JPH0614047B2 - 凝集反応試薬及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は凝集反応試薬及びその製造方法に関する。この
試薬は免疫及び診断分析操作に於て有用である。

〔先行技術〕

抗原−抗体反応は、全ての免疫学的試験方法の基礎であ
る。抗体として知られている或蛋白質は、抗原、即ち他
の蛋白質又は炭水化物である異質の物質の存在に反応
（response）して、哺乳動物により産出される。この異
質物質に対する正常生体反応（normal body response）
は、種々の疾病、疾患及び生理学的障害を診断するため
に使用される多くの技術の開発を導いた。一般的な意味
で、抗体−抗原反応の一つの成分は、免疫反応性種とし
て定義され、一方それと錯体化する対応する成分は、レ
セプターと考えられる。

予想される蛋白質の存在のためのインビトロ試験に於
て、生物学的試料中の抗原又は抗体は、該生物学的試料
に免疫学的対部分を添加することによって運び出され
る。もし予想される物質が存在するならば、その結果で
ある抗原−抗体反応は、抗原−抗体錯体の沈澱によって
示される。この反応錯体は、一般的に肉眼で検出するこ
とは困難である。この理由のために、抗体又は抗原の何
れかはしばしば不溶性粒子、例えば、ポリマーラテック
ス粒子に結合し、そうして、錯体が生成したとき、それ
は凝集物の存在を観察するか、又は該粒子に付随する検
出し得るトレーサーによって、結果としての凝集反応か
ら容易に検出できる。次いで凝集反応は、粒子の懸濁物
から粒子の凝集物により特徴付けられる。公知の凝集反
応方法の更に詳細なことは、米国特許第4,419,453号及
び同第4,459,361号に開示されている。

種々の検体のために分析される生物学的試料には、免疫
反応性種と対応するレセプターとの非特異的反応（又は
相互作用）を起こす物質が含まれている。これらの非特
異的反応は、偽の陽性を示すか又は高いバックグランド
を与えることによって分析結果に望ましくない影響を与
え、そのために真の陽性結果を検出することが困難であ
る。更に、免疫反応性種又はレセプターが結合するポリ
マー粒子は、表面電荷のために互いに相互作用する。更
に、該粒子に結合した種又はレセプターも同様に互いに
相互作用し、望ましくない凝集反応と不正確な結果を引
き起こす。

〔発明が解決すべき課題〕

分析pHの調節及び結合した蛋白質を変性するための物質
の添加を含む種々の方法が、非特異的反応を減少するた
めに提案されている。このような一つの方法は、米国特
許第4,591,571号に記載されている。この文献には、キ
ャリアー粒子に吸着された抗体を有する凝集反応試薬が
記載されている。結合に先立って、該抗体はアシル化剤
によって化学的に変性されている。このような処理は非
特異的反応を減少すると言われる。

免疫反応性種が、米国特許第4,591,571号の教示を使用
して、即ちビーズに結合させる前にスクシニル化によっ
て抗体を変性することによって製造されるとき、シグナ
ルは得られなかった（下記例６参照）。

〔課題を解決するための手段〕

先行技術の試薬及び方法に伴う上記問題点は、免疫反応
性種をポリマー粒子に共有結合せしめ、そして、結合し
た反応性種の遊離の第一及び第二アミノ基をアシル化
剤、アルキル化剤はスルホニル化剤によって化学的に変
性することからなる凝集反応試薬の製造方法によって克
服される。

本発明に係る凝集反応試薬は、ポリマー粒子に共有結合
で結合された免疫反応性種を含んで成り、この結合され
た免疫反応性種の有する遊離の第一及び第二アミノ基
が、前記免疫反応性種が前記ポリマー粒子に共有結合さ
れた後に、アシル化剤、アルキル化剤又はスルホニル化
剤によって化学的に変性されている。

〔実施態様〕 本発明は、非常に短時間、即ち10分間未満で、複雑な装
置を使用することなく、実施することができる、免疫反
応性種（単一又は多価）のための診断検査で有用な凝集
反応試薬を提供する。これは、診療所又は家庭で検査を
行なうことを許容し、医師又は家庭のユーザーが検査の
結果を非常に速く知ることを可能にする。この検査は、
咽喉からのスワブ標本、尿標本又は他の水性液体の試料
のような生物学的試料中の種の存在を検出する。このよ
うな生物学的試料は、望ましくない残骸（debris）又は
干渉物（interferents）を除くための前処理（例えば、
瀘過）をしたり又はすること無しに検査できる。

本発明の試薬は、広範囲の種々の免疫反応性種のあらゆ
るものを検出及び定量するために使用できる。定義の目
的で、測定すべき免疫反応性種は、本明細書中でリガン
ドと定義する。このようなリガンドは、一般に、蛋白
質、医薬、ステロイド、糖蛋白質、糖脂質、炭水化物又
は対応するレセプター、例えば抗原のための対応する抗
体と錯体化するための１個又は２個以上のサイトを有す
る関連の他の生物学的又は化学的化合物である。また、
リガンドは対応する抗原又は抗体と反応性の１個又は２
個以上の錯体化サイトを有する抗体とすることができ
る。本発明の試薬によって検出できるリガンドには、ス
トレプトコッカス（Strepto occus）Ａ抗原、クラミジ
ル及び淋菌有機体からの抗原、ＨＴＬＶ又はＨＩＶ（ヒ
ト免疫欠如症ビールス）又はそれらへ向けられる抗体の
ようなレトロビールスからの抗原、ヒト絨毛性性線刺激
ホルモン、ロイチナイズ化（leutinizing）ホルモン
（ＬＨ）、ヘルペスビールス、医薬、抗生物質並びに他
のホルモン性、殺菌性、又はビールス性抗体及び抗原が
含まれるが、これらに限定されるものではない。ある例
に於て、リガンドは生物学的標本中に見出される有機体
又はビールスから抽出しなければならない。他の例に於
て、リガンドは反応性形態中に既にあり、分析の前に抽
出操作を必要としない。与えられたリガンドのための抽
出方法は、当業者に公知である。ストレプトコッカスＡ
抗原のための典型的抽出方法を、下記に記載する。更に
他の例で、リガンドは抽出工程無しに有機体又はビール
スの一部として検出できる。

好ましくは、該試薬は次の実施態様及び下記例１に示さ
れるように、ストレプトコッカスＡ抗原を検出するため
に使用される。ストレプトコッカスＡ抗原に関する本発
明のこの態様は、例示する目的で示されるものである
が、本発明の範囲をそのように限定するものでないと理
解されるであろう。抗原を含有すると考えられる生物学
的試料は、あらゆる適当な手段で患者から集めることが
できる。続いて、もし必要ならば、抗原は適当な方法で
有機体から抽出される。好ましい抽出方法には、スワブ
を単独又は組合せで試料中の有機体、標本細胞及び他の
組織片からストレプトコッカスＡ抗原を放出する１種又
は２種以上の試薬を含む適当な抽出組成物中に浸漬する
ことが含まれる。

ストレプトコッカスＡ抗原のための当該技術で公知の有
用な抽出組成物には、ヨーロッパ特許公報第150,567号
に記載されたような、亜硝酸塩と氷酢酸の混合物、及び
米国特許第4,618,576号に記載されたような細菌ストレ
プトマイセスアルブス（Streptomyces albus）から誘導
された酵素が含まれる。好ましい抽出組成物は、亜硝酸
塩（例えば、亜硝酸ナトリウム又は亜硝酸カリウム）と
有機酸（例えば、琥珀酸マロン酸、またはクエン酸）と
の、結合物質を含むか又は含まない混合物である。

リガンド、例えばストレプトコッカスＡ抗原の存在は、
粒子に共有結合で結合している他の免疫反応性種（リガ
ンドのためのレセプターである）を有する水不溶性キャ
リアー粒子からなる本発明の凝集反応を使用して検出さ
れる。リガンドとレセプターとの間の反応（又は免疫化
学的結合）は、次いで粒子同士が結合する結果となり、
それらは凝集し、懸濁液から沈澱する。この凝集反応
は、粒子に付随するトレーサー物質を使用して適当に検
出できる。

試薬に於て有用である適当な粒子は、水不溶性で、適当
な方法でそれに共有結合で結合した免疫反応性種を有し
得る天然又は合成の粒子で有り得る。有用なキャリアー
粒子の例には、フェリチン結晶、アガロース（agaros
e）粒子、ガラスビーズ、ラテックス粒子のようなポリ
マー粒子、及び当該技術で公知の免疫反応性種との共有
結合反応のために粒子の表面上に反応性基を有する他の
ものが含まれる。次の文献には代表的な有用な粒子が記
載されている。米国特許第3,700,609号、同第3,853,987
号、同第4,108,972号、同第4,401,765号、同第4,419,45
3号、同第4,459,361号、同第4,478,946号、及び同第4,5
91,571号。本発明に於て有用な粒子は、一般に非常に小
さく、即ち直径が２μｍ未満である。好ましくは、0.1
〜１μｍの平均直径を有する。

該粒子は、その外面に免疫反応性種と共有結合を形成し
得る基を有していなくてはならない。このような基に
は、カルボキシル、アミン、エポキシ、アルデヒド、ハ
ロアルキル、活性化２−置換エチルスルホニル、ビニル
スルホニル、ビニルスルホニルアルキレン及び当該技術
で公知の他のものが含まれるが、これらには限定されな
い。これらの基は、適当な方法で、例えば、製造の間又
は免疫反応性種の結合の直前に、粒子中に導入される。
ハロアルキル、活性化２−置換エチルスルホニル、ビニ
ルスルホニル、及びビニルスルホニルアルキレン基が好
ましい。

特に有用な粒子は、ポリマーラテックス粒子であり、更
に好ましくは、コアーシェルポリマーラテックス粒子と
して当該技術分野で公知のものである。広範囲の種々の
モノマーが、粒子が水不溶性である限りこのような粒子
の製造に使用できる。ポリマー化学に於ける当業者は、
適当なラテックス粒子を設計し製造できる。本発明の実
施で使用される好ましいコアーシェルポリマーラテック
ス粒子は、下記例１及び２に記載されている。これらの
粒子は、スチレン又はトレーサー物質（後記する）に対
し高い親和性を有する他のモノマーのホモ−又はコポリ
マーから成るコアと、免疫反応性種との反応に無関係な
所望の反応性基を有するホモ−又はコポリマーから成る
シェルを有する。

本発明の実施に於て有用な粒子は、好ましくは、凝集体
又は非凝集残留物質中のトレーサーの量からリガンドの
定量的測定をするために、それと一緒になる十分なトレ
ーサー分子を有している。トレーサー分子は、適当には
粒子の外表面に付いているか、又は、好ましくは、粒子
内に分布している。凝集体を検出する如何なるトレーサ
ー物質も使用できる。もし、フェリチン結晶が粒子とし
て使用されるならば、トレーサー分子はそれらの結晶中
に元々ある鉄の分子である。他の天然又は合成粒子は、
トレーサーとしてラジオアイソトープ、比色染料、蛍光
物質、バイオルミネッセンス化合物、化学ルミネッセン
ス化合物、燐光化合物及び当該技術で公知の他の検出し
得る物質を有し得る。好ましくは、トレーサーは、ラジ
オアイソトープ、比色染料又は蛍光物質（例えば、蛍光
染料又は希土類キレート）である。当業者は、適切なト
レーサーを使用させる特定の粒子と組み合わせることが
できる。

一つの実施態様に於て、トレーサーは例えば、米国特許
第4,259,313号に記載されているユーロピウムキレート
のような蛍光希土類キレートである。他の好ましい実施
態様に於て、トレーサーは凝集体中で容易に検出される
比色化合物である。

有用な染料は当該技術で公知である。或染料は、粒子を
製造する時粒子中に導入される。また、染料は、浸出さ
れないような方法で前成形された粒子中に吸収される。

トレーサーは、適当な方法で粒子中に分布される。例え
ば、トレーサーは例えば、米国特許第3,853,987号に示
されているようにして、均一に分布できる。好ましく
は、トレーサー分子は粒子の限定された領域、例えば表
面付近又は内部に優位に位置される。好ましいコアーシ
ェル粒子に於て、トレーサーはコア又はシェルいずれか
にあるが、最も好ましくは、実質的にその全部が粒子の
コアにある。

免疫反応性種（即ち、リガンドと反応性のレセプター分
子）は、公知の方法及び必要ならば試薬を使用する適当
な手段で、粒子の外側表面に共有結合によって結合して
いる。結合した種が抗体であるとき、モノクローナル又
はポリクローナルの何れも使用できる。抗体は、商業的
に入手できるか又は公知技術を使用して製造できる。抗
体全体又はその一部の何れもが使用できる。

結合した免疫反応性種は、もしリガンドが抗体であるな
らば、抗原である。一つのこのような試薬は、ヒトレト
ロビールス抗原に対する検出抗体、例えばＨＴＬＶ−Ｉ
又はＨＩＶ−Ｉ抗原に対する抗体のために有用な凝集反
応試薬である。

結合の後、免疫反応性種は、第一及び第二アミン基を変
性し得る適当な変性剤で化学的に変性される。このよう
な変性剤の例には、アシル化剤、アルキル化剤、及びス
ルホニル化剤が含まれ、それらのあるものは、例えば、
Enzyme-lmmunoassay,Maggio(Ed.),CRC Press,Inc.,Boca
Raton,Florida,1980,pp.72-77に記載されている。

代表的有用なアシル化剤は、米国特許第4,591,571号に
記載されている。好ましいアシル化剤は、ジカルボキシ
ル酸及びポリカルボキシル酸（３個又は４個以上の酸
基）から誘導される無水物、アシルハライド、及びエス
テルから成る群から選択される。無水琥珀酸のような無
水物が最も好ましい。ブロモ酢酸、クロロ酢酸、フルオ
ロニトロベンゼン、ブロモマロン酸、ブロモプロピオン
酸、ｍ−（クロロスルホニル）安息香酸及びｐ−（クロ
ロスルホニル）安息香酸のような代表的アルキル化剤及
びスルホニル化剤もまた有用であり、ブロモ酢酸が最も
好ましい。

本発明の方法の化学的変性工程は、一般的に、免疫反応
性種を粒子上に最初共有結合で固定化す ることによって行われる。カゼインもまた同時にその上
に固定化される。次いで、固定化された種は、適当なア
シル化剤、アルキル化剤又はスルホニル化剤によって、
使用する変性剤に適切な条件下に変性される。このよう
な条件は、当業者に公知である。代表的な方法を、下記
例１、４及び５に記載する。

変性方法に於て、変性される固定化された免疫反応性種
の遊離第一及び第二アミノ基の数は、媒体のpH、試薬の
濃度及び免疫反応性種に依存する。しかし、充分な変性
は、本明細書に与えられた教示を使用して当業者によっ
て達成できる。一般に、使用される変性剤の量は、存在
する種の量の少なくとも10重量％である。

一度凝集体が分析で生成すると、凝集した物質を当該技
術で公知の適当な方法で非凝集物質から分離する。一般
に、分離は瀘過技術によって達成される。分離に続い
て、凝集物質又は非凝集物質の何れかを、公知の方法を
使用して測定する。

本発明はそのように限定されるものではないが、リガン
ドの分析は、微孔性膜からなる適当な試験装置を使用し
て行なうことができる。このような装置は、リガンドを
含有する標本が凝集反応試薬の表面上で種と反応のため
に添加される１個又は２個以上の窪みを有する。試薬は
分析の間に装置に添加できるか、又は製造時にその中に
含有させることができる。一度凝集体が生成されると、
非凝集残留物質は、洗浄溶液によって膜を通して膜の下
の分離した容器中に洗出される。

例１：ストレプトコッカスＡ決定のための凝集反応試薬
の製造と使用 本例は、本発明の凝集反応試薬の製造及びストレプトコ
ッカスＡ抗原を決定するためのその使用を示す。

コア中にレッド染料（Oil Red EGN）を含有するコア−
シェルポリマーラテックス粒子を、コア／シェル重合法
を使用して製造した粒子中に染料を固定化することによ
って製造した。染料をベルギー特許第843,647号に記載
された方法を使用して含有させた。粒子のコアは、ポリ
（スチレン−共−２−アセトアセトキシエチルメタクリ
レート）（70：30重量比）から成り、一方シェルはポリ
（ｍ，ｐ−クロロメチルスチレン）から成った。該粒子
の平均直径は、約0.45μｍであった。ストレプトコッカ
スＡ抗原に対するモノクロナール抗体とカゼインを次の
ようにしてこれらの粒子上に共有結合で固定化した。即
ち、50ミリモル濃度のホウ酸塩緩衝液（pH8.5）0.6ｍ
に、抗StrepＡ（anti-StrepＡ）抗体（ＰＢＳとして公
知の燐酸塩緩衝塩溶液中の2.9mg／ｍ溶液）とカゼイ
ン（10mg／ｍ水）との10：１混合物からなる全蛋白質
0.1mgを添加した。混合の後、ポリマーラテックス粒子
の５％懸濁液41.5μｌを添加し（0.3％固体にする）、
得られた溶液を37℃で24時間垂直方向に（end-over-en
d）回転し、抗体及びカゼインの粒子への共有結合を起
こさせ、凝集反応試薬を形成した。

無水琥珀酸の溶液（10mg／ｍジメチルスルホキシド）
を上記凝集反応試薬の懸濁液に、無水物１部：全蛋白質
１部の重量比で添加した。得られた懸濁液を25℃で４時
間混合し、次いで7000rpmで５分間遠心分離し、得られ
たペレットを0.1モル濃度グリシン緩衝液（pH8.5）中に
0.3％固体の濃度に再懸濁した。この方法で、粒子に結
合した蛋白質の第一及び第二アミン基を化学的に変性し
た。

ストレプトコッカスＡ抗原を、地方の病院から得られた
分離物から２５℃で１分間亜硝酸ナトリウム（８モル濃
度）及びクエン酸（0.2モル濃度）の等容量の溶液を使
用して抽出した。次いで該溶液を、等容量の、エチレン
ジアミンテトラ酢酸（75ミリモル）を含有する３−（Ｎ
−モルフォリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（２モル濃
度、pH7.5）で中和した。

ナイロン６６微孔性膜（５μｍ平均孔サイズ）をディス
ポーザブルな試験装置の試験窪み内に導入した。

塩化ナトリウム（80μ、１モル濃度）、上記凝集反応
試薬懸濁液（40μ）及び約4.2×10⁵コロニー形成単位
を含有する抽出抗原（80μ）の混合物を、膜を含有す
る試験装置の試験窪みに添加し、その中で２分間25℃で
インキュベートした。次いで液体を膜の下の室に流し、
膜上の凝集体をイオン強度0.25を有する洗液を150μ
で洗浄した。

洗浄工程の後、膜上の凝集体内の染料の量を、反射率測
定装置を使用して540nmで測定した。Williams-Clapper
変換器（J.Optical Soc.Am.,43,p.595,1953）を、変換
濃度値（transmission denstiy value）を計算するため
に使用した。膜上の凝集体は、容易に観察することがで
き、バックグランド対照よりも著しく大きい濃度値（そ
の差は0.148であった）を有していた。これらのデータ
は、本発明の凝集試薬が生物学的試料からストレプトコ
ッカスＡ抗原を測定するために有用であることを示して
いる。

例２：淋病の検査 本例は、淋病の検査のための本発明の凝集試薬の使用を
示す。本例で使用した凝集試薬は、ベルギー特許第843,
647号に記載された方法に従った、ユウロピウム（III）
（テノイルトリフルオロアセトン）_３とトリオクチルホ
スフィンオキサイドとをキレート１部対オキサイド２部
の比で５重量％固定化したポリ（スチレン−共−ｍ，ｐ
−クロロメチルスチレン−共−２−ヒドロキシエチルア
クリレート）（76：23：１重量比）から成るラテックス
粒子から成った。この粒子は、約0.45μｍの平均直径を
有していた。

Neisseria gonorrhea（またＰＩＢ抗原として当該技術
で公知である）の血清群Ｂ（serogroupＢ）のＰＩ抗原
に対するモノクロナール抗体を、下記のようにして上記
の粒子上に共有結合的に固定化した。即ち、50ミルモル
濃度のホウ酸塩緩衝液（pH8.5）1.3ｍに、燐酸塩緩衝
塩（ＰＢＳ）の1.08mg／ｍ抗体溶液0.15ｍを添加し
た。添加の際に、カゼインの１mg／ｍ水溶液0.32ｍ
を、カゼインを同様に粒子上に固定化するために添加し
た。

混合の後、上記のポリマーラテックス粒子の５％懸濁液
41.5μを添加し、得られた溶液を37℃で24時間混合し
た。無水琥珀酸の溶液（10mg／ｍジメチルスルホキシ
ド溶液0.174ｍ）を添加し、得られた溶液を、結合し
た蛋白質のアミン基を変性するために22℃で４時間混合
した。次いで、この溶液を10分間遠心分離し、得られた
ペレットを0.1モル濃度グリシン（pH8.5）に再懸濁さ
せ、凝集試薬の0.3％固体を含有する混合物を得た。

ＰＩＢ抗原を、１％エタノールアミン及び10ミリモル濃
度エチレンジアミンテトラ酢酸の混合物を使用してNeis
seria gonorrheaの標本から抽出し、次いで超音波処理
及び瀘過した。

５μｍの平均孔サイズを有するナイロン６６微孔性膜
を、２％カゼイン溶液中に浸漬することによって前処理
した。塩化ナトリウム（50μ、６モル濃度）、特定量
の抗原（ナノグラム）を有する抗原溶液（50μ）及び
上記凝集反応指示薬溶液（50μ）の混合物を試験管に
添加し、22℃で３０分間インキュベートし、次いで処理
された微孔性膜を通して瀘過した。膜上の得られた凝集
体を１モル濃度トリシン緩衝液（pH8.6）0.15μで洗
浄した。凝集体の量は標準表面蛍光測定装置（励起342n
m、放射610nm）を使用して凝集体中の蛍光の量を測定す
ることによって決定した。異なる抗原（即ち、Neisseri
a gonorrheaの血清群ＡのＰＩ抗原、またＰＩＡ抗原と
して公知である）の抽出物の特定量の含有する対照溶液
を、ＰＩＢ抗原に対する抗体の非特異的反応を測定する
ためと同じ方法で処理した。下記第１表は、これらの試
験の結果を示す。本発明の分析が、特定の淋病の血清群
の所望の抗原を測定するために使用できることが明らか
である。

例３：ヒト絨毛性性線刺激ホルモンの分析 本例は、ヒト絨毛性性線刺激ホルモン（ｈＣＧ）の測定
のための本発明の実施を示す。

コア／シェルポリマー粒子を、公知の方法に従ってOil
Red EGN染料で固定化した。粒子のコアは、ポリ（スチ
レン−共−２−アセトアセトキシエチルメタクリレー
ト）（85：15重量比）から成り、粒子のシェルはポリ
（ｍ，ｐ−クロロメチルスチレン−共−メタクリル酸）
（99.8：0.2重量比）から成った。該粒子の平均直径
は、約0.32μｍであった。

ｈＣＧの二つの異なったエピトピックサイト（epitopic
site）に対するモノクロナール抗体とカゼインを、次
のようにしてこれらの粒子上に共有結合的に固定化し
た。即ち、50ミリモル濃度のホウ酸塩緩衝液（pH8.5）
0.6ｍに、ｈＣＧ抗体（2.9mg／ｍ燐酸塩緩衝塩溶
液）とカゼイン（10mg／ｍ水）との10：１混合物0.1m
gを添加した。混合の後、上記ポリマーラテックス粒子
の５％懸濁液41.5μを添加し、得られた溶液を37℃で
24時間垂直方向に回転し、抗体及びカゼインの粒子への
共有結合を起こさせ、凝集反応試薬を形成した。

無水琥珀酸の溶液（10mg／ｍジメチルスルホキシド）
を、上記凝集反応試薬の懸濁液に、無水物１部：全蛋白
質１部の重量比で添加し、得られた懸濁液を25℃で４時
間混合し、結合した蛋白質のアミン基を化学的に変性す
るために7000rpmで５分間遠心分離した。得られたペレ
ット0.1モル濃度グリシン（pH8.5）中に0.3％固体の濃
度に再懸濁した。

種々の量のｈＣＧ（ミリＩ．Ｕ．／ｍ）を、0.5％ウ
シ血清アルブミンを含有する燐酸塩緩衝塩溶液（0.1モ
ル濃度の燐酸ナトリウム及び0.15モル濃度の塩化ナトリ
ウム）に添加した。約５μｍ平均孔サイズを有するナイ
ロン６６微孔性膜を、上記例１に記載したのと同様なデ
ィスポーザブルな試験装置の試験窪み内に導入した。こ
の膜は、スクシニル化カゼインの0.1％水溶液２滴で洗
浄した。ミリＩ．Ｕ．でのｈＣＧ濃度は、5000ミリＩ．
Ｕ．が精製ｈＣＧ１μｇに相当するとして定義する。

４モル濃度の塩化ナトリウム60μ、１モル濃度のトリ
シン緩衝液（pH8.6）、上記凝集反応試薬の懸濁液60μ
及び上記のｈＣＧ溶液240μの混合物を試験管に添
加し、ゆっくり混合し、25℃で10分間インキュベートし
た。各溶液（300μ）の一部を膜を含有する試験窪み
に添加し、膜を通過して流した。しかしながら、膜上に
形成した凝集体は、流出しなかった。凝集体を１モル濃
度の塩化ナトリウム溶液300μで洗浄し、凝集体中の
染料の量を、実施例１に記載したようにして540nmで測
定した。これらの測定の結果を下記第II表に変換濃度
（Ｄ_Ｔ）として示す。これは、本発明の分析がｈＣＧを
測定するために使用できることを示している。

例４：アルキル化試薬を使用する凝集反応試薬の製造 この例は、本発明の試薬を製造するために、３個の異な
るアルキル化剤：クロロ酢酸、ブロモ酢酸及びブロモプ
ロピオン酸を使用する固定化抗体の変性を示す。

例１に記載した方法を使用して、ポリ（スチレン−共−
アセトアセトキシエチルメタクリレート）（70：30モル
比）のコアとポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン）の
シェルから成るコア−シェルポリマーラテックスビーズ
を製造し、Oil Red EGN染料の2.5％アセトニロリル溶液
で固定化した。

染料したビーズを、0.1％アジドナトリウムを含有する
0.05モル濃度のホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）に懸
濁させ、0.3％固体の懸濁液を得た。

StrepＡ抗原に対するモノクロナール抗体及びカゼイン
を、例１に記載したようにしてビーズ上に固定化した。

固定化抗体混合物（0.012ml）を、適切なアルキル化剤
（10mg／ｍジメチルスルホキシド溶液0.012ｍ）と
混合し、37℃で18時間加熱し、次いで7000rpmで５分間
遠心分離した。得られたペレツトを0.1モル濃度グリシ
ン緩衝液（pH8.5）中に懸濁させ、0.3％固体懸濁液とし
て凝集反応試薬を得た。

例５：クロロメチルスルホニルモノマーから誘導された
ポリマーを使用する凝集反応試薬 例１に記載したようにして、ポリ（スチレン−共−アセ
トアセトキシエチルメタクリレート）（85：15モル比）
のコアとポリ［スチレン−共−ｍ＆ｐ−（２−クロロエ
チルスルホニルメチル）スチレン］（95.5：4.5モル
比）のシェルから成るコア−シェルポリマーラテックス
ビーズを製造し、Oil Red EGN染料の3.5％アセトニトリ
ル溶液で固定化した。ビーズを、0.1％アジドナトリウ
ムを含有する0.05％モル濃度のホウ酸ナトリウム緩衝液
（pH8.5）に懸濁させ、0.3％固体の懸濁液を得た。

StrepＡ［0.1％アジドナトリウムを含有する0.05モル濃
度のホウ酸塩緩衝液（pH8.5）中の3.8mg／ｍ溶液の0.
026ｍ］に対するモノクロナール抗体及びカゼイン
（水中の１mg／ｍ溶液の0.01ｍ）を約0.9ｍのホ
ウ酸塩緩衝液中で一緒に混合した。

ビーズ（1.73％緩衝懸濁液0.173ｍ）を添加し、混合
物を約25℃で24時間ずっと（end-over-end）混合した。
無水琥珀酸（10mg／ｍジメチルスルホキシド溶液0.01
ｍ）を添加し、混合物を３時間揺り動かした。混合物
を遠心分離し、浮遊物を傾瀉し、ペレットを0.1％アジ
ドナトリウムを含有する0.1規定グリシン（pH8.5）中に
懸濁させ0.3％固体懸濁液を得た。

例６：ストレプトコッカスＡの分析 本例は、本発明の方法により製造した凝集反応試薬を米
国特許第4,591,571号に教示された方法によって製造し
た凝集反応試薬と比較したStrepＡの分析を示す。

本発明の凝集反応試薬は、次のようにして製造し、Stre
pＡ分析において試験した。

例１に記載したようにして、ポリ（スチレン−共−アセ
トアセトキシエチルメタクリレート）（95：５モル比）
のコアとポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−共−メ
タクリル酸）（98：２モル比）のシェルから成るコア−
シェルポリマーラテックスビーズを製造し、Oil Red EG
N染料の２％アセトニトリル溶液で固定化した。

染色したビーズを0.1％アジドナトリウムを含有する0.0
5モル濃度のホウ酸ナトリウム緩衝液（pH8.5）に懸濁さ
せ、0.3％固体の懸濁液を得た。

例１に記載したようにして、StrepＡ抗原に対するモノ
クロナール抗体およびカゼインをこれらのビーズ上に共
有結合で固定化し、無水琥珀酸による処理によって変性
した。

Strep抗原を、地方の病院から得られた分離物から25℃
で１分間1.2モル濃度クエン酸（10μ）及び８モル濃
度亜硝酸ナトリウム（120μ）から成る溶液を使用し
て抽出し、次いで１モル濃度トリシン、pH8.5（120μ
）で中和した。

スクシニル化カゼインを1.07ｇ／m²含有するナイロン６
６微孔性膜（５μｍBiodyne Ａ）をディスポーザブル
な試験装置内に導入した。

ビーズ組成物（２滴、約90μ）をディスポーザブルな
試験装置に添加し、抽出された抗原１滴（約40μ）を
添加した。２分後、溶液を膜を通して流出させ、次いで
１モル濃度の塩化ナトリウム（２滴、90μ）の洗浄溶
液を添加した。次いで膜上の染料を反射率によって読み
取り、値を変換濃度（Ｄ_Ｔ）に転換した。第１図に示し
たデータのプロットは、本発明を使用する改良を示して
いる。

対照凝集反応試薬を、固定化に先立って抗体アシル化す
るために米国特許第4,591,371号の教示を使用して製造
した。変性した抗体を粒子に共有結合できる試みを、上
記と同様の条件を使用して成した。得られた試薬をStre
pＡ分析で試験した。

更に特に、対照試薬のために、StrepＡ抗原に対するモ
ノクロナール抗体を、次のように無水琥珀酸で処理する
ことによって先ず変性した。抗体（0.33mg）を0.1％ア
ジドナトリウムを含有する0.05モル濃度のホウ酸ナトリ
ウム緩衝液、pH8.5（0.9ｍ）中に溶解し、無水琥珀酸
の溶液（10mg／ｍジメチルスルホキシド溶液0.33ｍ
）を添加した。次いで混合物を室温で３時間攪拌し、
次いで0.05モル濃度のホウ酸塩緩衝液に対して４℃で約
16時間透析した。

スクシニル化抗体（0.33mg／ｍホウ酸塩緩衝溶液0.5
ｍ）及びカゼインの溶液（１mg／ｍ溶液0.087ｍ
）を、0.1％アジドナトリウムを含有する0.5モル濃度
のホウ酸塩緩衝液、pH8.5（0.7ｍ）中に混合した。次
いで染色したコア−シェルビーズ懸濁液（0.174ｍ）
を、抗体／カゼイン混合物に添加し、変性した抗体に共
有結合的に付ける試みで37℃で24時間垂直方向に回転し
た。混合物を遠心分離し、浮遊している液体を傾瀉し
た。ペレットを0.1％アジドナトリウムを含有する0.1モ
ル濃度グリシン（pH8.5）中に懸濁させ0.3％固体懸濁液
を得た。

対照StrepＡ分析を上記のように行った。データのプロ
ットを図に示す。プロットしたデータから、非常に少量
の凝集体が対照試薬で観察されたことが明らかである。
明らかに、結合の前の抗体の変性は著しい量の抗体の共
有結合を起こさせない。

〔発明の効果〕

本発明は、減少した非特異的相互作用を示す凝集反応試
薬を提供し、該試薬は対象の検体に対し高感度である。
これらの有利性は、対象の検体にとってレセプターであ
る免疫反応性種をポリマー粒子に最初共有結合で結合さ
せ、次いで第一及び第二アミン基を化学的に変性するた
めのアシル化剤、アルキル化剤又はスルホニル化剤によ
る化学的変性によって達成される。これは米国特許第4,
591,571号の教示とは直接的に相反する。この特許の教
示を使用して製造した試薬は診断分析に於て効果がな
く、他方本発明の試薬はこのような分析に於て非常に有
用であることが、上記例６で示される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の試薬について、米国特許第4,591,571
号によって製造した対象試薬と比較して、吸水度対スト
レプトコッカスＡ抗原濃度のグラフプロットを示す。こ
の比較は、上記例６に詳細に記載されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート トロコニス ベリー アメリカ合衆国，ニユーヨーク 14850, イサカ，ナンバー １，カユガ ビスタ タウンハウズィズ，ダンビイ ロード 1022 (56)参考文献 特開 昭59−224565（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】免疫反応性種をポリマー粒子に共有結合で
   結合せしめ、そして、ポリマー粒子に結合した免疫反応
   性種の遊離の第一及び第二アミノ基をアシル化剤、アル
   キル化剤又はスルホニル化剤によって化学的に変性する
   ことからなる凝集反応試薬の製造方法。
2. 【請求項２】ポリマー粒子に共有結合で結合された免疫
   反応性種を含んで成り、該結合された免疫反応性種の有
   する遊離の第一及び第二アミノ基が該免疫反応性種が前
   記ポリマー粒子に共有結合された後に、アシル化剤、ア
   ルキル化剤又はスルホニル化剤によって化学的に変性さ
   れている凝集反応試薬。