JPH0614044B2 - 酵素クロマトグラフ免疫分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は被検体を分析するための新規な免疫クロマトグ
ラフィー法に関する。

競争的蛋白質結合分析又は特異的結合分析の分野は、そ
の診断分野における重要性が認識されるようになって非
常に拡張されてきた。ある化合物を検知し、それを定量
的に測定しうることは、多種類の薬剤の投与の監視、多
種類のホルモンの不均衡の測定、及び病原菌の存在の診
断を可能にしてきた。多段操作の必要の有無、標識によ
って現像される信号の種類、溶液中又は表面上での信号
の発生及び定量のための測定法に関して異なる技術が知
られている。

分析法を開発する上で、試薬及び工程手順に関して多く
の考慮すべき点が存在する。その１つの考慮は分析を行
なう個人の偽混の程度である。比較的熟練してない個人
が分析を行ない且つ理にかなった定量的結果を与えうる
ことが望ましい場合が多くある、これらの場合には、分
析は試料中の物質による干渉が実質的にない、そして環
境状態における変化に伴なうバラツキが比較的ない、ま
た測定が容易であるということが望ましい。また、洗浄
操作は、非特異的結合物質を残留させたままの不適当な
洗浄或いは特異的結合の逆転という理由から誤差の原因
となりうる。

米国特許第４１６８１４６号は、抗体を含む免疫クロマ
トグラフィーを用い、次いでこの免疫クロマトグラフを
標識された抗体を含む水溶液と接触させる免疫分析法に
ついて記述している。米国特許第４２３３４０２号は、
１つの酵素の基質が他のものの生産物である酵素の組合
せを用いる均一分析法を記述している。生産物の高めら
れた生産は分析媒体中の被検体の量に関連する。米国特
第４２７５１４９号は、酵素の組合せ物を用いる、粒子
の存在が２つの酵素間の相互作用を高める、１つの酵素
の生産物が他のものの基質であるという粒子の使用法を
述べている。特異的結合対員の結合の結果として粒子に
結合した２つの酵素の存在のために高められた最終生産
物の生産は分析媒体中の被検体の量に関係する。

本発明によれば、定量的分析が特別な装置を用いずに容
易に行なうことができるという被検体を検知するための
新規な免疫クロマトグラフィー法が提供される。被検体
は、標識が１種又はそれ以上の酵素を含む酵素による信
号発生系の１員である標識された共役体(conjugate)の
存在又は不存在下に吸収性の担体で免疫クロマトグラフ
に供される。被検体をクロマトグラフィーで処理した
後、酵素共役体が試料中に含まれていなかった場合に
は、このクロマトグラフを、被検体の移動した距離と関
連してクロマトグラフに結合する標識された特異的結合
対員と接触させる。適当な試薬を与えることにより、１
つの酵素の基質が他の酵素の生産物である２つの酵素の
場合、検知しうる信号を与える最終生産物が生成され
る。この時被検体の移動した距離が決定され、その距離
を試料中の被検体の量と関係づける。

今回、試料中の被検体の存在を決定するのに用いるため
の方法及び組成物が提供される。本方法は、境界が免疫
クロマトグラフの両端間において発現され、境界の免疫
クロマトグラフの一端からの距離が試料中の被検体の量
と関係する免疫クロマトグラフを含む。

いろいろな工程手順を用いうるが、決まって免疫クロマ
トグラフをその一端で試料溶液と接触させ、その溶液を
免疫クロマトグラフに沿つて上昇させる。次いで被検体
が結合した領域及び被検体のない領域間のはっきりした
輪郭を与える１種又はそれ以上の試薬を組合せることに
よって種々の技術を使用することができる。その技術
は、被検体が結合している領域を被検体が存在しない領
域から明確に区別するために、単一の試薬又は組合せた
試薬を使用することを含む。これは結合した被検体又は
遊離域の被検体において、一方の又は他方の域に亘って
の検知しうる信号を与えて２つ領域を区別し、或いは２
つの領域間に区別しうる境界を発現させることを含む。
用いる試薬及び材料を適当に選択することにより、結合
した被検体又は遊離の被検体の領域のいずれかにおいて
或いは主に２つの領域間の境界において信号を発生させ
ることができる。本工程手順及び試薬を用いることによ
り、洗浄工程を最小にでき、偶然の、定量的結果の妨害
物は実質的に回避される。

本分析を行なう場合、配位体と受体からなる特異的結合
対の１員である被検体が測定される。配位体と受体は、
受体が配位体の極性及び空間的組織に特異的に結合し、
配位体を同様の特性をもつ他の化合物から区別できると
いう点で関係がある。免疫クロマトグラフは、液体を支
持体中の毛管現象によって移動せしめる吸収性支持体に
無拡散的に結合した特異的結合対員の１つを有すること
を特色として使用される。特異的結合対員のほかに、信
号発生系の酵素員も存在するであろう。信号発生系は被
検体が結合した又は存在しない領域を正確に決定でき、
一方非特異的結合を減ずるために洗浄又は他の工程を最
小にする試薬を含む。

分析を行なう場合には、免疫クロマトグラフを試料含有
溶液と接触させる。この試料含有溶液は特異的結合対員
に結合した信号発生系の員も含む。他に又は更に、いず
れかの信号発生員以外の信号発生員を、免疫クロマトグ
ラフを一部分に１つの又はそれ以上の連続した溶液の形
で最初に添加しておいてもよい。試料は溶出液又は溶媒
の移動によって免疫クロマトグラフの領域を横切り、い
くつかの工程手順では特異的結合対員の共役体及び信号
発生系員も免疫クロマトグラフを横切るであろう。

本発明を更に説明するために、本発明の以下の記述にお
いて次の定義を使用する。

定義 被検体−配位体であってよいモノ−又はポリ−エピトピ
ック(epitopic)、普通抗原又は付着体である測定すべき
化合物又は組成物。この化合物の単数又は複数は少くと
も１つの共通のエピトピック点或いは受体を分けあう。

特異的結合対（「mip」）一分子の一方が他の分子の特
別な空間的及び極性組織に特異的に結合する領域を表面
又は空洞中に有する２つの異なった分子。特異的結合対
の員は配位体及び受体（抗配位体）として言及される。
多くの場合、受体は抗体であろうし、配位体は抗原又は
付着体として役立つであろうし、その程度まで免疫学的
対の員である。それ故に、員の各々はmipとして言及さ
れる。「mip」はすべての配位体及びすべての受体を含
むことが意図されていることが理解されよう。

配位体−受体が天然に存在する又は製造できる有機化合
物。

受体（抗配位体）−分子の特別な空間及び極性組織、即
ちエピトピック点又は決定点を認識しうる化合物又は組
成物。受体の例は天然に存在する受体例えばチロキシを
結合するグロブリン、抗体、酵素、Fabフラグメント、
レクチン、核酸などを含む。

標識−標識は他の一分子又は支持体に共役したいずれか
の分子であってよく、２つの分子が包含される場合には
分子が標識であるように任意に選択される。

信号発生系−信号発生系は１つ又はそれ以上の成分を有
するが、少くとも１つの成分はmipに共役する。信号発
生系は外部的手段により、普通電磁照射の手段により、
望ましくは肉眼的検査により検知しうる測定可能な信号
を発生する。多くの場合、信号発生系は発色団及び酵素
を含む。この場合発色団は紫外又は可視域で光を吸収す
る染料、燐光体、螢光体及び化学発光体を含む。

免疫クロマトグラフ−被検体及び適当なものとして信号
発生系のいずれかの員を移動させつつ液体を移動せしめ
る吸収性支持体にある領域で結合した複数のmip、配位
体又は受体のいずれかを有する。mipは無拡散的に支持
体に、共有結合的又は非共有結合的に結合する。さらに
信号発生系の１つ又はそれ以上の員は無拡散的に吸収性
支持体に、共有結合的又は非共有結合的に結合する。

方法 本方法は静置固体相と移動液体相を含む吸収性支持体で
行なわれる。静置固体相は連続して異なる溶液中の複数
の試薬と接触させることができる。この時連続した試薬
組成物との接触間では洗浄工程が普通省略される。

mipが無拡散的に吸収性支持体に結合する領域は免疫吸
着域として言及される。試料からの被検体は他の前端を
進む溶媒と一緒に運ばれて吸着域を横切るであろう。支
持体に結合したmipに対して同族の又は補足的なmipであ
る被検体はmip複合体形成を介して支持体に結合するよ
うになる。信号発生系は、被検体が結合する免疫吸着域
の区域がそれが存在しない区域と区別できる手法を提供
する。この時免疫クロマトグラフ上の予じめ決められた
点からの距離は試料中の被検体の量の１つの尺度であ
る。

免疫吸着域を通る試料の量は、試料を適当な溶媒に溶解
すること及び溶液を毛管現象によって免疫吸着域を移動
させることによって増加せしめられる。

溶媒は普通水性媒体であり、これは他の極性溶媒、特に
アルコール、エーテルなどを含めて炭素数１〜６、更に
普通には１〜４の酸素化溶媒を約４０重量％まで含有し
ていてもよい。普通、共溶媒は約２０重量％以下で存在
しよう。

媒体に対するpHは普通４〜１１、更に普通５〜１０及び
好ましくは約６．５〜９．５の範囲であろう。pHはmip
の結合親和性をかなりの程度で維持するように選択され
る。所望のpHを達成し且つ溶出中にpHを維持するために
種々の緩衝剤が使用できる。緩衝剤の例は、ホウ酸塩、
燐酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタルなどを含む。使用
する緩衝剤は本発明にとって厳密でないが、個々の分析
においてある緩衝剤は他のものよりも好適なことがあ
る。

望ましくは、非イオン性洗剤約０．０５〜０．５重量％
を試料と共に包含させる。約２００〜２００００ダルト
ンの種々のポリオキシアルキレン化合物が使用できる。

分析を行なうためには、適度な、望ましくは実質的に一
定の温度が普通使用される。溶出及び検知しうる信号発
生のための温度は一般に約１０〜５０℃、更に普通には
約１５〜５０℃の範囲であり、しばしば室温、即ち約１
５〜２５℃である。

分析しうる被検体の濃度は、一般に約１０^-4〜約１０
^-15Ｍ、更に普通には約１０^-6〜１０^-14Ｍで変わりう
る。分析が定性的、半定性的又は定量的であるかどうか
の如き考慮、用いる検知法、問題の被検体の濃度及び工
程手順は普通他の試薬の濃度を決定するであろう。

試料及び試薬溶液中の種々の試薬の多くの濃度は一般に
問題の被検体の濃度範囲によって決定されるが、試薬の
各々の最終濃度は普通分析の感度を興味ある範囲に亘っ
て最適化するために実験的に決定されよう。しかしなが
ら、ある工程手順の場合、個々の試薬は分析の感度に致
命的に影響しないで実質的な過剰量で使用しうる。

免疫吸着域の寸法は、実際上の考慮を除いて上限がな
い。多くの場合に低濃度を分析するから、免疫吸着域の
巾は比較的狭い傾向があり、被検体は理にかなった距離
を横切り、問題の濃度に亘って合理的な差異を与えう
る。一般に細片の巾は約０．２mmより狭くなく、約２cm
より広くなく、一般に約５〜２０mm、好ましくは約５〜
１５mmである。複数の個々の細片が使用しうる。細片の
代りに、円筒、例えば棒を使用してもよい。

免疫吸着域の長さは、望ましくは巾の少くとも約２〜１
０倍、普通少くとも約２mm、更に普通には少くとも１０
mm、好ましくは少くとも約２３mm及び高々約１２cm、普
通高々約１０cm、好ましくは約５〜１０cmである。横切
る距離は、分析に必要とされる時間の因子であり、これ
を分析に必要な時間に影響する他の因子と一緒に考慮す
る。

信号発生系の員である他の試薬は、用いる工程手順及び
その信号発生における役割に依存して広い範囲に亘って
濃度を変えることができる。標識されたmip及び被検体
間の「真の」競争的状態において、普通標識されたmip
は、問題の被検体の最高濃度の１０倍を越えないであろ
うし、最小濃度の約０．５倍より少なくないであろう。
多くの他の状態において、mip複合体の生成に含まれる
他の試薬の量は被検体の結合当量より実質的に少ない量
で或いは被検体の結合当量より実質的な過剰量で存在し
うる。それ故に、単純な関係を与えることができない。

分析を行なう場合、工程手順は通常試料を溶出溶媒に溶
解することを含む。試料は多種類の起源、例えば生理学
的液体、例えば血液、血清、血漿、尿、目のレンズの体
液、髄液など、化学工程流、食品、殺虫剤、汚染物など
に由来しうる。

次いでクロマトグラフの一端を、普通緩衝された水性媒
体であって、信号発生系の１種又はそれ以上の員を含有
していてよい溶出試料を含む溶媒と接触させる。信号発
生系の員が存在する場合、少くとも１つの員はmipに共
役してmip−標識共役体を与えるであろう。

溶媒の前端が免疫吸着域を完全に横切るのに十分な時間
が必要であろう。この域は十分なmipを有していて、被
検体のすべてが該域において結合したmipを消費するこ
となしに該域で結合するようになることを保証する。

標識されたmipは３つの異なる方法で使用しうる。この
方法の２つは標識されたmipを溶出溶媒中に存在させる
ものであり、第３の方法は試料の溶出後に使用される試
薬溶液中に標識されたmipを存在させることを含む。溶
出溶媒を含む２つの方法は、mip標識が被検体と並流的
に免疫吸着域を横切って存在する結合点に対して被検体
と実際に競合する、或いはmip標識が見かけの競争を示
さずに、主に被検体が結合する域を越えたすぐの域に結
合しているものである。１つの場合には試料含有の溶媒
と免疫クロマトグラフとの最初の接触線から延びる域を
得、一方他の場合には被検体が結合する域と被検体の存
在しない域との間を区別する境界が生成する。

第３の方法では、抗原被検体の場合、試料と最初に接触
させ、試料が免疫吸着域を横切らせるために免疫吸着域
を抗原に結合する試料含有の標識されたmip中に浸すこ
とを含む。この分析法は慣用的にサンドウィッチ分析と
言われる。勿論付着体を含む場合には、付着体被検体及
びポリ配位体の双方に共通な決定点を複数で与えるため
に、固定された量のポリ配位体を与えることができ、即
ち配位体を中心核に重合させる又は共役させることがで
きる。効果的には合成抗原の移動の程度が試料中の被検
体の量に関連するような抗原を与える。免疫クロマトグ
ラフを、例えば浸漬、噴霧などにより実質的に均一に標
識されたmipを含む溶液と接触させる場合、標識されたm
ipは抗原の存在する決定点に結合し、試料中の被検体の
量に関連する領域を限定する検知できる信号を発生す
る。

２つの抗体間の橋かけとして役立つ抗原を用いるよりも
むしろ、１つのmipを免疫クロマトグラフに対して補足
的mipと共に溶液で使用することができる。被検体を免
疫吸着域を横切らせた後、免疫吸着域を浸漬、噴霧など
により実質的に均一に標識されたmipの溶液と接触させ
る。標識されたmipは免疫吸着域に結合したmipに対する
補体であり、標識されたmipは被検体のない免疫吸着域
における領域を限定する存在する結合点に結合する。こ
の場合被検体が移動する距離は被検体を含む領域におい
て観察しうる信号がないことで示され、境界は被検体を
含まない領域における信号の存在で明示される。

用いる工程手順に依存して、洗浄は有用であり又は望ま
しく、或いは全然行なわなくてよい。本発明は洗浄工程
を行なわないことが可能である。好適な工程手順はオペ
レーターの誤差の可能性を最小にした最小操作数の方法
を与える。それ故に工夫された工程手順は、結果が測定
誤差によるような測定段階を最小にすべきである。

免疫クロマトグラフが、条件の変化が被検体の移動距離
を変えうる程度まで標準化されていない場合には、被検
体を公知の量で有する標準的な試料を与えることができ
る。被検体試料及び標準試料を同時に展開させ、両試料
間で定量的な比較を行なうとよい。必要ならば１種以上
の標準試料を用い、移動距離を異なる濃度に対してグラ
フにし、用いた試料の定量に用いてもよい。

多くの場合、免疫クロマトグラフは短時間で済む。普通
試料の免疫吸着域を通る横切りは、少くとも３０秒で、
高々１時間以内に、更に普通には約１〜３０分で起こる
であろう。信号の発生は、一般に３０秒から３０分ま
で、更に普通には約３０秒から５分までの範囲で起こ
る。

信号発生系は少くとも１つの酵素を有し、信号発生系の
２つ又はそれ以上の他の成分或いは１つ又はそれ以上の
基質を有していてよく、更に補酵素も含有しうる。信号
発生系の員のいずれもが標識として用いてよく、この時
免疫クロマトグラフ上における標識の存在は標識の区域
における信号の実質的な変化を提供する。それ故に、標
識は酵素又は補酵素を含んでいてよいが、基質を含まな
い。普通標識は酵素である。

標識は基質の酵素ターンオーバー(turnover)によりその
近傍における事象を増巾する。即ち標識として使用され
る信号発生系の員は酵素的信号増巾体として言及される
であろうし、上述の員に限定される。

酵素標識の各々又は組合せは広く変えることができる。
検知しうる信号を発生する生成物は染料、螢光体又は化
学発光体であり、吸光、螢光又は化学発光の肉眼での観
察により或いは吸光、反射、螢光又は化学発光の測定に
用いる分光学的測定により検知できる信号を与える。

多くの場合問題の酵素は酸化還元酵素及び加水分解酵素
であるであろう。興味ある酵素は多くが米国特許第４２
７５１４９号に示されている。酵素の組合せ物の場合、
１つの酵素は無拡散的に免疫クロマトグラフに結合し、
一方他の酵素はmipに共役する。

試料が免疫吸着域を横切った後、標識−mip共役体が試
料と一緒にならなかった場合には、免疫吸着域を、 標識されたmip共役体の溶液と及び標識並びに工程手順
に依存して信号発生系の１つ又はそれ以上の他の員と実
質的に均一に接触させる。

酵素−mip共役体の場合には、免疫吸着域を酵素−mip共
役体及び基質と、随時捕捉剤と一緒に接触させる。この
場合、酵素は１つの基質が他のものの生成物であること
により、mipに結合した酵素と関連した免疫吸着域にお
いて免疫クロマトグラフに結合する。酵素−mip共役体
は普通緩衝された水溶液中に存在するであろうし、存在
する結合点の実質的な過剰量で存在していてよい。この
ときpH範囲及び緩衝剤は予じめ考慮されている。酵素−
mip共役体が配位体又は受体のいずれかに結合する及び
色が発現するのに十分な時間の後、溶液から免疫クロマ
トグラフを取り出す。

２種の酵素を含むことにより、酵素−mip共役体及び基
質が免疫吸着域との接触に先立つ反応なしに同一の溶液
中で一緒にできるから工程手順の工程が省略される。

酵素−mip共役体が試料中に存在することによって免疫
クロマトグラフに結合した後、免疫クロマトグラフを基
質溶液中に浸すことによって発色させる。この場合、酵
素は免疫クロマトグラフに結合していても、いなくても
よい。

酵素標識を用いる場合、現像剤溶液は普通１種又はそれ
以上の酵素を含有して補酵素及び基質を再生するであろ
う。酵素的反応は補酵素を必要とするから、酵素及び基
質は免疫吸着域と接触する前のいずれの反応もなく単一
の現像剤試薬として組合せることができる。

基質は酵素と共に変化するであろうし、通常律速にさせ
ないために実質的な過剰量で（Ｋｍより大濃度で）存在
する。水溶液は普通酵素系に対して適当に緩衝され、他
の酵素の基質である酵素の生成物に対する捕捉剤、例え
ばウリケース(uricase)からの過酸化水素に対するカタ
ラーゼを含有しうる。

被検体が結合した免疫吸着域の領域を限定するために、
十分に検知しうる信号発生化合物を生成するのに十分な
期間、免疫クロマトグラフを現像剤溶液と接触させる。
検知しうる信号が発生すると、クロマトグラフの１端か
らの距離が試料中の被検体の量の定量的尺度として測定
できる。

境界においていくらかのゆがみが観察できるけれど、殆
んどの場合に境界は理にかなって良く限定され、μｇ〜
pg範囲の２つ又はそれ以下の因子の濃度変化が多種類の
被検体で検知することができる。即ち適当な染料前駆体
を基質として用いることにより、被検体の量は１回の測
定（試料）での肉眼観察によって及び妨害に対して比較
的鈍感な２段操作によって定量的に決定しうる。

物質 本免疫クロマトグラフィー法において用いる成分は、吸
収性支持体、mip共役体（mip及び標識を含む）、免疫吸
着域において吸収性支持体に結合したmip、信号発生系
の残りの員、被検体、及び適当なものとしてポリ配位体
又は多価受体である。

被検体 本発明の配位体被検体はモノエピトピック又はポリエピ
トピックであることが特色であり、一方受体被検体は単
一の又は複数の結合点で有しうる。ポリエピトピック被
検体は通常ポリ（アミノ酸）、即ちポリペプチド及び蛋
白質、多糖類、核酸及びこれらの組合せ物である。その
ような組合せ物又は合体物はバクテリヤ、ウイルス、ク
ロモゾーム、遺伝子、ミトコンドリヤ、核、細胞膜など
を含む。

多くの場合、本発明で用いるポリエピトピック配位体被
検体は、少くとも約５０００、又は普通少くとも約１０
０００の分子量を有するであろう。ポリ（アミノ酸）の
範ちゅうにおいて、興味あるポリ（アミノ酸）は一般に
分子量約５０００〜５００００００、更に普通には約２
００００〜１００００００のものであり、興味あるホル
モンは分子量約５０００〜６００００のものである。

有用な配位体の莫大な列挙は米国特許第４２７５１４９
号欄１２〜１７に見出すことができ、この開示は本明細
書に参考文献として引用される。

モノエピトピック配位体被検体は、一般に分子量が約１
００〜２０００、更に普通には約１２５〜１０００であ
る。興味ある被検体は薬剤、代謝物、殺虫剤、汚染物な
どを含む。

多数の被検体は、開示が本明細書に参考文献として引用
される米国特許第４２７５１４９号欄１７及び１８に列
挙されている。

受体被検体の場合、分子量は一般に約１０⁴〜２×１
０⁸、更に普通には約３×１０⁴〜２×１０⁶の範囲であ
る。免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及
びＩｇＭの場合、分子量は一般に約１６００００〜約１
０⁶で変化するであろう。酵素は普通約１００００〜６
０００００ダルトンで変化する。天然の受体は広く変化
し、一般に分子量が少くとも２５０００であり、１０⁶
及びそれ以上であってよく、アビジン(avidin)、チロキ
シン結合グロブリン、チロキシン結合プレアルブミン、
トランスコーチン、膜表面蛋白質などを含む。

配位体が他の分子又は支持体に共役する場合には、配位
体はしばしば改変されて特別な官能基を特別な点に有す
るであろう。この改変は配位体同族体と呼ばれる生成物
を生成する。米国特許第４２７９１４９号は欄１８及び
１９に配位体の莫大な記述を含んでいる。この記述は本
明細書に参考文献として引用される。

免疫クロマトグラフ 免疫クロマトグラフは、キャピラリーを通して液体を移
動させる吸収性支持体、無拡散的に結合したmip、及び
更に信号発生系の１種又はそれ以上の員を含むことがで
きる。

異なった寸法、特に厚さ、異なった材質及び異なった形
態の多様の支持体が使用しうる。多くの場合、形態は長
い、簡便には長方形の細片である。細片の少くとも１部
分は細片に均一に結合したmipを有するであろう。細片
の寸法はある程度まで取り扱いの簡便さによって支配さ
れる。また免疫吸着域は被検体の興味ある濃度範囲にお
いて存在しうる被検体のすべてを保有しうるに十分な寸
法のものでなければならない。工程手順が被検体及び標
識されたmipの双方の結合を含む場合、免疫吸着域は被
検体及び標識されたmipの双方に対して能力を有さねば
ならない。

天然及び合成重合体材料、特にセルロース材料、例えば
繊維を含む紙例えば紙、クロマトグラフィー用の紙な
ど、合成又は改変天然産重合体、例えばポリ（塩化ビニ
ル）、架橋デキストラン、アクリレートなどを含み、そ
れ自体で或いはセラミック材料例えばシリカと組合せて
使用される種々の吸収性支持体が使用できる。

免疫クロマトグラフの吸収性支持体の厚さは一般に約
０．０５〜約２mm、更に普通には約０．１〜０．５mm、
好ましくは約０．２〜約０．４mmで変わるであろう。紙
の構造は広く変えることができ、細かい中位に細かい、
中程度の、中位に粗い及び粗い構造であってよい。表面
は平滑及び粗雑の、硬質及び軟質との種々の組合せによ
り広く変えることができる。

免疫クロマトグラフは種々の不活性な支持体、例えばマ
イラー(Myiar)、ポリスチレン、ポリエチレンなどによ
って支持されていてよい。この支持体は免疫クロマトグ
ラフの機械的合体性を高めるために免疫クロマトグラフ
から空間を置いた裏材、端材又は他の構造材として使用
できる。

免疫クロマトグラフは性質を高めるために多様の材料で
コーティングすることができる。このコーティング材は
特に支持体に共役した物質の安定性を高めるために使用
される蛋白質コーティング、多糖類コーティング、砂糖
などを含んでいてよい。これらの化合物は免疫クロマト
グラフに結合される物質、例えばmip又は信号発生系員
の結合を改善するためにも使用しうる。

免疫クロマトグラフは反応性官能基で活性化して、支持
体に共役すべき有機物質を共有結合させることができ
る。免疫クロマトグラフの吸収性支持体を活性化するた
めに使用しうる種々の技法は、アシル基例えばカルボニ
ルジイミダゾールでの官能基化、シアノゲンブロマイド
又は２官能性剤例えばグルタルアルデヒド、コハク酸で
の処理などを含む。いろいろな物質の吸収性支持体への
結合法は文献に見出すことができる。参照例えば米国特
許第４１６８１４６号。

支持体に結合するmipの量は、支持体の寸法及び被検体
のすべてと必要に応じて標識されたmipを結合するため
に必要とされる量に依存して変化しよう。一般にmipの
量は約１０^-5〜１０^-14モル／cm²、更に普通には約１０
^-7〜１０^-12のモル／cm²の範囲にある。単位面積当りの
モル数は、被検体の横切る距離に対して興味ある濃度範
囲を十分に区別することを保証するために変化させられ
るであろう。

好適な具体例において、信号発生系員は吸収性支持体に
無拡散的に結合する。特に酵素は標識されたmipと相互
作用するであろう支持体に結合し、一方標識は他の酵素
である。酵素の関係は信号発生系の記述において論議さ
れよう。

mip及び信号発生系員の双方は共有結合よりもむしろ吸
着によって種々の支持体に結合していてよい。これは吸
収性支持体を、mip及び／又は信号発生員を含む溶液と
接触させ、免疫クロマトグラフを溶液から取り出し、そ
して免疫クロマトグラフを乾燥させることを含む。他に
溶液を噴霧、塗布、又は均一性を与える他の技法で適用
してもよい。

一般に、比較的大きいシートを用い、次いでこれを適当
な寸法に切断する。

信号発生系 信号発生系は多くの場合に電磁照射、特に紫外線及び可
視域、更に特に約４００〜８００nmの波長を有する照射
の吸収及び発光を含めて検知しうる信号の発生を含む。
免疫クロマトグラフの性質上、検知しうる信号を有する
ためには、単位面積当りに十分な濃度の標識が存在する
ことが必要である。それ故に、多くの場合個々の標識は
所望の感度を与えるのに十分でないであろう。その程度
まで単一の標識されたmipと関連した複数の検知しうる
分子を発生させる手段と与えなければならない。但しこ
の場合、そのような発生のための手段を与える標識は、
標識されたmipが免疫吸着域を横切る時に標識されたmip
の移動を妨害してはならない。それ故に、検知しうる分
子を多数生成する標識例えば酵素又は補酵素を使用す
る。次いで信号標識の存在によって増巾を得る。

光を吸収する生成物、例えば染料を生成することによっ
て所望の増巾を与え、或いは照射時又は化学反応時に光
を放射する、例えば螢光体又は化学発光体を与える酵素
又は補酵素は使用される。そのような生成物を与える多
くの酵素又は補酵素は、本明細書に参考文献として引用
される米国特許第４２７５１４９号の第１９〜２３欄及
び米国特許第４３１８９８０号の第１０〜１４欄に示さ
れている。

特に興味あるものは、１つの酵素の生成物が他の酵素の
基質であることによって関係づけられている酵素の組合
せ物を用いることである。この方法では非特異的干渉が
実質的に減ぜられ、結合した被検体を含む及び被検体を
含まない域間の境界が更に効果的に明示される。

本発明において使用することのできる多くの酵素組合せ
物は米国特許第４２７５１４９号の第２３欄から第２８
欄にかけて示されている。この開示は本明細書に参考文
献として引用される。

特に興味あるものは、過酸化水素の生成と過酸化水素を
用いての染料前駆体の染料への酸化とを含む酵素であ
る。特別な組合せは、サッカライド・オキシダーゼ例え
ばグルコース及びガラクトースオキシダーゼ又は複素環
オキシダーゼ例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダ
ーゼと過酸化水素を用いて染料前駆体を酸化する酸素例
えばペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ及びチ
トクロームＣオキシダーゼの組合せを含む。この酸化還
元酵素の組合せは好適であるけれど、他の酵素例えば加
水分解酵素、転移酵素、及び上述以外の酸化還元酵素も
使用できる。

使用しうる補酵素は、ＮＡＤ（Ｈ）、ＮＡＤＰ（Ｈ）、
ピンディキサルホスフェート、ＦＡＤ（Ｈ）、ＦＭＮ
（Ｈ）など、普通酸化還元酵素と組合せられる補酵素を
含む。反応をサイクルすることを含む多くの補酵素に対
しては、特に米国特許第４３１８９８０号を参照のこ
と。

酵素反応の生成物は普通染料又は螢光体であろう。螢光
体の多くの例は、本明細書に参考文献として引用される
米国特許第４２７５１４９号の第３０及び第３１欄に示
されている。

適当な操作又は標識−mip共役体、受体、吸収性支持体
及び分析に用いる条件の選択により、被検体及び酵素−
mipを同一溶液で免疫クロマトグラフに適用する場合、
本発明の２つの異なる具体例が達成できる。１つの具体
例において、被検体の横切る免疫吸着域の領域は、被検
体が存在する領域に亘って検知しうる信号が実質的に均
一に生成するために観察しうる。１つの具体例におい
て、検知しうるシグナルは、被検体の占有した免疫吸着
域中の領域と関連した境界において主に観察しうる。

異なる結果は、被検体と比べての標識−mip共役体の異
なる結合定数、移動速度、吸着などと関係するかも知れ
ない。変化は、標識に結合したmip、特に付着性の被検
体の数を変えることにより、吸収性支持体に結合する受
体の結合特異性を、例えば付着性被検体及び抗原間に１
つの連結基を有して且つ標識−付着性被検体共役体との
異なる連結基を用いて抗体をイミュノジェンに対して準
備することによって変えることにより、Ｒｆ因子を変え
るために溶媒及び／又は支持体を変えることにより、或
いはその他の技術により達成することができる。

１つの酵素を標識として含む信号発生系に２つの酵素を
用いる結果として、単純化された工程手順が使用でき、
また強い検知しうる信号が得られ、被検体の前進する先
端を正確に描写する。更に、検知しうる信号発生化合物
を表面に迅速に付着させるために、基質の濃度を局所的
に高くして酵素を免疫クロマトグラフに結合させる。

キット 簡便化のために、免疫クロマトグラフを他の試薬と組合
せて被検体に対する分析に使用することができる。２つ
の酵素を含む場合、他の試薬は、酵素で標識されたmi
p、支持体に結合する酵素に対しての基質、いずれか他
の基質及び酵素によって必要とされる共因子及び検知し
うる発色体又は発螢光体を与える染料前駆体を含むであ
ろう。補酵素標識を用いる場合には、補酵素で標識され
たmgs、染料前駆体を含む適当な酵素が包含されよう。
更に他の添加剤例えば安定剤、緩衝剤なども含まれてい
てよい。種々の試薬の相対量は、分析の感度を実質的に
最適化する試薬の溶液中での濃度を与えるために広く変
えることができる。特に、試薬は溶解した時に試料と一
緒にするのに適当な濃度を有する試薬溶液を与える賦形
剤を含んだ、普通凍結乾燥した乾燥粉末として提供する
ことができる。

実験 次の実施例は例示であって、本発明を限定するものでは
ない。

以下次の略号を使用する：ＨＲＰ−西洋ワサビのペルオ
キシダーゼ；ＮＨＳ−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド；Ｅ
ＤＣＡ−エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミ
ド；ＤＭＦ−ジメチルホルムアミド；ＢＳＡ−牛の血清
アルブミン。温度は断らない限りセッ氏とし、部は重量
による、但し液体の混合物は容量によるものとする。

実施例１．免疫クロマトグラフの製造 セオフィリンに対する抗体（抗セオフィリン）及びグル
コースオキシダーゼは共役させるべき物質である。約５
５０cm²のWhatman３１Ｅｔのシートを、カルボニルジイ
ミダゾール中０．２Ｍピリジン１．８１に浸し、混合物
を室温で１時間穏やかに撹拌する。他のシートも同一の
活性化溶液で活性化することができる。次いで各シート
をテトラヒドロフラン３００mlで洗浄し、空気ガンによ
り約２０秒に亘って空気乾燥する。次いでシートを、抗
セオフィリンの４９mg／mlの溶液５００μｌ、グルコー
スオキシダーゼアミンの１６mg／mlの溶液７９０．５μ
ｌ及び０．１Ｍ燐酸ナトリウム、pH、０．２ＭＮａＣｌ
緩衝剤２００mlの溶液中に浸し、混合物を室温で４時間
穏やか振とうする。燐塩緩衝剤で洗浄した後、溶液を保
存剤として役立つ４％水性DextranT１０溶液中に浸し、
シートを吸い取り、凍結乾燥する。

実施例２．セオフィリン及びＮＲＰの共役 反応フラスコ中に１−メチル−３−（３′−カルボキシ
プロピル）キサンチン８．１mg、ＮＨＳ３．８mg、ＥＤ
ＡＣ６．７mg及びＤＭＦ１２５μｌを導入し、混合物を
夜通し室温で放置した。

０．１Ｍ炭酸ナトリウム中ＨＲＰ−オキシアミン（１m
g）の、pH９．０の１．３mlの試料４つに、上で調製し
たエステルをいろいろな量で添加し、セオフィリンとＨ
ＲＰのモル比を４００、２００、１００及び１００にし
た調製物を製造した。第１の反応混合物（モル比４０
０）に、約２時間に亘ってＤＭＦ０．２１７mlと上記エ
ステル６６μｌを８．２５μｌずつで添加した。第２の
反応混合物（モル比２００）に、ＤＭＦ０．２３８mlを
添加し、エステル３３μｌを８．２５μｌずつで添加し
た。第３の反応混合物（モル比１００モル）に、ＤＭＦ
０．２４mlを添加し、エステル１６．５μｌを８．２μ
ｌずつで添加した。一方最後の反応混合物（モル比１０
０）にはＤＭＦを添加せず、エステル８．２５μｌを
２．１μｌずつ添加した。添加中、温度を４℃に保ち、
次いで混合物を夜通し４℃で放置した。

次いで反応混合物の標準緩衝液を用いるＧ−２５ファデ
ックスでのクロマトグラフィーにより処理した。Folin
及びＵＶ分光分析はそれぞれ６．９、４．０、１．６及
び２．１のセオフィリン／ＨＲＰ比を示した。

実施例３．グルコースオキシダーゼアミン製造 グルコースオキシダーゼ(Sigma,Ｅ．Ｃ．１．１．３．
４）を、３０psi以下の圧力でAmiconＰＭ１０の膜を用
いることにより３６０mlから６０mlまで濃縮した。この
グルコースオキシダーゼ濃縮物を４℃の水４１に対して
２回透析し、過した。これは分光学的に３２mg／mlの
濃縮を有した。グルコースオキシダーゼ溶液５１．５ml
に０．２Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム５．１５mlを滴々に添
加した。反応は２５分間に亘って起こった。生成物をpH
４．５の２ｍＭ酢酸ナトリウムを用いるSephadexＧ−５
０の２．５×６０cmのカラムクロマトグラフィーで処理
した。この溶液に、pH９．５の０．２Ｍ炭酸ナトリウム
中３Ｍエチエンジアミン６mlを滴々に添加し、反応を３
時間進行させた。次いでこの混合物に１０mg／mlの水素
化ホウ素ナトリウム約３．９mlを添加し、混合物を夜通
し保温し、クロマトグラフィーにより水素化ホウ素ナト
リウムを除去した。

実施例４．ＨＲＰ−オキシアミンの製造 pH４．５の緩衝剤５ｍＭ酢酸ナトリウム中１０ｍ／mlの
西洋ワサビのペルオキシダーゼ５mlに０．２Ｍの過ヨウ
素酸ナトリウム５０mlを添加し、混合物を３０分間撹拌
し、次いでＧ−５０Gephadexカラムでのクロマトグラフ
ィーによりpH４．５の２ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝剤で流
出させた。蛋白質画分を２９mlまで集め、混合物を４℃
まで冷却し、pH９．５の０．５Ｍ炭酸塩緩衝液中０．２
Ｍ２．２′−オキシ−ビス−エチルアミン２．９mlを４
℃で添加した。混合物のpHをＩＮ水酸化ナトリウムで
９．５に調節し、２時間撹拌し、４mg／mlの水素化ホウ
素ナトリウム−水３．５２mlを添加し、混合物を３時間
反応させ、SephadexＧ−５０のカラムを用いるクロマト
グラフィーで処理した。

ＨＲＰ４００mg及び２，２′−オキシ−ビス−エチルア
ミン３．５ｇを用いて上記工程を繰返した。元々のアミ
ン及び約４つの更なるアミン基を有する改変アミン基間
において酵素活性のかなりの変化は認められなかった。

分析を行なう場合、実施例１で調製したシートから９０
×８mmの細片を準備し、この細片の端を０．１ＭＮａＰ
Ｏ₄、０．２ＭＮａＣｌ、pH７．０及びＢＳＡ１mg／ml
中試料１mlに浸した。この時異なる量のセオフィリンを
含有し且つ０．２％TritonＤＮ−６５を含有するある数
の試料を使用した。１２分後、細片を０．２μｇ／mlの
ＨＲＰ−セオフィリン共役体５mlに浸し、溶液中に浸漬
して１０分間放置した。次いで酵素溶液から細片を取り
出し、５０ｍＭグルコース２００μｇ／mlの４−クロル
−１−ナフトールの５mlを含んでなる現像溶液に浸し、
２０分間放置した。中心の最上からの境界の距離を、異
なるセオフィリン濃度の試料に対してグラフに書き次の
結果を得た。

次の試験では、実施例１の方法を繰返した。用いた細片
は寸法が６５×８mmであった。用いた工程手順は、細片
の端をＨＲＰ−セオフィリン共役体０．４μｇ／mlを含
有する溶液０．５μｌ中に浸すことであった。この場
合、異なる試料はセオフィリンをいろいろな濃度で有
し、各試料は０．２％TrifonＤＮ−６５を含有した。細
片は試料溶液中に６分間放置した。この時間の終りに、
細片をグルコース−（４−クロル−１−ナフトール）現
像剤溶液中に浸漬し、次の結果を得た。

次の実施例において、用いた紙はs.s.５８９ＷＨであ
り、４％デキストランＴ１０溶液を保存剤として使用し
た。試料溶液は、前述した緩衝剤中に種々の量のセオフ
ィリン、酵素当り平均約３つのセオフィリンを有するセ
オフィリン−ＨＲＰ共役体０．４μｇ／ml、０．１％Tr
ifonＸ−１００を含有する０．５mlであった。試料溶液
が免疫クロマトグラフを横切った後、この免疫クロマト
グラフを、前述した現像剤溶液で１０分間現像した。現
像した色の殆んどは境界において狭い帯であったことを
特に記しておく。次の表は結果を示す。

上述の結果からは、感度の良い簡単な方法が多種類の被
検体を定量的に決定することは明らかである。工程手順
は非特異的干渉を特に含まず、誤差をもたらす試剤の複
数の測定を回避し、そして高価な測定装置を必要とする
ことなく肉眼で結果を与えることができる。更に、分析
は迅速であり、従って患者が病院に滞在している時間内
に結果を得ることができる。また工程手順は中間での洗
浄操作を必要とせず、これは比較的熟練してない者が分
析を行なう場合に特に重要である。洗浄工程は必要な場
合実質的な誤差源となる。

本発明は例示の目的でいくらか詳細に及び理解を明確に
する目的で実施例により記述してきたけれど、ある変化
及び改変が特許請求の範囲内で行ないうることは明らか
であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭51−101122（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−92218（ＪＰ，Ａ)

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（Ａ）溶媒の移動が可能な多孔質支持体及
   び複数の特異的結合対員(mip)及び第２の酵素を有し、
   ここに該mip及び第２の酵素は該支持体に拡散不可能に
   及び均一に結合し且つ該支持体の第１端から一定距離ま
   で拡がった免疫吸着域を形成している、免疫クロマトグ
   ラフ；及び （Ｂ）第１の酵素で標識されたmip、ここにこの標識さ
   れたmipは、被検体が該試料中に存在する被検体の量に
   関連した境界を示すように結合する該免疫吸着域の一定
   部分に関連して該免疫吸着域に結合するように選択さ
   れ、その第１の酵素は該境界を示す検知し得る電磁放射
   信号を発生する、信号発生系の一部をなす酵素であり、
   該第１及び第２の酵素は一方の基質が他方の生成物の関
   係にある、 を用いることにより、該試料中の被検体の存在を決定す
   る方法であって、 該免疫クロマトグラフを、（１）該第１端において、溶
   媒の少くとも１部分が該免疫吸着域を移動するのに充分
   な期間、試料を含む該溶媒と；及び（２）標識されたmi
   pを含む溶媒と接触させ、その際該標識されたmipは該免
   疫吸着域において結合した被検体と関連して該免疫吸着
   域に結合し、段階（１）と（２）は同時的又は連続的で
   ある；及び 該免疫吸着域を該信号発生系の残りの員と接触させるこ
   とにより、該信号発生系を介して該標識mipによって示
   される境界を決定し、ここに境界の位置は該試料中に存
   在する被検体の量に関連している、 ことを特徴とする方法。
2. 【請求項２】少くとも１つの酵素が酸化還元酵素である
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】該標識されたmip及び該試料が同一溶媒中
   に包含されている特許請求の範囲第１又は、２項のいず
   れかに記載の方法。
4. 【請求項４】該標識されたmipが該被検体よりも遅い速
   度で該免疫吸着域を移動し、被検体を含む領域及び被検
   体を含まない領域間の境界の回りにおいて濃度が高くな
   る特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. 【請求項５】該決定が、電磁放射によって検知しうる生
   成物に酵素的に転化される酵素基質を含む溶液中に該免
   疫吸着域を浸すことを包含する特許請求の範囲第３項記
   載の方法。
6. 【請求項６】該生成物が可視光領域の光を吸収する特許
   請求の範囲第５項記載の方法。