JPH06118085A

JPH06118085A - 癌検出法

Info

Publication number: JPH06118085A
Application number: JP4293052A
Authority: JP
Inventors: Byron E Anderson; イーアンダーソンバイロン; E Davis Reimann; イーディヴィスライマン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-09-03
Filing date: 1992-10-30
Publication date: 1994-04-28
Also published as: US5376531A

Abstract

(57)【要約】〔目的〕哺乳動物における癌の検出法を提供する。〔構成〕本発明は、哺乳動物における癌を検出する方
法を提供し、該方法は、(a) 哺乳動物から採取した体液
をN3に接触させること；(b) 該体液中のN3に対する抗体
の量を測定すること；及び(c) 処理(b) で測定された抗
体量が、癌のない同種の哺乳動物から採取した同じタイ
プの体液中に標準的に存在するN3に対する抗体の量より
も高いかどうかを判定すること、を含む。本発明はさら
に、哺乳動物の体液中のN3に対する抗体の濃度を測定す
ることにより哺乳動物における癌を検出するためのキッ
トを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特定の腫瘍関連抗原に
対する抗体の患者体内における濃度を測定することを含
む、癌検出法に関する。該方法は癌の進行の初期ステー
ジでの検出において特に有用である。

【０００２】

【従来の技術】癌をモニターするための現行のアッセイ
は一般に、腫瘍関連抗原の濃度を測定するものである。
このようなアッセイは、腫瘍から血清等の生理的液体中
に流出又は排泄されたムチン及び他の糖蛋白又は蛋白を
測定することが多い。腫瘍は又、正常組織から血流中へ
の抗原の放出を促進するために、悪化時に濃度が上がる
らしい（例：CA 19-9 抗原）。腫瘍関連抗原に対する通
常の血清学的アッセイはフェラーら（Feller et al.)に
より“癌の免疫学的診断法”、第631-672 頁、ハーバー
マン及びマーサー（Herberman and Mercer）編、1990
年、及び“悪性疾患”、第167-294 頁、ボールドウィン
（Baldwin)編、1987年、に概説されている。一般的臨床
目的におけるこのような試験の例には、癌胎児抗原（CE
A)、CA 19-9、Ca 195、CA 125、B72.3(TAG 72、シアリ
ル Tn)、CA 50 、CA 549、デュパン-2及びCA 15-3 抗原
に対するものが含まれる。それよりも一般的ではないが
測定されている腫瘍関連抗原マーカー類には、Le^x、Le
^x二量体、Le^x三量体、CS Le ^x、シアリルLe^x-i、ジ
シアリルLe^a、Le^y、i 、T 及びTn抗原に対するものが
含まれる。現在測定されている大多数の腫瘍関連抗原は
炭水化物発現内に変化を示し、腫瘍関連炭水化物抗原と
して分類される（ハコモリ（Hakomori）、アドバンシス
・イン・キャンサー・リサーチ（Adv.Cancer Res.)、52
巻、第257-331 頁、1989年、に概説）。

【０００３】現在使用されている腫瘍関連抗原測定は、
それらが検出する抗原の濃度が一般に病気の進行期間中
を通じて上昇し、癌の後期ステージに最も検出可能であ
るが、新生物形成疾患の初期ステージに高くなることは
まれである。この腫瘍関連抗原濃度と腫瘍の大きさや進
行ステージとの関連性が、このような試験が癌又は癌の
再発の予測において相対的に低い有効性しか示さないこ
とを説明し、このようなアッセイの臨床的用途をモニタ
ー的役割に限られたものにしている。腫瘍抗原測定が初
期ステージの疾患において高い診断上の価値を持つ例外
的場合もある（リンスレーら（Linsley et al.）、キャ
ンサー・リサーチ（Cancer Res.)、46巻、第5444-5450
頁、1986年）。

【０００４】癌抗原濃度の測定に代わるものは、腫瘍関
連抗原に対する免疫応答の測定である。例えば、タルら
（Tal et al.、ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・キ
ャンサー（Br. J. Cancer)、18巻、第111-119 頁、1964
年）は腫瘍患者及び妊婦から取った血清は腫瘍細胞を凝
集させる抗体を含むことを証明している。ラクトースは
該凝集を阻害するため、該抗体はラクトシルセラミドに
対するものであることが示唆された。その後、ラクトシ
ルスフィンゴシンに対する抗体の濃度上昇が多数の胃腸
癌患者において検出された（ジョツウィアック及びコシ
ーラック（Jozwiak and Koscielak)、ヨーロッピアン・
ジャーナル・オブ・キャンサー・クリニカル・オンコロ
ジー(Eur. J. Cancer Clin. Oncol.）、18巻、第617-62
1 頁、1982年）。

【０００５】癌患者に由来するヒトモノクローナル抗体
の特異性も検査されている（ロイドら（Lloyd et a
l.）、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.)、49巻、第
3445-3451 頁、1989年) 。これらのヒトモノクローナル
抗体はガングリオシド類（GM3 、GM2 、GD3 、GD2)、フ
ォルスマン抗原、ガラクトシルグロボシド、ラクト-N-
テトラオース、及び i抗原に対して特異性を示すことが
見出されてた。

【０００６】癌患者における腫瘍関連抗原に対する抗体
の存在は、他の多数の腫瘍マーカーについても調査され
ている。これらの腫瘍マーカーには CEA、Le^x、T 及び
Tn抗原が含まれる。CEA は該分子のオリゴサッカライド
部分及びペプチド部分の両方に多数の抗原性エピトープ
をを含む糖蛋白である。これは成人の組織中には通常存
在しない胚抗原であるが、全てのヒト消化器系癌中に見
出されている。従って、組織上のCEA の存在、又は循環
性CEA の存在は消化器系癌を示唆するであろう。CEA に
対する抗体が正常人又は癌保有者に見出されるかどうか
が議論されてきた。スターブら（Staab et al.）、ブリ
ティッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Br. J.Ca
ncer)、42巻、第26頁、1980年；フレノイら（Frenoy et
al.)、アンチキャンサー・リサーチ( Anticancer Rese
arch)、７巻、第1229頁、1987年を参照のこと。抗CEA
抗体は非転移性消化器系癌の患者並びに妊婦及び分娩後
の婦人に見出されるが、正常人又は転移性癌の患者には
見出されないことが報告されている（ゴールド（Gol
d）、キャンサー（Cancer）、20巻、第1663頁、1967年1
0月）。これらの結果は他から異議を唱えられている。
ロゲルホら（Lo Gerfo et al.)、インターナショナル・
ジャーナル・オブ・キャンサー（Int. J. Cancer) 、９
巻、第344 頁、1972年；コラッツら（Collatz et a
l.）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャン
サー（Int. J. Cancer) 、８巻、第298 頁、1971年、参
照のこと。

【０００７】マックスウィーン（MacSween）は CEAに対
する抗体の検出を報告しているが、CEAへの結合は例え
ば血液型抗原類などの同様の抗原類への抗体の交差反応
性を表すものであることを示唆している（マックスウィ
ーン（MacSween）、インターナショナル・ジャーナル・
オブ・キャンサー（Int. J. Cancer) 、15巻、第246
頁、1975年）。実際に、CEA 調製品上の Lewis^ab物質に
対する抗CEA 抗体の濃度上昇が、女性；喫煙者；並びに
結腸癌、乳癌及び気管支癌の患者の7-23％に見出されて
いる（ポンペッキら（Pompecki et al.)、キャンサー・
リサーチ（CancerRes.)、41巻、第1910-1915 頁、1981
年) 。ポンペッキら（Pompecki et al.)は、これらの抗
体の濃度上昇は癌患者にとって悪い兆候であること、
又、血液型決定基及びおそらく他の炭水化物決定基に対
する抗体の濃度を追跡することはある種の癌及び他の疾
患における病気の進行をモニターする上で有用でありう
ることを示唆している（同上）。

【０００８】他のグループは、癌患者から得られた非常
に少数(3/500,000) の血清中に循環性抗CEA IgG 抗体が
存在することを報告している（ウラら（Ura et al.）、
キャンサー・レターズ（Cancer Letters）、25巻、第28
3 頁、1985年) 。より最近になって、CEA のペプチド部
分に対する親和性の弱い抗CEA 抗体が、酵素イムノアッ
セイを用いて試験した全ての正常血清及び異常血清中に
見出された（フレノイら（Frenoy et al.)、アンチキャ
ンサー・リサーチ( Anticancer Research)、７巻、第12
29頁、1987年）。最終的に、循環性 CEA免疫複合体が述
べられている（スターブら（Staab et al.）、ブリティ
ッシュ・ジャーナル・オブ・キャンサー（Br. J. Cance
r)、42巻、第26頁、1980年）。スターブら（Staab et a
l.）は CEA免疫複合体の存在は癌患者にとって悪い兆候
の指標であることを教示している（同上）。

【０００９】T 及び Tn も腫瘍関連抗原である。T 及び
Tn はほとんどの組織に存在するが、それらは通常、そ
れらを免疫系に近づけないようにする遮蔽構造体によっ
て妨げられている。遮蔽されていない免疫反応性形態の
T 及び Tn は、癌腫組織の約90％に多量に発現されるこ
とが報告されている（スプリンガー（Springer）、サイ
エンス（Science)、224 巻、第1198-1206 頁、1984
年）。腫瘍表面におけるT及び Tn の相対的比率及び密
度も腫瘍の攻撃性及び侵入性と相関させて報告されてい
る（同上）。特に、Tnは癌腫の転移において重要な抗原
であると考えられている（同上）。ヒトは全て、腸内細
菌叢の抗原に反応して優先的に顕在化されると考えられ
る、T 及び Tn に対する抗体を持つことが報告されてい
る（スプリンガー（Springer）、サイエンス（Scienc
e)、224 巻、第1198-1206 頁、1984年）。癌患者におい
て抗-T抗体の濃度は低下し、上昇し、又は変化しないと
いう報告がある。ブレイら（Brey et al.)、クリニカル
・アンド・エクスペリメンタル・イミュノロジィ（Cli
n. Exp. Immunol.)、47巻、第176-182 頁、1982年、を
参照のこと。

【００１０】例えば、米国特許第 4,241,044号（キム
（Kim)）は癌腫患者は一般に抗-T抗体の濃度が上昇する
ことを教示している。しかしながら、ブレイら（Brey e
t al.)は、転移性胃腸癌の患者は抗-T抗体の血清濃度が
低下していること、又、最小限の病巣しかない患者のう
ち０％、中程度に病巣がある患者のうち45％であること
に比較して、広範囲に病巣のある患者ではそのうち83％
が正常時の抗-T抗体濃度よりも低いことにおいて、抗-T
抗体濃度は病気の程度に相関することを教示している
（ブレイら（Brey et al.)、クリニカル・アンド・エク
スペリメンタル・イミュノロジィ（Clin. Exp. Immuno
l.)、47巻、第176-182 頁、1982年）。

【００１１】癌腫患者は一般に正常人又は良性の疾患の
患者に比較すると抗-T抗体の濃度が低下するが、まれな
例では癌腫患者が高い濃度の抗-T抗体を有するという報
告もされている（スプリンガー（Springer）、サイエン
ス（Science)、224 巻、第1198-1206 頁、1984年；スプ
リンガーら（Springer et al.)、細胞腫瘍学：生物学、
診断及び治療における新しい取り組み、第99-130頁、モ
ロイ及びニコルソン（Moloy and Nicolson）編）。

【００１２】最終的には、サッチャーら（Thatcher et
al.)は、治療前の転移メラノーマ患者において抗-T抗体
価が正常より低いこと、又、治療に対して好反応を示し
た患者は治療前、疾患の緩解又は進行時、及び最終の処
置期間中に採取した血清において、好反応を示さなかっ
た患者よりも有意に高い抗-T抗体価を示したことを教示
している（サッチャーら（Thatcher et al.)、キャンサ
ー（Cancer）、46巻、第1378頁、1980年）。治療前の抗
-T抗体価が高いことは同時に、有意に長い生存期間に関
連した（同上）。

【００１３】N3は母乳から単離されるジフコシルラクト
-N- ヘキサオース及びジフコシルラクト-N- ネオヘキサ
オースの混合物であることが報告されている（コバタ及
びギンズバーグ（Kobata and Ginsburg)、アーカイブス
・オブ・バイオケミストリィ・アンド・バイオフィジッ
クス（Arch. Biochem. Biophys.)、 150巻、第273-281
頁、1972年）。ラクト-N- ヘキサオースは次の式を持
つ： Galβ１→４GlcNAcβ１→６（ Galβ１→３GlcNAc
β１→３） Galβ１→４Glc （同上）。ラクト-N- ネオ
ヘキサオースは次の式を有した： Galβ１→４GlcNAcβ
１→６（ Galβ１→４GlcNAcβ１→３） Galβ１→４Gl
c （同上）。コバタ及びギンズバーグ（Kobata and Gin
sburg)は二個のフコース残基がα１→２でガラクトース
に、α１→３でN-アセチルグルコサミンに、α１→４で
N-アセチルグルコサミンに、又はα１→３でグルコース
に結合しているものと推測している（同上）。N3の正確
な組成は提供者のルイス血液型によって異なると考えら
れる（同上）。

【００１４】ルイス血液型 Le(a+b-) の個体の母乳から
単離されたN3は以下の式Ｉを有するオクタサッカライド
を含む：

【００１５】

【化１】（デュアら（Dua et al.) 、ジャーナル・オブ・クロマ
トグラフィー（J. Chrom.)、17巻、第259-269 頁、1985
年）。このオクタサッカライドは、ルイス(a+b-)個体か
ら単離されたN3の最低90％を成す（同上）。デュアら
（Dua et al.) は彼らのN3調製品中にジフコシルラクト
-N- ネオヘキサオースの存在を証明することはできなか
った（同上）。彼らの方法論的限界ゆえに、彼らはルイ
ス(a+b-)個体から単離されたN3はそのようなジフコシル
ラクト-N- ネオヘキサオースを多くとも10％しか含まな
いと結論した（同上）。デュアら（Dua et al.) の文献
においてはN3はM3と表示されていることに注意すべきで
ある。

【００１６】Le^a血液型抗原の免疫決定基構造は、タイ
プ１の血液型鎖上にあるトリサッカライド Galβ１→３
(Fucα１→４)GlcNAc である。Le^xの免疫決定基構造
は、タイプ２の血液型鎖上にあるトリサッカライド Gal
β１→４(Fucα１→３)GlcNAcである。Le^xは時々、ヒ
トでは3-フコシル-N- アセチルラクトサミン、X ハプテ
ン、分化群(CD)15白血球抗原、又、マウスではステージ
特異性胚抗原１(SSEA-1)とも呼ばれる。上記の式Ｉを調
べればわかるように、ルイス(a+b-)個体から単離された
N3はLe^a及びLe^x決定基を含む。従って、予想どうり、
ルイス(a+b-)個体から単離されたN3は血球凝集アッセイ
においてLe^a及びLe^xハプテン活性を示す（同上；ロー
アら（Rohr et al.)、フェデラル・プロシーディングズ
（Fed. Proc.) 、42巻、第2102頁、1983年；ローアら
（Rohr et al.)、フェデラル・プロシーディングズ（Fe
d. Proc.) 、42巻、第431 頁、1983年；ローアら（Rohr
et al.)、複合炭水化物学会、1983年10月）。

【００１７】結腸及び膵臓の上皮起源の癌では、Le^a血
液型抗原は、正常組織及び癌組織の両方において顕著に
発現することから、腫瘍関連抗原とは考えられていない
（イツコヴィッチら（Itzkowitz et al.) 、キャンサー
・リサーチ（Cancer Res.)、48巻、第3834-3842 頁、19
88年；ユアンら（Yuan et al.)、キャンサー・リサーチ
（Cancer Res.)、45巻、第4499-4511 頁、1985年；エル
ンストら（Ernst et al.) 、ラボラトリィ・インヴェス
ティゲイション（Lab. Invest.）、50巻、第394-400
頁、1984年）。Le^xは尿細管、胃腸上皮及び顆粒性白血
球等の多様な正常細胞に存在し、白血球、胃、肝臓、肺
及び結腸起始の癌を含む多様なヒトの癌中に蓄積する
（グーイら（Gooi et al.)、ヨーロッピアン・ジャーナ
ル・オブ・イミュノロジィ（Eur. J. Immunol.）、13
巻、第306-312 頁、1983年；ハコモリ（Hakomori）、ア
ドバンシス・イン・キャンサー・リサーチ（Adv.Cancer
Res.)、52巻、第257-331 頁、1989年；ハコモリ（Hako
mori）、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・
インスティテュート（J. Nat. Cancer Inst.）、71巻、
第231-250 頁、1983年）。

【００１８】例えば、Le^x抗原は膜結合形態（糖脂質及
び糖蛋白）及び分泌形態（糖蛋白及びムチン）の両方の
形態で胃腸癌中に蓄積する。該膜結合形態は一般に免疫
細胞化学的方法で検出され、該分泌形態は標準的イムノ
アッセイ法を用いてアッセイされる。組織上のLe^x抗原
の発現は初期の胃癌において、進行ステージの癌（66.7
％）よりも高い頻度（93.3％）で起こり、Le^xは組織学
的分類による未分化胃癌の症例の81％に存在し、分化胃
癌の66.7％に存在する（ドヒら（Dohi et al.)、日本胃
腸病学会誌（Gastroenterol. Jpn）、24巻、第239-245
頁、1989年）。組織上のLe^x抗原の発現量の増加も膵臓
癌及び結腸直腸腺癌中に観察されている（シュースラー
ら（Schuessler et al.)、インターナショナル・ジャー
ナル・オブ・キャンサー（Int. J. Cancer) 、47巻、第
180-187 頁、1991年；シら（Shi et al.）、キャンサー
・リサーチ（Cancer Res.)、44巻、第1142-1147 頁、19
84年；イツコヴィッチら（Itzkowitz et al.) 、キャン
サー・リサーチ（Cancer Res.)、46巻、第2627-2632
頁、1986年）。

【００１９】癌患者の血清中のLe^x濃度を測定するイム
ノアッセイからは雑多な結果が得られている。カンナギ
ら（Kannagi et al.；キャンサー・リサーチ（Cancer R
es.)、46巻、第2619-2626 頁、1986年）は、Le^x及びpo
lyLe^xの濃度は時折高いが、試験した癌患者の血清のう
ちの僅か約10％に上昇が見られたにすぎないことを報告
している。この著者らは又、シアリルLe^x-iの血清濃度
は腺癌が発生することが多い器官を起源とする癌の患者
で有意に高く、Le^yの血清濃度は肝癌の患者で高いこと
が多いことを報告した。彼らは四種の抗原（Le^x、poly
Le^x、シアリルLe^x-i及びLe^y）は全て腫瘍関連抗原で
あると結論した。

【００２０】ハーリンら（Herlyn et al. ；ジャーナル
・オブ・イミュノロジカル・メソッヅ（J. Immunol. Me
thods)、75巻、第15-21 頁、1984年）は、65才以上の結
腸直腸癌患者の53％でラクト-N- フコペンタオース(LN
F)IIIに対する抗体の濃度が上昇していたのに比較し
て、同年齢群の見かけ上健康な提供者又は良性の胃腸管
病変を持つ患者では一人も上昇しておらず、炎症性胃腸
管疾患の患者の18％で上昇していたことを報告してい
る。より若い患者では違いはこれほど顕著ではなく、25
才以下の正常人では相対的に高濃度のLNF III が見られ
る。LNF III は、Le^x決定基を含む炭水化物である。

【００２１】Le^x濃度と結腸癌のステージの間の良好な
相関関係が、Le^x単量体及びLe^x二量体構造に対する二
種類の高親和性モノクローナル抗体を結腸直腸腺癌血清
中のLe^x濃度のアッセイに用いた場合に報告されている
（シンガルら（Singhal et al.）、キャンサー・リサー
チ（Cancer Res.)、50巻、第1375-1380 頁、1990年）。
シンガルら（Singhal et al.）は、手術前のLe^x血清濃
度が手術後、結腸直腸癌が進行するに連れて（デューク
ス・ステージ Aから D）上昇したことを報告している。
特に彼らは、正常濃度の上限である10ng/ml を越えるLe
^x血清の占める割合が以下のようであることを見出し
た：デュークス A 20％デュークス B；癌の再発あり 41％デュークス B；癌の再発なし 46％デュークス C；癌の再発あり 68％デュークス C；癌の再発なし 67％デュークス D 74％この研究者らは、Le^x濃度が20ng/ml より高いデューク
ス B及び Cの患者の長期試験を行った。癌の再発を示す
デュークス Cの患者では、手術後24カ月における術後Le
^x濃度は有意に上昇したが、癌の再発のないデュークス
Cの患者は同じ期間の後、Le^x抗原濃度は減少を示し
た。デュークス Bの患者では、Le^xの術後濃度は同じく
24カ月の期間の後、患者に癌の再発があるなしにかかわ
らず上昇しなかった。この研究者らが検出したLe^x抗原
は大分子量糖蛋白（ M_r= 約200,000)上に発現された。
この糖蛋白は明らかに CEA又はシアリル- Le^a(19-9)抗
原を乗せた糖蛋白類とは異なる。該Le^x糖蛋白は腺腫患
者の血清の85％及び正常な血清の33％に存在することが
示された。該著者らは血清Le^x抗原濃度は、腺腫におい
て診断上及び予測上の価値を持ちうることを示唆してい
る。

【００２２】Le^xに対するヒトの抗体の存在は、Le^x抗
原を乗せた精製糖脂質に対して反応性を持つ抗体類及び
Le^x抗原（類）を発現する抗原成分を含むことが解離時
に示された、腺腫患者の血清から取った循環性免疫複合
体(CIC) の単離によって証明されている（シンガルら
（Singhal et al.）、キャンサー・リサーチ（Cancer R
es.)、47巻、第5566-5571 頁、1987年）。この研究者ら
は、対照（正常人及びメラノーマ患者）に比較して有意
に高い濃度のこれらの CIC類が胸部、肺及び結腸の腺腫
を患った患者において検出できること、又、これらの C
IC類はシアリルLe ^x抗原よりも遙かに高い割合の腺腫患
者に検出されることを見出した。

【００２３】従って、N3自体は腫瘍関連抗原であること
が証明されていないが、N3オリゴサッカライドの一部で
あるLe^x決定基は腫瘍上に優先的に発現される腫瘍関連
構造体である。例えば、デイビスら（Davis et al.）、
フェデラル・プロシーディングズ（Fed. Proc.) 、43
巻、第1751頁、1984年；アンダーソンら（Anderson eta
l.)、複合炭水化物の分子免疫学、第601-656 頁（ウ（W
u）編，1988年）；ハコモリ及びカンナギ（Hakomori an
d Kannagi）、“高等動物における炭水化物抗原”：実
験免疫学ハンドブック、１巻、第9.1-9.39頁（ウィアー
（Weir）編，1986年）；ポンペッキら（Pompecki et a
l.)、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.)、41巻、第1
910-1915 頁、1981年、を参照のこと。同様に、対照と
比較すると腺腫患者では、Le^xに対する抗体を含む有意
に高い濃度の CIC類が検出されうる。しかしながら本出
願人は、Le^xに対する非複合型抗体の癌患者における存
在又は濃度変化についての報告は見ていない。

【００２４】

【発明が解決しようとする課題】哺乳動物における癌の
検出法を提供することが本発明の目的である。

【００２５】

【課題を解決するための手段】本発明は、哺乳動物から
採取した体液中に存在するN3に対する抗体の量を測定す
ることにより、哺乳動物における癌を検出する方法を含
む。該方法は、(a) 哺乳動物から採取した体液をN3に接
触させること；(b) 該体液中のN3に対する抗体の量を測
定すること；及び(c) 処理(b) で測定された抗体量が、
癌のない同種の哺乳動物から採取した同じタイプの体液
中に標準的に存在するN3に対する抗体の量よりも高いか
どうかを判定すること、を含む。N3については上記の従
来の技術の項で述べているが、後でさらに述べることと
する。

【００２６】本発明はさらに、哺乳動物の体液中のN3に
対する抗体の濃度を測定することにより哺乳動物におけ
る癌を検出するためのキットを含む。一つの態様におい
ては、該キットはラベルされたN3の入った容器を含む。
別の態様においては、該キットは蛋白又はポリペプチド
と共役されているN3の入った容器を含み、これらのN3-
共役体はラベルされていてもされていなくてもよい。第
三の態様においては、該キットはN3の入った容器及び、
抗N3抗体に結合する二次抗体又は別の試薬の入った容器
を含む。該二次抗体又は他の試薬はラベルされていても
されていなくてもよい。

【００２７】本発明の方法及びキットは、癌をその進行
の初期ステージで検出することにおいて特に有用であ
る。図１は、正常人及び胃腸癌の患者から採取した血清
中のN3に対する抗体の滴定により得られたデータの非線
型回帰を行うために用いた、タイターカルクプログラム
の結果を表す典型的グラフである。

【００２８】図２は、胃腸癌のステージ対、抗N3抗体力
価及び癌胎児抗原（CEA)ユニットのグラフである。哺乳
動物の体液中のN3に対する抗体量を測定するために用い
る方法は、抗体を定量できるいずれのイムノアッセイ法
でもよい。適当な方法としては、蛍光イムノアッセイ、
ラジオイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、及び
酵素イムノアッセイがある。使用するイムノアッセイは
均質性又は非均質性アッセイでもよく、拮抗性アッセイ
又はイムノメトリックアッセイでもよく、或いは直接結
合アッセイ又は阻害アッセイでもよい。このようなイム
ノアッセイ法は周知であり、通常行われている。

【００２９】N3に対する抗体が低力価抗体又は低親和性
抗体でありうるために、好ましいイムノアッセイはキャ
リアー蛋白又はポリペプチドに共役されたN3（ N3-共役
体）を用いるものであり、該 N3-共役体は固体表面上に
固定される。同じ理由から、増幅信号を用いるイムノア
ッセイも好ましい。好ましいアッセイの例には、 N3-共
役体を固体表面に固定させた固体相非均質アッセイ、増
幅信号を用いる酵素イムノアッセイ、及び固体表面と増
幅信号の両方を用いる酵素連結性免疫吸着剤アッセイ(E
LISA) がある。後の実施例１で述べる直接結合型酵素連
結性蛍光アッセイ(ELFA)が特に好ましい。

【００３０】特定の濃度、温度及びインキュベーション
時間は、いずれのイムノアッセイが選択された場合でも
他のアッセイ条件と同様に、サンプルの性質、サンプル
中の抗体濃度等の因子によって変えることができる。当
業者は通例の実験法を用いながら、各測定において有効
且つ最適なアッセイ条件を決定することができるであろ
う。

【００３１】本発明の方法にはN3に対する抗体を含むい
ずれの体液を使用してもよく、それらには血清、血漿、
唾液及び尿が含まれる。血清又は血漿が好ましい。本発
明における使用に適したN3は、コバタ（Kobata）、複合
炭水化物：メソッズ・イン・エンザイモロジィ（Method
s in Enzymology)、28巻、第262-271 頁（ギンズバーグ
（Ginsburg）編、アカデミック・プレス社、ニューヨー
ク、1972年）；コバタ及びギンズバーグ（Kobata and G
insburg)、アーカイブス・オブ・バイオケミストリィ・
アンド・バイオフィジックス（Arch. Biochem. Biophy
s.)、150巻、第273-281 頁、1972年；デュアら（Dua et
al.) 、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（J. C
hrom.)、17巻、第259-269 頁、1985年、に述べられてい
るように調製してもよい。N3はアキュレイト・ケミカル
・アンド・サイエンティフィック社、ウェストベリィ、
NY、から購入することもできる。

【００３２】N3はそのまま本発明の方法に使用してもよ
いが、或いは先に触れたようにキャリアー蛋白又はポリ
ペプチドに共役させてもよい（ N3-共役体）。適当なキ
ャリアー蛋白及びポリペプチドは周知である。それらは
以下を含むが、限定するものではない：ウシ血清アルブ
ミン(BSA) 、オバルブミン及びヒト血清アルブミン等の
アルブミン類；キーホールリンペットヘモシアニン等の
ヘモシアニン類；ウシチログロブリン；ウシ、ブタ及び
北洋魚の皮等のゼラチン；ウシ、ニワトリ及びヒト等の
ガンマグロブリン類；並びにポリ-L- リジン、ポリ-DL-
アラニン- ポリ-L- リジン等の種々の合成ポリペプチド
類。これらの蛋白類及びポリペプチド類にN3を共役させ
る方法は通常行われており、周知である。好ましい方法
には、還元的アミノ化；フェニルイソチオシアネート誘
導体類、p-アミノフェニル誘導体類、ヒドラジド誘導体
類、チオセミカルバジド誘導体類を用いた共役化；フェ
ネチルアミン誘導体類を用いたジアゾカップリング；及
びグルタルアルデヒド、カルボジイミド類（塩酸 1-(3-
ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド
等）、N-N-カルボニルジイミダゾール、1-ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールモノヒドレート、N-ヒドロキシスクシ
ニミド、N-トリフルオロアセチルイミダゾール又は臭化
シアンを用いた適当な修飾に続く共役化がある。

【００３３】固体相アッセイに用いるのに適した固体表
面には、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメチ
ルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、
ポリアクリロニトリル、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、デキストラン、ガラス、ナイロン、ポリビニルアル
コール、ゲル類、クレー、及びセルロース誘導体類が、
他のポリマー物質と同様に含まれる。N3、 N3-共役体、
二次抗体、又は抗N3抗体類と反応する他の試薬は、固体
相アッセイ用に該固体表面上に固定化してもよい。これ
らの物質は該固体表面上に共有結合又は非共有結合によ
って固定化してもよく、それらの接着をポリマー性固体
表面の一部をなすか、或いはそこに誘導された通常のカ
ップリング剤を用いることにより増強してもよい。これ
らのカップリング剤には、ジイミドエステル類、カルボ
ジイミド、過ヨウ素酸塩、アルキルハライド類、ジメチ
ルピメリミデート及びジマレイミド類が含まれる。ブレ
ア及びゴウス（Blair and Ghose)、ジャーナル・オブ・
イミュノロジカル・メソッズ（J. Immunol. Methods)、
49巻、第129 頁、1983年；ブレア及びゴウス（Blairand
Ghose)、キャンサー・リサーチ（Cancer Res.)、41
巻、第2700頁、1981年；ゴーテア（Gautheir）、ジャー
ナル・オブ・エクスペリメンタル・メディスン（J. Ex
p. Med.）、156 巻、第766 頁、1982年；ウォング，S.
S.（Wong，S.S.）、蛋白共役及び交差結合の化学、第1-
324 頁（CRC プレス、1991年）、を参照のこと。

【００３４】体液中のN3に対する抗体を計量するため
に、ラベルされたN3又は N3-共役体を用いてもよい。 N
3-共役体を用いる場合は、N3がラベルされていても、又
は蛋白或いはポリペプチドがラベルされていてもよい。
或いは、体液中のN3に対する抗体は、該体液が採取され
た哺乳動物の抗N3抗体に選択的に結合するラベルされた
二次抗体又はその断片を用いて定量してもよい。該二次
抗体は、抗血清、抗血清の精製分画（DE-52 分画又はア
フィニティ精製抗体等）、モノクローナル抗体、又は抗
原に結合できる抗体断片（Fab 、F(ab′)₂、及び Fab′
断片）でもよい。抗体類の作製方法並びにそれらの精
製、分画、切断及びラベル化の方法は通常行われてお
り、周知である（ハーロウ，E.及びレーン，D.（Harlo
w,E. and Lane,D.)、抗体：実験マニュアル、第1-726
頁（コールド・スプリング・ハーバー研、1988年))。
又、多くの適当な二次抗体類が市販されている。

【００３５】ラベルされた二次抗体の代わりに、抗N3抗
体に結合するラベルされた他のいずれの試薬を用いても
よい。そのような試薬にはプロテインA 及びプロテイン
G のようなバクテリア性免疫グロブリン結合蛋白が含ま
れる。ボイル（Boyle)、バクテリア性免疫グロブリン結
合蛋白、２巻：イムノテクノロジィの応用、第1-475頁
（アカデミック・プレス、1990年）、を参照のこと。

【００３６】本発明において有用なラベル類及びそれら
を抗原に結合させる方法、抗体類並びにプロテインA 又
はプロテインG のような他のイムノアッセイ試薬類は当
技術分野において周知である。適当なラベルには、放射
性同位元素類、酵素類、化学発光ラベル類、生物発光ラ
ベル類及び蛍光ラベル類が含まれる。酵素ラベルされた
抗原、抗体及び他の試薬は、後に該酵素の基質にさらさ
れると、例えば分光測光法、蛍光測定法、化学発光測定
法又は電位差測定法等により検出可能な化学的部分を製
造するような様式で該基質と反応するであろう。検出可
能なラベルとして使用することができる酵素の例として
は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ラクトペル
オキシダーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、リゾチー
ム、ルシフェラーゼ、ペニシリナーゼ、ホスホリパーゼ
C、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカス
ヌクレアーゼ、デルタ-5- ステロイドイソメラーゼ、イ
ーストアルコールデヒドロゲナーゼ、アルファグリセロ
リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラー
ゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グル
コースオキシダーゼ、αアミラーゼ、βアミラーゼ、グ
ルコアミラーゼ、ヘキソキナーセ、ベータガラクトシダ
ーゼ、βグルコシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアー
ゼ、カタラーゼ、グルコース-6- リン酸デヒドロゲナー
ゼ、ピルベートキナーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ
及びアセチルコリンエステラーゼがある。

【００３７】或いは、該抗原、抗体又は他の試薬は放射
性同位元素でラベルされていてもよい。該放射性同位元
素の存在は後に、ガンマカウンター又はシンチレーショ
ンカウンターの使用等の方法により測定されるであろ
う。特に有用な同位元素は、³H、¹²⁵I、³²P 、³⁵S 、¹⁴
C 、⁵¹Cr、³⁶Cl、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁷⁵Se、¹¹¹In 、⁹⁹
^mTc、⁶⁷Ga、及び⁹⁰Y である。

【００３８】蛍光ラベルを付けた抗原、抗体及び他の試
薬も使用してよい。蛍光ラベルされた該分子が適当な波
長の光にさらされると、発生する蛍光によりその存在が
検出できる。最も重要な蛍光ラベル化合物としては、フ
ルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコ
エリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-
フタルデヒド、フルオロエスカミン、7-アミノ-4- メチ
ルクマリン-3酢酸、7-アミノ-4- メチルクマリン-3アセ
チルヒドラジド、及びスクシニミヂル7-アミノ-4- メチ
ルクマリン-3アセテートがある。

【００３９】Eu（ユーロピウム）及び他のランタニド類
等の蛍光放射性金属原子も使用することができる。これ
らは望ましい分子にDTPA又はEDTA等の金属キレート基に
よって結合されてもよい。該抗体、抗原又は他の試薬を
検出可能なようにラベルできる別の方法は、それを化学
発光化合物にカップリングさせることである。化学発光
標識の付いた分子の存在をその後、化学反応過程に起き
る発光の存在を検出することにより測定する。とくに有
用な化学発光ラベル化化合物の例には、ルミノール、イ
ソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダ
ゾール、アクリジニウム塩、ペルオキシダーゼ（化学発
光増強用）及びオキザレートエステル類がある。

【００４０】同様に、生物発光化合物をラベルとして使
用してもよい。生物発光は、生物系で見出され該化学発
光反応の効率が触媒性蛋白により増加される特殊な型の
化学発光である。生物発光分子の存在は、発光の存在の
検出により測定されるであろう。ラベルする目的におい
て重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラ
ーゼ、及びエクオリンである。

【００４１】N3に対する抗体を定量するために、抗原
（すなわち、N3又は N3-共役体）、二次抗体、又はN3抗
体と反応性を持つ他の試薬をビオチニル化してもよい。
該ビオチニル化抗原、抗体又は試薬をその後、上に掲げ
たラベルのいずれかでラベルしたアビジン又はストレプ
トアビジンと反応させる。特に好ましいのは、酵素でラ
ベルしたアビジン又はストレプトアビジンである。ビオ
チニル化された試薬の製造法及び使用法は周知である。

【００４２】同様の手法で、該抗原、二次抗体又は他の
試薬を（ジニトロフェノール又はジゴキシンのような）
ハプテンでラベルすることもできる。ハプテンでラベル
した該分子をその後、該ハプテンに対する抗体と反応さ
せ、この抗ハプテン抗体は上に掲げたラベルのいずれか
でラベルされる。このいわゆる“ハプテンサンドウィッ
チ”処理は当技術分野において周知である。

【００４３】ラベルされた二次抗体、又は抗N3抗体と反
応性を持つ他のラベルされた試薬を、上述の周知のイム
ノアッセイ手法を用いての体液中の抗N3抗体の定量に使
用してもよい。例えば、 N3-共役体は微量滴定プレート
のウェルなどの固体表面に固定化してもよい。非結合 N
3-共役体を洗い落とした後、該固体表面上に固定化した
N3-共役体を、ヒト血清サンプル等の体液サンプルに接
触させ、該サンプル中のN3に対する抗体が固定化された
N3-共役体に結合することになる。非結合物質を洗い流
し、ヒト免疫グロブリンに対する酵素ラベルされた抗体
のような、ラベルされた二次抗体を加える。ラベルされ
た該二次抗体が該抗N3抗体に結合し、非結合のラベルさ
れた成分を洗い流した後に該抗N3抗体の定量に用いるこ
とができる。例えば、ヒト免疫グロブリンに対する酵素
ラベルされた二次抗体上に存在する酵素に対する基質を
加えると性質の変化、多くは蛍光の増加、が起こり、該
性質の変化が該抗N3抗体の定量に用いることができる。
該抗N3抗体に反応性を持つ他のラベルされた試薬（ラベ
ルされたプロテインA 又はプロテインG など）をラベル
された二次抗体の代わりに用いてもよい。

【００４４】或いは、ラベルされていない二次抗体、又
は該抗N3抗体に反応性を持つ他のラベルされていない試
薬を固体表面上に固定化させ、その後体液サンプルに接
触させてもよい。該サンプル中のN3に対する抗体は（他
の抗体とともに）固定化された該二次抗体又は他の試薬
に結合するであろう。非結合物質を洗い流した後、ラベ
ルされたN3又は N3-共役体を加える。ラベルされた該N3
又は N3-共役体は抗N3抗体に結合し、該抗N3抗体の定量
に用いることができる。適当な二次抗体及びそのような
アッセイにおいて有用な抗N3抗体と反応性を持つ他の試
薬には先に述べたものが含まれるが、ラベルされていな
い形態をとる。

【００４５】本発明の方法の最終段階は、癌があるかも
しれない哺乳動物の体液中で測定されたN3に対する抗体
量が、癌のない同種の哺乳動物から採取した同じタイプ
の体液中に標準的に存在するN3に対する抗体の量よりも
高いかどうかを判定することを必要とする。この段階は
周知且つ通常の統計的方法を用いて行うことができ、コ
ンピューターを用いて行えば最も都合がよい。

【００４６】N3に対する抗体を定量するための試験キッ
トも本発明の一部をなす。一つの態様においては、該キ
ットはラベルされたN3の入った容器を含む。別の態様に
おいては、該キットはN3- 共役体の入った容器を含む。
該N3- 共役体はラベルされていてもされていなくてもよ
い。第三の態様においては、該キットはN3の入った容器
及び、二次抗体又は、抗N3抗体に反応する他の試薬の入
った容器を含む。この第三の態様において、該N3はラベ
ルされていてもされていなくてもよく、蛋白又はポリペ
プチドに共役されていてもよく、該二次抗体又は他の試
薬はラベルされていてもされていなくてもよい。

【００４７】適当な容器には、ボトル類、バイアル類、
チューブ類及び微量滴定プレート類が含まれる。該N3又
は N3-共役体は溶液になっていてもよく、凍結乾燥され
ていてもよく、或いは固体表面上に固定化されていても
よい。該固体表面は上述のタイプのものであり、該N3又
は N3-共役体は上述のように固定化される。従って、該
容器はN3の溶液の入ったボトルでもよく、凍結乾燥され
たN3の入ったバイアルでもよく、或いはウェルが N3-共
役体でコーティングされた微量滴定プレートでもよい。

【００４８】該二次抗体又は他の試薬は溶液になってい
てもよく、凍結乾燥されていてもよく、或いは固体表面
上に固定化されていてもよい。該固体表面は上述のタイ
プのものであり、該二次抗体又は他の試薬は上述のよう
に固定化される。従って、該容器は二次抗体又は他の試
薬の溶液の入ったボトルでもよく、凍結乾燥された二次
抗体又は他の試薬の入ったバイアルでもよく、或いはウ
ェルが二次抗体又は他の試薬でコーティングされた微量
滴定プレートでもよい。

【００４９】先に示したように、該N3、 N3-共役体、二
次抗体又は抗N3抗体と反応性を持つ他の試薬は、それが
体液中の抗N3抗体を定量するために用いる予定であるな
らばラベルされていてもよい。適当なラベル類は上に掲
げたものである。さらに該キットは他に、当技術分野に
おいて周知であり、商業上及びユーザーの視点から見て
望ましい、バッファー、希釈剤、標準品、対照血清等の
物質を含んでもよい。該キットは又、該イムノアッセイ
を行うために有用な空の容器を含んでもよい。実施例１胃腸癌患者の血清中のN3に対する抗体のアッセイ A.スクリーニングする抗原の調製 N3は、コバタ（Kobata）、複合炭水化物：メソッズ・イ
ン・エンザイモロジィ（Methods in Enzymology)、28
巻、第262-271 頁（ギンズバーグ（Ginsburg）編、アカ
デミック・プレス社、ニューヨーク、1972年）；コバタ
及びギンズバーグ（Kobata and Ginsburg)、アーカイブ
ス・オブ・バイオケミストリィ・アンド・バイオフィジ
ックス（Arch. Biochem. Biophys.)、 150巻、第273-28
1 頁、1972年、に述べられているように、ルイス血液型
Le(a+b-) の個体のヒトの母乳からゲル濾過及びペーパ
ークロマトグラフィーによって単離された。単離された
炭水化物の構造を、ハコモリ（Hakomori）、J.Biochem.
（ジャーナル・オブ・バイオケミストリィ）、55巻、第
205-208 頁、1964年、に述べられているように調製した
ペル-o- メチル化誘導体のガスクロマトグラフィー及び
質量分析により決定し、該ガスクロマトグラフィー及び
質量分析の結果は単離された該炭水化物が上記の式Ｉの
N3異性体であることを示唆した。単離された該N3オリゴ
サッカライド上にLe^a構造が存在することは、米国血液
銀行協会技術マニュアル、第392-393 頁（米国血液銀行
協会、第８版、1981年）に述べられているように行った
血球凝集阻害アッセイにより証明された。Le^x構造の存
在も以下で述べるように証明された。

【００５０】単離された該N3を、グレイ（Gray）、複合
炭水化物：メソッズ・イン・エンザイモロジィ（Method
s in Enzymology)、L 巻、第155-160 頁（ギンズバーグ
（Ginsburg）編、アカデミック・プレス社、ニューヨー
ク、1978年、に述べられている方法に従って、ソヂウム
シアノボロヒドリドを用いた還元的アミノ化によりウシ
血清アルブミン(BSA) にカップリングさせた。簡潔に言
うと、6.8mg( 0.1μモル）のウシ血清アルブミン(BSA、
シグマケミカル社、セントルイス、MO、製造番号 A703
0）、10mg（7.3 μモル）の精製N3オリゴサッカライ
ド、及び10mg(0.159mモル）のソヂウムシアノボロヒド
リド（シグマケミカル社、セントルイス、MO）を２mlの
滅菌 0.2M リン酸カリウムバッファー、pH 7.8、に溶解
し、該反応混合液を 0.2μm のゲルマンサイエンシスア
クロディスクフィルター（バクスターサイエンティフィ
ックプロダクツ、マックゴーパーク、IL）で濾過滅菌し
て、滅菌ガラス製スクリュートップ培養チューブ中に入
れた。該還元的アミノ化反応を37℃のインキュベーショ
ンにより６週間行わせ、その後、該反応混合液を 0.1M
リン酸カリウムバッファー、pH 7.0、で希釈し、バイオ
−ゲル P-2（バイオラッド、リッチモンド、Ca.)に通し
た。該 N3-共役体を含むボイド分画を蒸留水に対して完
全に透析し、続いて凍結乾燥した。N3-BSA上のLe^x抗原
の存在は、直接結合型酵素連結性蛍光アッセイ(ELFA)に
おける反応によって証明されたが、該アッセイは、体液
の代わりにLe^xに対するモノクローナル抗体（モノクロ
ーナル抗体PM81、ヒドリテク社、サンディエゴ、Ca. 、
より購入。カタログNo.0192 ）を用い、ラベルされた二
次抗体としてビオチニル−ウマ抗マウスIgG （重鎖及び
軽鎖）（ベクターラボラトリーズ）を用いることを除け
ば、以下のパートB に述べたのと同様の方法で行った。

【００５１】B.直接結合型酵素連結性蛍光アッセイヒト血清中のN3に対する抗体をアッセイするために、一
定量（100 μl)のN3-BSAをマイクロフルア"B" ブラック
ポリスチレン微量滴定プレート（ダイナテックラボラト
リーズ、アレキサンドリア、VA、USA 、より購入 )のウ
ェルに加え、37℃で３時間、その後該ウェルを覆うよう
に加湿チャンバー中で４℃で一晩インキュベートした。
N3-BSAを 0.1M NaHCO₃（pH 9.8）中に 1.0μg 蛋白/ml
の濃度になるように加えた。非結合N3-BSAを吸引除去
し、該ウェルを１％ BSA（シグマケミカル社、セントル
イス、MO、製造番号 A7030）を含むリン酸緩衝食塩水
（0.15M NaCl を含む 0.01 M リン酸ナトリウムバッフ
ァー、pH7.3 、で充填し、37℃で２時間インキュベート
することにより、残存するポリスチレン蛋白結合部位を
ブロックした。該ウェルを吸引した後、PBSA〔0.15 M N
aCl 、１％ BSA（シグマケミカル社、セントルイス、M
O、製造番号 A4503）、0.1 ％トゥィーン20、及び0.02
％ NaN₃を含む 0.01 M リン酸ナトリウムバッファー、
pH 7.3〕中に予め連続的に希釈した血清を 100μl ずつ
ウェルに加え、加湿チャンバー中で４℃で一晩インキュ
ベートした。

【００５２】試験した血清は正常人の15血清及び、胃腸
(GI)癌のヒト患者から癌手術の当日採取した31血清であ
った。癌性血清のうち、15個はステージB の癌患者か
ら、12個はステージC の癌患者から、さらに４個はステ
ージD の癌患者からのものであった。癌のステージはデ
ュークス（Dukes)、ジャーナル・オブ・パソロジカル・
バクテリオロジィ（J. Pathol. Bacteriol.)、50巻、第
527 頁、1940年、に述べられているように決定した。

【００５３】次に、該微量滴定ウェルをPBSAをウェルに
充填した後、加えた液体を吸引することを繰り返すこと
により５回洗浄した。PBSAで1:2000に希釈したビオチン
ラベル化ヤギ抗ヒトIgG （重鎖及び軽鎖）（ベクターラ
ボラトリーズ、バーリンゲイム、CA）を該ウェルに加え
(100μl/ウェル）、37℃で２時間インキュベートさせ
た。上記のようにPBSAで５回洗浄した後、PBSAで1:2000
に希釈したストレプトアビジン- β- ガラクトシダーゼ
（ベテスダリサーチラボラトリーズ、ガイタースバー
グ、MD）を 100μl ずつ各ウェルに加え、該プレートを
37℃で 1.5時間インキュベートした。

【００５４】最終的に上記のようにPBSAで５回洗浄した
後、PBS(pH 7.5) 中 0.1mg/ml 4-メチルアンベリフェリ
ル- β-D- ガラクトピラノシド基質を 100μl ずつ各ウ
ェルに加えた。約45-60 分間インキュベートした後、メ
チルアンベリフェロン蛍光を365 nmの励起波長及び450
nmの発光波長を用いて、相対的蛍光単位(RFU）でマイク
ロフルアリーダー（ダイナテックラボラトリーズ）で測
定した。測定記録はコンピューターでデータ整理及び曲
線あてはめが行えるようにフロッピーディスクに収集し
た。

【００５５】対照ウェルは、以下の違いを除いて上記と
同様の様式で処理した：N3-BSAのみを欠く対照ウェル
（“対照：マイナス抗原”）；癌血清又は正常血清のみ
を欠く対照ウェル（“対照：マイナス一次抗体”）；ブ
ロッキング処理のみを行い、基質のみを加えた対照ウェ
ル（“基質ブランク”）。“対照：マイナス抗原”及び
“対照：マイナス一次抗体”は、抗体及びラベル用試薬
の非特異的結合に対して測定値を補正するのに用い、
“基質ブランク”は非酵素的基質加水分解に対して補正
した。

【００５６】 C. 抗体力価の算出及び得られた力価の統計的比較予めフロッピーディスクにセーブした滴定データを最初
に、デュプリケートの測定値を平均化してバックグラウ
ンドに対して補正させるスプレッドシート（ロータス 1
-2-3、ロータス・ディベロップメント・コーポレイショ
ン、ケンブリッジ、MA、USA)にインポートした。バック
グラウンドは対応するデュプリケートの“対照：マイナ
ス抗原”の平均値から成った。

【００５７】バックグラウンドに対して補正した後、該
データをタイターカルクプログラム（ヒューレット・パ
ッカード、サンタクララ、CA、USA)にインポートし、マ
ークワート−リーヴェンバーグの非線型回帰アルゴリズ
ムを用いて４パラメーターロジスティックモデルについ
て行った。このプログラムからの典型的結果を図１に示
す。

【００５８】得られたＳ字状滴定曲線の中点値をN3-BSA
に対して反応性を持つ抗体量の尺度（すなわち、抗体力
価）として用いた。胃腸癌血清及び正常血清に対して得
られた中点値を有意性に対するフィッシャーの"t" 検定
を用いて統計的に比較し、ｐ値を適当な数の自由度に対
して得た。正常血清並びにステージ B、ステージ C及び
ステージ Dの癌血清に対する中点値を、図２に示した点
図表にプロットした。対応する"t" 検定計算値を以下の
表１に示す。表１：N3-BSAに対して反応性を持つ胃腸癌血清における統計表全体癌：ステージ B 癌：ステージ C 癌：ステージ D 正常調査数 31 15 12 4 15 平均 R＾2 - 0.9195- 平均中点 -- 155 425 110 24 （力価）Ｔ値 -- 4.96 1.44 4.33 ｐ値 -- ｐ＜0.001 0.10＜ｐ＜0.20 ｐ＜0.01 表１及び図２に示したように、N3に対する抗体力価は正
常血清よりも胃腸癌血清においてのほうが高かった。
又、N3に対する抗体の濃度は初期の癌ステージで最も高
かった。

【００５９】1:80のカットオフ力価を用いると、図２は
15個の正常血清のうち14個（93％）がこの力価より低
く、一方15個のステージ Bの癌腫血清のうち13個（87
％）、12個のステージ Cのうち７個（58％）及び４個の
ステージ Dのうち３個（75％）がこの希釈度よりも高い
力価を有した。正常血清の抗体濃度とステージ B又は D
の癌血清の抗体濃度の間の違いは有意度が高かった（表
１参照）。ステージ Cの血清うち１個が非常に高い力価
(3846)を示し、これがステージ Cのデータの高い平均値
及び大きな標準偏差をもたらした。この１力価を計算か
ら外せば、ステージCの平均力価は 114（ステージ B及
び Dの血清の平均値と同等）になるであろう。又、 114
というステージ Cの平均力価は正常血清の平均力価と有
意に異なるであろう（ｐ＜0.01）。

【００６０】図２のデータは同様に 1:100、1:80及び1:
50のカットオフ力価より上及び下の力価についてカイ二
乗分析により評価した。使用したカットオフ力価の全例
において、該カイ二乗分析から正常血清及びステージ
B、ステージ C又はステージ Dの血清の間に高い有意差
が示された（ｐ＜0.005 ）。CEA 抗原の濃度も CEAに対
するタンデムE 試験（ハイブリテック、サンディエゴ、
CA）を製造元の説明書に従って使用し、数名の該癌患者
について測定した。この試験の結果も図２に示す。３ユ
ニット/ml のカットオフ値を用いると、５個のステージ
Bの癌血清のうち３個（60％）、10個のステージ Cのう
ち4 個（40％）及び４個のステージ Dのうち２個（50
％）で CEAの濃度が上昇していた。

【００６１】図２及び表２に示したように、癌の全ステ
ージにおいて CEA抗原の濃度上昇を示した患者のほうが
N3に対する抗体の濃度上昇を示した患者よりも遙かに低
率であった。従って、 CEA抗原の濃度よりもむしろN3に
対する抗体を測定することにより、遙かに多数の癌患者
が検出される（表２参照）。特に、より多数のステージ
Bの癌患者が検出されていることはN3に対する抗体の測
定が実質的な数の患者において CEA抗原の測定よりも早
期に癌を検出することを示している。表２ 1:80よりも大きな抗N3力価を３ユニット/ml よりも多いCEA を癌ステージ有する患者の比率有する患者の比率 B 87％ 60％ C 58％ 40％ D 75％ 50％

【図面の簡単な説明】

【図１】正常人及び胃腸癌の患者から採取した血清中の
N3に対する抗体の滴定により得られたデータの非線型回
帰を行うために用いた、タイターカルクプログラムの結
果を表す典型的グラフである。

【図２】胃腸癌のステージ対、抗N3抗体力価及び癌胎児
抗原（CEA)ユニットのグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ライマンイーディヴィスアメリカ合衆国イリノイ州 60626 シカゴチェイス 1533

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物における癌を検出する方法であ
って： (a) 哺乳動物から採取した体液をN3に接触させること； (b) 該体液中のN3に対する抗体の量を測定すること；及
び (c) 処理(b) で測定された抗体量が、癌のない同種の哺
乳動物から採取した同じタイプの体液中に標準的に存在
するN3に対する抗体の量よりも高いかどうかを判定する
こと、を含む方法。
【請求項２】該体液が血清又は血漿である、請求項１
記載の方法。
【請求項３】該哺乳動物がヒトである、請求項１記載
の方法。
【請求項４】該哺乳動物中に存在する癌が進行の初期
ステージにある、請求項１記載の方法。
【請求項５】該N3が蛋白又はポリペプチドと共役され
ている、請求項１記載の方法。
【請求項６】該 N3-共役体が固体表面上に固定化され
ている、請求項５記載の方法。
【請求項７】該 N3-共役体が N3-ウシ血清アルブミン
である、請求項５記載の方法。
【請求項８】該 N3-ウシ血清アルブミンが固体表面上
に固定化されている、請求項７記載の方法。
【請求項９】該抗体量を直接結合型酵素連結性蛍光ア
ッセイを用いて測定する、請求項１記載の方法。
【請求項10】該体液がヒト血清であり、該抗原が N3-
ウシ血清アルブミンである、請求項９記載の方法。
【請求項11】該ヒト中に存在する癌が進行の初期ステ
ージにある、請求項10記載の方法。
【請求項12】ラベルされたN3の入った容器を含む、哺
乳動物における癌を検出するためのキット。
【請求項13】蛋白又はポリペプチドと共役されている
N3の入った容器を含む、哺乳動物における癌を検出する
ためのキット。
【請求項14】該 N3-共役体がラベルされている、請求
項13記載のキット。
【請求項15】 N3の入った容器及び、抗N3抗体に結合す
る二次抗体又は他の試薬の入った容器を含む、哺乳動物
における癌を検出するためのキット。
【請求項16】該二次抗体又は他の試薬がラベルされて
いる、請求項15記載のキット。
【請求項17】ラベルされた二次抗体の入った容器を含
み、該二次抗体がヒト免疫グロブリンに対して特異的で
ある、請求項16記載のキット。
【請求項18】ラベルされた二次抗体の入った容器を含
み、該二次抗体上のラベルがビオチンである、請求項16
記載のキット。
【請求項19】該N3がラベルされている、請求項15記載
のキット。
【請求項20】該N3が蛋白又はポリペプチドと共役され
ている、請求項15記載のキット。
【請求項21】該 N3-共役体がラベルされている、請求
項20記載のキット。