相補的接着末端を有するので、こ
の結合からただ１つの生存しうるプラスミドが生じた:p
lysΔ29（第９図）。
同一の方法においてプロモーターp415からの欠失により
誘導された２つの他の断片（p415Δ４およびp415Δ５）
を使用することにより、２つの他のプラスミドが生産さ
れた:plysΔ49およびplysΔ59。これらの３つのプラス
ミドは、こうして、次の事実によりのみ異る。プロモー
ターはリソチームcDNAから種々の距離に位置し、これは
対応するメッセンジャーRNAsの開始（５′末端）と自然
AUG翻訳開始部位との間の異る距離における転写の間に
生ずる。
誘導された２つの他の断片（p415Δ４およびp415Δ５）
を使用することにより、２つの他のプラスミドが生産さ
れた:plysΔ49およびplysΔ59。これらの３つのプラス
ミドは、こうして、次の事実によりのみ異る。プロモー
ターはリソチームcDNAから種々の距離に位置し、これは
対応するメッセンジャーRNAsの開始（５′末端）と自然
AUG翻訳開始部位との間の異る距離における転写の間に
生ずる。
３、３次いで、前述のように構成されたプラスミドを酵
母菌S.cerevisiaeのGRF18菌株（leu-、His-）に形質転
換し、次いでロイシンについてプロトトロープのクロー
ンについて選択した（leu+）。
母菌S.cerevisiaeのGRF18菌株（leu-、His-）に形質転
換し、次いでロイシンについてプロトトロープのクロー
ンについて選択した（leu+）。
次いで、これらのクローンをガラスビーズで粉砕し、そ
して得られたリゼイトを遠心により清澄にした。それら
のリゼイトの活性を、E.coli細胞の懸濁液の光学濃度の
増加をMcマッケン（Macken）らの方法［ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）49,19
70,639］の決定することにより試験した。第10図におい
て、650nmのおける光学濃度（OD65o）の初期の値はすべ
てのクローンについて同一である（0.7）が、完結を目
的として線図上でシフトさせた。第10図の結果はGRF18
（plysΔ49）について有意の活性を示し、そしてプラス
ミドplysΔ59により形質転換された細胞について多少低
い。
して得られたリゼイトを遠心により清澄にした。それら
のリゼイトの活性を、E.coli細胞の懸濁液の光学濃度の
増加をMcマッケン（Macken）らの方法［ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）49,19
70,639］の決定することにより試験した。第10図におい
て、650nmのおける光学濃度（OD65o）の初期の値はすべ
てのクローンについて同一である（0.7）が、完結を目
的として線図上でシフトさせた。第10図の結果はGRF18
（plysΔ49）について有意の活性を示し、そしてプラス
ミドplysΔ59により形質転換された細胞について多少低
い。
リソチームの作用のためのインジケーターとして使用す
る細胞かバクテリウムミクロコッカス・リソデイクチク
ス（Micrococcus lysodeikticus）の細胞である方法
［G.アルダートン（Alderton）ら，ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）157,19
45,43］を使用して同様な結果が得られた。
る細胞かバクテリウムミクロコッカス・リソデイクチク
ス（Micrococcus lysodeikticus）の細胞である方法
［G.アルダートン（Alderton）ら，ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）157,19
45,43］を使用して同様な結果が得られた。
異る型のアッセイにおいて、M.lysodeikictusの菌叢で
覆われたペトリ皿上で生長する形質転換されたコロニー
のまわりにリソチームが明示された。この場合におい
て、リソチームの発現はコロニーのまわりの溶菌の透明
なハローにより可視化された。細胞不含リゼイトを使用
する結果と一致して、溶菌のハローはplysΔ49を使用し
たとき最大であり、このことはこのクローンがリソチー
ムの最良の生産体であることを示した。この結果が、ま
た、示すように、リソチームは形質細胞から輸送され
た。なぜなら、バクテリアのインジケーターを溶解する
ためには、それは細胞外に存在することがかならず必要
であったからである。
覆われたペトリ皿上で生長する形質転換されたコロニー
のまわりにリソチームが明示された。この場合におい
て、リソチームの発現はコロニーのまわりの溶菌の透明
なハローにより可視化された。細胞不含リゼイトを使用
する結果と一致して、溶菌のハローはplysΔ49を使用し
たとき最大であり、このことはこのクローンがリソチー
ムの最良の生産体であることを示した。この結果が、ま
た、示すように、リソチームは形質細胞から輸送され
た。なぜなら、バクテリアのインジケーターを溶解する
ためには、それは細胞外に存在することがかならず必要
であったからである。
第10図がまた示すように、plysΔ29クローンを同一方法
で操作することにより、細胞の溶解を観測することがで
きなかった。したがって、プロモーターの機能に原因と
なる配列は発現すべき遺伝子の上流に存在するばかりで
なく、かつまたこの遺伝子に関して適当に位置すべきで
ある。
で操作することにより、細胞の溶解を観測することがで
きなかった。したがって、プロモーターの機能に原因と
なる配列は発現すべき遺伝子の上流に存在するばかりで
なく、かつまたこの遺伝子に関して適当に位置すべきで
ある。
４、ベクターplys50によるS.cerevisiae中のニワトリリ
ソチームの発現 ４、１リソチーム発現プラスミドplysΔ29、plysΔ49お
よびplysΔ59（前述した）が基づくベクターpJDB207
は、全体の２−ミクロンの酵母菌プラスミドを含有せ
ず、結局その連続する維持に内因性の２−ミクロンのプ
ラスミド（S.cerevisiaeのほとんどの菌株において見出
される）の存在に依存する。これはpJDB207型プラスミ
ドが細胞から頻繁に損失されるという不安定な場合に導
く［E.エアヘルト（Erhaert）およびC.P.ホエンバーグ
（Hollenberg），ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（J.Bacteriol.）156,1983,625およびM.ジャラヤム（Ja
rayam）ら，セル（Ce11）34,1983,95］。対照的に、自
然２−ミクロンのプラスミドは安定に遺伝される。プラ
スミドが全体の２−ミクロンのプラスミドpJDB219を含
有するような方法で構成されたプラスミドはpJDB207型
のものよりも安定であることは事実知られている［C.P.
ホランバーグ（Hollanberg）,Curr.Top.Microbiol.Immu
nol.）96,1982,119;R.M.ワルムスレイ（Walmsley）ら，
モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス
（Mol.Gen.Genet.）1983,361］。それゆえ、このような
プラスミドは、工業的発酵における例のように、長期間
の生長のために一層有用である。
ソチームの発現 ４、１リソチーム発現プラスミドplysΔ29、plysΔ49お
よびplysΔ59（前述した）が基づくベクターpJDB207
は、全体の２−ミクロンの酵母菌プラスミドを含有せ
ず、結局その連続する維持に内因性の２−ミクロンのプ
ラスミド（S.cerevisiaeのほとんどの菌株において見出
される）の存在に依存する。これはpJDB207型プラスミ
ドが細胞から頻繁に損失されるという不安定な場合に導
く［E.エアヘルト（Erhaert）およびC.P.ホエンバーグ
（Hollenberg），ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（J.Bacteriol.）156,1983,625およびM.ジャラヤム（Ja
rayam）ら，セル（Ce11）34,1983,95］。対照的に、自
然２−ミクロンのプラスミドは安定に遺伝される。プラ
スミドが全体の２−ミクロンのプラスミドpJDB219を含
有するような方法で構成されたプラスミドはpJDB207型
のものよりも安定であることは事実知られている［C.P.
ホランバーグ（Hollanberg）,Curr.Top.Microbiol.Immu
nol.）96,1982,119;R.M.ワルムスレイ（Walmsley）ら，
モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス
（Mol.Gen.Genet.）1983,361］。それゆえ、このような
プラスミドは、工業的発酵における例のように、長期間
の生長のために一層有用である。
このような完全な２−ミクロンのベクターを構成するた
めに、プラスミドYEpB2（第11図）を使用し、これは全
体の２−ミクロンのプラスミドをpBR322中にそれらの独
特PstＩ部位においてクローニングすることにより前も
ってつくられた。次いで、YEpB2からの２つの断片およ
びplysΔ49からの２つの断片を結合してplys50を得た
（第12図）。このプラスミドにおいて、３つの２−ミク
ロンの遺伝子Ａ、ＢおよびＣは無傷であり、そしてリソ
チーム遺伝子は前の実施例において記載したplysΔ49に
おけるようにp415Δ４プロモーターから発現される。
めに、プラスミドYEpB2（第11図）を使用し、これは全
体の２−ミクロンのプラスミドをpBR322中にそれらの独
特PstＩ部位においてクローニングすることにより前も
ってつくられた。次いで、YEpB2からの２つの断片およ
びplysΔ49からの２つの断片を結合してplys50を得た
（第12図）。このプラスミドにおいて、３つの２−ミク
ロンの遺伝子Ａ、ＢおよびＣは無傷であり、そしてリソ
チーム遺伝子は前の実施例において記載したplysΔ49に
おけるようにp415Δ４プロモーターから発現される。
４、２S.cerevisiaeのGRF18菌株（His-、leu-）をプラ
スミドplys50およびpJDB207により形質転換した後、両
者の場合に得られた形質転換された細胞をヒスチジン
（0.002％）を補充した最小培地上で別々に生長させ
た。培養物が静止相（約５の光学濃度）（細胞の乾燥重
量＝培養物の約1.5g/l）に到達したとき、細胞を培地か
ら遠心により分離し、0.1モルのpH7のリン酸塩緩衝液中
に懸濁させそしてガラスビーズで粉砕した。両者の培養
物からの上澄み液およびリゼイト中のリソチーム活性
を、D.シュガー（Shugar）の方法［バイオヒミカ・エト
・バイオフィジカ・アクタ（Biochem.Biohys.Acta），
8,1952,302］に従い、M.lysodeikticus細胞を溶解する
それらの能力により決定した。プラスミドpJDB207によ
り形質転換された菌株のホモジネート中に活性は検出さ
れず、これに対して菌株GRF18（plys50）のそれについ
て35単位/ml培養物のリソチーム活性を示すことができ
た。
スミドplys50およびpJDB207により形質転換した後、両
者の場合に得られた形質転換された細胞をヒスチジン
（0.002％）を補充した最小培地上で別々に生長させ
た。培養物が静止相（約５の光学濃度）（細胞の乾燥重
量＝培養物の約1.5g/l）に到達したとき、細胞を培地か
ら遠心により分離し、0.1モルのpH7のリン酸塩緩衝液中
に懸濁させそしてガラスビーズで粉砕した。両者の培養
物からの上澄み液およびリゼイト中のリソチーム活性
を、D.シュガー（Shugar）の方法［バイオヒミカ・エト
・バイオフィジカ・アクタ（Biochem.Biohys.Acta），
8,1952,302］に従い、M.lysodeikticus細胞を溶解する
それらの能力により決定した。プラスミドpJDB207によ
り形質転換された菌株のホモジネート中に活性は検出さ
れず、これに対して菌株GRF18（plys50）のそれについ
て35単位/ml培養物のリソチーム活性を示すことができ
た。
C.ワング（Wang）およびR.L.スミス（Smith）［アナリ
ティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）63,19
75,414］により修正されたD.ハーバート（Herbert）ら
の方法［メソッズ・イン・エンジモロジー（Meth.Enzym
ol.）5B,1971,209］に従い合計の蛋白質を決定し、商業
的に精製されたリソチームの特異的活性を考慮する［ベ
ーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）］こ
とにより、上の条件下で酵母菌中で生産されるリソチー
ムは可溶性酵母菌蛋白質の約0.8％になることが誘導さ
れた。
ティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）63,19
75,414］により修正されたD.ハーバート（Herbert）ら
の方法［メソッズ・イン・エンジモロジー（Meth.Enzym
ol.）5B,1971,209］に従い合計の蛋白質を決定し、商業
的に精製されたリソチームの特異的活性を考慮する［ベ
ーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）］こ
とにより、上の条件下で酵母菌中で生産されるリソチー
ムは可溶性酵母菌蛋白質の約0.8％になることが誘導さ
れた。
菌株GRF18（plysΔ49）およびAH22cir°（plys50）は19
84年12月５日に、セントラアル・ビュウロウ・ブーア・
シンメルカルチュアーズ（Centraal Bureau voor Schim
melcultures,Oosterstraat 1,P.P.Box 273,NL−3740 AG
Baarn）（オランダ国）に受託され、ここでそれらはそ
れぞれ受託番号CBS 7130およびCBS 7129を受けた。
84年12月５日に、セントラアル・ビュウロウ・ブーア・
シンメルカルチュアーズ（Centraal Bureau voor Schim
melcultures,Oosterstraat 1,P.P.Box 273,NL−3740 AG
Baarn）（オランダ国）に受託され、ここでそれらはそ
れぞれ受託番号CBS 7130およびCBS 7129を受けた。
第１図は、酵母菌プロモーターを単離するためのプロー
ブとして使用するプラスミドYEpZ36の構成を表わす。こ
の構成はLEU２標識遺伝子（marker gene）および２−ミ
クロンの酵母菌プラスミドの複製源を含有するプラスミ
ドpJDB207からの断片を、エシェリヒア・コリ（Escheri
chia coli）β−ガラクトシダーゼの遺伝情報を指定す
るlacＺ遺伝子を含有するプラスミドpLG400からの断片
と結合することにより得られる。 第２図は、プラスミドYEpZ36、YEpZ414およびpJDB207か
らの４つの断片を結合することにより、本発明の基本プ
ロモーター（p415）を有するプラスミドYEpZ415の構成
を表わす。 第３図は、EcoRIとMboＩとの間に位置する酵母菌配列か
らなるプロモーターp415の配列を示し、ここで他の強い
酵母菌プロモーター中に一般に見出されるいくつかの要
素:TATAのボックス、CTのブロック、密接して続くCAAGC
の配列が見える。 第４図および第５図は、それぞれ、プラスミドYEpZ100
およびpJ04の構成を表わし、これらは順次に、第６図に
示すように、HindIII−BamHI断片に関連するプロモータ
ーp415の変異種からなるプラスミドYEpZ101の構成に使
用される。 第７図は、プラスミドYEpZ100およびYEpZ101からのプラ
スミドYEpZ101Δの構成を表わし、このプラスミドYEpZ1
01ΔはBa101酵素を使用して実施した欠失により得られ
るプロモーターのいくつかの変異種からなる。このよう
にして得られる変異種（p415Δ２、p415Δ４およびp415
Δ５）は第８図に記載されている。 第９図は、ニワトリリソチームcDNAのplysΔ29、plysΔ
49およびplysΔ59の構成を表わす。この構成はプラスミ
ドYEpZ415、YEpZ101Δ、plysΔ９、pk01およびpJDB207
からの５つの精製された断片の一義の結合によりつくら
れた。 第10図は、プラスミドplysΔ49およびplysΔ59により形
質転換された酵母菌のすべての抽出物がEDTAで処理した
E.coli細胞を溶解してE.coli細胞をリソチーム作用に対
して感受性とすることができることを示す。 第11図は、プラスミドpBR322および２−ミクロンの酵母
菌内因性プラスミドヘPstＩ制限酵素を作用させること
により得られた断片の遺伝子によりプラスミドYEpB2の
構成を表わす。 第12図は、プラスミドYEpB2およびplysΔ49からの５つ
の精製断片の一義の結合による発現ベクターの構成を表
わす。
ブとして使用するプラスミドYEpZ36の構成を表わす。こ
の構成はLEU２標識遺伝子（marker gene）および２−ミ
クロンの酵母菌プラスミドの複製源を含有するプラスミ
ドpJDB207からの断片を、エシェリヒア・コリ（Escheri
chia coli）β−ガラクトシダーゼの遺伝情報を指定す
るlacＺ遺伝子を含有するプラスミドpLG400からの断片
と結合することにより得られる。 第２図は、プラスミドYEpZ36、YEpZ414およびpJDB207か
らの４つの断片を結合することにより、本発明の基本プ
ロモーター（p415）を有するプラスミドYEpZ415の構成
を表わす。 第３図は、EcoRIとMboＩとの間に位置する酵母菌配列か
らなるプロモーターp415の配列を示し、ここで他の強い
酵母菌プロモーター中に一般に見出されるいくつかの要
素:TATAのボックス、CTのブロック、密接して続くCAAGC
の配列が見える。 第４図および第５図は、それぞれ、プラスミドYEpZ100
およびpJ04の構成を表わし、これらは順次に、第６図に
示すように、HindIII−BamHI断片に関連するプロモータ
ーp415の変異種からなるプラスミドYEpZ101の構成に使
用される。 第７図は、プラスミドYEpZ100およびYEpZ101からのプラ
スミドYEpZ101Δの構成を表わし、このプラスミドYEpZ1
01ΔはBa101酵素を使用して実施した欠失により得られ
るプロモーターのいくつかの変異種からなる。このよう
にして得られる変異種（p415Δ２、p415Δ４およびp415
Δ５）は第８図に記載されている。 第９図は、ニワトリリソチームcDNAのplysΔ29、plysΔ
49およびplysΔ59の構成を表わす。この構成はプラスミ
ドYEpZ415、YEpZ101Δ、plysΔ９、pk01およびpJDB207
からの５つの精製された断片の一義の結合によりつくら
れた。 第10図は、プラスミドplysΔ49およびplysΔ59により形
質転換された酵母菌のすべての抽出物がEDTAで処理した
E.coli細胞を溶解してE.coli細胞をリソチーム作用に対
して感受性とすることができることを示す。 第11図は、プラスミドpBR322および２−ミクロンの酵母
菌内因性プラスミドヘPstＩ制限酵素を作用させること
により得られた断片の遺伝子によりプラスミドYEpB2の
構成を表わす。 第12図は、プラスミドYEpB2およびplysΔ49からの５つ
の精製断片の一義の結合による発現ベクターの構成を表
わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (15)
- 【請求項１】EcoRI部位とPvuII部位との間で構成される
DNA断片からなりかつ から選ばれるヌクレオチド配列を有することを特徴とす
る、一般に異種のポリペプチドをコードする遺伝子の酵
母菌中での発現を保証することができるプロモーター。 - 【請求項２】部位PvuIIが他の制限部位により置換され
ている特許請求の範囲第１項記載のプロモーター。 - 【請求項３】部位PvuIIが部位BamHI、EcoRI、ClaＩ、Hi
ndIII、SphＩ、SacＩ、PstＩ、XbaＩおよびXhoＩからな
る群より選択される制限部位により置換されている特許
請求の範囲第１項記載のプロモーター。 - 【請求項４】次のヌクレオチド配列： を有するDNA断片からなることを特徴とする特許請求の
範囲第３項のプロモーター。 - 【請求項５】次のヌクレオチド配列： を有するDNA断片からなることを特徴とする特許請求の
範囲第４項のプロモーター。 - 【請求項６】EcoRI部位とPvuII部位との間で構成される
DNA断片からなりかつ から選ばれるヌクレオチド配列を有する、一般に異種の
ポリペプチドをコードする遺伝子の酵母菌中での発現を
保証することができるプロモーターにより、一般に異種
のポリペプチドをコードするDNA断片を酵母菌中の発現
を保証することができることを特徴とする酵母菌中で自
律的に複製することができるベクタープラスミド。 - 【請求項７】複製が２−ミクロンプラスミドから得られ
かつ２−ミクロンプラスミドの複製源から少なくともな
る配列の存在により保証されることを特徴とする特許請
求の範囲第６項記載のベクタープラスミド。 - 【請求項８】このプラスミドにより形質転換された酵母
菌の選択マーカーとなる遺伝子をさらに含むことを特徴
とする特許請求の範囲第６または７項記載のベクタープ
ラスミド。 - 【請求項９】前記プラスミドがplysΔ49であることを特
徴とする特許請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の
プラスミド。 - 【請求項１０】前記プラスミドがplysΔ59であることを
特徴とする特許請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載
のプラスミド。 - 【請求項１１】前記プラスミドがplys50であることを特
徴とする特許請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の
プラスミド。 - 【請求項１２】EcoRI部位とPvuII部位との間で構成され
るDNA断片からなりかつ から選ばれるヌクレオチド配列を有する、一般に異種の
ポリペプチドをコードする遺伝子の酵母菌中での発現を
保証することができるプロモーターにより、一般に異種
のポリペプチドをコードするDNA断片の酵母菌中の発現
を保証することができる酵母菌中で自律的に複製するこ
とができるベクタープラスミドを含んでなることを特徴
とする形質転換された酵母菌。 - 【請求項１３】サッカロミセス（Saccharomyces）属に
属することを特徴とする特許請求の範囲第12項記載の形
質転換された酵母菌。 - 【請求項１４】サッカロミセス・セレビシアエ（Saccha
romyces cerevisiae）属に属することを特徴とする特許
請求の範囲第13項記載の形質転換された酵母菌。 - 【請求項１５】菌株AH22および菌株GRF18からなる群よ
り選択されることを特徴とする特許請求の範囲第14項記
載の形質転換された酵母菌。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE214123 | 1984-12-06 | ||
| BE0/214123A BE901222A (fr) | 1984-12-06 | 1984-12-06 | Promoteurs assurant l'expression de genes etrangers chez la levure, plasmides comportant ces promoteurs et leurs utilisations pour la production de polypeptides. |
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