JPH06113879A - ヒト第ｖｉｉｉ因子及びヒト第ｖｉｉｉ因子のアナログの製造方法 - Google Patents
ヒト第ｖｉｉｉ因子及びヒト第ｖｉｉｉ因子のアナログの製造方法Info
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- JPH06113879A JPH06113879A JP3102185A JP10218591A JPH06113879A JP H06113879 A JPH06113879 A JP H06113879A JP 3102185 A JP3102185 A JP 3102185A JP 10218591 A JP10218591 A JP 10218591A JP H06113879 A JPH06113879 A JP H06113879A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】少なくとも１つのポリカチオン性及び／又はポ
リアニオン性のポリマーの誘導体を含有する培養培地
中、第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログを産
生する細胞を培養することにより前記第ＶＩＩＩ因子又
は第ＶＩＩＩ因子のアナログを調製するとともに、第Ｖ
ＩＩＩ因子又はそのアナログを分離する方法、及び該方
法によって得た、第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子の
アナログとポリカチオン性及び／又はポリアニオン性の
ポリマーの少なくとも一つの誘導体との間の複合体或い
は第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログ。 【効果】培養培地中にフォン・ヴィレブランド因子の存
在を必要とせず、第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子の
アナログの工業的な生産のために十分な時間的・コスト
的利益が得られる。
リアニオン性のポリマーの誘導体を含有する培養培地
中、第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログを産
生する細胞を培養することにより前記第ＶＩＩＩ因子又
は第ＶＩＩＩ因子のアナログを調製するとともに、第Ｖ
ＩＩＩ因子又はそのアナログを分離する方法、及び該方
法によって得た、第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子の
アナログとポリカチオン性及び／又はポリアニオン性の
ポリマーの少なくとも一つの誘導体との間の複合体或い
は第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログ。 【効果】培養培地中にフォン・ヴィレブランド因子の存
在を必要とせず、第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子の
アナログの工業的な生産のために十分な時間的・コスト
的利益が得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト第ＶＩＩＩ因子及
びヒト第ＶＩＩＩ因子のアナログの製造方法に関する。
びヒト第ＶＩＩＩ因子のアナログの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】第ＶＩＩＩ因子は、血友病Ａに苦しむ患
者の治療に使用される血液凝固因子である。
者の治療に使用される血液凝固因子である。
【０００３】該治療に使用される第ＶＩＩＩ因子は、現
在分別によりヒト血漿から得られる第ＶＩＩＩ因子の濃
縮物から本質的に構成されている。その時以来、第ＶＩ
ＩＩ因子の該原料を、より容易に入手できウイルス又は
他の汚染（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）の影響がより
少ない原料により置き換えようとする試みがなされ、遺
伝子工学により第ＶＩＩＩ因子を得るために多大な努力
が払われてきた。現在得られた結果は、組換え第ＶＩＩ
Ｉ因子が、天然の第ＶＩＩＩ因子のあらゆる性質を示
し、該組換え第ＶＩＩＩ因子が満足のいく工業的条件下
で得ることができることを示している。
在分別によりヒト血漿から得られる第ＶＩＩＩ因子の濃
縮物から本質的に構成されている。その時以来、第ＶＩ
ＩＩ因子の該原料を、より容易に入手できウイルス又は
他の汚染（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ）の影響がより
少ない原料により置き換えようとする試みがなされ、遺
伝子工学により第ＶＩＩＩ因子を得るために多大な努力
が払われてきた。現在得られた結果は、組換え第ＶＩＩ
Ｉ因子が、天然の第ＶＩＩＩ因子のあらゆる性質を示
し、該組換え第ＶＩＩＩ因子が満足のいく工業的条件下
で得ることができることを示している。
【０００４】遺伝子工学の技術を使用した方法による第
ＶＩＩＩ因子の調製は、広く知られており、特に以下の
特許に記載されている。−ＥＰ−Ａ−１６２，０６７，
−ＥＰ−Ａ−１８２、４４８、−ＥＰ−Ａ−１５０、７
３５、−ＥＰ−Ａ−１５７、５５６及び−ＥＰ−Ａ−１
６０、４５７。
ＶＩＩＩ因子の調製は、広く知られており、特に以下の
特許に記載されている。−ＥＰ−Ａ−１６２，０６７，
−ＥＰ−Ａ−１８２、４４８、−ＥＰ−Ａ−１５０、７
３５、−ＥＰ−Ａ−１５７、５５６及び−ＥＰ−Ａ−１
６０、４５７。
【０００５】特に、特許ＥＰ−Ａ−１６２，０６７は、
種々のタイプの真核細胞、特にＣＨＯ細胞中における第
ＶＩＩＩ因子の発現について述べている。
種々のタイプの真核細胞、特にＣＨＯ細胞中における第
ＶＩＩＩ因子の発現について述べている。
【０００６】特許ＥＰ−Ａ−１６０、４５７もまた真核
細胞、特にＢＨＫ細胞中における第ＶＩＩＩ因子の発現
について記載している。
細胞、特にＢＨＫ細胞中における第ＶＩＩＩ因子の発現
について記載している。
【０００７】特許ＦＲ−Ａ−８６／０８，２５８及びＦ
Ｒ−Ａ−８７／０４，６９９は、真核細胞及びワクシニ
アウイルスを発現系として使用した第ＶＩＩＩ因子の調
製について記載している。第ＶＩＩＩ因子の最大の生産
量を得るために、培養培地はフォン・ヴィレブランド
（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子を含有する。
Ｒ−Ａ−８７／０４，６９９は、真核細胞及びワクシニ
アウイルスを発現系として使用した第ＶＩＩＩ因子の調
製について記載している。第ＶＩＩＩ因子の最大の生産
量を得るために、培養培地はフォン・ヴィレブランド
（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子を含有する。
【０００８】真核細胞経由のものとして、特許ＥＰ−Ａ
−２５３，４５５もまた、第ＶＩＩＩ因子の調製にイー
ストを使用することを示唆している。
−２５３，４５５もまた、第ＶＩＩＩ因子の調製にイー
ストを使用することを示唆している。
【０００９】いくつかの第ＶＩＩＩ因子のアナログもま
た提案されてきた。これらの誘導体をカバーする特許
中、特に以下のものを示すことができる。−ＷＯ−Ａ−
８６／０６，１０１，−ＥＰ−Ａ−２３２，１１２，−
ＷＯ−Ａ−８７／０７，１４４，−ＷＯ−Ａ−８８／０
０，３８１，−ＥＰ−Ａ−２６５，７７８，−ＥＰ−Ａ
−２９４，９１０及び−ＥＰ−Ａ−３０３，５４０。
た提案されてきた。これらの誘導体をカバーする特許
中、特に以下のものを示すことができる。−ＷＯ−Ａ−
８６／０６，１０１，−ＥＰ−Ａ−２３２，１１２，−
ＷＯ−Ａ−８７／０７，１４４，−ＷＯ−Ａ−８８／０
０，３８１，−ＥＰ−Ａ−２６５，７７８，−ＥＰ−Ａ
−２９４，９１０及び−ＥＰ−Ａ−３０３，５４０。
【００１０】第ＶＩＩＩ因子のこれらのアナログは、天
然の第ＶＩＩＩ因子を越える種々の長所を示し、好適に
は、遺伝子工学の技術を用いて得ることができる。
然の第ＶＩＩＩ因子を越える種々の長所を示し、好適に
は、遺伝子工学の技術を用いて得ることができる。
【００１１】現在使用されている方法は、第ＶＩＩＩ因
子を発現する真核細胞に好適に作用し、これらは、染色
体中に１又は２以上の第ＶＩＩＩ因子をコードした配列
を組込んだ細胞であるか、又は第ＶＩＩＩ因子を発現す
るウイルスベクターを組込んだ細胞である。
子を発現する真核細胞に好適に作用し、これらは、染色
体中に１又は２以上の第ＶＩＩＩ因子をコードした配列
を組込んだ細胞であるか、又は第ＶＩＩＩ因子を発現す
るウイルスベクターを組込んだ細胞である。
【００１２】この種の技術は、既述の特許に広範に記載
されており、ここで詳細に述べることはしない。記載す
るのは、単に第ＶＩＩＩ因子を発現する細胞又は第ＶＩ
ＩＩ因子のアナログについてである。
されており、ここで詳細に述べることはしない。記載す
るのは、単に第ＶＩＩＩ因子を発現する細胞又は第ＶＩ
ＩＩ因子のアナログについてである。
【００１３】第ＶＩＩＩ因子のアナログとは、第ＶＩＩ
Ｉ因子の活性を有し、幾つかのアミノ酸の削除により第
ＶＩＩＩ因子から得られた分子、又は、ある種の可能性
のある変異を受けたにもかかわらず第ＶＩＩＩ因子の主
要な活性を保持している分子であると理解されるもので
ある。
Ｉ因子の活性を有し、幾つかのアミノ酸の削除により第
ＶＩＩＩ因子から得られた分子、又は、ある種の可能性
のある変異を受けたにもかかわらず第ＶＩＩＩ因子の主
要な活性を保持している分子であると理解されるもので
ある。
【００１４】特許ＷＯ−８７／０４，１８７，ＦＲ−Ａ
−８，６０８，２５８及びＦＲ−Ａ−８７／０４，６９
９中に記載されているように、第ＶＩＩＩ因子又は第Ｖ
ＩＩＩ因子のアナログの産生を最適化するために、フォ
ン・ヴィレブランド因子又はリン脂質の細胞培養培地中
への添加を考えるのが有益かもしれない。培養培地中に
おけるこのフォン・ヴィレブランド因子の存在が、第Ｖ
ＩＩＩ因子を安定化し、かなり収率を向上させるのに効
果のあることが示されている。
−８，６０８，２５８及びＦＲ−Ａ−８７／０４，６９
９中に記載されているように、第ＶＩＩＩ因子又は第Ｖ
ＩＩＩ因子のアナログの産生を最適化するために、フォ
ン・ヴィレブランド因子又はリン脂質の細胞培養培地中
への添加を考えるのが有益かもしれない。培養培地中に
おけるこのフォン・ヴィレブランド因子の存在が、第Ｖ
ＩＩＩ因子を安定化し、かなり収率を向上させるのに効
果のあることが示されている。
【００１５】直前の記載と同様の理由により、使用され
るフォン・ヴィレブランド因子は、あらゆる汚染の危険
を避けるため明らかに組換え体のフォン・ヴィレブラン
ド因子である。このことは、第ＶＩＩＩ因子の産生にお
ける追加のステップを使用すること及び第ＶＩＩＩ因子
の産生方法におけるコストの増加、特に２倍の価格を必
要とする。
るフォン・ヴィレブランド因子は、あらゆる汚染の危険
を避けるため明らかに組換え体のフォン・ヴィレブラン
ド因子である。このことは、第ＶＩＩＩ因子の産生にお
ける追加のステップを使用すること及び第ＶＩＩＩ因子
の産生方法におけるコストの増加、特に２倍の価格を必
要とする。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】それゆえ、フォン・ヴ
ィレブランド因子の使用を必要とすることなく、第ＶＩ
ＩＩ因子を高い収率で得る第ＶＩＩＩ因子の製造方法を
持つことが有用である。
ィレブランド因子の使用を必要とすることなく、第ＶＩ
ＩＩ因子を高い収率で得る第ＶＩＩＩ因子の製造方法を
持つことが有用である。
【００１７】従って、本発明の目的は、正確にこの問題
の解決策を提供することである。
の解決策を提供することである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】より具体的には、本発明
は、培養培地中第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のア
ナログを産生する細胞を培養し、第ＶＩＩＩ因子又は第
ＶＩＩＩ因子のアナログを分離する第ＶＩＩＩ因子又は
そのアナログの製造方法であって、前記培養培地中には
少なくとも１つのポリカチオン性の及び／又はポリアニ
オン性のポリマーを含有していることを特徴とする方法
を提供するものである。
は、培養培地中第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のア
ナログを産生する細胞を培養し、第ＶＩＩＩ因子又は第
ＶＩＩＩ因子のアナログを分離する第ＶＩＩＩ因子又は
そのアナログの製造方法であって、前記培養培地中には
少なくとも１つのポリカチオン性の及び／又はポリアニ
オン性のポリマーを含有していることを特徴とする方法
を提供するものである。
【００１９】第ＶＩＩＩ因子のアナログのうちでも、特
に第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸第７７１〜１６６６を欠失
したものに対応する、第ＶＩＩＩ因子デルタ２を挙げる
ことができ、より詳細には特許ＥＰ３０３，５４０にそ
の製法が記載されている。
に第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸第７７１〜１６６６を欠失
したものに対応する、第ＶＩＩＩ因子デルタ２を挙げる
ことができ、より詳細には特許ＥＰ３０３，５４０にそ
の製法が記載されている。
【００２０】本発明のポリマーは、好適にはポリオシジ
ックポリマー（ｐｏｌｙｏｓｉｄｉｃ ｐｏｌｙｍｅ
ｒ）、特にポリサッカライドの誘導体である。これらの
ポリマーは、好適には硫酸化（ｓｕｌｆａｔｅｄ）され
ている。
ックポリマー（ｐｏｌｙｏｓｉｄｉｃ ｐｏｌｙｍｅ
ｒ）、特にポリサッカライドの誘導体である。これらの
ポリマーは、好適には硫酸化（ｓｕｌｆａｔｅｄ）され
ている。
【００２１】このタイプのポリマーは知られており、そ
れらは特にバクテリアの発酵により得た生産物、例えば
デキストランであるか、或いはそれらは抽出生産物、例
えばヘパリン型のムコポリサッカライド、低分子量のヘ
パリン又はヘパリノイド、又はデルマタン硫酸又はヘパ
ラン硫酸である。ヒドロキシエチルスターチ硫酸も、ポ
リマーとして使用できる。これらの化合物は、低いコス
ト及び利用可能性の観点から特に有用である。本発明に
使用されるポリマーは、１０００から１，０００，００
０の間の分子量を有している。
れらは特にバクテリアの発酵により得た生産物、例えば
デキストランであるか、或いはそれらは抽出生産物、例
えばヘパリン型のムコポリサッカライド、低分子量のヘ
パリン又はヘパリノイド、又はデルマタン硫酸又はヘパ
ラン硫酸である。ヒドロキシエチルスターチ硫酸も、ポ
リマーとして使用できる。これらの化合物は、低いコス
ト及び利用可能性の観点から特に有用である。本発明に
使用されるポリマーは、１０００から１，０００，００
０の間の分子量を有している。
【００２２】本発明の実施態様によると、使用されるポ
リマーは硫酸化デキストラン（ｓｕｌｆａｔｅｄ ｄｅ
ｘｔｒａｎ）である。この硫酸化デキストランの硫酸化
の程度は、硫黄の重量で０．５％〜約１８％、好適には
１０〜約１８％のオーダーである。
リマーは硫酸化デキストラン（ｓｕｌｆａｔｅｄ ｄｅ
ｘｔｒａｎ）である。この硫酸化デキストランの硫酸化
の程度は、硫黄の重量で０．５％〜約１８％、好適には
１０〜約１８％のオーダーである。
【００２３】非常に多様な分子量の硫酸化デキストラン
が、本発明において使用できる。それらの分子量は、
５，０００〜７００，０００ダルトン（Ｄａ）まで変え
ることができる。
が、本発明において使用できる。それらの分子量は、
５，０００〜７００，０００ダルトン（Ｄａ）まで変え
ることができる。
【００２４】本発明の有利な実施態様によれば、使用で
きるポリマー誘導体は、２価の金属イオンと結合してい
る。限定的な意味ではないが、該金属イオンとしてはＣ
ａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋が例示され、Ｃ
ａ２＋イオンが好ましい。
きるポリマー誘導体は、２価の金属イオンと結合してい
る。限定的な意味ではないが、該金属イオンとしてはＣ
ａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋が例示され、Ｃ
ａ２＋イオンが好ましい。
【００２５】培養培地中における本発明のポリカチオン
性及び／又はポリアニオン性のポリマーの存在は、第Ｖ
ＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログの産生に好適
であり、フォン・ヴィレブランド因子の使用を必要とす
ること無く、フォン・ヴィレブランド因子も本発明のポ
リマーも含有しない培地中で得られるよりも相当高い収
率で第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログを得
ることができる。
性及び／又はポリアニオン性のポリマーの存在は、第Ｖ
ＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログの産生に好適
であり、フォン・ヴィレブランド因子の使用を必要とす
ること無く、フォン・ヴィレブランド因子も本発明のポ
リマーも含有しない培地中で得られるよりも相当高い収
率で第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログを得
ることができる。
【００２６】このように、本発明の方法に従って行われ
た、以下の実施態様に記載された実験から、次のことが
示される。即ち、分子量５００，０００の硫酸化デキス
トランを含有する培養培地を使用して、２つの異なる方
法により、つまり、１つは免疫酵素的方法に基づき抗第
ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体を用いたことにより、
他の一つは還元又は非還元条件下でのＰＡＧＥ−ＳＤＳ
分析のような物理化学的方法により測定された大量の第
ＶＩＩＩ因子デルタ２を得ることが可能になり、前記分
析では、ウシ血清の非存在下で発現される第ＶＩＩＩ因
子デルタ２の主要型を表わす１６５キロダルトンの主要
なバンドを示す。
た、以下の実施態様に記載された実験から、次のことが
示される。即ち、分子量５００，０００の硫酸化デキス
トランを含有する培養培地を使用して、２つの異なる方
法により、つまり、１つは免疫酵素的方法に基づき抗第
ＶＩＩＩ因子モノクローナル抗体を用いたことにより、
他の一つは還元又は非還元条件下でのＰＡＧＥ−ＳＤＳ
分析のような物理化学的方法により測定された大量の第
ＶＩＩＩ因子デルタ２を得ることが可能になり、前記分
析では、ウシ血清の非存在下で発現される第ＶＩＩＩ因
子デルタ２の主要型を表わす１６５キロダルトンの主要
なバンドを示す。
【００２７】分子量（５０００，８０００，１５，００
０，５０，０００，５００，０００ダルトン）は、第Ｖ
ＩＩＩ因子の発現に関して本質的に等価な結果を与え
る。
０，５０，０００，５００，０００ダルトン）は、第Ｖ
ＩＩＩ因子の発現に関して本質的に等価な結果を与え
る。
【００２８】ポリカチオン性の及び／又はポリアニオン
性のポリマーが添加された培養培地は、当然に第ＶＩＩ
Ｉ因子の産生に好適であるかもしれない他の因子を含ん
でいるかもしれない。それらは、抗プロテアーゼ因子及
び／又はその安定化剤として知られるカルシウムクロリ
ドであるかもしれない。
性のポリマーが添加された培養培地は、当然に第ＶＩＩ
Ｉ因子の産生に好適であるかもしれない他の因子を含ん
でいるかもしれない。それらは、抗プロテアーゼ因子及
び／又はその安定化剤として知られるカルシウムクロリ
ドであるかもしれない。
【００２９】これらの条件下で、硫酸化デキストラン１
０００ｍｇ／ｌ及びカルシウムクロリド２ｍｍｏｌ（最
小培地中１ｍＭ＋１ｍＭ添加）を添加した培養培地にお
いて、２４時間中に、外因性のフォン・ヴィレブランド
因子の非存在下で蓄積される量よりも、免疫酵素的方法
による測定で６〜７倍多い量の第ＶＩＩＩ因子デルタ２
を蓄積することができることが示された。
０００ｍｇ／ｌ及びカルシウムクロリド２ｍｍｏｌ（最
小培地中１ｍＭ＋１ｍＭ添加）を添加した培養培地にお
いて、２４時間中に、外因性のフォン・ヴィレブランド
因子の非存在下で蓄積される量よりも、免疫酵素的方法
による測定で６〜７倍多い量の第ＶＩＩＩ因子デルタ２
を蓄積することができることが示された。
【００３０】第ＶＩＩＩ因子の分子は、Ｂ領域が完全で
あっても欠失されていても、非常に局在化した高い密度
の電荷を保有する特性を有し、クーロン力（イオン型の
相互作用）で各々ポリアニオン及びポリカチオンと結合
できる、陽性及び陰性に荷電した極を生み出している。
第ＶＩＩＩ因子の産生に関する硫酸化デキストランの有
利な効果は、デキストランの硫酸残基と第ＶＩＩＩ因子
の塩基性アミノ酸との間の相互作用の存在により説明す
ることができる。この完全な若しくは欠失された第ＶＩ
ＩＩ因子の分子の安定化は、さらに第ＶＩＩＩ因子又は
第ＶＩＩＩ因子誘導体の発現比率の増加にも関係してい
る。
あっても欠失されていても、非常に局在化した高い密度
の電荷を保有する特性を有し、クーロン力（イオン型の
相互作用）で各々ポリアニオン及びポリカチオンと結合
できる、陽性及び陰性に荷電した極を生み出している。
第ＶＩＩＩ因子の産生に関する硫酸化デキストランの有
利な効果は、デキストランの硫酸残基と第ＶＩＩＩ因子
の塩基性アミノ酸との間の相互作用の存在により説明す
ることができる。この完全な若しくは欠失された第ＶＩ
ＩＩ因子の分子の安定化は、さらに第ＶＩＩＩ因子又は
第ＶＩＩＩ因子誘導体の発現比率の増加にも関係してい
る。
【００３１】おそらく、培養培地中で使用されている完
全な若しくは欠失された第ＶＩＩＩ因子の分子とポリカ
チオン性及び／又はポリアニオン性のポリマーの少なく
とも一つの分子との間で複合体が形成されている。
全な若しくは欠失された第ＶＩＩＩ因子の分子とポリカ
チオン性及び／又はポリアニオン性のポリマーの少なく
とも一つの分子との間で複合体が形成されている。
【００３２】本発明はまた、この複合体の形態の第ＶＩ
ＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子誘導体に関するものであ
る。
ＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子誘導体に関するものであ
る。
【００３３】この第ＶＩＩＩ因子又はその誘導体の安定
された形態は、生産過程又はそれに続く過程中での前記
第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子の誘導体の保存に関
して特に大きな有用性を示す。その上、第ＶＩＩＩ因子
又はその誘導体の一つが凍結乾燥剤の一つである硫酸化
デキストランと複合体を形成する際、このようにして形
成された複合体は、良好な凍結乾燥能を示すことが期待
できる。
された形態は、生産過程又はそれに続く過程中での前記
第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子の誘導体の保存に関
して特に大きな有用性を示す。その上、第ＶＩＩＩ因子
又はその誘導体の一つが凍結乾燥剤の一つである硫酸化
デキストランと複合体を形成する際、このようにして形
成された複合体は、良好な凍結乾燥能を示すことが期待
できる。
【００３４】それゆえ、硫酸化デキストランの存在は、
第ＶＩＩＩ因子に対する安定化効果及び細胞膜のレベル
での相互作用を介して第ＶＩＩＩ因子の発現の刺激効果
をも有することになる。
第ＶＩＩＩ因子に対する安定化効果及び細胞膜のレベル
での相互作用を介して第ＶＩＩＩ因子の発現の刺激効果
をも有することになる。
【００３５】本発明で使用される培養培地は、組換えヒ
トインスリンに由来し、外因性の蛋白質を含有していて
もよい無血清培養培地であることが好ましい。
トインスリンに由来し、外因性の蛋白質を含有していて
もよい無血清培養培地であることが好ましい。
【００３６】これらの蛋白質は、好適には約４ｍｇ／ｌ
のオーダーの濃度で使用される。
のオーダーの濃度で使用される。
【００３７】第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナ
ログの産生に使用される細胞は、好適には哺乳類の細胞
であり、より具体的には継続的に第ＶＩＩＩ因子又は第
ＶＩＩＩ因子のアナログを発現する組換えＣＨＯ細胞で
ある。
ログの産生に使用される細胞は、好適には哺乳類の細胞
であり、より具体的には継続的に第ＶＩＩＩ因子又は第
ＶＩＩＩ因子のアナログを発現する組換えＣＨＯ細胞で
ある。
【００３８】これらの細胞は、第ＶＩＩＩ因子又は第Ｖ
ＩＩＩ因子のアナログのｃＤＮＡを含有する組込みベク
ターを用いて、真核細胞中での発現のために必要とされ
る要素及び細胞性ＤＮＡへの該ベクターの組み込みに適
したＤＮＡのセグメントの存在下で、トランスフェクシ
ョンされる。発現ベクターとしては、特許ＥＰ ０，３
０３，５４０に記載されている第ＶＩＩＩ因子のための
発現ベクター・ｐＴＧ１０２０及び第ＶＩＩＩ因子デル
タ２のための発現ベクター・ｐＴＧ１５０９並びに類似
構造の発現ベクターを使用することができる。プラスミ
ド・ｐＴＧ１５０９及びｐＴＧ１０２０の系は、ナショ
ナル・コレクション・オブ・ミクロバイアル・カルチャ
ーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に、Ｎｏ．
Ｉ−６７９及びＮｏ．Ｉ−６８１として寄託されてい
る。
ＩＩＩ因子のアナログのｃＤＮＡを含有する組込みベク
ターを用いて、真核細胞中での発現のために必要とされ
る要素及び細胞性ＤＮＡへの該ベクターの組み込みに適
したＤＮＡのセグメントの存在下で、トランスフェクシ
ョンされる。発現ベクターとしては、特許ＥＰ ０，３
０３，５４０に記載されている第ＶＩＩＩ因子のための
発現ベクター・ｐＴＧ１０２０及び第ＶＩＩＩ因子デル
タ２のための発現ベクター・ｐＴＧ１５０９並びに類似
構造の発現ベクターを使用することができる。プラスミ
ド・ｐＴＧ１５０９及びｐＴＧ１０２０の系は、ナショ
ナル・コレクション・オブ・ミクロバイアル・カルチャ
ーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に、Ｎｏ．
Ｉ−６７９及びＮｏ．Ｉ−６８１として寄託されてい
る。
【００３９】これらの組込みベクターによるＣＨＯ細胞
のトランスフェクションは、特許ＥＰ ０，３０３，５
４０に記載された技術に従い実行されるので、ここでは
繰り返さない。
のトランスフェクションは、特許ＥＰ ０，３０３，５
４０に記載された技術に従い実行されるので、ここでは
繰り返さない。
【００４０】本発明の方法は、幾つかの利点を有する。
【００４１】本発明の方法によれば、遺伝子工学により
最高の収率で第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナ
ログを得ることができる。
最高の収率で第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナ
ログを得ることができる。
【００４２】本発明による方法は、培養培地中のフォン
・ヴィレブランド因子の存在を必要とせず、第ＶＩＩＩ
因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログの工業的な生産のた
めに十分な時間的・コスト的利益が得られる。
・ヴィレブランド因子の存在を必要とせず、第ＶＩＩＩ
因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログの工業的な生産のた
めに十分な時間的・コスト的利益が得られる。
【００４３】最後に、本発明で使用されるポリマーのタ
イプは、ウイルス又は他の汚染の危険が全くなく、あま
り費用はかからず、かつ専門家にとっては得るのが容易
である。
イプは、ウイルス又は他の汚染の危険が全くなく、あま
り費用はかからず、かつ専門家にとっては得るのが容易
である。
【００４４】又、本発明は、本発明の方法によって得ら
れる第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログに関
する。
れる第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログに関
する。
【００４５】本発明の他の利点及び特徴は、以下に示さ
れるその非制限的な実施態様により表される。
れるその非制限的な実施態様により表される。
【００４６】
【実施例】第ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現についての硫
酸化ポリオシジックポリマーの効果の研究は、クローン
ＣＨＯ ＴＧ２３０７−１１を使用して行われた。
酸化ポリオシジックポリマーの効果の研究は、クローン
ＣＨＯ ＴＧ２３０７−１１を使用して行われた。
【００４７】
【実施例１】第ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現についての
デキストランＴ２０００の効果の研究第一段階におい
て、参考としてデキストランＴ２０００（ファルマシア
（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）分子量：２，０００，０００ダ
ルトン）の効果が評価された。以下の表１に、組換えフ
ォン・ヴィレブランド因子２Ｕ／ｍｌを含有する培地と
比較して得た結果が要約されている。
デキストランＴ２０００の効果の研究第一段階におい
て、参考としてデキストランＴ２０００（ファルマシア
（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）分子量：２，０００，０００ダ
ルトン）の効果が評価された。以下の表１に、組換えフ
ォン・ヴィレブランド因子２Ｕ／ｍｌを含有する培地と
比較して得た結果が要約されている。
【００４８】デキストランＴ２０００（非硫酸化）は、
血清及び組換えフォン・ヴィレブランド因子の非存在下
で第ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現にほとんど影響しな
い。従って、非置換グルコピラノシルユニットから成る
デキストラン・マトリクスは、第ＶＩＩＩ因子デルタ２
の分子に干渉しない。
血清及び組換えフォン・ヴィレブランド因子の非存在下
で第ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現にほとんど影響しな
い。従って、非置換グルコピラノシルユニットから成る
デキストラン・マトリクスは、第ＶＩＩＩ因子デルタ２
の分子に干渉しない。
【００４９】
【表１】 表１の注 解凍後の継代Ｐ１５（第１５回の継代）およびヒポキサ
ンチン・チミジン含有培養培地（ＭＥＭ ＨＴ）中でＰ
１２ ６−ウェルプレート（６−ＷＥＬＬ ＰＬＡＴＥ）にお
ける３７℃での成長及び３５℃での産生試験 培地は、２４時間ごとに交換した。 ヒト インスリン（ＨＵＭＡＨ ＩＮＳ） イーライリ
リー（ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ）３１９ＫＫ９Ｂデキストラ
ンＴ２０００（ファルマシア）：分子量２００００００
ダルトン ＡＰＴＴ：活性化部分トロンビン時間（ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ ｐａｒｔｉａｌｔｈｒｏｍｂｉｎｅ ｔｉｍｅ）
ンチン・チミジン含有培養培地（ＭＥＭ ＨＴ）中でＰ
１２ ６−ウェルプレート（６−ＷＥＬＬ ＰＬＡＴＥ）にお
ける３７℃での成長及び３５℃での産生試験 培地は、２４時間ごとに交換した。 ヒト インスリン（ＨＵＭＡＨ ＩＮＳ） イーライリ
リー（ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ）３１９ＫＫ９Ｂデキストラ
ンＴ２０００（ファルマシア）：分子量２００００００
ダルトン ＡＰＴＴ：活性化部分トロンビン時間（ａｃｔｉｖａｔ
ｅｄ ｐａｒｔｉａｌｔｈｒｏｍｂｉｎｅ ｔｉｍｅ）
【００５０】
【実施例２】 第ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現についての硫酸化ポリマ
ーの効果の研究 １）硫酸化デキストラン 硫酸化デキストラン（ファルマシア 分子量；５００，
０００）の用量−効果（ｄｏｓｅ−ｅｆｆｅｃｔ）が行
われた。以下の表２も、組換えフォン・ヴィレブランド
因子２単位を含む同一の培地を用いて得られたデータを
示す。これらの条件下、毎日新しい培地を用いて第３日
〜第６日に亘る生産サイクルにおいて、その１つのイン
キュベーション期間（第５日〜第６日）に、ＥＬＩＳＡ
での測定により、組換えフォン・ヴィレブランド因子２
単位／ｍｌの存在下で蓄積された活性の最大限２／３に
等しい量の第ＶＩＩＩ因子デルタ２が得られる。
ーの効果の研究 １）硫酸化デキストラン 硫酸化デキストラン（ファルマシア 分子量；５００，
０００）の用量−効果（ｄｏｓｅ−ｅｆｆｅｃｔ）が行
われた。以下の表２も、組換えフォン・ヴィレブランド
因子２単位を含む同一の培地を用いて得られたデータを
示す。これらの条件下、毎日新しい培地を用いて第３日
〜第６日に亘る生産サイクルにおいて、その１つのイン
キュベーション期間（第５日〜第６日）に、ＥＬＩＳＡ
での測定により、組換えフォン・ヴィレブランド因子２
単位／ｍｌの存在下で蓄積された活性の最大限２／３に
等しい量の第ＶＩＩＩ因子デルタ２が得られる。
【００５１】その上、これらの活性は、リン脂質の非存
在下であり、かつ、組換えフォン・ヴィレブランド因子
も硫酸化デキストランも含有しない培地中で得られる活
性のレベルの２〜３倍である。 ２）ウシ・ヘパリン（カビビトラム、ＫＡＢＩ ＶＩＴ
ＲＵＭ） ウシ・ヘパリンの用量−効果の研究の結果は表３に要約
される。生産の第１サイクル中、ヘパリンは第ＶＩＩＩ
因子デルタ２の発現について非常に制限的又は全く効果
がないことが示される。インキュベーションの最後の日
であるＤ５−Ｄ６において、非常に弱い用量−効果関係
が認められる。
在下であり、かつ、組換えフォン・ヴィレブランド因子
も硫酸化デキストランも含有しない培地中で得られる活
性のレベルの２〜３倍である。 ２）ウシ・ヘパリン（カビビトラム、ＫＡＢＩ ＶＩＴ
ＲＵＭ） ウシ・ヘパリンの用量−効果の研究の結果は表３に要約
される。生産の第１サイクル中、ヘパリンは第ＶＩＩＩ
因子デルタ２の発現について非常に制限的又は全く効果
がないことが示される。インキュベーションの最後の日
であるＤ５−Ｄ６において、非常に弱い用量−効果関係
が認められる。
【００５２】
【表２】 表２の注 解凍後の継代Ｐ２４およびＭＥＭ ＨＴ ＦＣＳ ＮＤ
７０１１２１中でＰ２１ ６−ウェル・プレート（ＮＵＮＣ製）における３７℃で
の成長及び３５℃での産生試験 培地は、２４時間ごとに交換した。 ヒト インスリン（ＨＵＭＡＮ ＩＮＳ） イーライリ
リー（ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ）３１９ＫＫ９Ｂ６−ウェル
・プレート（ＮＵＮＣ製） ＤＳ：硫酸化デキストラン 分子量：５００，０００
ファルマシア １７％Ｓ ＮＤ：硫酸化デキストランの抗凝固活性のために投与
（ｄｏｓｅ）できない ＣＮＴＳ：ＣＮＴＳ（ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ
ＤＥ ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ ＳＡＮＧＵＩＮＥり
定められた単位 ＦＣＳ；ウシ胎児血清
７０１１２１中でＰ２１ ６−ウェル・プレート（ＮＵＮＣ製）における３７℃で
の成長及び３５℃での産生試験 培地は、２４時間ごとに交換した。 ヒト インスリン（ＨＵＭＡＮ ＩＮＳ） イーライリ
リー（ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ）３１９ＫＫ９Ｂ６−ウェル
・プレート（ＮＵＮＣ製） ＤＳ：硫酸化デキストラン 分子量：５００，０００
ファルマシア １７％Ｓ ＮＤ：硫酸化デキストランの抗凝固活性のために投与
（ｄｏｓｅ）できない ＣＮＴＳ：ＣＮＴＳ（ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ
ＤＥ ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ ＳＡＮＧＵＩＮＥり
定められた単位 ＦＣＳ；ウシ胎児血清
【００５３】
【表３】 表３の注 解凍後の継代Ｐ２４およびＭＥＭ ＨＴ ＲＣＳ ＮＤ
７０１１２１中でＰ２１ ６−ウェル・プレート（ＮＵＮＣ製）における３７℃で
の成長及び３５℃での産生試験 培地は、２４時間ごとに交換した。 ヒトインスリン（ＨＵＭＡＮ ＩＮＳ） イーライリリ
ー（ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ）３１９ＫＫ９Ｂウシ・ヘパリ
ン カビ・ビトラム（ＫＡＶＩ ＶＩＴＲＵＭ） ＮＤ；ヘパリンの抗凝固活性のために投与（ｄｏｓｅ）
できない。
７０１１２１中でＰ２１ ６−ウェル・プレート（ＮＵＮＣ製）における３７℃で
の成長及び３５℃での産生試験 培地は、２４時間ごとに交換した。 ヒトインスリン（ＨＵＭＡＮ ＩＮＳ） イーライリリ
ー（ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ）３１９ＫＫ９Ｂウシ・ヘパリ
ン カビ・ビトラム（ＫＡＶＩ ＶＩＴＲＵＭ） ＮＤ；ヘパリンの抗凝固活性のために投与（ｄｏｓｅ）
できない。
【００５４】
【実施例３】第ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現率に対す
る、硫酸化デキストランと塩化カルシウムとの結合によ
り得られる効果についても、１０％ウシ胎児血清、又は
２Ｕ／ｍｌフォン・ヴィレブランド因子、又は実験にお
いて使用された血清を有しない全ての培地の組成物にお
いて使用されたヒトインシュリンのみを含有する対照培
地と比較して評価した。得られた結果を下記表４及び表
５に示す。
る、硫酸化デキストランと塩化カルシウムとの結合によ
り得られる効果についても、１０％ウシ胎児血清、又は
２Ｕ／ｍｌフォン・ヴィレブランド因子、又は実験にお
いて使用された血清を有しない全ての培地の組成物にお
いて使用されたヒトインシュリンのみを含有する対照培
地と比較して評価した。得られた結果を下記表４及び表
５に示す。
【００５５】最適値、即ち１０００ｍｇ／ｌの硫酸化デ
キストラン及び２ｍＭの塩化カルシウム（最小培地中１
ｍＭ＋１ｍＭ添加）に近い値については、２４時間で２
０〜２１単位の第ＶＩＩＩ因子デルタ２抗原が蓄積可能
である事が判明した。即ち、２単位の組換えフォン・ヴ
ィレブランド因子の存在下で蓄積する量の約２／３の量
が蓄積し、ウシ胎児血清又はフォン・ヴィレブランド因
子の不存在下で蓄積する量の６〜７倍の量が蓄積した。
キストラン及び２ｍＭの塩化カルシウム（最小培地中１
ｍＭ＋１ｍＭ添加）に近い値については、２４時間で２
０〜２１単位の第ＶＩＩＩ因子デルタ２抗原が蓄積可能
である事が判明した。即ち、２単位の組換えフォン・ヴ
ィレブランド因子の存在下で蓄積する量の約２／３の量
が蓄積し、ウシ胎児血清又はフォン・ヴィレブランド因
子の不存在下で蓄積する量の６〜７倍の量が蓄積した。
【００５６】また、ウシ胎児血清又は組換えフォン・ヴ
ィレブランド因子の不存在下では、２４時間で蓄積した
活性は３単位／ｍｌを越えることは決してなく、平均
２．２７単位／ｍｌであり、換言すれば、最適量の硫酸
化デキストランの存在下で蓄積された活性よりも非常に
有意に低いものであった。
ィレブランド因子の不存在下では、２４時間で蓄積した
活性は３単位／ｍｌを越えることは決してなく、平均
２．２７単位／ｍｌであり、換言すれば、最適量の硫酸
化デキストランの存在下で蓄積された活性よりも非常に
有意に低いものであった。
【００５７】
【表４】
【００５８】
【表５】 表４及び表５の注 解凍後の継代Ｐ２４及びＭＥＭ ＨＴ ＦＣＳ ＮＤ
７０１１２１中でＰ２１ ６−ウェル・プレート（ＮＵＮＣ製）における３７℃で
の成長及び３５℃での産生試験 培地は、２４時間ごとに交換した。 ヒトインスリン（ＨＵＭＡＮ ＩＮＳ） イーライリリ
ー（ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ）３１９ＫＫ９Ｂ６−ウェル・
プレート（ＮＵＮＣ製） ＤＳ：デキストラン硫酸 分子量：５００，０００ フ
ァルマシア １７％ Ｓ＊：６ウェルの平均、他の値は
２ウェルの平均 ＥＬＩＳＡ Ｄ３−Ｄ４は、サンプリング２４時間後に
行われた。 ＮＤ；硫酸化デキストランの抗凝固活性のために投与
（ｄｏｓｅ）できない。
７０１１２１中でＰ２１ ６−ウェル・プレート（ＮＵＮＣ製）における３７℃で
の成長及び３５℃での産生試験 培地は、２４時間ごとに交換した。 ヒトインスリン（ＨＵＭＡＮ ＩＮＳ） イーライリリ
ー（ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ）３１９ＫＫ９Ｂ６−ウェル・
プレート（ＮＵＮＣ製） ＤＳ：デキストラン硫酸 分子量：５００，０００ フ
ァルマシア １７％ Ｓ＊：６ウェルの平均、他の値は
２ウェルの平均 ＥＬＩＳＡ Ｄ３−Ｄ４は、サンプリング２４時間後に
行われた。 ＮＤ；硫酸化デキストランの抗凝固活性のために投与
（ｄｏｓｅ）できない。
【００５９】
【表６】
【００６０】
【表７】 表６及び表７の注 解凍後の継代Ｐ１９およびＭＥＭ ＨＴ ＦＣＳ ＮＤ
７０１１２１中でＰ１８ ６−ウェル・プレート（ＮＵＮＣ製）における３７℃で
の成長及び３５℃での産生試験 培地は、２４時間ごとに交換した。 ヒトインスリン（ＨＵＭＡＮ ＩＮＳ） イーライリリ
ー（ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ）３１９ＫＫ９Ｂ６−ウェル・
プレート（ＮＵＮＣ製） ヒドロキシエチルスターチ硫酸（ＨＥＳＳ） 分子量：
２００，０００ フェイファー（ＰＦＥＩＦＥＲ）及び
ランゲン（ＬＡＮＧＥＮ） ３．７６及び１３．１％
Ｓ 濃縮化ｖＷＦｒｅｃ ＣＮＴＳ ６３．７Ｕ／ＭＬ
（１１／１２／８９） ＮＤ：硫酸化ポリマーの抗凝固活性のために投与（ｄｏ
ｓｅ）できない Ｄ４−Ｄ５のＥＬＩＳＡ：抗原（Ａｇ）のインキュベー
ション１４時間、２０℃
７０１１２１中でＰ１８ ６−ウェル・プレート（ＮＵＮＣ製）における３７℃で
の成長及び３５℃での産生試験 培地は、２４時間ごとに交換した。 ヒトインスリン（ＨＵＭＡＮ ＩＮＳ） イーライリリ
ー（ＥＬＩ ＬＩＬＬＹ）３１９ＫＫ９Ｂ６−ウェル・
プレート（ＮＵＮＣ製） ヒドロキシエチルスターチ硫酸（ＨＥＳＳ） 分子量：
２００，０００ フェイファー（ＰＦＥＩＦＥＲ）及び
ランゲン（ＬＡＮＧＥＮ） ３．７６及び１３．１％
Ｓ 濃縮化ｖＷＦｒｅｃ ＣＮＴＳ ６３．７Ｕ／ＭＬ
（１１／１２／８９） ＮＤ：硫酸化ポリマーの抗凝固活性のために投与（ｄｏ
ｓｅ）できない Ｄ４−Ｄ５のＥＬＩＳＡ：抗原（Ａｇ）のインキュベー
ション１４時間、２０℃
【００６１】
【実施例４】他のポリマー及び、特にカルボキシメチル
セルロース、硫黄が３．７６及び１３．１％のヒドロキ
シエチルスターチ硫酸（分子量：２００，０００）が、
血清及びフォン・ヴィレブランド因子の無い培地中で第
ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現比率に影響を与える能力で
評価され、これは、ウシ血清１０％又は組換えフォン・
ヴィレブランド因子 ２ユニット／ｍｌを含有するコン
トロール及び血清もフォン・ヴィレブランド因子も含有
しないコントロールに対してなされた。
セルロース、硫黄が３．７６及び１３．１％のヒドロキ
シエチルスターチ硫酸（分子量：２００，０００）が、
血清及びフォン・ヴィレブランド因子の無い培地中で第
ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現比率に影響を与える能力で
評価され、これは、ウシ血清１０％又は組換えフォン・
ヴィレブランド因子 ２ユニット／ｍｌを含有するコン
トロール及び血清もフォン・ヴィレブランド因子も含有
しないコントロールに対してなされた。
【００６２】試験された濃度におけるカルボキシメチル
セルロースは、第ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現に関し顕
著な効果を持たなかったが、一方、硫黄が１３％で、濃
度が０．５及び１．０ｇ／ｌのスターチヒドロキシエチ
ル硫酸は，２４時間で第ＶＩＩＩ因子デルタ２ 約２０
ユニットのＣ：Ａｇ／ｍｌまで蓄積でき、それは、組換
えフォン・ヴィレブランド因子 ２ユニット／ｍｌの存
在下に同一の期間でえられたものの約２／３であると言
うことができる。硫黄をただ３．７６％だけ含む同一の
ポリマーは、第ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現について相
当少ない効果を有するのみである。この実験は、硫酸化
ポリサッカライドの有用性を確認し、ポリマーと第ＶＩ
ＩＩ因子デルタ２との相互作用における硫酸化の程度の
重要性を示すものである。
セルロースは、第ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現に関し顕
著な効果を持たなかったが、一方、硫黄が１３％で、濃
度が０．５及び１．０ｇ／ｌのスターチヒドロキシエチ
ル硫酸は，２４時間で第ＶＩＩＩ因子デルタ２ 約２０
ユニットのＣ：Ａｇ／ｍｌまで蓄積でき、それは、組換
えフォン・ヴィレブランド因子 ２ユニット／ｍｌの存
在下に同一の期間でえられたものの約２／３であると言
うことができる。硫黄をただ３．７６％だけ含む同一の
ポリマーは、第ＶＩＩＩ因子デルタ２の発現について相
当少ない効果を有するのみである。この実験は、硫酸化
ポリサッカライドの有用性を確認し、ポリマーと第ＶＩ
ＩＩ因子デルタ２との相互作用における硫酸化の程度の
重要性を示すものである。
【００６３】
【実施例５】 第ＶＩＩＩ因子に発現についての硫酸化デキストランの
効果の研究 該研究は、完全な第ＶＩＩＩ因子の分子を発現するクロ
ーンＣＨＯ ＴＧ １５６６−３０１３を使用して行わ
れる。
効果の研究 該研究は、完全な第ＶＩＩＩ因子の分子を発現するクロ
ーンＣＨＯ ＴＧ １５６６−３０１３を使用して行わ
れる。
【００６４】図１は、６ウェルプレートにおける第ＶＩ
ＩＩ因子の発現についての硫酸化デキストラン（ファル
マシア 分子量；５００，０００）の用量−効果の存在
を示す。
ＩＩ因子の発現についての硫酸化デキストラン（ファル
マシア 分子量；５００，０００）の用量−効果の存在
を示す。
【００６５】２日にわたる生産、Ｄ４−Ｄ５及びＤ５−
Ｄ６について、第ＶＩＩＩ因子の生産は、硫酸化デキス
トランのないコントロールと比較して十分に増加してい
る。域値は、硫酸化デキストラン５００ｍｇ／ｌに達し
た。
Ｄ６について、第ＶＩＩＩ因子の生産は、硫酸化デキス
トランのないコントロールと比較して十分に増加してい
る。域値は、硫酸化デキストラン５００ｍｇ／ｌに達し
た。
【００６６】
【実施例６】 化学的に限定された培地での第ＶＩＩＩ因子の発現につ
いてのｖＷＦ及び硫酸化デキストランの効果の比較 この研究は、１リットルのバイオリアクター（ＳＧＩ）
中で行われた。完全な第ＶＩＩＩ因子を発現するクロー
ンＣＨＯ ＴＧ １５６６−３０１３は、４ｇ／ｌの濃
度の支持体クルチスフェアー（ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ）
−Ｇ（架橋したウシゼラチンの微小孔ビーズ）上で培養
された。
いてのｖＷＦ及び硫酸化デキストランの効果の比較 この研究は、１リットルのバイオリアクター（ＳＧＩ）
中で行われた。完全な第ＶＩＩＩ因子を発現するクロー
ンＣＨＯ ＴＧ １５６６−３０１３は、４ｇ／ｌの濃
度の支持体クルチスフェアー（ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ）
−Ｇ（架橋したウシゼラチンの微小孔ビーズ）上で培養
された。
【００６７】５％ＦＣＳを含有するイスコブ（Ｉｓｃｏ
ｖｕ）培地中での４日間の成長段階の後に、３つの異な
る生産培地の影響が調べられた： ＊５％ＦＣＳは含有するが、ｖＷＦ及び硫酸化デキスト
ランは含有しない培地（培地Ａ） ＊ＦＣＳを含有せず、１ ＵＩ ｖＷＦ／ｍｌを含有す
る培地（培地Ｂ） ＊ｖＷＦ又はＦＣＳは含有しないが、硫酸化デキストラ
ン（分子量；５０，０００）２００ｍｇ／ｌを含有する
培地（培地Ｃ） 結果は図２に示される。
ｖｕ）培地中での４日間の成長段階の後に、３つの異な
る生産培地の影響が調べられた： ＊５％ＦＣＳは含有するが、ｖＷＦ及び硫酸化デキスト
ランは含有しない培地（培地Ａ） ＊ＦＣＳを含有せず、１ ＵＩ ｖＷＦ／ｍｌを含有す
る培地（培地Ｂ） ＊ｖＷＦ又はＦＣＳは含有しないが、硫酸化デキストラ
ン（分子量；５０，０００）２００ｍｇ／ｌを含有する
培地（培地Ｃ） 結果は図２に示される。
【００６８】第ＶＩＩＩ因子の活性は、硫酸化デキスト
ランを含有しない培地中では、培地１リットル当たりの
ＡＰＴＴユニット（ＡＴＰＰ／ｌ）により表され、硫酸
化デキストランを含有する培地中ではＣａｇユニットに
より表された（ＥＬＩＳＡアッセイ）。ＡＰＴＴ及びＥ
ＬＩＳＡのアッセイの間の比率は、１．２〜１．４のオ
ーダーである。
ランを含有しない培地中では、培地１リットル当たりの
ＡＰＴＴユニット（ＡＴＰＰ／ｌ）により表され、硫酸
化デキストランを含有する培地中ではＣａｇユニットに
より表された（ＥＬＩＳＡアッセイ）。ＡＰＴＴ及びＥ
ＬＩＳＡのアッセイの間の比率は、１．２〜１．４のオ
ーダーである。
【００６９】培地Ｂ中で達成された産生は、培地Ａ中で
達成されたものよりも高い（６８０±６７Ｕ ＡＰＴＴ
／ｌ対５０２±９６Ｕ ＡＰＴＴ／ｌ）。培地Ｃ中で達
成された産生は、培地Ｂ中で得られたものと匹敵する。
達成されたものよりも高い（６８０±６７Ｕ ＡＰＴＴ
／ｌ対５０２±９６Ｕ ＡＰＴＴ／ｌ）。培地Ｃ中で達
成された産生は、培地Ｂ中で得られたものと匹敵する。
【００７０】結論として、硫酸化デキストランは、化学
的に限定された培地中で第ＶＩＩＩ因子の発現を増加さ
せるためのフォン・ヴィレブランド因子に代替できるこ
とが明確に示された。
的に限定された培地中で第ＶＩＩＩ因子の発現を増加さ
せるためのフォン・ヴィレブランド因子に代替できるこ
とが明確に示された。
【図１】硫酸化デキストランの用量−効果の存在を示す
グラフである。
グラフである。
【図２】化学的に限定された培地での第ＶＩＩＩ因子の
発現についてのｖＷＦ及び硫酸化デキストランの効果の
比較を示すグラフである。
発現についてのｖＷＦ及び硫酸化デキストランの効果の
比較を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 (72)発明者 フィリップ アダモヴィクツ フランス国 92420 ヴォクレッソン ア レ デザラ 16
Claims (16)
- 【請求項１】少なくとも１つのポリカチオン性及び／又
はポリアニオン性のポリマーの誘導体を含有する培養培
地中、第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子のアナログを
産生する細胞を培養し、前記第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩ
ＩＩ因子のアナログを分離することを特徴とする第ＶＩ
ＩＩ因子又はそのアナログを製造する方法。 - 【請求項２】前記ポリマーが、ポリオシジック（ｐｏｌ
ｙｏｓｉｄｉｃ）ポリマーである請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】前記ポリマーが、ポリサッカライド誘導体
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記ポリマーの誘導体が、ポリ硫酸化され
た誘導体である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】前記ポリマーが、硫酸化ポリサッカライド
である請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】前記ポリ硫酸化された誘導体が、ヘパリ
ン、硫酸化デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ硫
酸の中から好適に選択されたものである請求項４に記載
の方法。 - 【請求項７】前記ポリマーが、１０００から１，００
０，０００の間の分子量を有している請求項１〜６のい
ずれか一つに記載の方法。 - 【請求項８】５，０００〜７００，０００の間の分子量
を有し、硫酸化の程度が硫黄の重量比で０．５〜１８重
量％である硫酸化デキストランに関する請求項７に記載
の方法。 - 【請求項９】前記硫酸化デキストランが、好適には硫酸
化の程度が１０〜１８重量％である請求項８に記載の方
法。 - 【請求項１０】前記ポリマーの誘導体が、２価の金属イ
オン、好適にはＣａ２＋と結合している請求項１〜９の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】調製される第ＶＩＩＩ因子のアナログ
が、第ＶＩＩＩ因子デルタ２である請求項１〜９のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項１２】培養中の前記細胞が、哺乳類の細胞であ
る請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】培養中の前記細胞が、第ＶＩＩＩ因子又
は第ＶＩＩＩ因子のアナログの分子を継続的に発現する
組換えＣＨＯ細胞である請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１４】前記培養培地が、血清を全く含まない培
地である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１５】請求項１〜１３に記載の方法を使用する
ことによって得た、第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子
のアナログとポリカチオン性及び／又はポリアニオン性
のポリマーの少なくとも一つの誘導体との複合体。 - 【請求項１６】請求項１〜１３のいずれか一つに記載の
方法を使用することによって得た第ＶＩＩＩ因子又は第
ＶＩＩＩ因子のアナログ。
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