JPH06109735A - 抗原・抗体反応による生体内物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 生体内物質の臨床検査を短時間に、微量の
試料で、定量可能にする。 【構成】（１） 特定磁化量、粒径、比重の磁性粒子
（Ｉ）と磁性粒子（Ｉ）とは磁化量の異なり、特定粒
径、比重の磁性粒子（ＩＩ）に、抗体又は抗原を担持さ
せた混合粒子に、前記混合粒子の抗体と生体内物質中の
抗原、又は前記混合粒子の抗原と生体内物質中の抗体を
反応させる工程 （２） 前記反応混合物に磁場を付与する工程 （３） 集磁されない磁性着色粒子の量を、３５０ｎｍ
以上波長で測定し、定性又は定量する工程を順次経て生
体内物質を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、磁性粒子が特定範囲の
粒径で単分散状態では、集磁されない磁化量の粒子と集
磁される磁化量の粒子とを併用して、生体内物質の抗原
・抗体測定法において、極めて短時間に高感度、高信頼
性の得られる凝集法による免疫測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内物質の各種抗体、抗原、細菌、ウ
ィルスあるいは癌マーカー等の測定は、多数の検体を短
時間で感度よく、しかも再現性等の信頼性も高くなけれ
ばならない。しかも分析コストの点から、少量の検体や
試薬による少量分析が望まれている。抗原又は抗体を固
定した特定の磁性粒子を用いる各種の方法が採用されて
いる。

【０００３】特開平１−１９３６４７号公報では、磁性
体含有不溶性担体粒子と磁性体を含有していない不溶性
担体粒子を用いる抗原・抗体の測定方法において、不溶
性担体粒子が有機高分子物質よりなる粒子、セラミック
粒子、又はシリカ粒子等を用いる事が記載されている。
特開平３−５９４５９号公報では、磁性体含有不溶性担
体粒子と磁性体を含有していない不溶性担体粒子を用い
る抗原・抗体の測定方法において、前記粒子の平均粒
径、使用割合及び測定波長を特定する事が記載されてい
る。前記特開平３−１９３６４７号公報及び特開平３−
５９４５９号公報は、いずれも磁性粒子と磁性体を含有
していない不溶性担体粒子を用いており、磁性のある粒
子と磁性のない粒子との組み合わせであり、２種類の粒
子の比重差を利用して分散性を改良する点については記
載されていない。

【０００４】ＵＳＰ４１７７２５３には、磁性粒子を用
いた免疫測定試薬及び測定方法が記載されている。この
記載は、Ｂ／Ｆ分離を必要とするＥＩＡ（エンザイムイ
ムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオアイソトープイムノア
ッセイ）等に関してでありＢ／Ｆ分離を必要としない凝
集方法については、記載されていない。また２種類の磁
性粒子を併用する点についても記載されていない。

【０００５】また特開平２−１２２２６５号公報では、
測定すべき物質と該物質に特異的に反応するかもしくは
競合する物質を固定した磁性粒子を含む反応液を反応容
器に入れ、該反応液にノズルから気流又は水流等の流体
を供給して該反応液を旋回させると共に、前記磁性粒子
が前記反応容器の少なくとも一部の壁面に沿って収束す
るような磁場をかけることにより前記磁性粒子の分布パ
ターンを形成して物質間の結合状態を測定する免疫学的
測定方法が記載されている。さらに特開平２−２８１１
４２号公報では、液中において、測定対象である抗原ま
たは抗体と、前記の抗原または抗体と特異的に結合し得
る抗体または抗原を固定化した磁気微粒子とを接触さ
せ、抗原−抗体反応を生起させることにより抗原−抗体
−磁気微粒子結合体を生成させる工程を有する抗原また
は抗体の測定方法において、前記の抗原−抗体反応が、
反応系に交番磁界を印加した状態で行われる抗原または
抗体の測定方法が記載されている。しかしながら特開平
２−１２２２６５号公報の方法では、凝集した粒子に磁
場を付与して形成された分布パターンを測定するためマ
イクロプレートの材質に影響される等の問題点があり、
特開平２−２８１１４２号の方法では、交番磁界を印加
するための特別な装置を必要とする等の問題点がある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は前記
した従来技術の測定における問題点を解決し、感度が高
く、簡便で信頼性の高い生体内物質の定性又は定量測定
方法を提供することを目的とする。

【０００７】また、本発明に従えば （１）磁化量−粒径図でＡ（１，１０）、Ｂ（１，１０
００）、Ｃ（Ｘ１，１０）、Ｄ（Ｘ２，３００）及びＥ
（Ｘ３，１０００）の範囲内に含まれ比重が１〜２であ
る磁性粒子（Ｉ）、及びＣ′（Ｘ１，１０）、Ｄ′（Ｘ
２，３００）、Ｅ′（Ｘ３，１０００）、Ｆ（７０，１
０）及びＧ（７０，１０００）の範囲内に含まれ比重が
１〜２である磁性粒子（ＩＩ）に、抗体又は抗原を担持
せさた混合粒子と、前記混合粒子の抗体と生体内物質中
の抗原、又は前記混合粒子の抗原と生体内物質中の抗体
を反応させる工程（ただし、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３は、Ｘ１
＞Ｘ２＞Ｘ３，１８＜Ｘ２＜３５である磁性粒子（Ｉ）
を単分散させた時に集磁される下限磁化量、磁性粒子
（ＩＩ）の点Ｃ，Ｄ，ＥのＸ軸＞Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３、磁
性粒子（Ｉ）と磁性粒子（ＩＩ）との比重差が０〜０．
５である。磁化量：ｅｍｕ／ｇ，粒子：ｎｍ） （２）前記反応混合物に磁場を付与する工程 （３）集磁されない磁性粒子の量を３５０ｎｍ以上の波
長で吸光度又は透過度を測定し、生体内物質中の抗原又
は抗体を定性又は定量する工程を順次経る抗原・抗体反
応による生体内物質の測定方法が提供される。

【０００８】本発明の方法では、単分散させた時に集磁
されない磁性粒子（Ｉ）と単分散状態でも集磁される磁
化量を持つ特定粒径の特定比重の磁性粒子（ＩＩ）に、
抗体又は抗原を担持せさた混合粒子と、測定対象である
生体内の抗原又は抗体を反応させる事により、集磁工程
における集磁がより迅速確実に行われ、吸光度、透明度
又は濁度の測定をする事により、生体内物質中の抗原又
は抗体を定性又は定量できる事を見い出して本発明を完
成したものである。本発明で磁性粒子を単分散させた状
態とは、反応系に生体内物質が存在しないため、抗原・
抗体反応が起こらず、磁性粒子が分散している状態であ
る。

【０００９】本発明で用いる磁性粒子（Ｉ）及び磁性粒
子（ＩＩ）は、架橋重合体粒子、有機高分子物質や無機
微粉末等が用いられる。

【００１０】架橋重合体粒子の製法としては各種の方法
が提案されているが、その一つはエチレン性不飽和単量
体を、架橋性の共重合単量体と水性媒体中でサスペンジ
ョン重合または乳化重合させて微小樹脂粒子分散液をつ
くり、溶媒置換、共沸、遠心分離乾燥などにより水を除
去して架橋重合体粒子を得るものであり、他の一つは脂
肪族炭化水素等の低ＳＰ有機溶媒、あるいはエステル、
ケトン、アルコール等の高ＳＰ有機溶媒のようにモノマ
ーは溶かすが重合体は溶解しない非水性有機溶媒中で、
エチレン性不飽和単量体と架橋重合体とを共重合させ、
得られる微小樹脂粒子共重合を分散するＮＡＤ法あるい
は沈殿析出法と称される方法がある。又本出願人の特開
昭５８−１２９０６６号に記載された両イオン性基を有
するモノマー等から合成された微小樹脂粒子を用いても
よい。水性媒体または非水性有機媒体中で製造した架橋
重合体粒子は、ロ過、スプレー乾燥、凍結乾燥などの方
法で微小樹脂粒子の粒径を選別し、そのままもしくはミ
ルなどを用いて適当な粒径に粉砕して用いる事もでき
る。

【００１１】有機高分子物質としては、ポリスチレン、
スチレン−ブタジエン共重合粒子、ポリ塩化ビニル、ポ
リメタクリル酸メチル、ポリアミド、ポリエステル、ポ
リカーボネート等を用いることができる。この他にも、
多糖類、蛋白質の反合成ポリマー、、天然ポリマーおよ
びこれらの混合物も用いる事ができる。

【００１２】無機微粉末としては、セラミック微粉末、
シリカ、アルミナ、シリカーアルミナ等を用いる事がで
きる。粒子の磁性化部位については、表層でも内部で
も、また粒子全体が磁性化されていてもよい。

【００１３】磁性化するには、例えば、金属鉄、Ｆｅ_３
Ｏ_４、γ−Ｆｅ_２Ｏ_３、Ｃｏ−γ−Ｆｅ_２Ｏ_３、（Ｎｉ
ＣｕＺｎ）Ｏ・（ＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ_２Ｏ_３、（ＭｎＺ
ｎ）Ｏ・Ｆｅ_２Ｏ_３、（ＮｉＺｎ）Ｏ・Ｆｅ_２Ｏ_３、Ｓ
ｒＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３、ＢａＯ・６Ｆｅ_２Ｏ_３さらにＳｉ
Ｏ_２で被覆したＦｅ_３Ｏ_４等の各種フェライトを３〜１
００％、好ましくは３０〜５０％含有するように調製さ
れたものを用いる。前記の磁性を有する粒子として本出
願人による特開昭６３−６５０８５号及び特開平２−２
３７０１９号公報の方法等によって得られたものを用い
ることができる。磁性粒子は、着色粒子を磁化させたも
のでも、また磁性粒子を着色したものでも、さらに着色
されてなくともよい。

【００１４】磁性粒子（Ｉ）は、Ｘ軸に磁化量（ｅｍｕ
／ｇ）Ｙ軸に粒径（ｎｍ）の座標を持つ磁化量−粒径図
（図１）においてＡ（１，１０）、Ｂ（１，１００
０）、Ｃ（Ｘ１，１０）、Ｄ（Ｘ２，３００）及びＥ
（Ｘ３，１０００）の範囲内に含まれるものであり、磁
性粒子（ＩＩ）は、Ｃ′（Ｘ１，１０）、Ｄ′（Ｘ２，
３００）、Ｅ′（Ｘ３，１０００）、Ｆ（７０，１００
０）及びＧ（７０，１０００）、の範囲内ただし磁性粒
子（ＩＩ）のＣ′Ｄ′Ｅ′点におけるＸ軸＞Ｘ１，Ｘ
２，Ｘ３，）に含まれるものである。

【００１５】磁化量についてみると磁性粒子（Ｉ）は、
１ｅｍｕ／ｇ≦磁性粒子（Ｉ）＜Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３ｅｍ
ｕ／ｇの範囲であり、磁性粒子（ＩＩ）は、Ｘ１，Ｘ
２，Ｘ３≦磁性粒子（ＩＩ）≦７０ｅｍｕ／ｇの範囲の
ものを用いる。Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，は、磁化量一粒径図
における、Ｃ，Ｄ，Ｅ点のＸ軸を示し、本発明における
集磁工程の条件（例えば磁石の磁力、磁石及び器具の配
置条件、集磁時間等）で、磁性粒子を単分散させた時に
１０，１００及び１０００ｎｍの粒径の磁性粒子が集磁
されない磁化量の最大値を示し、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３を越
えると、上記条件で単分散の磁性粒子が集磁される磁化
量となる。従ってＸ１，Ｘ２，Ｘ３の磁化量は、集磁条
件によって決定される値であり、条件を変えると、異な
る値をとる。例えば集磁条件を内径７ｍｍのウエル（分
析液収容部）を４方向に等間隔（中心間隔９ｍｍ）で配
置した直径３ｍｍの棒磁石（２７００ガウス）の中心部
に置いて集磁を５分間行った結果、Ｘ１、＝３５、Ｘ２
＝２６、Ｘ３＝２０であった。

【００１６】磁化量を制御するためには、種々な手法を
取ることができ、制約されることはないが、例えば、前
記特開昭６３−６５０８５号及び特開平３−２３７０１
９号公報に記載の方法によると、第１鉄イオンの濃度、
酸化剤の濃度、反応温度、第１鉄イオン、溶液中への酸
化剤の供給割合等を変化させる事により可能である、上
記要因中、磁化量を低くするためには、第１鉄イオンの
濃度を下げる、酸化剤の濃度を上げる、反応温度を下げ
る、酸化剤の供給配合を多くする事により、一方磁化量
を高くするためには、上記条件を逆の方向にすることに
よって得られる。上記条件は、単独でも複数組み合わせ
でも可能である。

【００１７】磁化量は、振動試料型磁力計を用いて測定
した。このような磁力計としては、例えば理研電子株式
会社よりＭＯＤＥＬ ＢＨＶ−３．５として市販されて
いる。

【００１８】磁性粒子（Ｉ）及び磁性粒子（ＩＩ）につ
いて、比重は、１〜２の粒子を用い、比重が１未満の粒
子で磁性粒子を作る事は困難であり、比重が２を越える
と反応液中で分散性が不良となる。さらに比重について
は、両者の比重差が比重の大小関係を問わず０〜０．５
である。比重差が０．５を越えると、磁性粒子（Ｉ）と
磁性粒子（ＩＩ）の免疫反応による凝集性が低下する。
好ましくは、０〜０．２である。

【００１９】粒径については、磁性粒子（Ｉ）及び磁性
粒子（ＩＩ）ともに１０〜１０００ｎｍのものを用い
る。粒径１０ｎｍ未満では、磁化量が大きくても、凝集
塊が集磁されにくく、１０００ｎｍを越えると、分散性
が悪くなり、免疫反応が遅くなる。粒径は、磁性粒子の
核となる前述した架橋重合体粒子、有機高分子物質、無
機微粉末の粒径によって決定される。本発明での粒径
は、１次粒子を電子顕微鏡を用いて測定したものであ
る。

【００２０】本発明の方法では、磁化量−粒径図におい
てＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅの範囲の磁性粒子（Ｉ）とＣ′、
Ｄ′、Ｅ′、Ｆ、Ｇの範囲の磁性粒子（ＩＩ）を用い
て、凝集塊を生成させるが、磁性粒子（Ｉ）について
は、好ましくはｍ（１，２００）、ｎ（１，４００）、
ｏ（１８，４００）及びｐ（１８，２００）の点を結ん
だ線に囲まれた内側の範囲、磁性粒子（ＩＩ）について
好ましくは、ｑ（３５，２００）、ｒ（３５，４０
０）、ｓ（４５，４００）及びｔ（４５，２００）の点
を結んだ線に囲まれた内側の範囲である。単位は、磁化
量はｅｍｕ／ｇ，粒径はｎｍである。

【００２１】本発明の方法でいずれか一方の磁性粒子が
測定の範囲を外れた磁性粒子を用いた場合には、免疫反
応による凝集塊が成長されにくくまたは、凝集塊が磁力
によって誘引されなくなって結果的に感度低下の原因と
なる。

【００２２】磁性粒子（Ｉ）と磁性粒子（ＩＩ）の好ま
しい使用比率は、磁性粒子（Ｉ）／磁性粒子（ＩＩ）＝
１／２０〜２／１より好ましくは１／８〜１／１であ
る。上記比率が１／２０より小さい（磁性粒子（ＩＩ）
が多過ぎる）と、定量できる測定範囲が狭くなり、２／
１を越える（磁性粒子（Ｉ）が多過ぎる）と免疫反応に
よる磁性粒子（ＩＩ）が磁性粒子（Ｉ）を誘引しきれな
くなり、免疫反応による吸光度の感度が小さくなる。

【００２３】本発明の工程（１）として磁性粒子（Ｉ）
と磁性粒子（ＩＩ）に抗体又は抗原を担持させる方法に
は、物理吸着法と共有結合法と包括法がある。物理吸着
法は、磁性粒子と、抗体又は抗原の間に働く疎水性相互
作用により固定化する方法等であり、磁性粒子は、抗原
溶液又は抗体溶液に浸漬するだけで、抗体又は抗原等の
タンパク質を吸着する。共有結合法は、磁性粒子に、ア
ミノ基やカルボキシル基のような官能基が表面についた
粒子で、グルタルアルデヒド等の架橋剤や水溶性カルボ
ジイミドのような活性剤を用いて、抗原又は抗体を共有
結合させる方法である。包括法は、物理吸着法と共有結
合法の中間方法で、抗原又は抗体をＨＥＭＡ（Ｈｙｄｒ
ｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）やＨＰＭ
Ａ（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａ
ｔｅ）のようなモノマーと混合し、γ線等で重合させて
結合する方法である。

【００２４】本発明で測定する生体内物質とは、血液、
リンパ液、尿、だ液等の体液内の抗体又は抗原であり、
または体液内に侵入した微生物、ウイルスやその成分で
あり、その種類は、被測定対象である生体内物質の特定
の抗原又は抗体に対して抗体又は抗原の関係にあるもの
であり、分析液中の抗原又は抗体に応じて選択される。
かかる抗原又は抗体の例としては、以下のもの等を挙げ
ることができる。 抗原類：ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＥ，アルブミ
ン、ｈＣＧ，ＡＦＰ，カルジオライビン抗原、血液型物
質、コンカナバリンＡ，ＤＮＡ，プロスタグランジン、
ＣＲＰ，ＨＢｓ，ヒト成長ホルモン、ステロイドホルモ
ン、ＣＥＡ，ＩｇＤ等。 抗体類：抗アルプミン抗体、抗ｈＣＧ抗体、抗ＩｇＧ抗
体、抗ＩｇＡ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗Ｉ
ｇＤ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗プロスタグ
ランジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗ＣＲＰ抗
体、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ステロ
イドホルモン抗体等、及びこれらを含む血清、並びにモ
ノクロナール抗体等。

【００２５】本発明では、工程（２）として吸光度や透
過率を測定する際に凝集塊を分析容器の分析液収容部側
方に集磁させ、工程（３）で磁力をかけた状態で集磁さ
れない磁性粒子を分析することにより、分光光度計の光
源−検出器の光路から凝集塊による妨害を極めて簡便か
つ効率的に排除することができる。

【００２６】本発明では、さらに効率を上げたるために
は、分析容器の分析液収容底部はＶ字型やＵ字型ではな
く、平底状が好ましい。磁石の配設は、好ましくは分析
容器の分析液収容部の回り４方向に等間隔に磁力がかる
ように磁石を支持プレートに配置した場合だが、それら
に限定されず、支持体に配置しただけでなく、凝集塊
が、分析容器の分析液収納部側壁に集磁させられる配置
であれば限定されず、少なくとも１個の磁石の個数で達
成できる。また、分析液収容部周囲の全周に磁石を配設
してもよい。また、磁石の形状も丸棒状、角状、リング
状、シート状等の任意の形状を選択できる。

【００２７】集磁するための磁石は、永久磁石でも電磁
石でもよく、永久磁石の場合は、集磁が必要なときに磁
石を配置した支持プレートを分析容器に近接させること
で集磁が可能となり、電磁石の場合には、必要な際に電
気的に磁力を発生させることで集磁が可能となる。永久
磁石を用いる、より効率的な好ましい方法は、例えば９
６の微小ホール（ウェル）有するプラスチックプレート
（市販品としてグライナー社製の「マイクロプレート」
を使用できる）を用意し、これを分析容器として用い、
マイクロプレートの周縁下部突起部の内側に、はまるよ
うに磁石支持プレートをマイクロプレートにかぶせる状
態で用いる。ゴム磁石製シートを用いることもできる。
支持プレートに磁石を配設させる方法は、分析液収容部
の側方部に磁力がかかるように、収容部に相当する部分
の３〜４方向に、好ましくは等間隔になるよう磁石を固
定すればよい。

【００２８】本発明では、吸光度や透過率を分光光度計
により測定するが、その測定波長は、３５０ｎｍ以上の
波長を選択する。

【００２９】本発明による生体内物質の測定方法は、こ
れまで定量測定を主体に述べてきたが、定性測定に適用
する事もできる。例えば、カットオフ値をＡＦＰでは、
１０ｎｇ／ｍ１に設定し、その時の吸光度を１．０近傍
になるように、磁性粒子の量、緩衝液び緩衝液中の塩濃
度、界面活性剤の濃度等を調製する。カットオフ値を境
として、３５０ｎｍ以上の波長を用いて、吸光度が１．
０を越えるものを陽性、越えないものを陰性として判定
することによって定性測定を行う。

【００３０】本発明では、特定磁化量、特定粒径及び特
定比重の磁性粒子（Ｉ）により抗原−抗体−磁性粒子又
は、抗体−抗原−磁性粒子の複合体の凝集塊が生成され
るが、磁性器粒子（Ｉ）は単分散状態では集磁されない
のに、凝集塊が生成されると集磁されるのは、ストーク
スの法則による原理と推定される。ストークスの法則で
働く力は重力であるが、本発明では、ストークスの法則
の重力の代わりに磁力が作用して、凝集塊が形成される
と集磁される。

【００３１】以下、本発明を実施例に基づいて、さらに
具体的に説明するが、本発明の技術範囲をこれらの実施
例に限定すべきでないことは言うまでもない。

【００３２】（製造例１） ポリマー粒子の製造 蒸留水・・・・・・・・・・・・・・・・・１１００ｇ スチレンスルホン酸ソーダ・・・・・・・・０．２８ｇ ４、４−アゾビス（４シアン吉草酸）・・・３．７５ｇ ジメチルエタノールアミン・・・・・・・・２．４０ｇ を反応容器に仕込み、温度８３℃にセットし、窒素ガス
（Ｎ_２）流入下で攪拌し、ここに、スチレン１００ｇを
滴下ロートから６０分かけて滴下し、合計６時間重合し
た。走査型電子顕微鏡（Ｓ−５１０：日立制作所製）で
粒径を測定したところ平均粒子径１１０ｎｍであった。
この溶液をラテックス溶液（１）とする。

【００３３】（製造例２） ポリマー粒子の製造 蒸留水・・・・・・・・・・・・・・・・・１１００ｇ スチレンスルホン酸ソーダ・・・・・・・・０．２８ｇ ４、４−アゾビス（４シアン吉草酸）・・・３．７５ｇ ジメチルエタノールアミン・・・・・・・・２．４０ｇ を反応容器に仕込み、温度８３℃にセットし、窒素ガス
（Ｎ_２）流入下で攪拌し、ここに、スチレン３００ｇを
滴下ロートから６０分かけて滴下し、合計６時間重合し
た。走査型電子顕微鏡で粒径を測定したところ平均粒子
径２９０ｎｍであった。この溶液をラテックス溶液
（２）とする。

【００３４】（製造例３） ポリマー粒子の製造 蒸留水・・・・・・・・・・・・・・・・・１１００ｇ スチレンスルホン酸ソーダ・・・・・・・・０．２８ｇ ４、４−アゾビス（４シアン吉草酸）・・・３．７５ｇ ジメチルエタノールアミン・・・・・・・・２．４０ｇ を反応容器に仕込み、温度８３℃にセットし、窒素ガス
（Ｎ_２）流入下で攪拌し、ここに、スチレン５００ｇを
滴下ロートから６０分かけて滴下し、合計６時間重合し
た。走査型電子顕微鏡で粒径を測定したところ平均粒子
径６２０ｎｍであった。この溶液をラテックス溶液
（３）とする。

【００３５】（製造例４） 磁性粒子の製造 反応容器にイオン交換水０．９リットルを仕込んだ。こ
れに（製造例１）のラテックス溶液（１）１００ｇ（固
形分１０ｇ）を投入し、窒素ガスにより脱酸素を行っ
た。充分脱酸素を行った後、ＦｅＣｌ_２を１０ｇ投入
し、０．１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ６．９に調製した。この
後、窒素ガス流入下で攪拌しながら、容器内の温度７０
℃に加温した。このものに予め、脱酸素イオン交換水１
リットルに亜硝酸ナトリウム２０ｇ溶解した溶液を、２
５ｍｌ／分の割合で供給した。この間ｐＨは一定に維持
し、約２０分後、フェマタイトの磁性粒子が生成した。
走査型電子顕微鏡で粒径を測定したところ平均粒子径１
２０ｎｍであった。これを濾過、水洗いして磁性粒子を
得た。得られた粒子は茶色をしていた。磁化量は１０ｅ
ｍｕ／ｇであった。

【００３６】（製造例５） 磁性粒子の製造 反応容器にイオン交換水０．９リットルを仕込んだ。こ
れに（製造例１）のラテックス溶液（１）１００ｇ（固
形分１０ｇ）を投入し、窒素ガスにより脱酸素を行っ
た。充分脱酸素を行った後、ＦｅＣｌ_２１０ｇ投入し、
０．１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ６．９に調製した。この後、
窒素ガス流入下で攪拌しながら、容器内の温度７０℃に
加温した。このものに予め、脱酸素イオン交換水１リッ
トルに亜硝酸ナトリウム２０ｇ溶解した溶液を、２０ｍ
ｌ／分の割合で供給した。この間ｐＨは一定に維持し、
約２０分後、フェマタイトの磁性粒子が生成した。走査
型電子顕微鏡で粒径を測定したところ平均粒子径１２０
ｎｍであった。これを濾過、水洗いして磁性粒子を得
た。得られた粒子は茶色をしていた。磁化量は２０ｅｍ
ｕ／ｇであった。

【００３７】（製造例６） 磁性粒子の製造 反応容器にイオン交換水０．９リットルを仕込んだ。こ
れに（製造例１）のラテックス溶液（１）１００ｇ（固
形分１０ｇ）を投入し、窒素ガスにより脱酸素を行っ
た。充分脱酸素を行った後、ＦｅＣｌ_２１０ｇ投入し、
０．１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ６．９に調製した。この後、
窒素ガス流入下で攪拌しながら、容器内の温度７０℃に
加温した。このものに予め、脱酸素イオン交換水１リッ
トルに亜硝酸ナトリウム２０ｇ溶解した溶液を、１０ｍ
ｌ／分の割合で供給した。この間ｐＨは一定に維持し、
約２０分後、フェマタイトの磁性粒子が生成した。走査
型電子顕微鏡で粒径を測定したところ平均粒子径１２０
ｎｍであった。これを濾過、水洗いして磁性粒子を得
た。得られた粒子は茶色をしていた。磁化量は３１ｅｍ
ｕ／ｇであった。

【００３８】（製造例７） 磁性粒子の製造 反応容器にイオン交換水０．９リットルを仕込んだ。こ
れに（製造例１）のラテックス溶液（１）１００ｇ（固
形分１０ｇ）を投入し、窒素ガスにより脱酸素を行っ
た。充分脱酸素を行った後、ＦｅＣｌ_２１０ｇ投入し、
０．１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ６．９に調製した。この後、
窒素ガス流入下で攪拌しながら、容器内の温度７０℃に
加温した。このものに予め、脱酸素イオン交換水１リッ
トルに亜硝酸ナトリウム２０ｇ溶解した溶液を、５ｍｌ
／分の割合で供給した。この間ｐＨは一定に維持し、約
２０分後、フェマタイトの磁性粒子が生成した。走査型
電子顕微鏡で粒径を測定したところ平均粒子径１２０ｎ
ｍであった。これを濾過、水洗いして磁性粒子を得た。
得られた粒子は茶色をしていた。磁化量は４２ｅｍｕ／
ｇであった。

【００３９】（製造例８） 磁性粒子の製造 反応容器にイオン交換水０．９リットルを仕込んだ。こ
れに（製造例２）のラテックス溶液（２）１００ｇ（固
形分１０ｇ）を投入し、窒素ガスにより脱酸素を行っ
た。充分脱酸素を行った後、ＦｅＣｌ_２１０ｇ投入し、
０．１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ６．９に調製した。この後、
窒素ガス流入下で攪拌しながら、容器内の温度７０℃に
加温した。このものに予め、脱酸素イオン交換水１リッ
トルに亜硝酸ナトリウム２０ｇ溶解した溶液を、３０ｍ
ｌ／分の割合で供給した。この間ｐＨは一定に維持し、
約２０分後、フェマタイトの磁性粒子が生成した。走査
型電子顕微鏡で粒子径を測定したところ平均粒子径３１
０ｎｍであった。これを濾過、水洗いして磁性粒子を
得。得られた粒子は茶色をしていた。磁化量は１ｅｍｕ
／ｇであった。

【００４０】（製造例９） 磁性粒子の製造 反応容器にイオン交換水０．９リットルを仕込んだ。こ
れに（製造例２）のラテックス（２）溶液１００ｇ（固
形分１０ｇ）を投入し、窒素ガスにより脱酸素を行っ
た。充分脱酸素を行った後、ＦｅＣｌ_２１０ｇ投入し、
０．１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ６．９に調製した。この後、
窒素ガス流入下で攪拌しながら、容器内の温度７０℃に
加温した。このものに予め、脱酸素イオン交換水１リッ
トルに亜硝酸ナトリウム２０ｇ溶解した溶液を、２５ｍ
ｌ／分の割合で供給した。この間ｐＨは一定に維持し、
約２０分後、フェマタイトの磁性粒子が生成した。走査
型電子顕微鏡で粒子径を測定したところ平均粒子径３０
０ｎｍであった。これを濾過、水洗いして磁性粒子を得
た。得られた粒子は茶色をしていた。磁化量は９ｅｍｕ
／ｇであった。

【００４１】（製造例１０） 磁性粒子の製造 反応容器にイオン交換水０．９リットルを仕込んだ。こ
れに（製造例２）のラテックス溶液１００ｇ（固形分１
０ｇ）を投入し、窒素ガスにより脱酸素を行った。充分
脱酸素を行った後、ＦｅＣｌ_２１０ｇ投入し、０．１Ｎ
−ＮａＯＨでｐＨ６．９に調製した。この後、窒素ガス
流入下で攪拌しながら、容器内の温度７０℃に加温し
た。このものに予め、脱酸素イオン交換水１リットルに
亜硝酸ナトリウム２０ｇ溶解した溶液を、２０ｍｌ／分
の割合で供給した。この間ｐＨは一定に維持し、約２０
分後、フェマタイトの磁性粒子が生成した。走査型電子
顕微鏡で粒子径を測定したところ平均粒子径３１０ｎｍ
であった。これを濾過、水洗いして磁性粒子を得た。得
られた粒子は茶色をしていた。磁化量は１９ｅｍｕ／ｇ
であった。

【００４２】（製造例１１） 磁性粒子の製造 反応容器にイオン交換水０．９リットルを仕込んだ。こ
れに（製造例２）のラテックス（２）溶液１００ｇ（固
形分１０ｇ）を投入し、窒素ガスにより脱酸素を行っ
た。充分脱酸素を行った後、ＦｅＣｌ_２１０ｇ投入し、
０．１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ６．９に調製した。この後、
窒素ガス流入下で攪拌しながら、容器内の温度７０℃に
加温した。このものに予め、脱酸素イオン交換水１リッ
トルに亜硝酸ナトリウム２０ｇ溶解した溶液を、５ｍｌ
／分の割合で供給した。この間ｐＨは一定に維持し、約
２０分後、フェマタイトの磁性粒子が生成した。走査型
電子顕微鏡で粒子径を測定したところ平均粒子径３００
ｎｍであった。これを濾過、水洗いして磁性粒子を得
た。得られた粒子は黒色をしていた。磁化量は４０ｅｍ
ｕ／ｇであった。

【００４３】（製造例１２） 磁性粒子の製造 反応容器にイオン交換水０．９リットルを仕込んだ。こ
れに（製造例３）のラテックス（３）溶液１００ｇ（固
形分１０ｇ）を投入し、窒素ガスにより脱酸素を行っ
た。充分脱酸素を行った後、ＦｅＣｌ_２１０ｇ投入し、
０．１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ６．９に調製した。この後、
窒素ガス流入下で攪拌しながら、容器内の温度７０℃に
加温した。このものに予め、脱酸素イオン交換水１リッ
トルに亜硝酸ナトリウム２０ｇ溶解した溶液を、２５ｍ
ｌ／分．の割合で供給した。この間ｐＨは一定に維持
し、約２０分後、フェマタイトの磁性粒子が生成した。
走査型電子顕微鏡で粒子径を測定したところ平均粒子径
６３０ｎｍであった。これを濾過、水洗いして磁性体を
含有する不溶性担体粒子を得た。得られた粒子は茶色を
していた。磁化量は９ｅｍｕ／ｇであった。

【００４４】（製造例１３） 磁性粒子の製造 反応容器にイオン交換水０．９リットルを仕込んだ。こ
れに（製造例３）のラテックス（３）溶液１００ｇ（固
形分１０ｇ）を投入し、窒素ガスにより脱酸素を行っ
た。充分脱酸素を行った後、ＦｅＣｌ_２１０ｇ投入し、
０．１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ６．９に調製した。この後、
窒素ガス流入下で攪拌しながら、容器内の温度７０℃に
加温した。このものに予め、脱酸素イオン交換水１リッ
トルに亜硝酸ナトリウム２０ｇ溶解した溶液を、１０ｍ
ｌ／分．の割合で供給した。この間ｐＨは一定に維持
し、約２０分後、フェマタイトの磁性粒子が生成した。
走査型電子顕微鏡で粒子径を測定したところ平均粒子径
６３０ｎｍであった。これを濾過、水洗いして磁粒子を
得た。得られた粒子は茶色をしていた。磁化量は３０ｅ
ｍｕ／ｇであった。

【００４５】（感作法）（製造例１〜１３）で作成した
磁性粒子は、粒子濃度４％となるように１ｍｌのりん酸
緩衝液（ｐＨ５．０）に分散させる。これに１％ＥＤＣ
（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉ
ｎｏｐｒｏｐｙｌ）Ｃａｌｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄ
ｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）：（株）同人化学研究所製）水
溶液２００μｌを加え、攪拌した。この後、遠心分離
（１２０００ｒｐｍ×２０分）により上清を取り除き、
分離させた粒子を１ｍｌの蒸留水に再分散させ、この操
作を２回繰り返し、３回目に上清を取り除いた沈殿物の
粒子に２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え、粒
子濃度４％となるように分散させた。これに、塩析法に
よって部分精製した抗ヒトＡＦＰヤギ由来抗体（ＡＴＡ
Ｂ社製）２００μｌを加え攪拌後、冷蔵庫中にて３日間
感作させる。その後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ×２
０分）により上清を取り除き分離された粒子を１ｍｌの
「０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、１．５％ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ６０００）、１％牛血清アルブミン／
２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．５）」（ＰＢ溶液と省
略）に再分散させ、この操作を３回繰返し、粒子濃度を
４％に調製する。各感作粒子の粒径、磁化量及び比重を
表１に示した。

【００４６】（実施例１）表１の磁性粒子（Ｉ）として
感作粒子９溶液０．１２５ｍｌと磁性粒子（ＩＩ）とし
て感作粒子１１溶液０．５ｍｌにＰＢ溶液１．３７５ｍ
ｌを混合してよく攪拌した溶液を試薬とする。この試薬
を０．１ｍｌを平底９６穴マイクロプレートのウェルに
分注する。ＡＦＰ製品（バイオテスト社製）を生理食塩
水で希釈し、濃度５００ｎｇ／ｍｌとしたものを標準液
とする。標準液を生理食塩水で２倍ずつ希釈した系列を
作製したこれを検体とする。これらの検体を０．１ｍｌ
ずつ上記の平底９６穴マイクロプレートのウェルに分注
し５０分間室温で反応させた。次に当社作製の磁気分離
装置を平底９６穴マイクロプレートのウェル側面外部５
分間あて、抗原抗体反応によって凝集した粒子を集磁さ
せる。残存する未反応の磁性粒子をマイクロプレートリ
ーダー（東ソー（株）製ＭＰＲＡ４ｉ）により波長５７
０ｎｍでその吸光度を測定した。

【００４７】（実施例２）実施例１において磁性粒子
（ＩＩ）しての感作粒子１１溶液を０．１２５ｍｌに、
ＰＢ溶液を１．７５ｍｌに変えただけで、操作方法は実
施例１と同じである。

【００４８】（実施例３）実施例１において磁性粒子
（ＩＩ）しての感作粒子１１溶液を０．１２５ｍｌに、
ＰＢ溶液を０．１７５ｍｌに変えただけで、操作方法は
実施例１と同じである。

【００４９】（実施例４〜１１，比較例１）実施例４〜
実施例１１及び比較例１は表３に示したように磁性粒子
（Ｉ）と磁性粒子（ＩＩ）を組み合わせて実験を行った
もので、操作方法は実施例１と同じである。

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【００５３】結果 吸光度とＡＦＰ溶液濃度の結果を表３に示した。比較例
１は両磁性粒子の磁化量が高い為、未反応の磁性粒子が
磁力によって引き付けられてしまった。測定不可能であ
った。

【００５４】

【発明の効果】本発明によれば、磁化量の異なる２種類
の磁性粒子を用いることにより、抗原−抗体−磁性粒子
又は抗体−抗原−磁性粒子の凝集塊を生成し、この凝集
塊を集磁させるため、Ｂ／Ｆ分離が不要で、従来より
も、簡便で目的の物質が定量又は定性可能となり、集磁
がより確実に行なえ、一層高精度が分析が可能となり、
有用な臨床診断方法が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に用いる磁性粒子の磁化量一粒径図

【符号の説明】

Ａ，Ｂ，Ｅ，Ｄ，Ｃ………………この範囲内が磁性粒子
（Ｉ）の条件 Ｃ′，Ｄ′，Ｅ′，Ｇ，Ｆ………この範囲内が磁性粒子
（ＩＩ）の条件 ｍ，ｎ，ｏ，ｐ……………………この範囲内が磁性粒子
（Ｉ）の好ましい条件 ｑ，ｒ，ｐ，ｔ……………………この範囲内が磁性粒子
（ｎ）の好ましい条件

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 阿南 真 東京都品川区南品川４丁目１番15号 日本 ペイント株式会社東京事業所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記（１）〜（３）の工程を順次経ること
   を特徴とする抗原・抗体反応による生体内物質の測定方
   法。 （１）磁化量−粒径図でＡ（１，１０）、Ｂ（１，１０
   ００）、Ｃ（Ｘ１，１０）、Ｄ（Ｘ２，３００）及びＥ
   （Ｘ３，１０００）の範囲内に含まれ比重が１〜２であ
   る磁性粒子（Ｉ）、及びＣ′（Ｘ１，１０）、Ｄ′（Ｘ
   ２，３００）、Ｅ′（Ｘ３，１０００）、Ｆ（７０，１
   ０）及びＧ（７０，１０００）の範囲内に含まれ比重が
   １〜２である磁性粒子（ＩＩ）に、抗体又は抗原を担持
   させた混合粒子と、前記混合粒子の抗体と生体内物質中
   の抗原、又は前記混合粒子の抗原と生体内物質中の抗体
   を反応させる工程（ただし、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３，は、Ｘ
   １＞Ｘ２＞Ｘ３，１８＜Ｘ２＜３５である磁性粒子
   （Ｉ）を単分散させた時に集磁される下限磁化量、磁性
   粒子（ＩＩ）の点Ｃ′Ｄ′Ｅ′のＸ軸＞Ｘ１，Ｘ２，Ｘ
   ３、磁性粒子（Ｉ）と磁性粒子（ＩＩ）との比重差が０
   〜０．５である。磁化量：ｅｍｕ／ｇ，粒径：ｎｍ） （２）前記反応混合物に磁場を付与する工程 （３）集磁されない磁性粒子の量を３５０ｎｍ以上の波
   長で吸光度又は透過度を測定し、生体内物質中の抗原又
   は抗体を定性又は定量する工程