JPH06134206A

JPH06134206A - 生体物質を分離する方法

Info

Publication number: JPH06134206A
Application number: JP4293121A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Yoshida; 弘之吉田; Hideaki Kiba; 秀明木庭; Keiko Kudo; 慶子工藤
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp; Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1992-10-30
Publication date: 1994-05-17

Abstract

(57)【要約】【構成】多孔質体の細孔部分に親水性架橋ゲルが担持
された複合体構造でありかつイオン交換基を有する分離
剤を用いて、該分離剤１リットルに対して５０ｇ以上の
生体物質を含む混合物を負荷した後、塩濃度０．０２Ｍ
以上０．２Ｍ以下の範囲の溶離液を接触させる事によ
り、目的とする生体物質と夾雑物とを分離する方法。【効果】本発明方法は、生体高分子物質を高負荷量で
負荷でき、なおかつ低塩濃度かつ高流速で目的の生体高
分子物質を分離できるものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド、タンパク
質、核酸、酵素等の生体物質を液体クロマトグラフィー
により分離する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質に代表される生体物質を分離
精製する場合、多糖の架橋ゲルからなるイオン交換体又
は合成高分子の多孔質体からなるイオン交換体が一般に
用いられている。しかしこの多糖の架橋ゲルは機械的強
度が弱く、クロマトグラフィーで使用した場合の圧力損
失が大きく、例えば４ｍ／ｈ以上の線速度で通液する事
は困難である。更に、高粘度溶液を通液した場合、通液
抵抗により、樹脂が変形、圧密化する恐れがある。この
ため、生体物質を含んだ溶液を前処理によって低粘度化
したり、負荷量を減少させ、溶離時に高濃度に濃縮され
た生体物質がカラム内を通過するのを防ぐなどの措置が
必要である。

【０００３】また、吸着させた生体物質を溶離させる為
には、一般に０．２Ｍ以上の塩濃度の溶離液が必要であ
り、その後の脱塩操作での負荷が大きくなるという欠点
を有する。一方、合成高分子の多孔質体からなるイオン
交換体の場合、機械的強度は満足できるものの、吸着可
能な生体物質量が少なく、分離剤１リットル当たり５０
ｇ以上負荷させることは困難である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来の技術
では不可能であった、高負荷量の生体物質の分離を、高
流速かつ低塩濃度の条件で分離する方法を提供する事で
ある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題に対し本発明者
らは、特定の分離剤を用いることにより上記課題を解決
できる事を見いだした。すなわち、本発明は、多孔質体
の細孔部分に親水性架橋ゲルが担持された複合体構造で
あり、かつイオン交換基を有する分離剤を用いて、該分
離剤１リットルに対し、５０ｇ以上の生体物質の混合物
を負荷した後、塩濃度が０．０２Ｍ以上０．２Ｍ以下の
溶離液を接触させる事により、目的とする生体物質を分
離する方法をその要旨とする。

【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明で
使用する多孔質体の細孔部分に架橋ゲルが担持された複
合体にイオン交換基を導入した分離剤は、特開平１−２
５４２４７号公報に記載されているように、多孔質体と
架橋ゲルの複合体を形成させ、さらにゲル部分にイオン
交換基を導入して得られる。

【０００７】この時多孔質体の細孔容積は、樹脂体積の
３０％以上９０％以下が好ましい。高流速での通液に耐
えるより強固な構造とするためには、３０％以上７０％
以下が更に好ましい。また細孔直径は、０．０１μｍ以
上、１μｍ未満である事が好ましい。該多孔質体は、有
機高分子多孔質体や、多孔質けい酸などの無機多孔質体
を用いる。特に親水性架橋ゲルを担持させる為、親水性
表面を有する事が好ましい。疎水性表面を有する多孔質
体の場合、細孔内に充分な量の架橋ゲルを担持できない
ため、生体物質の吸着量が減少するので好ましくない。
更に、疎水性の高い表面を有する多孔質体の場合、分離
する生体物質と疎水性相互作用による非特異吸着を起こ
し易いという欠点を有するため、好ましくない。

【０００８】該多孔質体として用いられる無機物質の例
としては、ヒドロキシアパタイトや酸化チタン等があ
る。一方、該多孔質体として用いられる有機高分子多孔
質体としては、ビニル共重合体や多糖類の多孔質体が好
ましい。該ビニル共重合体としては、具体的にはビニル
基もしくはイソプロペニル基を分子中に１個有するモノ
不飽和単量体とそれらの基を２個以上有するポリ不飽和
単量体との架橋共重合体である。しかも、このような親
水性架橋共重合体の多孔質体を形成するのに使用するモ
ノ不飽和単量体及びポリ不飽和単量体としては、共重合
後、親水性の表面を形成可能なものであり、水酸基、カ
ルボキシル基等の親水性の基を有するか又は加水分解等
によりこれらを形成可能なもの（例えばグリシジル基）
が好ましい。

【０００９】かかるモノ不飽和単量体とポリ不飽和単量
体とから本発明で用いる複合体を形成する多孔質体を製
造する方法は、例えば特開昭６０−９６６０５号公報に
記載されている通り、多孔質化剤等を用いて容易に製造
できる。多糖類の多孔質体の場合、アガロース、キトサ
ン、セルロース等の多孔質体が好ましい。さらに、エピ
クロルヒドリン、ジグリシジル化合物、ジビニルスルフ
ォン等の架橋剤により架橋処理を行って機械的強度の強
化された架橋多孔質体がより好ましい。

【００１０】また、本発明で用いる複合体を形成する多
孔質体の必要条件を満たす多孔質体は、既存の吸着剤や
イオン交換樹脂として市販されている多孔質体を用いて
実施することも可能である。上記各種の多孔質体の中で
も、ビニル共重合体が特に好ましい。また、該多孔質体
の細孔部分に担持される親水性の架橋ゲルは、デキスト
ラン、アガロース、キトサン等を前述のような架橋剤で
処理した多糖類の架橋ゲルや、ポリビニルアルコール、
酢酸ビニル等の親水性合成高分子で、水酸基やカルボキ
シル基等の親水性基を有し、エピクロロヒドリン等のエ
ピハロヒドリンや、グルタルアルデヒド等のアルデヒド
等の架橋剤で処理された架橋ゲルが好ましく、多糖類の
架橋ゲルが特に好ましい。

【００１１】架橋ゲルの分離剤に占める重量分率は乾燥
した分離剤に対して１０〜３０重量％である事が好まし
い。多孔質体の細孔部分に親水性架橋ゲルを担持する方
法としては、多糖類や親水性高分子の水溶液を多孔質体
に含浸させた後架橋剤と反応させる方法が挙げられる。

【００１２】該複合体にイオン交換基を導入する方法と
しては、一般的に知られている方法を用いる。具体的に
は、多孔質体の細孔部分に担持された架橋ゲルにイオン
交換基導入反応を行うか、多孔質体の細孔部分に担持さ
れる前の親水性高分子にイオン交換基導入反応を行って
得られる。例えば、イオン交換基がジエチルアミノエチ
ル基で、多孔質体の細孔部分に担持された架橋ゲルにイ
オン交換基導入反応を行う場合、水湿潤状態の複合体を
所定濃度のアルカリ水溶液に浸漬し、ついでジエチルア
ミノエチルクロライド塩酸塩の水溶液と、４０〜９０度
で０．５〜１２時間反応させることにより得られる。イ
オン交換基の導入はアルカリ性雰囲気下、ハロゲン化ア
ルキルと反応させた後に導入してもよい。

【００１３】また、本発明における分離剤のイオン交換
基の量は、好ましくは０．０１ｍｅｑ／ｍｌ以上０．３
ｍｅｑ／ｍｌ以下であり、更に好ましくは０．０２ｍｅ
ｑ／ｍｌ以上０．２ｍｅｑ／ｍｌ以下である。イオン交
換基としては、弱酸性基、強酸性基、弱塩基性基、強塩
基性基のいずれでも良いが、ジエチルアミノエチル基等
の塩基性イオン交換基が特に好ましい。

【００１４】また、乾燥した分離剤１ｇに対する水中で
の体積（膨潤度）は２ｍｌ／ｇ以上、７ｍｌ／ｇ以下で
ある事が好ましい。本発明における生体物質とは、ペプ
チド、タンパク質、核酸、酵素等の物質で、水溶性の物
質である。より具体的には、血清アルブミン、免疫グロ
ブリン等のタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオ
テクノロジーにより生産されるタンパク質等の生理活性
物質、或いはＤＮＡや生理活性を有するペプチド等の生
体物質である。本発明で処理する生体物質はこれらのう
ち１種と夾雑物との混合物、あるいはこれらの少なくと
も１種と夾雑物との混合物であり、分離剤に対する負荷
量は、生体物質全量で５０ｇ以上である。分子量は、２
００万以下、さらに好ましくは５０万以下程度のもので
ある。

【００１５】分離の操作は、以下の条件で行う。吸着操
作は適当な容器に生体物質を含む溶液を用意して、その
中に分離剤を添加し生体物質と接触させるバッチ吸着法
でも、分離剤を充填したカラムに生体物質の溶液を通液
するカラム吸着法でも実施できる。その後の分離操作
は、バッチ吸着法で生体物質を吸着した分離剤をカラム
に充填するか、カラム吸着法で吸着させた状態の分離剤
をそのままカラムクロマトグラフィーの手法で溶離させ
る事により実施できる。

【００１６】分離剤に負荷させる生体物質の量は、通常
分離剤の生体物質吸着容量が小さいか、あるいは機械的
強度が弱く、高濃度の生体物質を含む溶液を通液できな
いために制限され、一般的には分離剤１リットルに対し
て５０ｇ未満の範囲である。本発明における分離剤を用
いた生体物質の分離方法は、分離剤１リットルに対して
生体物質５０ｇ以上の高負荷の条件において、目的とす
る生体物質を夾雑物質と分離するものである。

【００１７】本発明において分離剤に吸着させた生体物
質を溶離・回収するには、該分離剤をカラムに充填し、
塩を溶解した水溶液を通液する。該塩溶液としては、塩
化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチウム等のアルカ
リ金属の塩等が挙げられる。塩の濃度が高い場合、溶離
操作の後に行う生体物質からの脱塩操作において、除去
すべき塩の量が多くなり、経済的にも好ましくない。溶
離操作での塩濃度としては、０．０２Ｍ以上、０．２Ｍ
以下が好ましい。さらに好ましくは、０．０５Ｍ以上、
０．１５Ｍ以下の濃度が好ましい。

【００１８】塩を溶解した水溶液を、通液する流速は、
遅すぎると時間当たりに分離精製できる生体物質量が少
なく、生産性の面で好ましくないが、極度に速すぎても
分離精度が低下するため好ましくない。本発明において
塩を溶解した水溶液を通液する流速は、線速度で０．５
ｍ／ｈ以上、３０ｍ／ｈ以下、好ましくは２ｍ／ｈ以上
２０ｍ／ｈ以下、特に好ましくは、４ｍ／ｈ以上、１５
ｍ／ｈ以下である。

【００１９】

【実施例】以下、本発明を実施例により説明するが、本
発明はこれら実施例に限定される物ではない。〔実施例１〕多孔質体と親水性架橋ゲルの複合体は、特
開平１−２５４２４７号公報に記載の方法に従って調製
した。２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレートと
エチレングリコールジメタクリレートからなる球状多孔
質重合体（粒子径１２０μｍ、細孔直径１０００Å、細
孔容積１．７５ｍｌ／ｇ、比表面積１５．４ｍ²／ｇ）
にデキストランの架橋ゲルを担持した複合体を得た。つ
いでＮａＯＨ存在下、ジエチルアミノエチルクロライド
塩酸塩と、５０℃で５時間反応させ、ジエチルアミノエ
チル基（ＤＥＡＥ基）をイオン交換基として有するイオ
ン交換体（交換容量０．１１ｍｅｑ／ｍｌ−ｒｅｓｉ
ｎ、水中での膨潤度３．８１ｍｌ／ｇ−ｒｅｓｉｎ）を
得た。このイオン交換体を、直径８ｃｍ×１０ｃｍのカ
ラムに充填し、以下の条件でウシヘモグロビンとウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）の１／１混合物の１％溶液を３
０ｍｌ，流速１０．７ｍ／ｈで通液、溶離した。条件：０〜６分０．０１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）６分以降０．０１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）ＮａＣｌ＝０．１Ｍその結果、ウシヘモグロビンに続いて、ＢＳＡが溶出
し、２成分が完全に分離した。溶出時間は０．３〜４．
５分と８分であり、それぞれの回収率は、ウシヘモグロ
ビン９５％、ＢＳＡ９９％だった。

【００２０】〔比較例１〕実施例と同様にして、架橋ア
ガロースからなるイオン交換体（ＤＥＡＥセファロース
ファストフロー、ファルマシア社製）を用いて、ウシヘ
モグロビン／ＢＳＡ混合物の分離を試みた。その結果、
ウシヘモグロビンは溶出したが、ＢＳＡは吸着されたま
ま溶出しなかった。

【００２１】〔実施例２〕実施例１のイオン交換体を直
径０．８ｃｍ×１０ｃｍのカラムに充填し、ミオグロビ
ンとオブアルブミンの１／１混合物を１％溶液として７
０ｍｌ以下の条件で通液し、溶離した。条件：流速５．４ｍ／ｈ０〜２８分０．０１Ｍ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）２８分以降０．０１Ｍ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）ＮａＣｌ＝０．１５Ｍその結果、ミオグロビンに続いてオブアルブミンが溶出
し、２成分を完全に分離することができた。溶出時間
は、０．５〜２０分と２９分でありオブアルブミンを９
５％回収できた。後記図１に、クロマトグラフを示す。

【００２２】〔実施例３〕実施例１のイオン交換体を直
径０．８ｃｍ×１０ｃｍのカラムに充填し、以下の条件
でＢＳＡを１％溶液として７０ｍｌ通液し、溶離した。条件：流速５．４ｍ／ｈ０〜１６分０．０１Ｍ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）１６分以降０．０１Ｍ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）ＮａＣｌ＝０．１４Ｍその結果、ＢＳＡは１６分以降に溶出し、溶出時間は１
８．５分、回収率は９６％であった。

【００２３】〔実施例４〕実施例１のイオン交換体を直
径０．８ｃｍ×１０ｃｍのカラムに充填し、各種タンパ
ク質の１％溶液を以下の条件で７０ｍｌ通液し、溶離し
た。その結果、各タンパク質とも良好に回収できた。溶
出操作でのＮａＣｌ濃度、溶出時間、回収率を下記表−
１に示す。条件：流速５．４ｍ／ｈ０〜１６分０．０１Ｍ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）１６分以降ＮａＣｌを所定濃度含む０．０１Ｍ−ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）

【００２４】

【表１】

【００２５】〔実施例５〕実施例１のイオン交換体５ｍ
ｌを、ＢＳＡの０．４％溶液（０．０１Ｍ−トリス塩酸
緩衝液、ｐＨ７．０）中に分散させ、液温５℃で６時間
放置した後取り出して直径０．８ｃｍ×１０ｃｍのカラ
ムに充填し、ＮａＣｌ＝０．１Ｍを含む緩衝液を流速
５．４ｍ／ｈで通液した。吸着されていたＢＳＡ５８５
ｍｇが回収された。

【００２６】

【発明の効果】本発明の、多孔質体の細孔部分に親水性
架橋ゲルが担持された複合体構造を有するイオン交換体
を用いて生体物質を分離する方法は、高負荷、高速度、
かつ低塩濃度での生体物質の分離精製に関する方法であ
る。従来のイオン交換体を用いた分離方法に比べて、高
負荷により１回の精製で処理される生体物質量が多く、
高速度で溶離するため操作に必要な時間が少なく、低塩
濃度での溶離操作のため、その後の脱塩操作での負荷が
少ない、生産性、経済性面で優れた生体物質の分離方法
を提供するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で用いたイオン交換体を用いてミオグ
ロビン（Ａ）とオブアルブミン（Ｂ）の混合物を分離精
製した際（実施例２）のクロマトグラフである。

【符号の説明】

Ａミオグロビンの溶離を示すピークＢオブアルブミンの溶離を示すピークを表わす

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ 8310−2Ｊ 30/88 Ｅ 8310−2Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】多孔質体の細孔部分に親水性架橋ゲルが
担持された複合体構造であり、かつイオン交換基を有す
る分離剤を用いて、該分離剤１リットルに対して５０ｇ
以上の生体物質を含む混合物を負荷した後、塩濃度０．
０２Ｍ以上０．２Ｍ以下の範囲の溶離液を接触させる事
により、目的とする生体物質を分離する方法。