JPS63501331A - 糸状菌類のプロモ−タ−及びその使用法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ６９、アスペルギルス・ｓｐ種である第６８項に記載の形質転換体。

７０、アスペルギルス・ニデユランス種である第６８項に記載の形質転換体。

７１、アスペルギルス・ニーガ一種である第６８項に記載の形質転換体。

７２、該構築物のコピーを多数含む第６８項に記載の形質転換体。

７３、形質転換体が、通常レベルの調節遺伝子生産物よりも高度に発現する第７ ２項に記載の形質転換体。

７４、該構築物に含まれるプロモーターの転写促進機能を調節する遺伝子の多重 コピーによって、通常レベルの調節遺伝子生産物よりも高度に発現する第７３項 に記載の形質転換体。

７５、アルコールデヒドロゲナーゼエ遺伝子のプロモーターおよびａｌｃ　Ｒ遺 伝子の多重コピーからなる構築物の多重コピーを含む第７４項に記載の形質転換 体。

７６、適切な発育条件下で第６８−７５項に規定する糸状菌類細胞を培養するこ とからなる、接糸”状菌類細胞でタンパク質を発現させる方法。

７７、プロモーターの転写促進機能を誘導あるいは抑制する物質の存在を゛コン トロールするという条件下で、菌類を培養する第７６項に規定の方法。

７８、糸状菌類細胞にとって外来性のタンパク質を分泌する能力を有する該糸状 菌類細胞。

７９、第１８−２４項および第３６−５５項のいずれかに規定のＤＮＡ構築物に よって形質転換された糸状菌類細胞。

８０、アスペルギルス・ｓｐ種である第７９項に記載の形質転換体。

８１、アスペルギルス・ニデユランス種である第７９項に記載の形質転換体。

８２、アスペルギルス・ニーガ一種である第７９項に記載の形質転換体。

８３、当該構築物の多重コピーを含む第７９項に記載の形質転換体。

８４、形質転換体が、通常レベルの調節遺伝子生産物よりも高度に発現する第８ ３項に記載の形質転換体。

８５、当該構築物に含まれるプロモーターの転写促進機能を調節する遺伝子の多 重コピーによって、通常レベルの調節遺伝子生産物よりも高度に発現する第８４ 項に記載の形質転換体。

の多重コピーを含む第８５項に記載の形質転換体。

８７、適切な発育条件下で菌類を培養することからなる、第７９−８６項に規定 の糸状菌類細胞にタンパク質を発現させ、分泌させる方法。

８８、プロモーターの転写促進機能を誘導あるいは抑制する物質の存在をコント ロールするという条件下で、菌類細胞を培養する第８７項に記載の方法。

明　細　書 糸状菌類のプロモーター及びその使用法発明の分野 この発明は、糸状菌類におけるタンパク質の発現および分泌を伴なうタンパク質 の発現に関するものである。

発明の背景 組換えＤＮＡ技術のひとつの目標は、容易にしかも経済的に入手できる宿主細胞 に、商業的にあるいは科学的に価値のあるタンパク質をコードしているＤＮＡセ グメントを挿入することである。一般に、挿入のために選ばれる遺伝子は、それ ら本来の宿主で限られた量しか産生されないタンパク質をコードしているもの、 あるいは高価すぎて維持することのできない宿主に固有のものである。より多く の収量で、あるいは同様の収量でより経済的にタンパク質を産生ずることが可能 な宿主に、制御された方法で遺伝情報を転移することにより、タンパク質産生の ためのより望ましいビヒクルが得られる。

タンパク質をコードしている遺伝子は、本質的に、タンパク質コード（暗号）領 域の５′末端に接しているＤＮＡのプロモーター領域を含んでいる。プロモータ ー領域は、ＲＮＡポリメラーゼ■との結合部位を含んでいる。ＲＮＡポリメラー ゼ■は、コード領域の適当なりＮＡ鎖と相補的なメツセンジャーＲＮＡの組立て を効果的に触媒する。はとんどのプロモーター領域には、“ＴＡＴＡボックス１ として一般に知られている配列に関係するヌクレオチド塩基配列が存在し、そし て、該配列は通常、コード領域の始まりから幾分能れた上流に位置していて、正 確な転写開始反応には必要なものである。コード領域を正しく機能させ、制御す るのに重要な、あるいは必須であるそれ以外の特徴も、コード領域の始まりの上 流にあるプロモーター領域中に含まれている。

糸状菌類、特に、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）、たとえばア スペルギルス・ニーガー（Ａ、　ｎｉｇｅｒ　）のような糸状嚢子菌類は、有用 なタンパク質をコードしている外来遺伝子の受容体として適している微生物群の 一種である。現在、Ａ、二−ガーとその関連（近縁）種は、たとえば食品業界に おいて使用するような酵素の工業生産に係る業界で広範に用いられている。それ らの用途は、微生物の分泌能力に基づくものである。微生物は十分に特徴づけら れていて、広範に利用され、受は入れられているので、有用なタンパク質を得る ためにＡ、ニーガーの細胞やＡ、ニデユランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）を 含むその関連種の細胞を遺伝子的に修飾し増強するような工業的でかつ科学的な 誘因（動機）が存在する。

糸状菌類由来の外来タンパク質を発現、分泌させる方法は、いまだ完成されてい ない。酵母において成功した試みが、アスペルギルス属のような糸状菌類におい て成功するかどうかは決して自明のことでない。酵母は、糸状菌類の遺伝子を発 現させるのに適した組織ではなく〔ペンチラ（Ｐｅｎｔｉｌｌａ　）らのモレ＝ θニラ−・ジーン・ジヱネテイツク（Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　 ）　（１９８４）１９４：４９４−４９９）、また酵母遺伝子は糸状菌類中で発 現しないことが明らかにされた。最近になって、Ａ。

ニデユランスおよびＡ、ニーガーにおける遺伝子工学技術が発達してきた。これ らの技術は、外来的に加えられる遺伝子が、発現することのできる形態でアスペ ルギルス・ゲノムに組込まれることと関連している。

現在までのところ、これらの技術を用いても、外来タンパク質は糸状菌類中で発 現されず、該菌類から分泌されなかった。これは、適当な発現ベクターやその組 立て構成要素がないことによっていた。これらの構成要素には、上述したアスペ ルギルス・プロモーター配列、所望の生産物をコードしている領域、および所望 の生産物を細胞外媒質に導びくために加えられる関連配列が含まれる。

上記のように、宿主細胞によって外来遺伝子が発現するには、タンパク質をコー ドしている領域の上流に位置するプロモーター領域が存在することが必要である 。このプロモーター領域は、それと関連するコード領域が、最後には所望のタン パク質生産物に翻訳されるメツセンジャーＲＮＡに転写されることの制御におい て活性である。このようにして産生されるタンパク質は、宿主に関する運命に基 づいて２つの種類に分類される。

第一の種類のタンパク質は、細胞内に残る。細胞内にある場合、所望のタンパク 質を抽出するには、生産物を放出させて、最終的に精製するために、遺伝子的に 操作された宿主を破壊あるいは溶解する必要がある。細胞内生産物は、いくつか の点で都合がよい。このタンパク質生産物は、濃縮することができ、すなわち細 胞塊とともにペレットにすることができ、もし、生産物が細胞外状況で不安定、 あるいは構造的に分泌することができない場合には、これは、産生および精製の 望ましい方法である。

２番目の種類のタンパク質は、細胞から分泌されるものである。この場合、精製 は、細胞自身よりも細胞外媒質上で行われる。生産物は、アフィニティークロマ トグラフィーのような方法で抽出することができ、連続液中発酵が可能である。

また、特定の生産物は、細胞外でより安定であり、細胞外精製が有利である。

真核生物におけるタンパク質の分泌は、通常、タンパク質のアミノ基末端に位置 している分泌シグナルペプチド（以下、シグナルペプチドと呼ぶ）によって、は とんど常に指令を受けていることが実験的に明らかとなっている。シグナルペプ チドは、ジー、ボン　ヘイジン（Ｇ、　Ｖｏｎ　Ｈｅｉ　ｊｎｅ　）　のヨーロ ピアン・ジャーナル・バイオケム（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ）　１７− ２１　（１９８３）によって記述されているように、特徴的な分布を有していて 、当業者によりそのことは理解されている。シグナルペプチドは、細胞に認識さ れた時点で、タンパク質を分泌経路へと導びく。分泌の間に、シグナルペプチド は開裂して除かれ、タンパク質は、細胞外媒質から成熟した形で収獲することが できるようになる。

細胞内および細胞外の両種のタンパク質はともに、コード領域と連結しているプ ロモーター領域を含む遺伝子によってコードされている。細胞外へ導かれるタン パク質をコードしている遺伝子は、細胞内のタンパク質をコードしている遺伝子 と、細胞外タンパク質をコードしている遺伝子では、シグナルペプチドをコード しているプロモーター（それは、ＲＮＡポリメラーゼによって最初に転写される 部分である）に最も近いコード領域部分がシグナルペプチドをコードしていると いう点で異なっている。シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列は 、以下ではシグナルペプチドのコード領域あるいはシグナル配列と表わされるが 、それ自体コード領域の機能的な部分である。

発明の概要 所望のタンパク質を発現するために糸状菌類を形質転換する方法（システム）が 、ここに開発された。この方法によれば、形質転換によって、そのタンパク質が 天然に分泌されるものであるかどうかに関係なべ１、該タンパク質を発現するば かりでなく、そのタンパク質を分泌することのできる糸状菌類を得ることができ る。その上、本発明のある面においては、発現されるタンパク質の濃度レベルを 、コントロールすることができる。当業者には、本明細書で示される方法によっ て、糸状菌類がタンパク質の貴重な産生源として機能し、多くの適用例で、細菌 や酵母による方法（系）よりも秀れている代替系がもたらされることを理解でき るであろう。

このように一般的な態様では、本発明は、糸状菌類細胞の遺伝子構成を改良し、 これらの細胞によって発現されるタンパク質の性質または量を変えるための糸状 菌類の形質転換方法（系）を提供するものである。

本発明のより具体的な態様を以下に記述する。

本発明におけるひとつの態様では、Ａ、ニーガー、Ａ。

ニデユランスあるいはその関連（近縁）種のような糸状菌類におけるコード領域 と関連するプロモーター領域を、同定、分離し、細胞外で２番目の異なるコード 領域と機能的な関係の下で適当に結合させ、そして、適当なベクターを用いて、 宿主糸状菌類に再び導入する。形質転換された宿主細胞は、導入されたプロモー ター領域のコントロールの下で、２番目のコード領、域のタンパク質を発現する 。特定の宿主が天然では発現しないタンパク質を発現する場合、および該タンパ ク質を分泌するいくつかの場合には、この２番目のコード領域は、宿主種にとっ て外来のものであるかもしれない。他方、２番目のコード領域がタンパク質発現 を改良または増強するために特定の宿主内でそのタンパク質が自然の状態で関連 しているプロモーター領域とは異なるプロモーター領域と関連している場合には 、第２の暗号領域は宿主本来のものであるかもしれない。

第２のコード領域が、通常分泌されるタンパク質をコードしているものである場 合にはその配列は、転写および翻訳後、タンパク質生産物のアミノ基末端にシグ ナルペプチドを存在せしめるようなヌクレオチド配列を、５′末端、すなわちシ グナルペプチドのコード領域に含んでいるだろう。そのシグナルペプチドは、菌 類宿主によって認識され得、そして、タンパク質生産物は、細胞の分泌経路へき 導びかれ、分泌され得る。

もうひとつの態様では、本発明は、シグナルペプチド、すなわちシグナルペプチ ドのコード領域をコードしているＤＮＡ配列であって、コード領域内でコードさ れているタンパク質の分泌を促すように、糸状菌類、好ましくは嚢子菌類種、た とえばＡ、ニーガーやＡ、ニデユランスによって、認識されるＤＮＡ配列を提供 するものである。これらのシグナルペプチドのコード領域は、天然状態では細胞 内に保持されるタンパク質の分泌を誘導するために該タンパク質をコードしてい るコード領域と連結することができる。一方、通常分泌されるタンパク質は、普 通、これらのシグナルペプチドのコード領域を天然に含んでいるので、シグナル ペプチドをコードしている領域を挿入することは通常必要としないが、それでも 、所望により、本発明のシグナルペプチドのコード領域で、天然に存在するこの ような配列を置換してもよい。従って、シグナルペプチドのコード領域が、非分 泌性のタンパク質をコードしている領域と連結されている場合には、そのものは 上記コード領域にとって、外来性であるだろう。

本発明は、菌類宿主が異種タンパク質を発現するように配列されたプロモーター を伴った外来性のコード領域を糸状菌類中に導入し得る方法（性能）を提供する ものである。また、本発明は、そこに、天然に存在する個々の遺伝子、あるいは そこに導入された外来遺伝子の転写を、その遺伝子と共に宿主に導入されたプロ モーター領域を介して調節することのできる方法をも提供する。たとえば、Ａ、 ニデユランスのアルコールるプロモーター領域は、細胞外媒質のヱタノール、ス レオニン、あるいは他の誘導物質によって調節できる。この効果は、ａｌｃ　Ｒ として知られる遺伝子の保全に依存している。ａｌｃ　ＡあるいはａｌｄＡプロ モーター領域が、アスペルギルスなどにおいて、外来タンパク質をコードしてい る領域と連なっている時には、本発明に従って、ヱタノールあるいはその他の誘 導物質によって、異なる遺伝子の発現を同様に調節することができる。

さらなる例として、Ａ、ニーガーにおいてグルコアミラーゼ遺伝子と天然で連な っていて、本発明の態様において使用されるプロモーター領域は、でんぷんおよ び他の糖類によって正に誘導される。

もうひとつの態様では、本発明は、シグナルペプチドをコードしている領域と機 能的に連なるプロモーター領域であって、その３′側に位置し、シグナル配列と 同じ解続枠内に所望のタンパク質をコードしている領域を導入させ得る領域を含 むＤＮＡ構築物を提供するものである。プロモーター／シグナル構築物は、タン パク質コード領域をシグナルペプチドのコード領域に正確に連結させ得る制限部 位をその側面に有している。

他の態様では、本発明は、プロモーターやシグナルペプチドのコード領域を含む セグメントを、完全なタンパク質のコード領域と共に、糸状菌類宿主のゲノムに 導入することのできる遺伝子ベクターを提供するものである。そのタンパク質を コードしている領域は、宿主の糸状菌類にとって、固有のものであっても、外来 のものであってもよい。

このように、本発明は、アスペルギルス・ニーガー、アスペルギルス・ニデユラ ンスなどの糸状菌類細胞において、プロモーター領域として活性なりＮＡ配列、 およびシグナルペプチドのコード領域として活性なりＮＡ配列を提供するもので ある。

更に、本発明は、糸状菌類細胞においてプロモーター領域として活性なりＮＡ配 列、および該ＤＮＡ配列と機能的な関連性を持って化学的に結合しているコード 領域（つまり、該コード領域は糸状菌類宿主において、前記ＤＮＡ配列の影響下 で発現することができる）からなる新規な構築物を提供するものでもある。

更に、本発明は、形質転換されたアスペルギルス宿主細胞において発現すること のできるコード領域、および形質転換されたアスペルギルス宿主細胞において活 性であるプロモーター領域（コード領域とプロモーターとは化学的に結合し、互 いに機能的に関連している）を、適当なベクターによって宿主細胞に導入するこ とからなる、糸状菌類宿主細胞を遺伝子的に修飾する方法を提供する。

この方法は、遺伝子発現の水準を上げるために、選択された構築物の多数のコピ ーを宿主に導入することも包含している。要すれば、あるいは所望ならば複数の 構築物のコピーの導入に伴なって、構築物に対して調節作用を有する生産物をコ ードしている遺伝子の多数のコピーを導入する。

本発明は、本発明の構築物によって形質転換された糸状菌類細胞をも含むもので ある。

好ましい態様の説明 本発明において好ましい宿主は、子嚢菌種の糸状菌類で、最も好ましくは、Ａ、 二−ガー、Ａ、ニデユランスなどを含むアスペルギルス属である。

発明の好ましい態様においては、Ａ、ニーガー・グルコアミラーゼ遺伝子、ある いは、Ａ、ニデユランスのアルコール・デヒドロゲナーゼ■遺伝子またはアルデ ヒド・デヒドロゲナーゼ遺伝子と関連しているプロモーター領域、のいずれかと 関連しているプロモーター領域を、適当なベクター・プラスミドを製造する上で 使用する。

これらプロモーター領域のうちいずれか、あるいは全ては、適当な誘導物質を加 えることで宿主細胞内で調節することができる。ａｌｃＡとａｌｄＡにおいては 、この誘導は、第３の遺伝子のタンパク質生産物である、プ伝子の多数のコピー の導入を伴なわずに宿主に導入しことが明らかにされている。このような場合、 宿主かによる誘導を必要とするいくつかのプロモーターの要求量に応するのに不 十分であることがある。従って、ａｌｃＡあるいはａｌｄＡプロモーターを含む 構築物の多数のコピーによる糸状菌類の形質転換には、本発明の好ましい態様に 従がってａｌｃＲ遺伝子の多数のコピーの導入を僻村せて行う。他方、たとえば 、高濃度のグルコース（および、いくつかの他の炭素源）を、宿主の増殖に用い る培地中に使用することによって、転写を抑制することができる。そして、コー ド領域によりコードされていて、プロモーターによって制御されている生産物の 発現は、細胞生育相の終了の後、つまり、グルコースの全てが消費され、その遺 伝子の抑制が解除される時まで遅延する。この時に、プロモーターの活性を増強 するために誘導物質を添加する。

上述したプロモーターの制御のもとで、発現するように選択されたコード領域の タンパク質生産物の運命は、該コード領域のヌクレオチド配列によって決定され る。既述したように、もし、タンパク質生産物が天然で細胞外環境に導びかれる ものならば、生来、分泌性のシグナルペプチドのコード領域を含んでいるであろ う。通常、細胞内に存在するタンパク質生産物には、このシグナルペプチドが欠 如している。

、このように本明細書の目的においては、”１コーＹド゛領域１は、細胞内に残 っているか、分泌されるかのいずれかのタンパク質をコードしていると解すべき である。（この１コード領域１とは、当業界では、時に構造遺伝子すなわち遺伝 子の、タンパク質をコードしている部分を指して呼ばれることがある。）タンパ ク質が、それを産生ずる細胞内に残っている場合には、通常、コード領域は、シ グナルペプチドのコード領域を欠如しているだろう。コード領域が本来、分泌タ ンパク質をコードしているコード領域のセグメントと翻訳解読フレームにおいて 天然で連結しているシグナルペプチドのコード領域を含んでいる場合には、コー ド領域内でコードされているタンパク質は、細胞代謝における当然の結果として 分泌され得る。この場合、シグナルペプチドのコード領域を挿入する必要はない 。一方、分泌タンパク質をコードしているコード領域部分にとって外来のシグナ ルペプチドのコード領域を導入するように操作することもある。コード領域が、 シグナルペプチドのコード領域を天然で含んでいない場合、あるいは天然のシグ ナルペプチドと通常連結している所望のタンパク質の分泌を増強するために天然 のシグナルペプチドのコード領域と単に置換する場合には、この外来性シグナル ペプチドのコード領域が必要となる。

従って、本発明の他の好ましい態様においては、要すれば、すなわち、上述した プロモーターの制御のもとで発現するために選択されたコード領域が、それ自身 シグナルペプチドのコード領域を含んでいない時には、シグナルペプチドのコー ド領域を供給する。使用されるシグナルペプチドのコード領域は、Ａ、ニーガー のグルコアミラーゼ遺伝子に伴なっているもの、あるド領域であることが好まし く、適当なベクター・プラスミドの作成に使用する。他のベクターの他の成分と ライゲイトできるように、これらシグナルペプチドのコード領域の片方あるいは 両方の末端が修飾されていることが最も好ましい。シグナルペプチドのコード領 域が、コード領域の、成熟した機能的タンパク質をコードしているセグメントと 同一フレーム中にあるように、シグナルペプチドのコード領域をプロモーター領 域とコード領域のタンパク質をコードしているセグメントの間に挿入するような 方法で行うと、このライゲイジョンは効果的である。

図面の簡単な説明 第１Ａ図は、アスペルギルス・ニデユランスのアルコールデヒドロゲナーゼＩ（ ａｌｃＡ）遺伝子にお、けるコード領域およびプロモーター領域を構成している ＤＮＡの塩基配列の模式図である。

第１Ｂ図は、Ａ、ニデユランスのアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｌｄＡ）遺伝 子におけるコード領域およびプロモーター領域を構成しているＤＮＡの塩基配列 の模式図である。

第２図は、糸状菌類細胞を形質転換するのに有効なプラスミドｐＤＧ６を°組立 てる方法の概略的模式図である。

第３図は、第２図のプラスミドｐＤＧ６の一部分の線状表示図である。

第４図は、ｐＧＬｌおよびｐＧＬ　２のプラスミド地図の概略的模式図である。

第５図は、プラスミドｐＧＬ２への挿入のための合成リンカ−配列の選択性の模 式図である。

第６図は、　ｐＧＬ２の７ラグメントのヌクレオチド配列の模式図である。

第７図は、ｐＧＬ２ＢおよびｐＧＬ２ＢＩＦＮのプラスミド地図の模式図である 。

第８図は、ｐＧＬ２ＢＩＦＮのフラグメントのヌクレオチド配列の模式図である 。

第９図は、プラスミドｐＡＬｃＡ１ｓおよびその作成方法の模式図である。

第１０図は、ｐＡＬｃＡＩＳＩＦＮのプラスミド地図およびその作成方法の模式 図である。

第１１図は、ｐＡＬｃＡＩＳＩＦＮのフラグメントのヌクレオチド配列の模式図 である。

第１２図は、ｐＧＬ２ｃＥＮＤｏのプラスミド地図の模式図である。

第１３図は、ｐＧＬ２ｃＥＮＤｏのフラグメントのヌクレオチド配列の模式図で ある。

第１４図は、ｐＡＬｃＡＩＳＥＮＤＯのプラスミド地図である。

第１５図は、ｐＡＬｃＡＩＳＥＮＤＯのフラグメントのヌクレオチド配列の模式 図である。

第１６図は、プラスミドｐＡＬｃＡＩＡＭＹおよびその作製方法の模式図である 。

第１７図は、第１６図に示すｐＡＬｃＡＩＡＭＹのセグメントのヌクレオチド配 列の模式図である。

好ましい態様の詳細な説明 本発明において、Ａ、ニーガーあるいはＡ、ニデユランスなどにおいて機能的な 遺伝子のプロモーター領域が同定された。所望のプロモーター領域を含む各々の 遺伝子を同定する方法は同様であるため、ａｌｃ　Ａ遺伝子およびそれに含まれ ているプロモーターの位置を決め、同定する方法について概説する。この目的の ために、選択したタンパク質、たとえばａｌｅ　Ａを発現するように、選択種の 細胞を誘導し、これらの細胞から、メツセンジャーＲＮＡを分離する。それらの 一部は、未だ同し、ベクターにクローン化する。誘導されたＡ、ニデユランスよ り分離されたメツセンジャーＲＮＡをサイズ菌株より調製されたｃＤＮＡクロー ンとハイブリダイズクローンは、ａｌｃＡ　ｍＲＮＡのＤＮＡコピーを含んでい る。この切片を、選択したアスペルギルス菌株由来の全ＤＮＡ遺伝子バンクとハ イブリダイズし、選択したコード領域たとえばａｌｃＡおよびその非翻訳領域を 分離する。ａｌｄＡコード領域も同様の方法を用いて分離した。

そのコード領域は、他のコード領域およびタンパク質と同様に、メチオニンをコ ードしているコドンＡＴＧを伴った５′末端より始まる。発現されるタンパク質 のアミノ酸配列が知られている場合には、コード領域のＤＮＡ配列は、容易にわ かる。ＡＴＧコドンのすぐ１上流１は、プロモーター領域に先行されるメツセン ジャーＲＮＡのリーダ一部分である。

第１ＡおよびＩＢでは、Ａ、ニデユランス由来の全ＤＮＡ配列を、従来からの塩 基表示法によって図示している。第１Ａ図に示した部分は、プロモーター領域お よびアルコールデヒドロゲナーゼエ酵素をコードしているａｌｃＡ遺伝子のコー ド領域を含んでいる。第１Ｂ図に示した部分は、プロモーター領域およびアルデ ヒドデヒドロゲナーゼ酵素、すなわちａｌｄＡをコードしている領域を含んでい る。（両方ともに、”ＩＶＳ’の用語は、介在配列を表わす。）これら２つの酵 素のアミノ酸配列は、他の種において公知である。これらより、領域１０および １０′がコード領域であると認められる。コード領域は各々、１２位のメチオニ ン・コドンＡＴＧを有する５′（ｌ上流“）末端より開始する。りンパク質のコ ード領域によってコードされる相応のアミノ酸配列を、第１Ａおよび１８図のそ れぞれの列の下に、従来からの省略法によって付記する。コ、トン１２のすぐ上 流は、メツセンジャーＲＮＡのリーダー領域およびプロモーター領域をコードし ている領域で、長さは、プロモーターとして機能する上で必須の構造的特徴を全 て含ませるために決定するか、あるいは少なくとも概算しておく必要がある。第 １Ａおよび１８図の各々には、ＡＴＧコドン１２より上流の約８００塩基の配列 をそれぞれ示す。

機能するのに必須なものは全て、約１０００塩基の長さの配列中に、おそら（は 図示した８００塩基配列中含まれているだろうし、さらには、最初の２００〜３ ００塩基配列、すなわち第１Ａおよび１８図における約１４の位置よりも後にあ るだろうことは、他の既知のプロモーターとの類似性によって予測できる。プロ モーター領域の本質的な機能は、転写の正確な開始のための部位を提供すること で、それはＴＡＴＡボックス配列として知られている。このような配列は、第１ Ａ図のモーター領域のもうひとつの機能は、たとえζｆ遺伝子の転写を増強する 調節分子のためのあるいは遺伝子を活性または不活性にするための結合部位のよ うな遺伝子転写の調節において活性な、適当なりＮＡ配列を提供することである 。このような調節領域は、第１Ａおよび１８図に、それぞれａｌｃＡおよびａｌ ｄＡ遺伝子として図示したプロモーター領域中にある。

本発明でプロモーター領域として使用されるＤＮＡ配列の正確な上流５′末端は 、それが本明細書で記述するような必須の機能的な配列を含んでいるならば、決 定的なものではない。５′末端の上流にある余分なりＮＡ配列は、必要なもので はないが、本発明において有害なものではないようである。

本明細書記載の操作によって、ある遺伝子のプロモーター領域を組立てるのに必 須の機能的特徴全てを含む配列の大きさを決定したなら、次の工程では、プロモ ーター領域の末端の下流の都合よい位置でＤＮＡ鎖を切断し、タンパク質のコー ド領域を取り除き、基本的に、プロモーター領域および、時にメツセンジャーＲ ＮＡのリーダー領域をコードしている領域部分を含む配列を残す。この目的のた めには、適当な位置に制限部位が存在していなければならず、次いで、適当な制 限酵素でＤＮＡを処理して有効に切断する。制限部位は、第１Ａ図に図示される ａｌｃＡ配列によってわかる。上流の切断には、プロモーター領域にとって必須 の機能部位の全てを保持される部分に含めるように、十分な距離をもって上流に 部位を選択する。下流の開裂部位に関しては、ａｌｃｃの場合、正確にＡＴＧコ ドン１２の位置にある、制限部位は存在していない。該部分に最も近い下流の制 限部位は、１３における配列ＧＧＧＣＣＣで、そこでは、その鎖を制限酵素Ａｐ ａ　Ｉによって切断することができる。もし所望ならば、このような開裂の後、 位置１３から位置１２までの残ったヌクレオチドは、ヱキソヌクレアーゼを用い て段階的に取り除くことができる。このような取り除かれるヌクレオチドの数が わかっているなら、ヱキンヌクレアーゼの作用を、位置１２を過ぎる時に適当に 停止させることができる。第１Ｂ図に示すａｌｄＡコード領域のメチオニン・コ ドン１２の下流に同様の制限部位を位置決めすることによって、このプロモータ ー領域をもその後の使用のために同様に切り出す。多くの場合、プロモーター領 域の５′末端上に残ったヌクレオチドは、塩基トリプレットの解読フレームが維 持される限りは、プロモーター領域の機能に害を与えることはなく、該機能を有 意に妨げることもない。

添付の第２図は、本発明に従ってアスペルギルス形質転換体を形成するのに使用 できるプラスミドｐＤＧ６を作成する方法の工程を概略的に示したものである。

第２図においては、１８は、細菌セルロモナス・フイミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎ ａｓ　ｆｉｍｉ　）由来のヱンドグルコナーゼ（セルラーゼ）のコード領域３０ すなわち既知のベクターＭ１３ＭＰ８　におけるＣ、フイミ由来のＢａｍ　ＨＩ 　ヱンドグルカナーゼ・フラグメントを含む組換えプラスミドである。それは、 図示した適切なＥｃｏＲＩ　、Ｈｉｎｄ　ｍおよびＢａｍＨＩ　制限部位、並び に、図示されていない、本発明にとって問題外の他の制限部位を含んでいる。項 目２０は、ｐ５と名付けられた組換えプラスミドで、既知の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ ｉ　）プラスミドｐＢＲ３２２より組立てられ、開始コドンＡＴＧをも含む、ａ ｌｃＡコード領域の一部分とともに、上述のようにして作成されたａｌＣＡｌＣ 上−ター領域を含むＡ、ニデユランスのＥｃｏＲＩフラグメントを含有している 。それは、図示した制限部位、並びに本発明では使用されないために図示されて いなぃ他の制限部位を有している。プラスミドｐ５は、ＥｃｏＲＩ部位（３′） からＨｉｎｄＩ［（５’　）に至るＤＮＡ配列２２を有しており、該部分は事実 上、第１Ａ図で示している配列の一部で、それは配列の上部に位置１５　（Ｅｃ ｏＲＩ制限部位の構成部位である配列ＧＡＡＴＴＣ）から位置１７と表わされて いる部分に相当する。プラスミド２０における配列２２は、約２ｋｂの長さであ る。

次に、プラスミド１８と２０を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉで切断 して、ａｌｃＡプロモーター領域と、ヱンドグルカナーゼのコード領域３０とを 切り取り、Ｈｉｎｄ■切断プラスミドｐＵｃ１２とライゲイトして、ｐＵｃ１２ 上にこれらの配列を含む、第２図に示すような新規な構築物ｐＤＧ５Ａを作成す る。プラスミドｐＵｃ１２は公知で、市販されている大腸菌プラスミドであり、 該プラスミドは大腸菌内において効率的に複製するので、所望ならば、ｐＤＧ５ Ａのコピーを豊富に産することができる。新規な構築物ｐＤＧ５Ａを、構築物調 製におけ宿主の場合、この目的のために、一般にＡ、ニデュランミラーゼをコー ドしていて、この遺伝子を含む菌株は菌株は、アルギニン欠損の培地で発育でき ない。

第２図に示すように本発明のこの態様において、選択マーカーを組込むには、Ｘ ｂａＩを使用して、Ａ、ニデュモ ランス由来のＡｒｇ　Ｂ遺伝子を含むプラスミドｐＤＧ　ＡＴＣＣ５３００６の Ｘｂａ　Ｉフラグメント３２（ブクストン（Ｂｕｘｔｏｎ　）らの米国特許出願 、通し番号０６　／　６７８，５７８．１９８４年１２月５日出願を参照）と構 築物ｐＤＧ５Ａをライゲイトし、ヱンドグルカナーゼのコード領域と規な構築物 ｐＤＧ６を形成する。そして、実施例１において、より詳細に記述するが、プラ スミドｐＤＧ６を形質転換に使用し、ａｌｃＡプロモーターの制御下にあるヱン ドグルカナーゼのコード領域を含む新規なアスペルギルス突然変異体菌株を作成 する。

第３図には、Ｈｉｎｄ　ｍ部位２４からＨｉｎｄｌＩ［部位２６までの構築物ｐ ＤＧ　６の機能部である配列の概略を、線状で示す。それは、第１図で示したよ うにａｌｃＡプロモーター領域２２とＡＴＧコドン１２およびＡＴＧコドンの下 流にあるａｌｃＡコード領域の残余部分の一部を含んでいて、それに続いてプラ スミド１８由来のセルラーゼのコード領域３０を含んでいる。

プラスミドｐＤＧ６は、糸状菌類にとって外来のタンパク質のコード領域と結合 した糸状菌類プロモーターを含むベクターの１例にすぎない。第１６図に示した 本明細書中でｐＡＬＣＡＩＡＭＹと呼ぶもうひとつのベク転換された菌類宿主に とって外来の生産物をコードしている配列とが連結されている。ベクターｐＤＧ ６およびｐＡＬｃＡＩＡＭＹのタンパク質生産物は、両方とも、それぞれの形質 転換された宿主によって発現する。さらに、α−アミラーゼのコード領域は、天 然でシグナルペプチドのコード領域を含んでいるので、この生産物は、宿主にと っては外来性であるにもかかわらず、宿主の分泌機序を用いて、形質転換される 宿主によって分泌され得る。

このように、糸状菌類のプロモーター領域を同定、分離することによって、所望 の暗号領域と連結したこれらのプロモーター領域を含むベクターで、形質転換す ることによって宿主を操作し得る。

もし、ベクターのコード領域がシグナルペプチドのコード領域を必要とするか、 あるいは存在するシグナル配列を、別の、好ましい、より効率的なシグナルペプ チドのコード領域によって置き換えられるなら、このようなシグナルペプチドの コード領域は、プロモーターと、分泌タンパク質をコードしているセグメントと の間に挿入することができる。プラスミドｐＧＬ２（第４図）およびｐＡＬｃＡ ｌ、ｓ（第９図）は、特にこの目的に適した中間体クローニングベクターを例示 している。各々は、カセットとして機能することができ、プロモーター、シグナ ル配列および、シグナル配列と一緒に、正しい転写解読フレームに、タンパク質 のコード領域を挿入することを可能ならしめる、シグナル配列下流の制限部位を 提供するものである。

第４図において示すプラスミドｐＧＬ２は、グルコアミラーゼ遺伝子のプロモー ター４０、シグナル配列４２および開始部分４６を含むｐＧＬｌより作成するこ とができ、それらすべては本明細書で示す方法に従い、Ａ。

ニーゴーＤＮＡ由来の１つのセグメントから導かれる。このセグメントにおいて は、以下のチャート１に再現するヌクレオチド配列の末端（しかし、グルコアミ ラーゼのシグナル配列４２の内部にある）に向けて、Ｂｓ５ＨＩ［制限部位が得 られる。

５’　ＡＴＧ　ＴＣＧ　ＴＴＣＣＧＡ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＣＴＣＧＣＣＣｒＧ　 ＡＧＣＧＧＣｍｅｔ　ｓｅｒ　ｐｈｅ　ａｒｇ　ｓｅｒ　ｌｅｕ　ｌｅｕ　ａｌ ａ　ｌｅｕ　ｓｅｒ　ｇｌｙＣＴＣＧＴＣＴＧＣＡＣＡ　ＧＧＧ　ＴｒＧ　ＧＣ Ａ　ＡＡＴ　ＧＴＧ　ＡＴＴ　ＴＣＣＩｅｙ　ｖａｌ　ｃｙｓ　ｔｈｒ　ｇｌｙ 　ｌｅｕ　ａｌａ　ａｓｎ　ｖａｔ　ｉｌｅ　５ｅｒＢｓｓＨＩＩ シグナル配列４２をもった解読フレームに、タンパク質のコード領域を受け入れ ることのできるセグメント、すなわちリンカ−４４を該シグナル配列の下流に供 給するためには、シグナル配列中に存在するＢｓ５ＨＩ［部位およびその下流の Ｓｓｔ　Ｉ部位を利用する。この特別な態様においては、セグメント４６をｐＧ Ｌｌから取り出し、第５図に示すＡ、ＢあるいはＣと表示した３つのリンカ−の うちひとつを選んでそれにより置き換える。各々のリンカ−は、Ｂｓ５ＨＩＩ末 端およびＳｓｔ　Ｉ末端とライゲイトすることができる。Ｂｓ５ＨＩＩによるセ グメント４６の開裂に際して欠損されたシグナル配列の末端コドンを修復するた めにもリンカ−を操作できる。さらに、所望のコード領域をベクターｐＧＬ２に 挿入できるようにするために、各々のリンカ−を、そのヌクレオチド配列中のＥ ｃｏＲＶおよびＢｇ　Ｉ　ＩＩ／Ｘｈｏ　ＩＩ部位を唯一つに限定する。

適当なリンカ−の選択は、リンカ−に挿入されるタンパク質のコード領域の少な くとも最初の２．３のコドンについての知見に基づいて行われる。有意に翻訳さ れるべきタンパク質のコード領域のためには、タンパク質のコード領域の開始部 位は、シグナル配列の開始点に直接結合しているか、開始点から特定の数のヌク レオチド（即ち、トリプレット）をもって結合しているべきである。従って、も し、挿入されるタンパク質のコード領域が一つあるいは二つの不必要なヌクレオ チド（あるいは、それらの非トリプレット因子）をその５′領域に通常の開裂に より生じるように有していれば、第５図に示す三つのリンカ−のうちのひとつで 、余分で不必要なヌクレオチドの存在に対処することができ、シグナル配列をも つ転写解読フレームに、タンパク質のコード領域の始まりを位置せしめることが できる。

リンカ−Ａ％ＢおよびＣによってコードされるアミノ酸残基は、第５図で示すよ うにヌクレオチド配列の下に示されており、このことから、リンカ−の解読フレ ームに及ぼす、さらに最終的には、挿入されるタンパク質のコード領域に及ぼす 、余分なヌクレオチドのリンカ−配列への付加の影響がわかるであろう。制限部 位が常に解読フレームの修飾部より下流にあるようにリンカ−を設計しくつまり 、リンカ−ＡＳＢ、あるいはＣにおけるそれぞれ一つ、二つあるいは三つのアデ ニン残基）そうすることによって、制限部位に挿入されるコード領域の解読フレ ームを、適当なリンカ−を選択することで維持することができる。

プラスミドｐＧＬ２や、特定のリンカ−セグメントＡ、ＢあるいはＣを使用する プラスミドには、例えば、Ｂリンカ−を用いたｐＧＬ２ＢＩＦＮがあり、これを 用いて糸状菌類たとえばアスペルギルス菌種を形質転換するとインターフエロン α−２が分泌され、さらには、Ｃリンカ−を用いたｐＧＬ２ｃＥＮＤｏがあり、 これを用いてこのような糸状菌類を形質転換すると、ヱンドグルカナーゼが分泌 される。

プラスミドｐＧＬ２は天然に存在するシグナル配列を利用しているが、合成シグ ナル配列を含むベクターを利用することも、本発明の範囲内に属する。このよう なベクターの１例は、ｐＡＬｃＡｌｓで、それは糸状菌類を形質転換することの できるベクターを形成するためにタンパク質のコード領域を挿入できるプラスミ ドｐＧＬ２と同様の中間型ベクターである。しかし、ｐＧしし、プロモーターと 連結した合成シグナル配列を利用している。ｐＡＬｃＡｌｓを第９図に示し、そ の組立て模式図を表わし、さらに実施例を参考に挙げる。ｐＡＬｃＡｌｓから作 られるプラスミドには、例えば、形質転換された糸状菌類にインターフエロンα −２を分泌させるｐＡＬｃＡｌｓＩＦＮ　、および糸状菌類宿主にヱンドグルカ ナーゼを分泌させるｐＡＬｃＡＩＳＥＮＤＯがある。両方の場合とも、宿主にと って分泌タンパク質が外来性であっても分泌できる。

さらに、以下の実施例によって、本発明をさらに詳細に説明、例示する。しかし 、それは本発明を限定するものではない。

以下に挙げる実施例１および２の各々によって、天然で存在するが非菌類のコー ド領域と連結された糸状菌類から導かれたプロモーターを有するベクターを用い て、糸状菌類宿主を首尾よく形質転換できることを示す。

実施例１　ｐＤＧ６　ＡＴＣＣ５３１６９を使用するＡ、ニデユランスの形質転 換 まず、第２図に示すベクター構築物ｐＤＧ６を、標準的な通常のライゲイジョン および制限技術を用いて第２図に示した設計方法に従って製造した。次いで、以 下のように構築物ｐＤＧ６をアスペルギルス・ニデユランスのＡｒｇ　Ｂ変異体 細胞に導入した：２ｅのＰｌ形フラスコ中に０．０２％アルギニンｃ！＝１０− ５ヂビオチンを含有する完全培地（Ｃｏｖｅ　１９６６）　５００ｍＱ／　ｍＱ を植え付け、２０時間２５　Ｏｒｐｍで撹拌しながらインキュベートした。ワッ トマン＆５４Ｆ紙を通して菌糸を収穫し、無菌脱イオン水で洗浄して、吸引乾燥 した。菌糸１ｙ当たり２０〜の７ボザイム２３４（ノボ・ヱンザイム・インダス トリーズ（Ｎｏｖｏ　ＥｎｚｙｍｅＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　）　）、０．１ｍＱ （＝１５０００単位）のβ−グルクロニダーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）　）およ び３■の牛血清アルブミンを添加した、２５０ｍＱフラスコ中の濾過滅菌した１ 、　２　Ｍ　Ｍｇ　Ｓ　０４　・１０　ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ５，８）に菌 糸を加えた。光学顕微鏡によってスフエロプラストの生成を周期的に確認しなが ら、ゆつ（りと撹拌して、５０−７０分間、３７℃で消化を行なった。５０己の 無菌イオン交換水を加え、３０　ｕｍのナイロンメツシュに通して濾過すること でスフヱロプラストヲ未消化のフラグメントから分離し、室温で５０ｄの円錐底 管に入れ、振盪ローター（ｓｗｉｎｇ　ｏｕｔ　ｒｏｔｏｒ　）で５分間２５０ ０．９で遠心分離して収穫した。０．６　Ｍ　ＫＣＩ　１０ｍＱ中で再懸濁と遠 心分離を行ない、スフヱロプラストヲ２回洗浄した。スフエロプラストの数を血 球計算器を用いて計測し、最終濃度が１０８個／　ｒｎＱとなるように、ｐＨ７ ，５の１．２Ｍンルビトール、１０　ｍＭ　）すｘ／ＨＣ１，１０ｍＭＣａ（Ｊ ’２中に再懸濁した。ＤＮＡｐＤＧ６（ｐＨ８の、１０ｍＭ）リス／ＨＣ７？・ １ｍＭＥＤＴＡ中、全量４０μｌ）を加えたプラスチック管に、０．４　ｍＱの 部分標本を入れ、室温で２５分間、インキュベートした。ｐＨ７，５の６０％Ｐ ＥＧ４０００．１０ｍＭ　）リス／ＨＣ＃、１０ｍＭＣａ　ＣＡ’２の部分標本 ０．４　ｒｎＱｌｏ、　４　ｍＱ、そして１．６　ｍＱを、添加の都度おだやか に、しかし完全に混合しながら、各々のチューブに順次加え、次いで２０分間室 温でインキュベートした。そして、形質転換されたスフエロプラストを、適当に 補充した最小培地１％寒天上層（ｏｖｅｒｌａｙ　）に加え、４５℃でｏ、６Ｍ Ｋｃ＃を加えるか減じるかして、直ちに、プレート内の同一の（冷えてはいるが ）培地上に注ぎ入れた。３７℃で３〜５日培養し、増殖しているコロニーの数を 計測した（ヱフ・ブクストン（Ｆ、　Ｂｕｘｔｏｎ　）　らのジーン（Ｇｅｎｅ ）　３７，２０７−２０４（１９８５）　）。エルトン（Ｙｅｌｔｏｎ　）　ら の方法〔プロナス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）アメリ カ（Ｕ、Ｓ、Ａ）　８１　；１３７０−１３７４（１９８０）　）も使用した。

コロニーを２つの群に分けた。組み込まれたセルラーゼ遺伝子を誘導するために 、ひとつの群のインキュベート培地に、スレオニン（１１，９ｙ／リツトル）ト フルクトース（１，Ｆ／リットル）を加えた。他の群には、誘導物質を加えない で、炭素源としてグルコースだけを使用した最小培地上で発育させることで抑制 した。培養した後に、菌糸を濾過して分離し、凍結乾燥して、すりつぶし、ｐＨ ７の２０　ｍＭ　）リス／ＨＣ（ｌでタンパク質を抽出し、両群ともにバイオラ ド分析（ＢｉｏＲａｄＡｓｓａｙ　）によって全タンパク質生産を検定した。

セルラーゼの生産を調べるために、セルラーゼ（９ｙ／リツトル、カルボキシメ チルセルロース）含有の寒天培地のプレートを作成し、ガラス繊維の濾過物質の 小片を用意し、お互いを分離して、相同対接合体（トランスコンシュガント）の ひとつからの全タンパク質７５μｙを各々濾過器に加えた。プレートを一晩３７ ℃でインキュベートした。そして、濾過器を取り除き、下の寒天培地におけるセ ルラーゼの破壊で明らかになるように、プレートをコンゴーレッドで着色シテ、 濾過器上の全タンパク質にどこにセルラーゼが存在しているかを確認した。プレ ートを５ＭＮａＣ６水溶液で洗浄してよごれを取り除き、肉眼で様相の違いを検 定した。

スレオニンとフルクトースによって誘導された４つの形質転換体のうち３つが、 全タンパク質生産物中のセルラーゼの存在を明らかに示した。誘導されなかった 、グルコース抑制形質転換体は、セルラーゼ産生を示さなかった。

同じベクター糸および菌株より３つのコントロール（対照）形質転換体を作成し たが、この場合はプロモーター配列を除いた。それらはどれも、誘導物質があろ うとなかろうとセルラーゼを産生じなかった。スレオニン誘導された、形質転換 菌株由来の培地が、Ｃ，フイミのヱンドグルカナーゼに対して惹起したモノクロ ーナル抗体と反応を示す事実によって、Ｃ，フィミ・ヱンドグルカナーゼのコー ド領域の存在を確認した。このモノクローナル抗体は、コントロール菌株の細胞 内Ａ、ニデユランスタンパク質とは交差反応を示さなかった。

実施例２　ｐＡＬｃＡＩＡＭＹ　ＡＴＣＣ５３３８０を使用したＡ、ニデユラン スの形質転換 ベクター構築物ｐＡＬｃＡＩＡＭＹを第１６図に示すように、標準的な通常のラ イゲイジョンおよび制限技術を用いて調製した。第１６図を参照しながら具体的 に説明すると、プラスミドｐｓｏｉ　［Ｓ、Ｊ−ロススティン（Ｓ、　Ｊ、　Ｒ ｏｔｈｓｔｅｉｎ　）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、３０８．６６２−６ ５５　（１９８４）を参照〕上に規定されたＥｃｏ　ＲＩ　−ＥｃｏＲＩフラグ メント中に含まれている小麦α−アミラーゼ遺伝子７２のコード領域を挿入する ために、Ａ、ニデユランス・アルコールデヒドロゲナーゼ１のプロモーター２２ が位置している（上述）　Ｈｉｎｄｅｒ−ＥｃｏＲＩセグメントを含有するベク ターｐＡＬｃＡ１　を、そのＥｃｏＲＩ部位で切断した。小麦α−アミラーゼは 、自然に分泌されるタンパク質であるのでそのコード領域７２は、シグナルペプ チドのコード領域７６と、成熟型の分泌されたα−アミラーゼをコードしている セグメント７８を含有している。ｐ５０１のＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩセグメン ト中モーター２２がα°−アミラーゼのコード領域と機能的に連結しているプラ スミドｐＡＬｃＡＩＡＭＹが得られる。ｐＡＬｃＡＩＡＭＹ中でのｐ５０１起源 のα−アミラーゼコード領域の正しい方向性は、常法によりライゲイジョン部位 の配列を決定することで確認する。プロモーター／コード領域の結合部のヌクレ オチド配列を第１７図に示す。

Ａ、ニデユランスを実施例１に記載の方法で形質転換し、細胞外媒質の試料を取 り出して、１％溶解性でんぷん寒天上に置かれたガラス繊維濾過紙に適用する。

そして、３７℃で８時間後、濾過紙を取り出し、固体ヨードの入ったビーカー（ ５０℃の水浴中）上で裏返す。きれいなはん点は、でんぷんの減成を表わしてい て、一方残ったでんぷんは、深い紫色に変わり、これにより、分泌されたα−ア ミラーゼの存在を確認するっ以下に挙げる実施例３−１２においては、完全なベ クターによって形質転換された糸状菌類から、外来性タンパク質を分泌させるた めに、分泌シグナルペプチドのコード領域を導入したベクターを提供する。

生 Ａ）プロモーターおよびシグナルペプチド配列の供給源 ＡＴＣＣにカタログ番号２２３４３で寄託されているんニーガー株から得られる ＤＮＡから誘導された遺伝子バンクをプローブして、Ａ、ニーガーのグルコアミ ラーゼ遺伝子を分離した。このプローブは、バイオサーチ・オリゴヌクレオチド 合成装置とグルコアミラーゼ・タンパク質の公開されているアミノ酸配列の情報 を用いて調製したオリゴヌクレオチド・プローブを用いて行った。アミノ酸配列 のデータをヌクレオチド配列データに１逆翻訳１して、プローブを合成した。プ ローブされた特定の遺伝子バンクは、大腸菌丙で生存でき、複製し得る市販のプ ラスミドｐＵｃ１２のＢａｍＨＩ部位にクローンされた、上述のＡ、ニーガーＤ ＮＡの５ａｖ３Ａ部分消化物であった。

グルコアミラーゼ遺伝子を含むＨｉｎｄＩ［−ＢｇｌＩＩのＤＮＡ断片を、ｐＵ ｃ１２にサブクローンした。次いで、所望のプロモーター領域、シグナルペプチ ドのコード領域およびグルコアミラーゼタンパク質のコード領域の位置を、サブ クローンしたフラグメントを含有するｐＵＣ１２中に確認した。

ＥｃｏＲＩ　／　ＥｃｏＲ：［フラグメント（第４図参照）の配列を決定し、そ の配列データをライスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）大学の配列分析プログラ ムを用いて分析した結果、該フラグメントは長く、オープン翻訳解読フレームラ 含んでいることがわかった。

Ｈｉｎｄｍ−ＢｇｌｌＩフラグメント内の５’ＥｃｏＲＩ部位とＢｓ５ＨＩＩ３ ’部位の間のグルコアミラーゼ遺伝子の領域部分であるヌクレオチド配列の分析 結果を第６図に示す。この領域には、グルコアミラーゼプロモーターおよびシグ ナルペプチドのコード領域を含んでいる。

このフラグメント内、すなわちヌクレオチド９７一１０２はタータボックス（Ｔ ＡＴＡ　ｂｏｘ）４８　であり、これは正確な転写開始のために、多くの真核生 物のプロモーター領域に必要とされる部位（多分ＲＮ、、Ａポリメラーゼ■結合 部位）である。従って、プロモーター領域の少なくとも一部分が存在することが 確認される。さらに、機能的必須部の全てが約１０００塩基の長さの配列内に含 まれているらしく、特にコード領域の開始コドン、すなわちヌクレオチド２０６ −２０８、即ちメチオニンに対応するコドン”ＡＴＧ’４９の上流の最初の２０ ０塩基内にあるらしいことを他の既知のプロモーター領域との類似性から予言で きる。このように、プロモーターと転写リーダー配列は、ヌクレオチド２０５で 終了する。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼ■結合部位およびその機能 に必要な他の全ての特徴を含んでいるにちがいないが、プロモーター領域の始ま りを確認することは、それ程重要なことではない。このように、ＥｃｏＲＩ−Ｅ ｃｏＲＩ配列は、グルコアミラーゼ遺伝子の完全なプロモーター領域を表わして いると考えられるがプラスミドｐＧＬ２に使用するフラグメントは、完全なプロ モーター領域が、得られたプラスミド中に適切に含まれることを確実にするため に、もつと大きいＨｉｎｄ　ｍ　−Ｂａｍ　Ｉ　／　Ｂｇｌ　ＩＩ上セグメント 中このフラグメントをまぜたものである。

成熟グルコアミラーゼのアミノ酸配列が既知であることに基いて（スベンソン（ ５ｖｅｎｓｓｏｎ　）らの１アス６ルギルス・ニーガー由来の２形態のグルコア ミラーゼの特徴付け１、カールスベルグ・リサーチ・コミュン（Ｃａｒｌｓｂｅ ｒｇ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ　）　、　４７．５ｓ−６９（１９８２）を参照 ）、シグナルペプチドのヌクレオチド配列を正確に決定することができる。分泌 タンパク質をコードしている遺伝子のシトナルペプチドのコード領域は、ＡＴＧ コドン４９によってコードされているメチオニン残基によって開始することで知 られている。ヌクレオチド配列の開始部分以外、すなわちＡＴＧコドン３′側を 確認することにより、該部分のアミノ酸配列を決定することのできる情報が得ら れる。このアミノ酸配列を発表されているアミノ酸配列と比較することによって 、その比較した、発表されている配列に対応する部分が存在しないグルコアミラ ーゼの部分的遺伝子として、シグナルペプチドを同定することができる。本明細 書で定義されているグルコアミラーゼのシグナルペプチド・フード領域は、先に この方法によって確認された。

上記の方法により、５ａｕ３Ａ部分消化により生成され、ｐＵｃ１２　に組込ま れたＨｉｎｄｕ−ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ　フラグメントが、グルコアミラーゼ 遺伝子の以下の特徴を含むことを確認した：開始部、たぶん無関係な部分、プロ モーター領域、シグナルペプチドのコード領域、およびコード領域の残りの部分 。ＨｉｎｄｌｌｌとＢａｍＨ工／ＢｇｌＩＩ　による開裂およびライゲイジョン で、ｐＵｃ１２プラスミドに挿入されたこのフラグメントは、第４図。

にプラスミドｐＧＬ１として模式的に示されている。このプラスミドは、大腸菌 中でも依然として選択でき、複製できるような、複製などに必要な全ての特徴を 含前駆体としてｐＧＬｌを使用して、プラスミドベクターｐＧＬ２を第４図に示 すように形成することができる。本明細書第５図に示した合成リンカ−配列Ａ、 ＢあるいはＣを挿入するために、シグナル配列４２の３′末端近くの制限部位Ｂ ｓ５Ｈｎを、唯一の下流の５ｓｔＩ部位とともに利用する。このように、ｐＧＬ ｌをＢｓ５ＨＩＩ　と５ｓｔＩ　のふたつで開裂し、それによって、そこに含ま れているグルコアミラーゼのコード領域４６の開始部分を取り除く。その後、Ｂ ｓｓ　ＨＩＩ　／　Ｓｓｔ　Ｉに適合した末端を持つ様に設計した合成リーダー 配列ＡからＣまでのうちのひとつを選んで挿入し、ライゲイトし、プラスミドｐ ＧＬ２を作成する。３つのリンカ−配列、即ちＡ、ＢあるいはＣのいずれを使用 するかにより、得られたプラスミドを、以下、それぞれｐＧＬ２Ａ、ｐＧＬ２Ｂ あるいはｐＧＬ２Ｃと呼ぶ。

本明細書に示した合成リンカ−配列は、第５図に示す様に単一のＥｃｏＲＶおよ びＢｇｌＩＩ制限部位を備えており、そこへ所望のタンパク質のコード領域を挿 入する。挿入すれば、得られたプラスミドは、宿主、たとえばＡ、ニーガー、Ａ 、ニデユランスなどを形質転換するのに使用できる。価主に認識されるプロモー ター領域およびシグナルペプチドのコード領域が存在することによって、タンパ ク質のコード領域を発現させ、その発現されたタンパク質を分泌させることがで きる。

実施例４　ｐＧＬ２ＢＩＦＮ作成時のプラスミドｐＧＬ２の使用 プラスミドｐＧＬ２の使用例を以下に第７図を参照して述べる。第７図では、ｐ ＧＬ２Ｂ由来のプラスミドｐＧＬ２ＢＩＦＨの組立てを図示している。

第５図に示される合成リンカ−配列１Ｂ″を挿入することを除いて、ｐＧＬ２に 関して一般的に述べた方法に従ってプラスミドｐＧＬ２Ｂを作成する。従って、 第７図においては、参照番号４４を’４４Ｂ’と置き換えた。ベクターｐＧＬ２ Ｂに開裂部を設けるために、プラスミドをリンカ−４４Ｂの内部のＥｃｏＲＶ部 位で切断する。開裂によって平滑末端が生じるが、これは、この目的のために有 用であると知られているりガーゼを使用して、平滑末端を両端に持つフラグメン トとライゲイトできる。

第７図に記載する態様においては、ヒトインターフエロンα−２のコード領域を 含有するフラグメント６０を挿入してｐＧＬ２ＢＩＦＮを作成する。具体的には 、ヒトインターフエロンα−２をコードしているコード領域を含むＤｄｅ　Ｉ　 −Ｂａｍ　ＨＩフラグメント６０を、既知であるこの遺伝子の配列および制限地 図に基づいて、プラスミドｐＮ５Ｈ８（表示していない）より取り出した。

プラスミドｐＮ５Ｈ８は、既知のプラスミドｐＡＴ　１５３をＢａｍＨＩ部位で インターフヱロン遺伝子と結合させたものである。そのインターフヱロン遺伝子 は、スロコンブ（Ｓｌｏｃｏｍｂ　）らによるプロナス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ 　）、ＵＳＡ、７９巻、　５４５５−５４５９頁（１９８２）の１フア一ジＭ１ ３ｍｐ７におけるクローンされたインターフェロンα−２遺伝子の高レベルの発 現およびモノクローナル抗体によるその精製１において開示されている。

インターフエロン・フラグメントの粘着末端ヲｐＧＬ２ＢのＥｃｏＲＶ切断部位 にアニールするために、逆転写酵素を用いてＤｄｅＩおよびＢａｍＨＩ　粘着末 端を充填しインターフエロンα−２のコード領域の解読フレームおよび、そのヌ クレオチド配列、および適当な場合にはアミノ酸配列についての再生されたシグ ナルペプチド配列との関係を示している第８図により、ｐＧＬ２の挿入のために リンカ−配列Ｂを選ぶのが都合よいことは明らかであろう。

第８図は、４９におけるメチオニンコドンＡＴＧから始まり、５０におけるリジ ンコドンＡＡＧで終わるグルコアミラーゼのシグナルペプチド配列４２部分に連 結した、シグナル配列の５′部にあるプロモーター領域４０の部分を表わしてい る。実際には、シグナルペプチドのコード領域は、さらにひとつの残基、つまり ５２におけるアルギニンに対応するＣＧＣコドンまで延びているが、この残基は 、リンカ−配列を挿入するための開裂およびライゲイジョンの間に欠損したアル ギニン残基を補うように操作された合成リンカ−配列４４Ｂによって構成されて いる。この様にすれば、シグナルの遺伝子配列は、もとのままである。

同様にリンカ−配列は、解読フレームを変更することなく、インターフエロンα −２のコード領域の挿入を可能にする。第７、および第８図は、ＥｃｏＲＶによ るリンカ−配列４４Ｂの開裂により、平滑末端を有するリンカ−・フラグメント ４４Ｂ′および４４Ｂ″が得られることを示している。インターフェロンα−２ コード領域をＤｄｅ　Ｉ　部位で切り取り、その酵素によって形成した粘着末端 を充填すると、コード領域の配列をきずつけずに所望のヌクレオチド配列がつく られる。Ｄｄｅ　Ｉ部位を充填したインター７ヱロン配列をＥｃｏＲＶで開裂し たリンカ−配列内にライゲイジョンしたものは、リンカ−の４４Ｂ′部とインタ ーフエロンのコードｆｆｌ　域６０の間のトリプレット・コドン状態で明らかの ように、インターフヱロンコード領域の本来の解読フレームを維持している。万 一、リンカ−Ｂよりもヌクレオチドがひとつ少ない第５図に示すリンカ−Ａを選 ぶと、ひとつのヌクレオチドによって全解読フレームがシフトし、ナンセンス配 列となってしまうだろう。合成リンカ−Ｂを選ぶことによって、平滑末端にした ＩＦα−２フラグメントを正しく方向づける時に、コード領域の解読フレームを 変えないシグナルペプチド配列とインター７ヱロンのコード領域の間のコドンを 使用することができる。正しい方向性は、ライゲイジョン結合部にまたがる挿入 体をもったクローンの塩基配列を決めることによって選択する。

実施例５　ｐＧＬ２ＢＩＦＮ　ＡＴＣＣ５３３７１で形質転換されたＡ、ニデユ ランスからの発現および分泌プラスミドｐＧＬ２ＢＩＦＮを同時形質転換した。

すなわち、米国特許出願通し番号６７８，５７８　（１９８４年１２株を、ａｒ ｇＢ選択マーカーを含有する別のブラスミドモ といっしょに同時形質転換した。Ａｒｇ　Ｂ形質転換体を選択すると、その２０ 個のうち１８個が１−１００のコピー数のヒトインターフエロンα−２のコード 領域を含有していた。

いくつかの形質転換体をでんぷん培地上で培養し、グルコアミラーゼ・プロモー ターを誘導して、セルチック（Ｃｅ１ｌＴｅｃｈ　）　Ｉ　Ｆα−２分析キット を用いて、細胞外媒質を定量してヒ）ＩＦα−２を分析した。

全ての形質転換体が、あるレベルの合成と、定量可能なタンパク質の分泌を示し た。２つのコントロール（対照）、つまり宿主菌株（形質転換されていな％Ｎも の）および検出可能なヒトＩＦα−２ＤＮＡを持たないひとつのａｒｇＢ形貢転 形体転換体ては、ＩＦα−２タン、ｓ６り質の合成を検出できなかった。別の実 験では、必要な変更を加えた上記と同様の方法で、ｐＧＬ２ＢＩＦＮを用いて、 Ａ、ニデユランスの代りにＡ、ニーガーを形質転換すると、ＩＦα−２分泌能力 を有するＡ、ニーガーが観察された。

プロモーターとｐＧＬ２ＢＩＦＮのシグナル領域は、Ａ。

ニーガー由来であるけれど、それらはＡ、ニデユランスおよびＡ、ニーガーの両 方において機能し得ること力くわかる。

本発明においては、グルコアミラーゼのプロモーター領域以外のプロモーター領 域も使用できる。第１Ａゼエ遺伝子およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の プロモーター領域を使用するのが適当である。

実施例６　プラスミドｐＡＬＣＡ　Ｉ　Ｓ、　ＡＴＣＣ５３３６８中間型ベクタ ーの組立て 本実施例では、受託番号５３１６９の下、宿主、Ｅ。

Ｃｏ１１　（大腸菌）ＪＭ８３に入れてＡＴＣＣに保管されている１０．３ｋｂ プラスミドｐＤＧ　６中に含まれているａｌｅ　Ａプロモーターを使用した。ｐ 　Ｄ　Ｇ　６のプラスミド地図を第２図に示す。尚、ａｌｃＡプロモーターを使 用するもうひとつの態様の例示を容易にするために、ここで参照する第９図にも このプラスミドを示す。

ｐＤＧ６は、そのＨｉｎｄｕ　−ＥｃｏＲＩ　（最初のもの）セグ一部含んでい る（エンドグルカナーゼのコード領域３０と結合している）。さらにｐＤＧ６は 、Ｃ，フイミのエンドグルカナーゼのフード領域２０の下流に多数のクローン部 位６２を含んでいる。

ａｌｃＡプロモーター領域２２を得るため、ｐＤＧ６をＰｓｔＩおよびＸｈｏ　 Ｉで切断し、エンドグルカナーゼのコード領域の大部分を除去した。第２の工程 では、この直線化したプラスミド６４を、ヱキソヌクレアーゼ■（これはＸｈｏ Ｉ−切断ＤＮＡ末端から切除して行くが、ＰｓｔＩ　末端からは切除しない）を 用いる制御された方法で１方向から切除し、次いでＳ１ヌク１／アーゼて仕置ま でヌクレオチドを除去し、ＴＡＴＡボックスを残し、メツセンジャーＲＮＡの開 始部位を無傷のまま残す様に切断を調節した。

切除した後、ベクター６６を再ライゲート（再環状化）シ、プロモーター領域２ ２のすぐ下流に５ａｌＩ　−Ｘｂａ　Ｉ制限部位を有するベクター６８を創製し た。

５ａｌＩ／ＸｂａＩによるベクター６８の切断により、ベクター内の適切な位置 にシグナルペプチドのコード領域を導入することが可能になる。

本実施例で用いる特定のシグナルペプチドのコード領域を合成してヘイジン（Ｇ 、　Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　、　Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１７−２ １（１９８３）：］が開示している常法に従って同定される特徴あるシグナルペ プチドのコード領域を作成した。Ｓａｌ　Ｉ切断部位に相補的な５′側配列、お よびＸｂａ　Ｉ制限配列とライゲーションしうる３′側配列を供するようにこの 合成シグナルを設計した。

この合成分泌シグナル６８の配列は以下の式で示さ１　−−−−−−−−−＋− 〜−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−ＧＴＡＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＧ ＡＧＣＧＧＣＡＧＴＡＧＡＧＣＭｅ　ｔＴｙｒＡｒｇＰｈｅＬｅｕＡｌａＶａ　 ｌ　Ｉ　１ｅＳｅｒｂａ　Ｉ ↓ ＧＣＣＴｒＣＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴｒＣＧＣＣＡＡＧＴ−−−一−−÷− −−−−−−−−−七−−−−−−−一＝−七−−−−−−６４ＣＧＧＡＡＧＧ ＡＧＣＧＧＴＧＡＣＧＧＡＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＡＴＣＡｌａＰｈｅＬｅｕＡｊ ａＴｈｒＡ１　ａＰｈｅＡｌ　ａＬｙｓＳｅｒＡｒｇこの分泌シグナル自身はＭ ｅｔで始まり、矢印で示した４回目のＡｌａで終わる。

シグナルとして作用するこの合成配列６８が得られたなら、これをベクター７０ のＳａｌ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ部位にクロ−ニングし、ａｌｅＡプロモーター領域 ２２および合成ペプチドシグナルのコード領域６８を含有するプラスミドｐＡＬ ｃＡ１ｓを得る。このシグナルペプチドのコード領域が多重クローニング部位６ ２の上流に挿入されているということは、この部位６２が、種々のタン／々り質 のコード化セグメントをこのプラスミド内にクロ−ニングすることを可能にして いる部位であるという点で重要である。

従って、ｐＡＬｃＡｌｓは本発明の重要な具体何である。

実施例７　プラスミドｐＡＬＣＡ　Ｉ　Ｓ　Ｉ　ＦＮの構築ｐＡＬｃＡ１ｓの有 用性の例として、ｐＡＬＣＡ　Ｉ　Ｓ　Ｉ　ＦＮの創製を示す第１０図について 言及する。このプラスミドは、ａｌｃＡ遺伝子のプロモーター領域２２および合 成シグナルペプチドのコード領域６８〔この両者はｐＡＬＣＡ　Ｉ　Ｓ（第９図 ）由来である〕を含有する。さらに、このプラスミドはｐＧＬ２ＢＩＦＮ由来の ヒトインターフエロンα−２をコードしているコード領域６ｏを含有している。

タンパク質のコード化セグメントを得るために、ｐＧＬ２ＢＩＦＮをＥ　ｃｏ　 ＲＩで切断し、そしてＢｇｌＩ［で部分的に切断する（内部にＢｇｌ　ＩＩ部位 が存在するので）。

このタンパク質のコード領域の挿入は、ｐＡＬｃＡｌｓをＢａｍＨＩおよびＥｃ ｏＲＩで切断しくこの両者は、多重クローニング部位６２中に存在する）、そこ へ該コード領域をライゲートすることによって行なわれ、こうしてｐＡＬｃＡｌ ｓＩＦＮ　が創製される。

得られたプラスミドのヌクレオチド配列、すなわちＨｉｎｄＩ［（７）　１１７ ０　ヌクレオチド下流の部位からＥｃｏＲＩまでを、制限ヱンドヌクレアーゼ消 化の関連部位を表示する第１１図に示す。第１１図の３から、このＩＦα−２コ ード領域６０が合成シグナルペプチドのコード領域６８の適切な解読フレーム内 に存在することがわかるであろう。

実施例８　プラスミドＡＬＣＡＩＳＩＦＮで形質転換したＡ、ニデユランスから の発現および分泌上記のようにしで調製したプラスミドｐＡＬＣＡ　Ｉ　Ｓ　Ｉ 　ＦＮをＡ、ニデユランスといっしょにして同時形質転換して選別し、ヒトイン ターフエロンα−２のコード領域の存在についてチェックし、次いでスレオニン 含有培地前記実施例３の記載と同様にして）。セル・チク（Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｌ 〕）　Ｉ　Ｆα−２検定キツトを用いて、この細胞外培地をヒｌ−ＩＦ−２につ いて検定した。形質転換体２０個のうち１１個が、スレオニンの存在下で誘起さ れ、そしてグルコースの存在下で抑制されるインターフエロンの分泌を示した。

実施例９　ｐＧＬ２ｃＥＮＤｏ　ＡＴＣＣ５３３７２リンカ−配列＃Ｂ″のかわ りに合成リンカ−配列１Ｃ’　（第５図）を用い、第７図で示されるｐＧＬ２Ｂ ＩＦＮに類似しているが、インターフェロン２コード領域ノかわりにヱンドグル カナーゼコード領域を含有する、ｐＧＬ２ＣＥＮＤＯと命名したベクタープラス ミドを、プラスミドｐＧＬ２ＣＡＴＣＣ５３３６７から、前記実施例にフラグメ ントをｐＧＬ２ＣのＢｇｌＩＩ部位に挿入した。Ａ。

ニデユランス形質転換体はこのベクタープラスミドから調製され、この形質転換 体はデンプン調節性のセルラーゼ分泌を示した（実施例１の記載のようにして検 定して）。ベクタープラスミドｐＧＬ２ｃＥＮＤｏの地図を添付の第１２図に示 すが、ここで３０はヱンドグルカナーゼコード領域（第２図および実施例１に関 連して記載した、セルロモナス・フィミのヱンドグルカナ−４’：Ｉ−ＮＩＭ） を、４２はグルコアミラーゼ遺伝子のシグナルペプチドのコード領域を、そして ４０はグルコアミラーゼ遺伝子のプロモーター領域を示ス。このヌクレオチド配 列を第１３図に示すが、これは、リンカ−配列Ｃ（第５図）の使用によってシグ ナルペプチドコード化領域４２およびヱンドグルカナーゼコード化領域３０の解 読フレームが保持されていることを例証している。

５３３７０の構築 前記実施例に記載の方法に従い、実施例５（第９図）に記載したようにしてＥｃ ｏＲＩで直線化したプラスミドｐＡＬＣＡ　Ｉ　Ｓ　を、プラスミドｐＤＧ５Ｂ 　（ｐＵｃ１２が逆向きであるＨｉｎｄＩ［フラグメントの配向を有するｐＤＧ ５；第２図参照）由来であり、かつヱンドグルカナーゼコード化領域３０を含有 するＥｃｏＲＩフラグメントと結合させることによって、ｐＡＬＣＡＩＳＥＮＤ Ｏと命名したベクタープラスミドを構築した。ｐＡＬｃＡｌｓＥＮＤｏ　ｌニア ）地図を第１４図に示し、その関連領域のヌクレオチド配のプロモーター領域は 数字２２で、合成シグナルペプチドコード化領域は６８で、そしてヱンドグルカ ナーゼコード化領域は３０で表示する。

質転換したＡ、ニデユランスからの発現および分泌前記のようにして調製したプ ラスミドｐＡＬＣＡ　Ｉ　ＳＥＮＤＯまたはｐＧＬ２ｃＥＮＤｏおよびａｒｇＢ ＋”Ａ別可能マーカーで、Ａ、ニデユランスを同時形質転換した。得られた同時 形質転換体のうち数個が、実施例１に記載したものと同じモノクローナル抗体試 験系およびカルボキシメチルセルロースプレートで検定したとき、レベルの異な るセルラーゼ（すなわちヱンドグルカナーゼ）の分泌を示した。両プラスミドの 形質転換体は、結合させたプロモーターによって制御される分泌を示した。プラ スミドｐＧＬ２ｃＥＮＤｏはデンプンで誘起し、ｐＡＬＣＡ　Ｉ　５ＥＮＩ力は スレオニンで誘起した。

ｐＧＬ２ｃＥＮＤｏで同時形質転換した。形質転換体のい（ツカがレベルの異な るヱンドグルカナーゼの分泌を示した（実施例１．に記載のように検定して）。

この分泌は培地中にデンプンを存在させることによって誘起した。

アスペルギルス・ニデユランスにおいて適切な誘導物質（たとえばエタノール） の存在下、ａｌｃＲ（ａｌｃ　Ａのだめの陽性調節遺伝−ｆ）の遺伝子産物の作 用によって、ａｌｃＡプロモーターを作動させる。

多重コピー形質転換体（多数のａｌｅ　Ａプロモーターをター機能を制限してい ることを示唆する。

３１ｃＲ遺伝子のコピー数の増加はａｌｅＲの発現を増加させ、このような状況 を改善する。この証拠は以下のよを過剰生産することがわかっている）では、そ れ自身のコード領域（ＡＤＨＩ）と融合した多重コピーａｌｃＡプロモーターを 有する形質転換体は、エタノール上では十分に増殖しない。これは、おそらくエ タノールのＡＤＨ分解の産物であるアルデヒドの急速な蓄積によるものであろう 。これらの菌株中のＡＤＨ活性は高い。コピー数の増加によりＡＤＨ活性が増加 したというのが、おそらくこれらの観察結果の説明となろう。

多重ａｌｅ　Ｒという状況下では、インターフヱロンσ−質転換体は、かなり高 レベルの分泌インターフエロンを産生する。これらの菌株においては、単一コピ ーすなわち、本発明の好ましい態様は、形質転換されたときには所望のタンパク 質を分泌するであろう糸状菌類宿主に、コード領域を導入するための手段を提供 するものである。この目的のための特に有用な中間型プラスミドはｐＡＬＣＡ　 Ｉ　ＳおよびｐＧＬ２　（Ａ　、　ＢまたはＣ）である。

これらのプラスミドから創製された有用な形質転換ベクターには、ｐＡＬｃＡｌ ｓＩＦＮ　、　ｐＧＬ２ＢＩＦＮ。

ｐＡＬｃＡｌｓＥＮＤｏおよびｐＧＬ２　ＣＥＮＤＯが含まれる。これらのプラ スミドおよび本明細書に挙げたその他のプラスミドそれぞれの培養物は、現在永 久生存しうる状態でアレリツクス社（Ａ１１ｅｌｉｘ　Ｉｎｃ、、　６８５０　 Ｇｏｒｅｗａｙ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ　、　０ｎｔａｒｉｏ 　、　Ｃａｎａｄａ　）の研究室に保管されている。これらのプラスミドは、本 特許出願が継続している間じゆうこの状態で保管し、許可を与えられた者が利用 できるようにする。本出願について特許が付与された後は、ブダペスト条約に基 づいて認められたＡＴＣＣ寄託機関から制限されることなく利用することができ るようにする。寄託物およびそれぞれの受託番号を以下の表に挙げる。

Ｈ↓　Ｏ↓　【１１↓　（Ｊ　Ｊ−Ｃ”ｌ　４．ｓｌ’ふＡｒｇＡｌａＡｓｐＬ ｅｕＡｓｐ工１ｅＧｌｕ？？ＡｒｇＡ１ａＡｒｇＳｅｒＡｒｇＴｙｒＡｒｇＡｌ ａＡｒ（ｉＡｌａＬｙｓ工１ｅｖｅｒ工１ｅｓｅｒｓｅｒ？−↓　Ｃ”Ｕ　Ａ　 ＋＋１！　五　−ＪＬｓ１国際調査報告 ＋−Ｉ＠−−ｕ−−ムｅｏｎ−−＝”ＰＣＴ／ＧＢ８６１００２０９−２−１＋ ｌ＃Ｍ８１１６Ｎｆｆｉｌ＾ｐｐｎ＋、Ｉ朝−、、ＰＣＴ／ＧＢ　８６１００２ ０９　−３−Ａ−”；’ＮＥＸＴｏ’１ＨＥＸＦコニ：’ＥＲＮＡＴＸＯＮＡＬ ＳＥ；≧１＝電：ＣＨＲＥｐ○ＲＴＯＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．機能的にコード領域と連結する時該コード領域の転写を促進する、糸状菌類 で機能し得るプロモーターを含有してなるＤＮＡ構築物。 ２．該プロモーターが、糸状菌類遺伝子由来のものである第１項に記載の構築物 。 ３．該プロモーターが、アスペルギルス・ＳＰの遺伝子由来のものである第２項 に記載の構築物。 ４．該プロモーターが、アスペルギルス・ニデユランス由来のものである第３項 に記載の構築物。 ５．該プロモーターが、アスペルギルス・ニデユランスのアルコールデヒドロゲ ナーゼＩ遺伝子のプロモーターである第４項に記載の構築物。 ６．該プロモーターが、アスペルギルス・ニデユランスのアルデヒドデヒドロゲ ナーゼ遺伝子のプロモーターである第４項に記載の構築物。 ７．該プロモーターが、アスペルギルス・ニーガー遺伝子由来のものである第３ 項に記載の構築物。 ８．該プロモーターが、アスペルギルス・ニーガーのグルコアミラーゼ遺伝子の プロモーターである第７項に記載の構築物。 ９．糸状菌類で機能するＤＮＡ配列であって、タンパク質のコード領域が該ＤＮ Ａ配列と適切な翻訳解読フレーム中にある時に、該タンパク質のコード領域によ ってコードされているタンパク質の分泌を信号するＤＮＡ配列であり、実質的に 以下に規定するヌクレオチド配列を持つたＤＮＡ配列： 【配列があります】 １０．タンパク質をコードしているコード領域と機能的に連結している、糸状菌 類中で機能するプロモーターを含有するＤＮＡ構築物。 １１．コード領域がプロモーターにとって外来性のものである第１０項に記載の 構築物。 １２．プロモーターが糸状菌類由来のものである第１１項に記載の構築物。 １３．プロモーターがアスペルギルス・ｓｐの糸状菌類由来のものである第１１ 項に記載の構築物。 １４．プロモーターがアスペルギルス・ニデユランスあるいはアスペルギルス・ ニーガー由来のものである第１１項に記載の構築物。 １５．プロモーターが、アスペルギルス・ニデユランスのアルコールデヒドロゲ ナーゼＩ遺伝子のプロモーター、アスペルギルス・ニデユランスのアルデヒドデ ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターおよびアスペルギルス・ニーガーのグルコ アミラーゼ遺伝子のプロモーターから選ばれる第１１項に記載の構築物。 １６．セルロモナス・フイニのエンドグルカナーゼコード領域と機能的に連結し ているアスペルギルス・ニデユランスのアルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子の プロモーターを含有している第１０項に記載の構築物。 １７．ＡＴＣＣカタログ番号５３１６９のプラスミドｐＤＧ６上に含まれる第１ ６項に記載の構築物。 １８．コード領域が完全なシグナルペプチドのコード領域を天然に含有している 第１１項に記載のＤＮＡ発現ベクター。 １９．プロモーターが糸状菌類由来のものである第１８項に記載の構築物。 ２０．プロモーターがアスペルギルス・ｓｐの糸状菌類由来のものである第１８ 項に記載の構築物。 ２１．プロモーターがアスペルギルス・ニデユランスあるいはアスペルギルス・ ニーガー由来のものである第１８項に記載の構築物。 ２２．プロモーターが、アスペルギルス・ニデユランスのアルコールデヒドロゲ ナーゼＩ遺伝子のプロモーター、アスペルギルス・ニデユランスのアルデヒドデ ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターおよびアスペルギルス・ニーガーのグルコ アミラーゼ遺伝子のプロモーターより選ばれる第１８項に記載の構築物。 ２３．プラスミドｐ５０１上に含まれる小麦ａ−アミラーゼのコード領域と機能 的に連結しているアスペルギルス・ニデユランスのアルコールデヒドロゲナーゼ Ｉ遺伝子のプロモーターを含有している第１８項に記載の構築物。 ２４．ＡＴＣＣカタログ番号５３３８０のプラスミドｐＡＬＣＡＩＡＭＹ上に含 まれる第２３項に記載の構築物。 ２５．ａ）糸状菌類において機能するプロモーター；ｂ）プロモーターと機能的 に連結しているシグナルペプチドのコード領域であって、該シグナルペプチドと 機能的に融合しているタンパク質の分泌を信号する、糸状菌類中で機能するポリ ペプチドをコードしている該シグナルペプチドのコード領域；および、Ｃ）該シ グナルペプチドのコード領域と連結されていて、さらに、タンパク質のコード領 域が該シグナルペプチドのコード領域と適切な翻訳解読フレーム中にくるように 、該タンパク質のコード領域を挿入することのできる制限部位を規定しているＤ ＮＡのセグメント：を５′から３′の方向で含んでいるＤＮＡ構築物。 ２６．該プロモーターが糸状菌類由来のものである第２５項に記載の構築物。 ２７．該シグナルペプチドのコード領域が、糸状菌類由来のものである第２６項 に記載の構築物。 ２８．該シグナルペプチドのコード領域が、アスペルギルス・ニーガーあるいは アスペルギル久・ニデユランスより分泌されるタンパク質をコードしている遺伝 子由来のものである第２７項に記載の構築物。 ２９．該シグナルペプチドのコード領域が、アスペルギルス・ニーガーのグルコ アミラーゼ遺伝子のシグナルペプチドのコード領域である第２６項に記載の構築 物。 ３０．プロモーターが、アスペルギルス・ニーガーのグルコアミラーゼ遺伝子の プロモーターである第２９項に記載の構築物。 ３１．ＡＴＣＣカタログ番号５３３６５のｐＧＬ２Ａ、ＡＴＣＣカタログ番号５ ３３６６のｐＧＬ２ＢおよびＡＴＣＣカタログ番号５３３６７のｐＧＬ２Ｃから 選ばれるプラスミド上に含まれる第３０項に記載の構築物。 ３２．該シグナルペプチドのコード領域が、糸状菌類中で機能するシグナルペプ チドのコード領域に特徴的なヌクレオチド配列を有する第２６項に記載の構築物 。 ３３．該シグナルペプチドのコード領域および該ＤＮＡセグメントが、以下のよ うなヌクレオチドの配列を実質的に有する第３２項に記載の構築物。 【配列があります】 ３４．プロモーターが、アスペルギルス・ニデユランスのアルコールデヒドロゲ ナーゼＩ遺伝子のプロモーターである第３３項に記載の構築物。 ３５．ＡＴＣＣカタログ番号５３３６８であるプラスミドｐＡＬＣＡＩＳ上に含 まれる第３４項に記載の構築物。 ３６．ａ）糸状菌類で機能するプロモーター；ｂ）該プロモーターと機能的に連 結しているシグナルペプチドのコード領域であり、タンパク質に機能的に融合さ れる時、糸状菌類由来のタンパク質の分泌を信号するように機能するシグナルペ プチドをコードしている該シグナルペプチドのコード領域；およびＣ）タンパク 質をコードしているタンパク質のコード領域であって、シグナルペプチドのコー ド領域と適切な翻訳解読フレーム中で連結されている該タンパク質のコード領域 ：を５′から３′の方向で含むＤＮＡ構築物。 ３７．少なくともひとつの該プロモーター、該シグナルペプチドのコード領域お よび該タンパク質のコード領域が、その他方の該プロモーター、該シグナルペプ チドのコード領域および該タンパク質のコード領域にとつて外来性である第３６ 項に記載の構築物。 ３８．該タンパク質のコード領域が、該シグナルペプチドのコード領域および該 プロモーターにとつて外来性である第３７項に記載の構築物。 ３９．該プロモーターおよび該シグナルペプチドのコード領域が、糸状菌類由来 のものである第３８項に記載の構築物。 ４０．該プロモーターおよび該シグナルペプチドのコード領域が、アスペルギル ス・ｓｐ由来のものである第３８項に記載の構築物。 ４１．プロモーターが、アスペルギルス・ニデユランスのアルコールデヒドロゲ ナーゼＩ遺伝子のプロモーター、アスペルギルス・ニデユランスのアルデヒドデ ヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターおよびアスペルギルス・ニーガーのグルコ アミラーゼ遺伝子のプロモーターから選ばれる第４０項に記載の構築物。 ４２．プロモーターが、アスペルギルス・ニーガーのグルコアミラーゼ遺伝子の プロモーターであり、シグナルペプチドのコード領域が、該遺伝子のシグナルペ プチドのコード領域である第４０項に記載の構築物。 ４３．タンパク質のコード領域が、セルロモナス・フイミのエンドグルカナーゼ 遺伝子のエンドグルカナーゼ・コード領域である第４２項に記載の構築物。 ４４．ＡＴＣＣカタログ番号５３３７２のプラスミドｐＧＬ２ＣＥＮＤＯ上に含 まれる第４３項に記載の構築物。 ４５．タンパク質のコード領域が、ヒトインターフエロンａ−２遺伝子のインタ ーフエロンａ−２コード領域である第４２項に記載の構築物。 ４６．ＡＴＣＣカタログ番号５３３７１のプラスミドｐＧＬ２ＢＩＦＮ上に含ま れる第４５項に記載の構築物。 ４７．該シグナルペプチドのコード領域が、糸状菌類で機能する糸状菌類由来の シグナルペプチドコード領域に特徴的なヌクレオチドの配列を有している第３８ 項に記載の構築物。 ４８．プロモーターが糸状菌類由来のものである第４７項に記載の構築物。 ４９．シグナルペプチドのコード領域が、実質的に以下に示すヌクレオチド配列 を有する第４８項に記載の構築物。 【配列があります】 ５０．シグナルペプチドのコード領域と機能的に連結しているプロモーターが、 アスペルギルス・ニデユランスのアルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子のプロモ ーター、アスペルギルス・ニデュランスのアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の プロモーターおよびアスペルギルス・ニーガーのグルコアミラーゼ遺伝子のプロ モーターから選ばれる第４９項に記載の構築物。 ５１．アスペルギルス・ニデュランスのアルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子の プロモーターからなる第４９項に記載の構築物。 ５２．該シグナルペプチドのコード領域と連結されるタンパク質コード領域が、 セルロモナス・フイミのエンドグルカナーゼ遺伝子のエンドグルカナーゼ・コー ド領域である第５１項に記載の構築物。 ５３．ＡＴＣＣカタログ番号５３３７０のプラスミドｐＡＬＣＡＩＳＥＮＤＯ上 に含まれる第５２項に記載の構築物。 ５４．シグナルペプチドのコード領域と連結されるタンパク質のコード領域が、 ヒトインターフエロンａ−２遺伝子のインターフエロンａ−２コード領域である 第５１項に記載の構築物。 ５５．ＡＴＣＣカタログ番号５３３６９のプラスミドｐＡＬＣＡＩＳＩＦＮ上に 含まれる第５４項に記載の構築物。 ５６．糸状菌類宿主に導入した時、該宿主を形質転換するベクターであって、第 １０項−第２４項および第３６項−第５５項のいずれかに規定されているＤＮＡ 構築物からなる発現ベクター。 ５７．ＤＮＡ発現ベクターで形質転換される宿主が、アスペルギルス・ｓｐであ る第５６項に記載のベクター。 ５８．ＤＮＡ発現ベクターで形質転換される宿主が、アスペルギルス・ニデユラ ンスである第５６項に記載のベクター。 ５９．ＤＮＡ発現ベクターで形質転換される宿主が、アスペルギルス・ニーガー である第５６項に記載のベクター。 ６０．プラスミド形態である第５７項に記載のＤＮＡ発現ベクター。 ６１．プラスミドｐＤＧ６ＡＴＣＣ５３１６９である第５７項に記載のＤＮＡ発 現ベクター。 ６２．プラスミドｐＡＬＣＡＩＡＭＹＡＴＣＣ５３３８０である第５７項に記載 のＤＮＡ発現ベクター。 ６３．プラスミドｐＡＬＣＡＩＳＥＮＤＯＡＴＣＣ５３３７０である第５７項に 記載のＤＮＡ発現ベクター。 ６４．プラスミドｐＡＬＣＡＩＳＩＦＮＡＴＣＣ５３３６９である第５７項に記 載のＤＮＡ発現ベクター。 ６５、プラスミドｐＧＬ２ＢＩＦＮＡＴＣＣ５３３７Ｉである第５７項に記載の ＤＮＡ発現ベクター。 ６６．プラスミドｐＧＬ２ＣＥＮＤＯＡＴＣＣ５３３７２である第５７項に記載 のＤＮＡ発現ベクター。 ６７．糸状菌類細胞にとって外来性のタンパク質を発現する能力を有する該糸状 菌類細胞。 ６８．第１０−２４項および第３６−５５項のいずれかに規定されるＤＮＡ構築 物によって形質転換された糸状菌類細胞。 ６９．アスペルギルス・ｓｐ種である第６８項に記載の形質転換体。 ７０．アスペルギルス・ニデユランス種である第６８項に記載の形質転換体。 ７１．アスペルギルス・ニーが一種である第６８項に記載の形質転換体。 ７２．該構築物のコピーを多数含む第６８項に記載の形質転換体。 ７３．形質転換体が、通常レベルの調節遺伝子生産物よりも高度に発現する第７ ２項に記載の形質転換体。 ７４．該構築物に含まれるプロモーターの転写促進機能を調節する遺伝子の多重 コピーによって、通常レベルの調節遺伝子生産物よりも高度に発現する第７３項 に記載の形質転換体。 ７５．アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子のプロモーターおよびａｌｃＲ遺伝 子の多重コピーからなる構築物の多重コピーを含む第７４項に記載の形質転換体 。 ７６．適切な発育条件下で第６８−７５項に規定する糸状菌類細胞を培養するこ とからなる、該糸状菌類細胞でタンパク質を発現させる方法。 ７７．プロモーターの転写促進機能を誘導あるいは抑制する物質の存在をコント ロールするという条件下で、菌類を培養する第７６項に規定の方法。 ７８．糸状菌類細胞にとって外来性のタンパク質を分泌する能力を有する該糸状 菌類細胞。 ７９．第１８−２４項および第３６−５５項のいずれかに規定のＤＮＡ構築物に よって形質転換された糸状菌類細胞。 ８０．アスペルギルス・ｓｐ種である第７９項に記載の形質転換体。 ８１．アスペルギルス・ニデユランス種である第７９項に記載の形質転換体。 ８２．アスペルギルス・ニーが一種である第７９項に記載の形質転換体。 ８３．当該構築物の多重コピーを含む第７９項に記載の形質転換体。 ８４．形質転換体が、通常レベルの調節遺伝子生産物よりも高度に発現する第８ ３項に記載の形質転換体。 ８５．当該構築物に含まれるプロモーターの転写促進機能を調節する遺伝子の多 重コピーによって、通常レベルの調節遺伝子生産物よりも高度に発現する第８４ 項に記載の形質転換体。 ８６．アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子のプロモーターおよびａｌｃＲ遺伝 子の多重コピーよりなる構築物の多重コピーを含む第８５項に記載の形質転換体 。 ８７．適切な発育条件下で菌類を培養することからなる、第７９−８６項に規定 の糸状菌類細胞にタンパク質を発現させ、分泌させる方法。 ８８．プロモーターの転写促進機能を誘導あるいは抑制する物質の存在をコント ロールするという条件下で、菌類細胞を培養する第８７項に記載の方法。