JPH06113819A - ユーグレナの培養方法 - Google Patents

ユーグレナの培養方法

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JPH06113819A
JPH06113819A JP4263734A JP26373492A JPH06113819A JP H06113819 A JPH06113819 A JP H06113819A JP 4263734 A JP4263734 A JP 4263734A JP 26373492 A JP26373492 A JP 26373492A JP H06113819 A JPH06113819 A JP H06113819A
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euglena
culture
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paramylon
protein
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JP4263734A
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Masahiro Hayashi
雅弘 林
Kyoji Toda
享次 戸田
Hiroto Ishiko
裕人 石古
Shozaburo Kitaoka
正三郎 北岡
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Harima Chemicals Inc
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 蛋白質含有量の高いユーグレナ細胞を得る。 【構成】 対数増殖期後期あるいは定常期においてパラ
ミロンを豊富に含有しているユーグレナ細胞を資化性窒
素化合物の共存下特定のpH条件下で培養する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はユーグレナの培養方法特
には蛋白質含量の高いユーグレナの培養方法に関する。
【0002】
【従来の技術と問題点】ユーグレナ細胞は優れたアミノ
酸組成のタンパク質を含み、動物の消化酵素で容易に消
化される。また、ビタミンA、C、Eなどを豊富に含む
ためSCP(Single Cell Protein )や飼料タンパク質
として有望視されている。従ってその培養方法はすでに
いろいろ研究され報告されている。例えばユーグレナの
培養方法は従来、フラスコや培養槽で光照射下、あるい
は暗黒下での回分培養方式が通常とられてきた。そして
ユーグレナ細胞に含有されるタンパク質は光照射によっ
て増加することが知られており、これまでも光照射を前
提とする培養方法が検討されてきた。(特開昭61−3
7092、特開昭61−40785)しかしこれらの方
法によると光照射の装置が必要となり、さらに多大な照
射コストがユーグレナの安価な供給を困難なものにす
る。さらに照度のコントロールなど、培養操作は煩雑な
ものであった。
【0003】
【問題を解決するための手段】発明者らは研究の結果、
ユーグレナ細胞が対数増殖期後期あるいは定常期におい
て細胞内に蓄積したパラミロン(β−1,3グルカン)
をタンパク質に変換し、その変換効率が特定の培地pH
において良好であることを見いだし、さらに対数増殖期
後期から定常期において培地中の窒素源を枯渇させずに
保っておくとパラミロンからタンパク質への変換が効率
よく行なわれることを見いだし、本発明を完成したもの
である。
【0004】本発明でいうユーグレナとは、動物学の分
類上でユーグレナ属(ミドリムシ属)に属する原生動物
で、これに属する種、変種、変異種のすべてを含む。代
表的なものとしてはユーグレナ・グラシリス(Euglena
gracilis)、ユーグレナ・グラシリス・バシラリス変種
(Euglena gracilis var. bacillaris)、ユーグレナ・
ビリディス(Euglena viridis )、アスタシア・ロンガ
(Astasia longa )などである。
【0005】これらユーグレナの培養に使用する培地に
は、コーレン・ハットナー培地(ジャーナル・オブ・プ
ロトゾオロジー(Jouenal of Protozoology ) 14巻
(1967年) 増補17頁)や、ハットナー培地(ジ
ャーナル・オブ・プロトゾオロジー(Jouenal of Proto
zoology ) 6巻(1959年) 23頁)等の公知の
培地を使用することができる。また炭素源としてグルコ
ース、澱粉水解物、糖蜜、グルタミン酸、酢酸、エタノ
ール等を使用し、窒素源として硝酸アンモニウム、第2
リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アンモニア水
等のような無機窒素源、グルタミン酸、アスパラギン酸
のようなアミノ酸、またはペプトン、カザミノ酸、酵母
エキス、コーンスティープリカー等の有機窒素源を適宜
組合せ、これにカルシウム、マグネシウム、マンガン、
鉄等の無機塩とビタミンB1 およびB12を微量加えたよ
うな培地を使用することもできる。一般的にユーグレナ
の培養温度は20〜35℃が適当であり、初発pHは
2.0〜7.5が適当であるが、細胞の増殖には3.0
〜5.0の範囲が最も好ましい。また、培養時には1分
間あたり50〜250回の振盪、適度の通気攪拌を行な
うことが望ましい。
【0006】本発明では暗黒下の培養でも従来の光照射
下の培養以上の高タンパク質のユーグレナ細胞が得られ
るが、光照射の有無を限定する必要はない。もちろん光
照射下の培養においても本発明は十分な効果を得ること
ができる。
【0007】本発明を実施するについてユーグレナを培
養するには培地の初発pH2.0〜7.5、好ましくは
3.0〜5.0で培養を開始するとよい。その後、ユー
グレナの増殖が対数増殖期後期ないし定常期に達した時
点ではユーグレナ細胞はパラミロンを細胞内に多量に蓄
積し、タンパク質含量は低いものとなっているが、培地
pHを1.5〜3.5、あるいは5.5〜8.0の範囲
に調整し、資化性窒素化合物の存在下でさらに培養を継
続すると細胞中のパラミロンは激減し、タンパク質含量
が増加する。その場合、pH調整後の培養時間は3時間
以上で効果が期待でき、好ましくは6〜48時間培養を
継続する。また、この時のpH調整は硫酸、塩酸、水酸
化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、アンモニア水
等、ユーグレナに悪影響を与えない酸・アルカリであれ
ばいかなるものでも使用できる。勿論、pHコントロー
ラー等で一定のpHに維持してもよいがとにかくpH
1.5〜3.5あるいは5.5〜8.0の範囲内に維持
されればよい。
【0008】ユーグレナを培養すると培養中に培地pH
が低下する。このため初発pHをユーグレナの増殖に適
したpHとしても培養中に変化し、細胞収量の低下を招
くことがある。このため、対数増殖期中期の培地pHを
ユーグレナ細胞の増殖に適した3.0〜5.0に保つこ
とにより細胞収量の低下を防ぐことができる。この時、
培養開始から対数増殖期後期あるいは定常期にpH調整
を行なうまでの期間をつうじてpHを維持することもで
きるし、最も細胞の増殖が盛んな対数増殖期中期のみp
Hを維持してもよい。また、この時のpH維持には硫
酸、塩酸、水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶
液、アンモニア水等、ユーグレナに悪影響を与えない酸
・アルカリであればいかなるものでも使用できる。
【0009】このようにして盛んな増殖を継続して行な
えばユーグレナは優に乾物重量で30%を超えるパラミ
ロンを含有するようになる。
【0010】ユーグレナは増殖にともなって培地中の窒
素源を消費し、対数増殖期の後期から定常期においては
培地中の窒素源は非常に低濃度となる。しかし、窒素は
パラミロンからのタンパク質合成に必須の因子であり、
パラミロンがタンパク質に変換される際、培地中の窒素
源が不足しているとタンパク質への変換は効率よく行な
われ得ない。したがって本発明の方法ではユーグレナの
増殖を、一定水準に維持された資化性窒素源の存在下に
行なわせる。こうすることで効率よく高タンパク質含量
のユーグレナ細胞を得ることができる。添加する窒素源
はユーグレナに悪影響を与えず資化される窒素源であれ
ばいかなるものでもかまわない。代表的なものとして硝
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、第2リン酸アンモ
ニウムあるいはアンモニア水等のような無機窒素源、グ
ルタミン酸、アスパラギン酸のようなアミノ酸、または
ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、コーンスティープ
リカー等の有機窒素源等が使用できる。これらのうちで
アンモニア態窒素とアミノ酸は特に資化され易いようで
好ましい。アンモニア水をアルカリ剤として使用すれば
pHの低下に見合って添加することで培地中の窒素濃度
を測定せずとも実用上充分に必要な資化性窒素化合物の
水準を維持することができ、さらにpHも増殖に適した
範囲に保つことができて好都合である。ユーグレナの資
化性窒素化合物取り込みは強力に行なわれるらしく本発
明の効果がもたらされるその存在量の下限は可成り低
い。すなわち10ppm以下でも本発明効果はもたらさ
れる。しかし、これを越えていれば一層速かに取り込み
が行なわれる。 ユーグレナ培養例 グルコース 120g,硫酸アンモニウム 42g,コ
ーンスティープリカー30g,硫酸マグネシウム 3
g,リン酸一カリウム 3g,エチレンジアミン四酢酸
ナトリウム塩 0.3g,モール塩 0.3g,硫酸亜
鉛 0.15g,硫酸マンガン 0.1g,ビタミンB
1 30mg,ビタミンB12 60μgを水道水6 l
に溶解し、10 l容ジャーファーメンターに仕込ん
で、オートクレーブで滅菌(120℃、20分)した。
これに予め同様の培地で前培養したユーグレナ・グラシ
リス(Euglena grasilis)の培養液600mlを接種
し、28℃で72時間通気培養した。この時、培地のp
HはpHコントローラーを用い、2N 水酸化ナトリウ
ム水溶液で4.5に培養終了まで維持した。なお、用い
たユーグレナは国立環境研究所微生物系統保存施設(茨
城県つくば市小野川16−2)より分譲を受けたユーグ
レナ・グラシリスNIES48であり、同じ株は請求に
より入手できる。
【0011】培養中、経時的にサンプリングし、培養液
中の細胞密度をトーマ式血球計算盤で計測した。細胞の
増殖は培養48時間で定常期に達し、それ以降増殖は見
られなかった。培養終了後、培養液を遠心分離して細胞
を回収し、培養液1 l当たりの乾燥細胞重量、タンパ
ク質含量、パラミロン含量を測定した。結果は以下に示
す通りパラミロン含量40.9%のユーグレナを得た。
パラミロンの定量は、菌体脂質をアセトンで除去後、ド
デシル硫酸ナトリウム水溶液(1%)で除タンパクし、
得られたグルカンを水酸化ナトリウム(2N)に溶解し
てフェノール硫酸法で定量し、タンパク質の定量はミク
ロケルダール法によった。
【0012】
【表1】 表1 ─────────────────────────── 細胞収量 8.2g/l タンパク質 45.2% パラミロン 40.9% (dry basis) ─────────────────────────── 実施例1 上記のユーグレナ培養例で培養48時間目以降を更に操
作を続けた。すなわちまず上記培養例の通りユーグレナ
を培養しておき、2N水酸化ナトリウム水溶液、あるい
は2N硫酸を用いて培養開始後48時間で培地pHを
1.0〜8.5に変化させた。培養48時間から以降は
それぞれのpHに培地pHをコントロールし、培養開始
後72時間で細胞をそれぞれ回収し、タンパク質含量、
パラミロン含量を測定した。結果を以下に示す。
【0013】
【表2】 表2 ─────────────────────────────────── 培養48時間以降のpH タンパク質含量 パラミロン含量 ─────────────────────────────────── 1.0 44.9 41.2 1.5 55.8 30.9 2.0 56.9 29.1 2.5 55.0 29.8 3.0 53.1 32.6 3.5 53.9 33.1 4.0 49.0 38.3 4.5 45.1 40.2 5.0 43.9 43.2 5.5 51.0 34.2 6.0 55.4 29.7 6.5 59.0 24.1 7.0 59.3 24.3 8.0 58.6 25.0 8.5 45.0 40.6 (%) ─────────────────────────────────── 上記のごとく、定常期における培地pHが1.5〜3.
5、あるいは5.5〜8.0で培養したユーグレナは培
養例で示したものに比較し、低パラミロン、高タンパク
質となっていた。
【0014】実施例2 培養例とほぼ同様にしてユーグレナを培養した。しかし
培養中の培地pHは48時間まで4.5、48時間以降
は6.5とした。そして48時間目以降の培養中、下記
の設定で窒素源を添加した。
【0015】
【表3】 表3 ─────────────────────────────────── 添加窒素源 添加時間 添加量 pHコントロール ─────────────────────────────────── 1区 硝酸カリウム 48時間目 0.5 % 水酸化ナトリウム 2区 硫酸アンモニウム 48時間目 0.5 % 〃 3区 塩化アンモニウム 48時間目 0.5 % 〃 4区 グルタミン酸ナトリウム 48時間目 0.5 % 〃 5区 − − 〃 6区 − − アンモニア水 ───────────────────────────────────
【0016】
【表4】 表4 ────────────────────────── タンパク質含量 パラミロン含量 (%) ────────────────────────── 1区 48.4 34.9 2区 68.6 15.5 3区 66.9 18.0 4区 65.7 19.7 5区 47.1 35.6 6区 74.1 11.8 ────────────────────────── 上記のように窒素源の添加によってよりパラミロン含量
は低くなるが、タンパク質含量が高い細胞を得ることが
できた。特に培養中のpHコントロールをアンモニア水
で行なうことによって別途窒素源を添加する事無く、高
蛋白細胞を得ることができる。これはpH制御の目的で
添加したアンモニア水が窒素源として作用した結果であ
る。また、ユーグレナは窒素源として硝酸態窒素を利用
することができないためか添加する窒素源が硝酸態窒素
では本発明の効果を十分期待できないことがわかる。な
お、本実施例において6区を除き、48時間目の培地中
にはアンモニア態窒素は検出されなかった。6区の培地
中ではアンモニア態窒素濃度は培養期間中ほぼ一定して
いた。
【0017】
【発明の効果】以上の実施例から明らかなように本発明
によるユーグレナの培養方法は従来の培養方法に比べて
簡便かつ効率的に高タンパク質のユーグレナ細胞を提供
することができる。また従来の方法で得ることが困難で
あったタンパク質60%以上の細胞も何ら特殊な装置を
も必要とせずに得ることが可能である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 北岡 正三郎 大阪府河内長野市大矢船中町17−11

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 パラミロンを30%(対乾物重量比)以
    上含有するユーグレナ細胞を培地中で資化性窒素化合物
    に接触させながら培地のpHを1.5ないし3.5又は
    5.5ないし8.0の範囲として行なうことを特徴とす
    るユーグレナの培養方法。
  2. 【請求項2】 資化性窒素化合物を培地中に少なくとも
    10ppm以上とする請求項1の方法。
  3. 【請求項3】 資化性窒素化合物がアンモニア態窒素化
    合物又はアミノ酸のいずれかである請求項2の方法。
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