JPH0223890A

JPH0223890A - 新規な酵素活性測定用基質

Info

Publication number: JPH0223890A
Application number: JP63173789A
Authority: JP
Inventors: Shuichi Nakatsuyama; 中津山　秀一; Yoshio Nakamura; 中村　善夫; Katsumasa Kuroiwa; 黒岩　勝昌; Takeshi Nagasawa; 長澤　健
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1988-07-14
Filing date: 1988-07-14
Publication date: 1990-01-26
Anticipated expiration: 2009-12-21
Also published as: JPH06104079B2; EP0350915B1; EP0350915A3; US5116941A; DE68915216D1; EP0350915A2; DE68915216T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】俺泉上０憇里止訪本発明は、トリプシンなどの酵素活性測定用の新規発色
性且つ蛍光性基質に関する。本発明の基質は、従来報告
されている基質に比して、極めて選択性よく例えばトリ
プシン定量を行う事が出来、トリプシンが形成、阻害又
は消費される反応の研究、又はそれ等に関与する因子、
例えばトリプシノーゲン及びトリプシンインヒビターの
測定にも利用できる。また医療分野においては、膵炎の
診断薬として有用である。

従来０扶亜トリプシンなどの酵素を定量する方法としては、酵素と
反応する基質を利用して酵素を測定する方法がこれまで
多く開発されてきた。

例えば、トリプシン測定用基質として古くはゼラチン、
ヘモグロビン等の蛋白質が用いられていたが、膵炎や十
二指腸液では他の蛋白質分解酵素（キモトリブシン等）
が共存するため、この基質を用いてトリプシンを測定す
る方法は適さない。トリプシンが、蛋白質分解作用の他
にアミダーゼ、エステラーゼ作用を有していることがＢ
ｅｒｇｍａｎ　”４　［Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、μ３０８１〜８６　（１９３
９月によって報告されて以来、アルギニンのアミド結合
又はエステル結合に基づいた測定法として多くの合成基
質（例えば、Ｂｚ−Ｌ−Ａｒｇ−ＯＥｔ、　Ｔｏｓ−Ｌ
−Ａｒｇ−〇Ｍｅ、　Ｂｚ−ＤＬ−Ａｒｇ−ＰＮＡ、　
Ｔｏｓ−Ｌ−Ａｒｇ−ＰＮＡ等）が利用されてきたが、
基質の特異性や感度が低い問題があった。更に、トリプ
シン測定用基質としてＺ　−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
ＰＮＡ　（ＣＨＲ−ＴＲＹ、　Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社
。

Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　
４２７８７６２．　ｐａｔｅｎｔｅｄ　ｏｎＪｕｌ、　
１４．１９８１　）が開発された。

発明が角、決しようとする課題一般に、酵素測定用合成基質は、酵素に対する高感度及
び特異性、水或は緩衝液に対する良好な溶解性及び分解
物の易検出性の４点を満足する事が重要である。

このうちでも、測定しようとする酵素に対する高い特異
性は、特に重要であり、従来開発されて来た最良のトリ
プシン測定用基質としては、上記のＣＨＲ−ＴＲＹがあ
げられるが、基質特異性の点に於いて必ずしも満足出来
るものではない。

即ち、ＣＨＲ−ＴＲＹは、蛋白質分解酵素のうちトリプ
シン以外にトロンビン、プラスミン、第Ｘａ因子と可成
り反応する事が解っている。

更に、ＣＨＲ−ＴＲＹの如き基質を用いてトリプシンを
測定する場合には、該基質とトリプシンとを反応させて
生成する発色性化合物ｐ−ニトロアニリンを定量してト
リプシンを測定するものであるが、生成するｐ−ニトロ
アニリンの黄色を比色する際には、生体試料中の夾雑物
の影響を免かれる事は出来ない。

しかして、本発明の目的はトリプシンなどの酵素を簡単
で迅速に測定でき、尚且つ前述の４条件を満足する酵素
活性測定用基質を提供することである。

課題を月決するための手段本発明者等は、新規なトリプシンなどの酵素活性測定用
基質の開発研究を行った結果、上記の問題点を解決でき
る優れた性質を有する基質を見出した。

本発明による新規な酵素活性測定用基質は、次の一般式％式％［式中、Ａ１はＬもしくはＤのＰｒｏ　Ｇｌｕ又はＬもしくはＤ
のＧｌｕ（ＯＲ）（ＯＲはグルタミン酸のｒ位のカルボ
キシ基に結合する基であり、Ｒは水素原子又は１〜８個
の炭素原子を有する脂肪族炭化水素残基である）；Ａ２
はＧｌｙ　、　Ｐｒｏ　、　Ｐｉｐ　、　Ａｌａ　、　
Ｖａｌ　、　Ｂｕｔ　、　ＮＶａｌ又はＮＬｅｕである
。】で表わされる。本発明の酵素活性測定用基質は、特に発
色基として、３−カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリ
ドを用いる事を特徴とする。本基質は、発色基にヒドロ
キシル基、カルボキシル基と言う極めて親水性の高い基
を持つために卓越した水に対する溶解特性を持っている
。

本明細書において使用する略号の意味は以下の通りであ
る。

Ａｒｇ　　　＝アルギニンＧ１ｙ＝グリシンＰｒｏ　　　　＝プロリンＰｉＰ　　　　＝ピペコリン酸Ａｌａ　　　　＝アラニンＶａｌ　　　＝バリンＢｕｔ　　　　＝２−アミノ酪酸ＮＶａｌ　　　＝ノルバリンＮＬｅｕ　　　＝ノルロイシンＧｌｕ　　　　＝グルタミン酸ＰｙｒｏＧｌｕ　＝ピログルタミン酸Ａｒｇ（Ｎｏ２）　＝δ−グアニジノ基がニトロ基で保
護されたアルギニンＢＯＣｚｏｓＭＦｅＯＨＥＭＳＰＤＯ８ｕ０ＬＢｕ −Ｏ’Ｐｒ −０’ＰｒＰＮＡＣＨＡＬＣＰＣｃＯＨｕＯＨｃＯＥｔ＝ベンジルオキシカルボニルも−ブチルオキシカルボニル＝ベンジル＝ｐ−トルエンスルフォニル＝ジメチルホルムアミド＝メタノール＝Ｎ−エチルモルホリン＝４，６−シメチルピリミジンー２−チオコサクシミド
オキシ＝Ｌ−ブトキシ＝ｎ−プロピルオキシ＝ｉミープロピルオキシｐ−ニトロアニリド＝３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド＝薄層クロマトグラフィー＝ゲル濾過クロマトグラフィー＝酢酸＝ｎ−ブタノール＝酢酸エチル上記式［Ｉ］において、Ａ１はＬもしくはＤのＰｙｒ。

Ｇｌｕ又はＬもしくはＤのＧｌｕ　（ＯＲ）である。こ
こでＯＲはグルタミン酸のｒ位のカルボキシ基に結合す
る基であり、Ｒは水素原子又は１〜８個の炭素原子を有
する脂肪族炭化水素残基　（この場合、ＯＲはエステル
を形成する）を示す。かかる脂肪族炭化水素残基として
は、例えばメチル、エチル、ｉ−プロピル、ｎ−プロピ
ル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル。

ヘキシル、オクチルなどの炭素数１〜８のアルキル基；
シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シク
ロへブチル、シクロオクチルなどの炭素数３〜８のシク
ロアルキル基等が挙げられる。なかでもメチル、エチル
、ｉ−プロピル、ｎ−プロピルなどの炭素数１〜４のア
ルキル基が好ましい。

Ａ２はＧｌｙ、　Ｐｒｏ、　Ｐｉｐ、　Ａｌａ、　Ｖａ
ｌ、　Ｂｕｔ、　ＮＶａｌ又はＮＬｅｕである。

上記式［Ｉ］におけるアミノ酸残基は、ことわりのない
限りＬ体である。

本発明の基質は酸付加塩であってもよく、かかる酸付加
塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩。

リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸塩；コハク酸塩
、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、ベンゼンスルホン
酸塩などの有機酸塩等が挙げられる。

上記式［Ｉ］で表わされる本発明の基質は、ペプチド化
学においてよく知られる方法により合成される。

即ち、本発明の基質合成は、最初、発色基となる３−カ
ルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリンをアルギニンに結
合させ、次いで逐次的にアミノ酸をカップリングしてい
く方法により合成することが出来る。或いは、Ｎ−末端
ジペプチドフラグメント自体をあらかじめ合成し、それ
に発色基が結合したアルギニンを結合する事によって合
成することも可能である。

上記のカップリングあるいは結合反応を行なうに際して
は、反応を行なうアミノ酸、ジペプチドフラグメントな
どの分子中に存在する、反応に直接関与しないアミノ基
、カルボキシ基は、ペプチド合成で通常使用される保護
基で保護する。

アミノ保護基としては、カルボベンゾキシ、１−ブチル
オキシカルボニル、又はそれらに関連する基、例えば、
ｐ−メトキシ、ｐ−二トロ又はｐ−メトキシフェニルア
ゾールカルボベンゾキシ等を用いるのが有利である。カ
ルボキシ保護基としては、ベンジル、Ｌ−ブチルなどに
よるエステル基が有利である。アルギニンを反応に用い
るに際しては、アルギニンのδ−グアニジノ基を保護す
る。アルギニンのδ−グアニジノ基の保護には、ニトロ
基やプロトン化を用いるのが有利である。

以上に述べた保護基は、反応後、それ自体公知の方法に
よって脱離することができる。

２個のアミノ酸のカップリング、ジペプチドフラグメン
トとアミノ酸のカップリング、３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシ−アニリンとアルギニンの結合反応等は、ペプ
チド合成に通常使用される活性エステル化法、混合酸無
水物法あるいはカルボジイミド法により行うことができ
る。

活性エステル化法は、α−カルボキシル基の活性化によ
り行われる。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニックイミ
ド、ｐ−ニトロフェノール、トリクロロフエノール、４
，６−シメチルピリミジルー２−チオール全周いた活性
エステル化法が有利である。

混合酸無水物法では、炭酸モノアルキルエステル塩化物
２例えば、イソブチルクロロフォルメートを用いるのが
有利である。

カルボジイミド法では、カルボジイミド、例えば、Ｎ、
　Ｎ’　　−ジシクロへキシルカルボジイミド（Ｄ。

Ｃ，Ｃ，）の存在下で行うのが有利である。

上記式ＩＩＩのＧｌｕ（ＯＲ）の場合のグルタミン酸の
ｒ位のカルボキシ基のエステル化は、対応するアルコー
ルとの脱水縮合、例えば酸触媒下にｉ−プロパツールな
どとの脱水縮合により行うことができる。

発明の効果本発明の酵素活性測定用基質の特徴は、特にトリプシン
に対する優れた基質特異性を有する点にある。例えば、
本発明の新規基質ＰＳ−１２４５Ｈ−Ｐｙｒｏ　Ｇｌｕ
　−Ａｌａ　−Ａｒｇ　−ＣＨＡ及び従来の基質ＣＨＲ
−ＴＲＹ　（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ社、参考例）と、蛋
白質分解酵素であるトリプシン（Ｔｒｙ）、　トロンビ
ン（ＴＨ）、プラスミン（ＰＬ）、第Ｘａ因子（ＦＸａ
　）等との相対反応性を、ＣＨＲ−ＴＲＹを１００とし
て示すと、第１表の如くなり、トロンビン、プラスミン
、第Ｘａ因子等に対する反応性が、本発明の新規基質の
場合には著しく低く、例えば、トロンビンは１２％、プ
ラスミン３６％、第Ｘａ因子１９％しか反応せず、他方
トリプシンに対しては２７８％と極めて高い反応性を示
す。従って本発明の新規基質は特にトリプシンに対して
優れた基質特異性を有する事が判る。

本発明の基質の用途は、既に述べた通りトリプシンなど
の酵素活性測定であるが、その場合当該基質をｐＨ８，
０〜１０．０間の緩衝液中で例えばトリプシンに作用さ
せ生成する３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンを
適当な着色物に導き、これを比色定量することにより例
えばトリプシン活性を測定できる。あるいは又、励起波
長３２８ｎｍ、蛍光波長５４０　ｎｍにて蛍光分析法に
より、定量することにより例えばトリプシン活性を測定
する事も可能である。

着色物に導く方法としては、ペンタシアノアミンフェロ
エート法やカプラーと酸化縮合させる方法がある。カプ
ラーとしては、酸性側での発色の場合は、アニリン系化
合物、例えば、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、アルカリ側
では、フェノール、ナフトール、２，６−キシレノール
、チモール、０−クレゾール、０−エチルフェノール等
が用いられる。

酸化縮合の酸化剤として、過酸化水素、過硫酸塩等、種
々のものが用いられるが、メタ過ヨウ素酸が好適である
。

３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンを適当な着色
物に導くことにより極大吸収波長が５６０〜７７０ｎｍ
中に分布するが、呈色の温度による変動は極めて少く安
定で、トリプシンなどの酵素活性測定に適している。更
に発色感度を比べてみても、従来の発色性基質のｐ−ニ
トロアニリンの場合、一般測定波長４０５　ｎｍにて、
ε＝　１０６００であるのに対し、上記のペンタシアノ
アニンフェロエート法ではλ＝７００ｎｍで、ε：２１
，５００、酸化縮合による発色に於いては、０−エチル
フェノールの場合λ＝　６４５　ｎｍで、ε：２９，０
００．２，６−キシレノールの場合λ＝６１５　ｎｍで
、ε：２１，６００で極めて吸光度が大きく、この点に
於いても測定上極めて有利である。

本発明の特徴の一つとして、生体試料中の夾雑物による
測定上の影響をほとんど受けないことがあるが、これは
、従来の基質として用いられているｐ−ニトロアニリド
系化合物に於いては、５６０　ｎｍ以下の波長で測定す
るのに対して、本発明では、５６０　ｎｍ以上の波長で
測定する為、試料中の夾雑物の影響を受けず、基質本来
の高特異性と併せて、正確な測定結果が得られる。

以上の通り本発明の基質は、トリプシンなどの酵素活性
測定用基質として、従来のものに比べて、非常に優れて
いることが明らかである。従って本発明の基質は医療分
野においては、膵炎の診断薬として極めて有用である。

実施例本発明を以下実施例により詳細に説明するが、本発明は
、これら実施例に限定されるものではない。

以下の実施例において、アミノ酸は特にことわらなけれ
ばＬ一体を示す。

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析は、シリカゲル
Ｆ２５４（メルク製）プレートを使用した。溶媒は、以
下に示す組成の溶媒を使用した。

ＲｆＩＣＨＣｆ３：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ２０＝８０
：２０＋５：２．５Ｒ１２ｎ−ＢｕＯＨ：ＡＣＯＨ：Ｈ
２０＝４：１：ＩＲｆ３ｎ−ＢｕＯＨ：ＡＣＯＨ：Ｈ２
０＝４：１：２Ｒ１，４ｎ−ＢｕＯＨ：ＡＣＯＨ：Ｈ２
０＝４：１：５ゲル濾過には、東洋曹達工業株式会社の
ポリビニールゲル、トーヨーパールＨＷ　４０　Ｆ　（
商品名）を使用した。

実施例１ＢＯＣ−Ａｒｇ　（Ｎｏ２）　−ＯＨ５０，３ｇ　（０
，１５８ｍｏｌｅ　）をＤＭＦ　１６０　ｍｅに溶解し
、ＮＥＭ　２０．５　ｍｌ　（０，１５８ｍｏｌｅ　）
を加え、これに−２０°Ｃにてイソブチルクロロフォル
メート２１．２　ｍｅ　（０，１５８ｍｏｌｅ　）を滴
下し、１０分間反応させる。反応後、５−アミノサリチ
ル酸・塩酸塩３０．０　ｇ　（０，１５８ｍｏｌｅ　）
とＮＥＭ　６１．６　ｍｅ　（０，４７４ｍｏｌｅ　）
のＤＭＦ　２５０　ｍｅ温溶液上記反応液に−１５〜−
１０°Ｃにて滴下する。滴下後、同温度にて３時間反応
させ、さらに室温（１５〜２０°Ｃ）にて１８時間反応
させる。反応後、ＤＭＦを減圧留去し、残渣をＡｃＯＥ
ｔ９５０ｍ＜’に溶解し、冷５％塩酸３００ｍｔ’で４
回、飽和食塩水３００ｍｆｆで２回洗浄後、無水硫酸マ
グネシウムおよび活性炭にて脱色乾燥する。乾燥後、硫
酸マグネシウムおよび活性炭を濾別して冷却静置し、析
出結晶を濾取、乾燥するとＢＯＣ−Ａｒｇ（Ｎｏ□）−
ＣＨＡ　４６．２　ｇ　（４６，３％）を得る。

Ｒｎ　＝　０．１１　、　　ｍ、　ｐ、　２０８°Ｃ（
分解）［ａ　］　Ｄ８．４　（Ｃ＝１　、　ＭｅＯＨ）
元素分析　Ｃｌ８Ｈ２６Ｎ６０８・１／４Ｈ２０ＨＮ測定値　４７．１６％　５．７５％　１８．３０％計算
値　４７．１１％　５．８２％　１８．３１％Ｉ１．　
ＢＯＣ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｎｏ□）　−ＣＨＡＢＯＣ−
Ａｒｇ（ＮＯ２）　−ＣＨＡ４５．４ｇ（０，１ｍｏｌ
ｅ）を２ＮＨＣＩ　／　ＡｃＯＨ３００ｍｅ　（０，６
ｍｏｌｅ　）と少量のＭｅＯＨに溶解して、室温にて２
時間反応を行う。反応終了後、乾燥エーテル３００ｍｅ
を加えると結晶化する。

３４．９　ｇ　（８９，４％）のＨＣＩ　・ＨＡｒｇ　
（ＮＯ２）　　ＣＨＡを得る。

Ｒｆ３＝０．３１　、　　ｒｎ、　ｐ、　１９３〜２０
６°Ｃ［Ｑ］Ｄ＋３７．４（Ｃ＝１．ＭｅＯＨ）１５．
９　ｇ　（０，０８４ｍｏｌ　）のＢＯＣ−Ａｌａ−Ｏ
ＨをＤＭＦ　８４ｍ１に溶解し、ＮＥＭ　１０．９　ｍ
ｌ　（０，０８４ｍｏｌ　）を加え、これに−２０°Ｃ
にてイソブチルクロロフォルメート１０．９　ｍｅ　（
０，０８４ｍｏｌ　）を滴下し１０分間反応する。反応
後、ＨＣＩ　・ＨＡｒｇ　（ＮＯ２）　ＣＨＡ　３２．
８　ｇ　（０，０８４ｍｏｌ　）とＮＥＭ　３２．Ｑ　
ｍｅ　（０，２５２ｍｏｌ　）のＤＭＦ　８４　ｍ６溶
液を上記反応液に一１５°Ｃ〜−１０°Ｃにて滴下する
。滴下後、同温度にて２３時間反応し、さらに室温（１
５〜２０°Ｃ）にて１８時間反応する。反応後、ＤＭＦ
を減圧留去し、残渣をＡｃ０Ｅｔ　６００　ｍｌに溶解
し、冷５％塩酸２００　ｍｆｆ　Ｘ　３、飽和食塩水２
００　ｍ６　Ｘ２にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムお
よび活性炭にて脱色乾燥する。乾燥後、硫酸マグネシウ
ムと活性炭を濾別して溶媒を減圧留去し、残渣をＭｅＯ
Ｈ／　Ａｃ０Ｅｔ　／エーテルより再結晶をすると、３
１．０　ｇ　（７０，３％）のＢＯＣＡｌａ　Ａｒｇ（
ＮＯｚ）−ＣＨＡを得る。

Ｒｎ　＝　０．１２　、　　ｍ、　ｐ、　２０１〜２１
２°Ｃ［ａ　］　ｏ　　　１６．０°（Ｃ＝　０．５　
、　ＤＭＦ　）元素分析　Ｃ２□Ｈ３、Ｎ７０９・１１
２Ｈ２０測定値　Ｃ：４７．２５％　Ｈ、６，２５％　
Ｎ　：１８．５５％計算値　Ｃ：４７．１９％　Ｈ：６
．０３％　Ｎ　：１８．３４％ＩＩ１．　Ｚ−Ｐｙｒｏ
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｎｏ　）　−ＣＨＡＢＯＣ−
Ａｌａ−Ａｒｇ　（Ｎｏ２）　−ＣＨＡ　３０．Ｏｇ　
（０，０５７ｍｏｌ）を２　Ｎ　ＨＣＩ　／　ＡｃＯＨ
１４２，５ｍ６　（０，２８５ｍｏｌ　）と少量のＭｅ
ＯＨに溶解して、室温にて２時間反応を行う。反応終了
後、乾燥エーテル１０１００Ｏを加え析出結晶を濾取乾
燥するとＨＣＩ　−Ｈ−Ａｌａ　−Ａｒｇ　（Ｎｏ２）
−ＣＨＡ　２５．Ｏｇ　（９５，０％）を得る。

Ｒｒ２＝０．１３．　　ｍ、ｐ、　１７８〜２０５°Ｃ
［α］Ｄ−９，０°（Ｃ＝　０．５．　ＤＭＦ）２．３
１　ｇ　（５，０ｍｍｏｌ　）のＨＣＩ　・Ｈ−Ａｌａ
−Ａｒｇ　（Ｎｏ２）−ＣＨＡを１．５　Ｎ　ＮＥＭ　
／　ＤＭＦ　１０　ｒｎｅ　（１５，０ｍｍｏｌ　）に
溶解し、０〜５°ＣにてＺ−Ｐｙｒｏ　Ｇｌｕ−８ＤＰ
　１．９３　ｇ（５，０ｍｍｏｌ　）を加え、１８時間
室温にて反応する。反応後、Ａｃ０Ｅｔ　３００　ｍｌ
にて反応液を希釈して、冷５％塩酸１００ｍｅＸ４、飽
和食塩水１００　ｍｅ　Ｘ　２にて洗浄する。ＡｃｏＥ
ｔ層を無水硫酸マグネシウムおよび活性炭にて脱色乾燥
後、減圧留去して残渣をＭｅＯＨ／　Ａｃ０Ｅｔ　／エ
ーテルより再結晶すると、２−Ｐｙｒｏ　Ｇｌｕ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ　（Ｎｏ２）　−ＣＨＡ　１８．４　ｇ　（
５４，９％）を得る。

Ｒｆ２＝０．７１．　　ｍ、ｐ、　２３７°Ｃ（分解）
［Ｑ］、　　−３０，０°（Ｃ＝　０．５　、　ＤＭＦ
　）元素分析　Ｃ２８Ｈ３゜Ｎ８０１、・Ｈ２０測定値
　Ｃ：５２．０５％　Ｈ：５．５０％　Ｎ　：　１６．
６３％計算値　Ｃ：５１．９４％　Ｈ：５．４１％　Ｎ
　：１６．７１％ＩＶ、　Ｈ−Ｇｌｕ−Ａｌａ　−−Ｃ
ＨＡ−ＨＣＩＺ−ＰｙｒｏＧｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｎ
ｏ２）　−ＣＨＡ　１．７５　ｇ（２，６ｍｍｏｌ　）
をＭｅＯＨ１１２，５ｍｅとＨ２Ｏ２７，’ｌ　ｒｒｈ
ｅおよびｌＮ−ＨＣｌ　９．８　ｍｅの混合溶媒に懸濁
し、パラジウム黒１ｇを加え、３０°Ｃにて６時間接触
還元をする。反応後、触媒を濾別して溶媒を減圧留去す
る。残渣を展開溶媒がＭｅＯＨのトーヨーパールＨＷ４
０Ｆカラムにて精製すると、０．４７１　ｇ　（３４，
４％）のＨ−Ｐｙｒ。

Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＣＨＡ−ＨＣＩを得る。

Ｒ，：０．２５［α］Ｄ−６３．０°（Ｃ＝　０．４６　、　Ｉ　ＮＨ
Ｃｌ　）元素分析　Ｃ２□Ｈ２９Ｎ７０□ＨＣＩ　−１
／　２　Ｈ２０測定値　Ｃ：４６．９９％　Ｈ：５．８
６％　Ｎ　：　１８．１０％計算値　Ｃ：４６．９７％
　Ｈ：　５．８２％　Ｎ　：１８．２５％実施例２Ｈ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ　−−ＣＨＡ−ＨＣＩの合成Ｉ　、
　ＢＯＣ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｎｏ　）　−ＣＨＡＨ−Ａ
ｒｇ　（ＮＯ２）　ＣＨＡ−ＨＣＩ　３９．１　ｇ　（
０，１Ｍ　）をＤＭＦ　２００　ｍｅに溶解し、ＮＥＭ
　４２．Ｏｍｅ　（０，３Ｍ　）を加える。０〜５°Ｃ
にてＢＯＣ−Ｐｒｏ−８ＤＰ３３．７ｇ（０，１Ｍ）を
加えて、室温で１８時間反応する。反応後ＤＭＦを減圧
留去し、残渣をＡｃ０Ｅｔ　１０００　ｍｅに溶解して
、冷５％塩酸３００　ｍｅ　Ｘ　３、飽和食塩水３００
　ｍｅ　Ｘ２洗浄後、無水硫酸マグネシウムおよび活性
炭にて脱色乾燥する。乾燥後、硫酸マグネシウムおよび
活性炭を濾別して溶媒を減圧留去し、残渣をＭｅＯＨ／
　Ａｃ０Ｅｔ　／エーテルより再結晶すると２７．７　
ｇ（５０，３％）のＢＯＣ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ　（Ｎｏ
□）　−ＣＨＡを得る。

Ｒｎ　＝０．１６　、　　　ｉｎ、　ｐ、　　１１６°
Ｃ（分解）［α］Ｄ−２６°（Ｃ＝　０．５　、　ＤＭ
Ｆ）元素分析　Ｃ２３Ｈ３３Ｎ７０９・Ｈ２０測定値　
Ｃ：４８．２５％　Ｈ：６．４５％　Ｎ　：１７．５５
％計算値　Ｃ：４８．５０％　Ｈ：６．１９％　Ｎ　：
　１７．２１％Ｉ１．　Ｚ−ＰｙｒｏＧｌｕ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ（Ｎｏ　）　−ＣＨＡＢＯＣ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（
Ｎｏ２）−ＣＨＡ２６．Ｏｇ（０，０４７ｍｏｌ）を２
　Ｎ　ＨＣＩ　／　ＡｃＯＨ１１７，５ｍｅ　（０，２
３５ｍｏｌ　）と少量のＭｅＯＨに溶解して、室温にて
２時間反応を行う。

反応終了後、乾燥エーテル９００　ｍｅを加え、析出結
晶を濾取乾燥すると、ＨＣＩ　−Ｈ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ
　（Ｎｏ２）−ＣＨＡ１９．８ｇ（９３，３％）を得る
。

Ｒｒ２＝０．０８　、　　　ｉｎ、　ｐ、　　８８　９
３°Ｃ［Ｑ］Ｄ３５．８°（Ｃ＝　１　、　ＭｅＯＨ）
２．２５　ｇ　（５，０ｍｍｏｌ　）のＨＣＩ　・ＨＰ
ｒｏ　Ａｒｇ　（ＮＯ２）−ＣＨＡを１．５　Ｎ　ＮＥ
Ｍ　／　ＤＭＦ　１０　ｍｅ　（１５，０ｍｍｏｌ　）
に溶解し、０〜５°Ｃにて、Ｚ−Ｐｙｒｏ　Ｇｌｕ−８
ＤＰ　１．９３　ｇ（５，０ｍｍｏｌ　）を加え、１８
時間室温にて反応する。反応後、Ａｃ０Ｅｔ　３００　
ｍｌにて反応液を希釈して、冷５％塩酸１００　ｍｅ　
Ｘ　４飽和食塩水１００　ｍｅ　Ｘ　２にて洗浄する。

ＡｃｏＥｔ層を硫酸マグネシウムおよび活性炭にて脱色
乾燥後、減圧留去して残渣をＭｅＯＨ／Ａｃ０Ｅｔ　／
エーテルより再結晶すると、Ｚ−Ｐｙｒ。

Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　（Ｎｏ２）　−ＣＨＡ　１．
８６　ｇ　（５３，４％）を得る。

Ｒｆ２＝０．６９．　　　ｍ、ｐ、　　２２０°Ｃ（分
解）［α］Ｄ−１８°（Ｃ＝　０．５　、　ＤＭＦ　）
元素分析　Ｃ３、Ｈ３６Ｎ８０１□・Ｈ２０測定値　Ｃ
：５２．１３％　Ｈ：５．４０％　Ｎ　：１５．７５％
計算値　Ｃ：５２．１０％　Ｈ：　５．３６％　Ｎ　：
　１５．６８％ＩＩ１．　Ｈ−ＧＩｕ−Ｐｒｏ　−−Ｃ
ＨＡ−ＨＣＩＺ−Ｐｙｒｏ　Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　
（Ｎｏ□）　−ＣＨＡ　Ｏ，６０ｇ（０，８７ｍｍｏｌ
　）をＭｅＯＨ１１２，５ｍｅとＨ２Ｏ３５，８ｍｅお
よびＩ　Ｎ−ＨＣｌ　１．７　ｍｅの混合溶媒に懸濁し
、パラジウム黒１ｇを加え、３０°Ｃにて５時間接触還
元をする。反応後触媒を濾別して溶媒を減圧留去する。

残渣を展開溶媒がＭｅＯＨのトーヨーパールＨＷ　４０
Ｆカラムにて精製すると０．４２　ｇ　（８７，５％）
のＨ−Ｐｙｒ。

Ｇｌｕ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ　−ＣＨＡ　−ＨＣＩを得
る。

Ｒｆ３＝　０．２６　、　　　ｍ、　ｐ、　　１５５°
Ｃ（分解）［Ｑ］Ｄ　　　９２°（Ｃ＝　０．５　、　
ＭｅＯＨ）元素分析　Ｃ２３Ｈ３□Ｎ７０７・ＨＣｌ−
Ｈ２０測定値　Ｃ：４８．３３％　Ｈ：　５．７０％　
Ｎ　：　１７．３０％計算値　Ｃ：４８．２９％　Ｈ：
５゜９９％　Ｎ　：　１７．１４％実施例３Ｈ−Ｄ−Ｇｌｕ　０ｔＢｕ　−Ｇｌ　−−ＣＨＡ−２Ｈ
Ｃ１の合成Ｉ　、　ＢＯＣ−Ａｒ　−ＣＨＡ−ＨＣＩＢＯＣ−Ａｒ
ｇ−ＯＨ−ＨＣＩ・Ｈ２Ｏ３８１，１ｇ（１，１６ｍｏ
ｌ　）をＤＭＦ　１３９２　ｍｅに溶解し、ＮＥＭ　１
５１　ｍｅを加え、これに−２０°Ｃにてインブチルク
ロロホルメート１５２．３　ｍｅを滴下する。１０分間
反応後、５−アミノサリチル酸・塩酸塩２１９．８　ｇ
　（１，１６ｍｏｌ　）とＮＥＭ３０１．６ｍｅのＤＭ
Ｆ　９２８　ｍｅ温溶液上記反応液に−１５〜−１０°
Ｃにて滴下する。滴下後、同温度にて３時間反応させ、
さらに室温にて１５時間反応させる。

反応後、ＤＭＦを減圧留去し、残渣をＭｅＯＨ４６４ｍ
ｆｆとｎ　−ＢｕＯＨ３３２ｍｅに溶解する。Ａｃ０Ｅ
ｔ　３３００　ｍｅを加え、食塩を飽和させた冷５％塩
酸２１６０ｍｔ’にて２回洗浄後、無水硫酸マグネシウ
ムにて乾燥する。

乾燥後硫酸マグネシウムを濾別し、て溶媒を減圧留去す
ると、ＢＯＣ−Ａｒｇ　−ＣＨＡ　−ＨＣＩ　４６４．
８　ｇ　（８９，９％）を得る。

Ｒｆ２＝　０．６４　、　　　ｍ、　ｐ、　　２２５．
０°Ｃ（分解）［Ｑ］Ｄ−１０，７°（Ｃ＝　１　、　
ＭｅＯＨ）元素分析　Ｃｌ８Ｈ２８Ｎ５０６Ｃ１・Ｈ２
０ＣＨＮ測定値　　４６．７１％　　６．６０％　　１４．９０
％計算値　　４６．６０％　　６．５２％　　１５．１
０％Ｉ１．ＢＯＣ−Ｇｌ　　−Ａｒ　−ＣＨＡ−ＨＣＩ
ＢＯＣ−Ａｒｇ−ＣＨＡ　−ＨＣＩ　２４３．７　ｇ　
（０，５５ｍｏｌ　）を２ＮＨＣＩ　／　ＡｃＯＨ１０
９３ｍｌと少量のＭｅＯＨに溶解して、１時間室温にて
反応させる。反応終了後、イソプロパツール１０９３　
ｍｅを加え、Ａｃ０Ｅｔ中に再沈する。

析出結晶を濾取・乾燥するとＨ−Ａｒｇ−ＣＨＡ・２　
ＨＣｌ１５６．２　ｇ　（７４，３％）を得る。

Ｒｒ４＝０．１５　、　　　ｍ、　ｐ、　　２４０．５
°Ｃ（分解）［ａ　］　ｏ　　＋　５３．５°（Ｃ＝１
．Ｈ２Ｏ）１０９．２　ｇ　（０，２７ｍｏｌ　）のＨ
−Ａｒｇ−ＣＨＡ　、２　ＨＣＩをＤＭＦ　２９０　ｍ
ｌに溶解させ、ＮＥＭ　７０．２　ｍ（（０，５４ｍｏ
ｌ　）を加える。これに０〜５°ＣにてＢＯＣ−Ｇｌｙ
−Ｏ８ｕ８１．７　ｇ　（０，３ｍｏｌ　）を加え、室
温にて１８時間反応させる。反応終了後、ＤＭＦを減圧
留去し、残渣をＭｅＯＨ５００ｍｅに溶解して、Ａｃ０
Ｅｔ　８　ｅに再沈する。

析出結晶を濾取、乾燥すると、ＢＯＣ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
　−ＣＨＡ　、　ＨＣＩ　１３５．８　ｇ　（１００％
）を得る。

Ｒｒ２＝０．４６　、　　　ｒｎ、　ｐ、　　２１４．
５°Ｃ（分解）［ａ　］　Ｄ２２°（Ｃ＝　１　、　Ｍ
ｅＯＨ）元素分析　Ｃ２ｏＨ３ｏＮ６０□・ＨＣｌ・Ｈ
２０ＣＨＮ測定値　　４６．５５％　　６．８０％　　１６．１５
％計算値　　４６．１１％　　６．３９％　　１６．１
３％ＩＩ１．　Ｚ−Ｄ−Ｇｌｕ　０ｔＢｕ　　−Ｇｌ　
−−ＣＨＡ−ＨＣＩＢＯＣ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ　
−ＨＣＩ　１２５．７　ｇ　（０，２５ｍｏｌ　）を少
量のＭｅＯＨに溶解後、２　Ｎ　ＨＣＩ　／　ＡｃＯＨ
５００ｍぞ（０，１０ｍｏｌ　）を加え、１時間室温に
て撹拌反応させる。反応終丁後、エーテル４．５ｅに再
沈し、析出結晶を濾取・乾燥するとＨ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−ＣＨＡ−２ＨＣｌ１０９．８　ｇ　（１００％）を得
る。

Ｒｒ４＝０．０９　、　　　ｒｎ、　ｐ、　　２１９．
５°Ｃ（分解）［α］Ｄ−２１，０°（Ｃ＝１．ＡｃＯ
Ｈ：Ｈ２０＝１：１）４．４　ｇ　（１０ｍＭ　）のＨ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ・２　ＨＣＩを０．７５　Ｎ
ＮＥＭ　／　ＤＭＦ　２０　ｍぞに溶解し、０〜５°Ｃ
に冷却撹拌しなからＺ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）　−０
ＳＵ　４．３ｇ（１０ｍＭ）を加えて、室温にて１５時
間反応させる。反応後、溶媒を減圧留去し、残渣をＭｅ
ＯＨに溶解してＡｃ０Ｅｔ　１　ｅに再沈する。析出結
晶を濾取・乾燥するとＺ−Ｄ−Ｇｌｕ　（０ｔＢｕ　）
　−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ　−ＨＣＩ　６．１ｇ（８
４，５％）を得る。

Ｒｒｚ＝０．６０．　　　ｒｎ、ｐ、　　１９５．０°
Ｃ（分解）［Ｑ１０　　７．０°（Ｃ＝　０．５　、　
ＭｅＯＨ）元素分析　Ｃ３□Ｈ４３Ｎ７０１ｏ−ＨＣｌ
・１．５Ｈ２０ＨＮ測定値　　５１．４５％　　６．１０％　　１３．１０
％計算値　　５１．３０％　　６．１９％　　１３．０
９％Ｉ１．Ｈ−Ｄ−Ｇｌｕ　　Ｏ’Ｂｕ　　−Ｇｌ　−
−ＣＨＡ−２ＨＣＩＺ−Ｄ−Ｇｌｕ　（０’Ｂｕ　）　
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ　５．５　ｇ　（７，６ｍＭ
）をＭｅＯＨ１５０ｒｎｅに溶解し、パラジウム黒１ｇ
を加え、３０°Ｃにて５時間接触還元をする。反応後触
媒を濾別して、溶媒を減圧留去する。残渣を５％ＨＣＩ
　−ＭｅＯＨ５，５ｍｅとＭｅＯＨ２０ｒｎｅに溶解し
て、エーテルに再沈する。析出物を濾取・乾燥後、展開
溶媒がＭｅＯＨのトーヨーパールＨＷ４０Ｆカラムにて
精製すると、３．６　ｇ　（７５，８％）のＨ−Ｄ　−
Ｇｌｕ　（０ｔＢｕ　）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＨＡ　・
２ＨＣ１を得る。

Ｒｒｓ＝０．３５．　　　ｍ、ｐ、　　１６８．５°Ｃ
（分解）［ａ　］　Ｄ　　　３．０°（Ｃ＝　０．５　
、　ＭｅＯＨ）元素分析　Ｃ２４Ｈ３□Ｎ７０８・２　
ＨＣＩ　、　１／２　Ｈ２０ＨＮ測定値　　４５．４８％　　６．４３％　　１５．３５
％計算値　　４５．５０％　　６．３６％　　１５．４
８％実施例４実施例１，２あるいは３と同様な方法にて下記の第２表
に示す基質の合成を行った。基質の物性値も第２表に示
した。

第２表に示した本発明基質の元素分析の結果を第３表に
示した。

実施例５実施例１〜４において新規に合成した基質の特異性を各
酵素と反応させる事により試験した。

（１）基質液：　１０　ｍｍｏｌ　／　ｅ（２）緩衝液
ニドリス、ＮａＣ１、ＣａＣ１５＋の濃度、及びｐＨ（
２５°Ｃ）は、酵素により次の通りとした。

（３）使用酵素：使用した酵素の起源等は以下の通りで
ある酵素　　起源　メーカー　　Ｌｏｔ　　　　単位る。

測定結果は第４表に示した通りである。

トリプシン　　ウシ　ワージントン３１　Ｍ　７７１　
１０　ｐｇ／ｍｅトロンビン　　ウシ　持出製薬　　　
６５１４６　　　４．０ＮＩＨ／ｍ？プラスミン　　ヒ
ト　ミドリ十字　ＰＬ　−３５０，２５０Ｕ１ｍｅカリ
クレインブタ　シグマ　　　３２Ｆ−０８１０１，ＯＵ
／ｍｅ第Ｘの因子　　ウシ　シグマ　　　　７３Ｆ　−
９４５００，４Ｕ／ｍＣ（４）反応停止液（ＰＮＡ）：
１０％−酢酸（５）発色試薬（ＣＨＡ）：ペンタシアノ
アミンフエロエート激元店二緩衝液０．３　ｍｅと酵素試薬０．１ｍｅをシリコン処
理硬質ガラス製試験管又は、プラスチック製試験管に採
取し、３７°Ｃ恒温槽中にて５分間予加温する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＡｌはＬもしくはＤのＰｙｒｏＧｌｕ又はＬもしくはＤ
のＧｌｕ（ＯＲ）（ＯＲはグルタミン酸のｒ位のカルボ
キシ基に結合する基であり、Ｒは水素原子又は１〜８個
の炭素原子を有する脂肪族炭化水素残基である）；Ａ＿
２はＧｌｙ、Ｐｒｏ、Ｐｉｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｂｕｔ
、ＮＶａｌ又はＮＬｅｕである。］の化合物又はその塩で表わされる事を特徴とする新規な
酵素活性測定用基質。