JPH06141880A

JPH06141880A - Ｃｍｐ−ｋｄｎの合成方法

Info

Publication number: JPH06141880A
Application number: JP4321161A
Authority: JP
Inventors: Fumio Ito; 文雄伊藤; Taisuke Iwasaki; 泰介岩崎
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1992-11-05
Filing date: 1992-11-05
Publication date: 1994-05-24

Abstract

(57)【要約】【構成】シチジントリホスフェイトと２−ケト−３−
デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノノン酸と
を、ウシ顎下腺またはブタ肝臓の抽出液の存在下に反応
させてシチジンモノホスフェイト−２−ケト−３−デオ
キシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノノン酸を生成せ
しめこれを採取することよりなるシチジンモノホスフェ
イト−２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガ
ラクト−ノノン酸（ＣＭＰ−ＫＤＮ）の製造法。酵素と
してウシ顎下腺またブタ肝臓の抽出上澄液の３５〜６０
％飽和硫安分画画分を用いることができる。【効果】利用価値のないウシ顎下腺あるいは大量に生
産されるブタ肝臓を酵素源として用い、高い収率でＣＭ
Ｐ−ＫＤＮを得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウシ顎下腺またはブタ
肝臓の酵素抽出液を用いてシチジンモノホスフェイト−
２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト
−ノノン酸を合成する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】シチジントリホスフェイト（ＣＴＰと略
記する）と２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ
−ガラクト−ノノン酸（ＫＤＮと略記する）を出発物質
とし、シチジンモノホスフェイト（ＣＭＰと略記する）
−ＫＤＮの合成反応を触媒する酵素としてＣＴＰ：ＣＭ
Ｐ−ＫＤＮシチジルトランスフェラーゼ（ＣＭＰ−ＫＤ
Ｎ合成酵素）が知られている。ＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素
に関しては、ウシ脳中に存在することが最初に報告され
ている（ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ，２
９，７８９−７９０，１９８８）。そして、ニジマス未
受精卵中にも存在することが報告されている（Ｇｌｙｃ
ｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＪ．，８，１５３，１９９１、
第１１回国際複合糖質シンポジウム講演要旨集）。その
後、ニジマス未受精卵中に存在するＣＭＰ−ＫＤＮ合成
酵素の諸性質について詳しく検討されており（生化学，
８，８００，１９９１：第６４回日本生化学大会講演要
旨集）、この報告によると、ＣＭＰ−ＫＤＮの合成能
は、ウシ脳由来のＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素よりもニジマ
ス未受精卵由来のＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素のほうが高い
ということである。

【０００３】したがって、ウシ脳由来のＣＭＰ−ＫＤＮ
合成酵素を用いてＣＭＰ−ＫＤＮを合成する場合、ウシ
脳中に含まれるＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素の量が少ないた
め、必要な酵素量を確保するには多量のウシ脳を確保す
る必要がある。さらに、ＣＭＰ−ＫＤＮの合成能が必ず
しも高くないので、反応時間を長くしなければならな
い。一方、ニジマス未受精卵由来のＣＭＰ−ＫＤＮ合成
酵素を用いてＣＭＰ−ＫＤＮを合成する場合、ニジマス
未受精卵に含まれるＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素の量は十分
であるが、ニジマス未受精卵の入手に際しては時期的な
制約を受ける。このように、ＣＭＰ−ＫＤＮを合成する
に当たっては、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成能の高いＣＭＰ−Ｋ
ＤＮ合成酵素を利用すると共に、そのＣＭＰ−ＫＤＮ合
成酵素の原料となる物質を安定的に確保しなければなら
ないという問題がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、上述の
問題に鑑み、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成能の高いＣＭＰ−ＫＤ
Ｎ合成酵素を求め、動物臓器を対象に探索を行ったとこ
ろ、ウシ顎下腺またブタ肝臓の抽出液が高いＣＭＰ−Ｋ
ＤＮ合成能を有することを見出し、本発明を完成するに
至った。したがって、本発明は、ウシ顎下腺またはブタ
肝臓の酵素抽出液の存在下にＣＴＰとＫＤＮとを反応さ
せてＣＭＰ−ＫＤＮを合成する方法を提供することを課
題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＣＴＰとＫＤ
Ｎとをウシ顎下腺またはブタ肝臓の酵素抽出液の存在下
に両者を反応させてＣＭＰ−ＫＤＮを製造する方法に関
する。本発明でウシ顎下腺は、食用としての需要がない
ので、安定的に供給され得る。このウシ顎下腺の酵素抽
出液中にはＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素が含まれているもの
と思われる。この酵素抽出液は、以下のような処理を行
うことによって得ることができる。ウシを屠殺した後、
直ちに周辺の脂肪や肉を含んだ状態で頭部から顎下腺を
摘出し、−８０℃で凍結保存する。凍結した顎下腺は、
酵素の抽出処理を行うに際して、４℃で一夜放置し、温
和な条件下で解凍する。解凍後、脂肪と結合組織を除去
し、冷脱イオン水で洗浄した顎下腺を用い、酵素の抽出
処理を行う。酵素の抽出処理は、ｐＨ９．０〜１０．０
に緩衝能を有する適当な緩衝液、例えば、トリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．０〜１０．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ８．５〜１１．０）、炭酸ナトリウム−炭酸水
素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０）、ホウ酸
ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１
１．０）などを用いて行う。いずれの緩衝液を用いる場
合でも、５〜５０ｍＭ当量の緩衝液を用いることが好ま
しい。また、用いる緩衝液に、０．３〜０．５Ｍ当量の
塩化カリウムまたは０．１〜０．３Ｍ当量の塩化ナトリ
ウム、０．５〜２ｍＭ当量のジチオトレイトール（ＤＴ
Ｔ）またはメルカプトエタノールなどの還元剤（ＳＨ基
保護剤）を添加するとよい。このようにすると酵素抽出
液中の酵素に存在するＳＨ基を保護し、酵素を安定に保
持することができる。まず、顎下腺の湿潤量に対して２
倍量の緩衝液を加え、ワーリングブレンダーなどを用い
て磨砕処理を行う。得られた磨砕物について、３０分間
〜２時間の攪拌抽出処理を行った後、遠心分離処理を行
って脂肪層を除去し、上澄液を回収することにより、Ｃ
ＭＰ−ＫＤＮ合成酵素の抽出液を得ることができる。

【０００６】なお、このようにして得られたウシ顎下腺
酵素抽出液には、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素と共にヌクレ
オチドホスホハイドラーゼ（ＥＣ．３．１．３．３１）
が存在しているので、この酵素抽出液を用いてＣＭＰ−
ＫＤＮの合成を行う場合、このヌクレオチドホスホハイ
ドラーゼの触媒作用により、出発原料のＣＴＰがＣＤＰ
に加水分解されてしまう。そこで、このヌクレオチドホ
スホハイドラーゼを除去するために硫安分画処理を行う
とよい。酵素抽出液物の上澄みを０〜３５％飽和硫安分
画処理した画分では、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素活性が殆
ど認められず、活性として大部分のヌクレオチドホスホ
ハイドラーゼが存在することが認められた。一方、上記
上澄みを３５〜６０％飽和硫安分画処理した画分では、
活性として大部分のＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素が回収さ
れ、ヌクレオチドホスホハイドラーゼの活性は殆ど認め
られなかった。したがって、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素の
粗酵素液を３５〜６０％飽和硫安分画処理することによ
り、ヌクレオチドホスホハイドラーゼを効率的に除去す
ることができることが判った。このような硫安分画処理
を行って得られたＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素画分には、ヌ
クレオチドホスホハイドラーゼ活性が殆ど認めらず、Ｃ
ＭＰ−ＫＤＮの合成に必要な十分量のＣＭＰ−ＫＤＮ合
成酵素が含まれていることから、ＣＭＰ−ＫＤＮの合成
を行うに際しては、このＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素画分を
使用することで十分に目的を達成することができる。

【０００７】一方、ブタ肝臓は、比較的安価であること
から、安定的かつ大量に提供できる。このブタ肝臓の酵
素抽出液にも同様にＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素が含まれて
いると見られる。この酵素抽出液はウシ顎下腺の酵素抽
出液と同様に、以下のような処理を行うことによって得
ることができる。ブタを屠殺した後、直ちにブタ肝臓を
摘出し、−８０℃にて凍結保存する。凍結した肝臓は、
酵素の抽出処理を行うに際して、４℃で一夜放置し、温
和な条件下で解凍する。解凍後、結合組織を除去し、冷
脱イオン水で洗浄した肝臓を用い、酵素の抽出処理を行
う。酵素の抽出処理は、ｐＨ９．０〜１０．０に緩衝能
を有する適当な緩衝液、例えば、トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０〜９．０）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０〜
１０．０）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．５〜１１．０）、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０）、ホウ酸ナトリウ
ム−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０）
などを用いて行う。いずれの緩衝液を用いる場合でも、
５〜５０ｍＭ当量のものを用いることが好ましい。ま
た、用いる緩衝液に、０．３〜０．５Ｍ当量の塩化カリ
ウムまたは０．１〜０．３Ｍ当量の塩化ナトリウム、
０．５〜２ｍＭ当量のジチオトレイトール（ＤＴＴ）ま
たはメルカプトエタノールなどの還元剤（ＳＨ基保護
剤）を添加するとよい。まず、肝臓の湿潤量に対して２
倍量の緩衝液を加え、ワーリングブレンダーなどを用い
て磨砕処理を行う。得られた磨砕物について、３０分間
〜２時間攪拌抽出を行った後、遠心分離処理を行って脂
肪層を除去し、上澄液を回収することにより、ＣＭＰ−
ＫＤＮ合成酵素の粗酵素液を得ることができる。

【０００８】次に、ＣＭＰ−ＫＤＮの合成について説明
する。この合成の出発物質としては、ＫＤＮまたはその
含有物とＣＴＰまたはその含有物とが用いられる。ＫＤ
Ｎの含有物としては、Ｄ−マンノースとピルビン酸を出
発原料とし、シアル酸アルドラーゼ（ＥＣ．４．１．
３．３）の触媒作用によって合成したＫＤＮの混合物
を、また、ＣＴＰの含有物としては、ＣＭＰを出発原料
とし、パン酵母または醸造用酵母を作用させて合成した
ＣＴＰの混合物などを例示することができる。ＫＤＮま
たはその含有物とＫＤＮの１ｍＭ当量に対して３ｍＭ当
量以上のＣＴＰまたはその含有物を出発原料として加
え、反応液を調製する。そして、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵
素の至適ｐＨが９．０〜１０．０であるので、この反応
液にトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）、ホウ
酸緩衝液（ｐＨ８．０〜１０．０）、グリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜１１．０）、炭酸ナト
リウム−炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０〜１
１．０）、ホウ酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９．０〜１１．０）などの緩衝液を加える。いず
れの緩衝液を用いる場合でも反応液全容量に対して５０
〜２００ｍＭ当量となるよう添加することが好ましい。
また、マグネシウムやマンガンなどの二価金属イオンと
ＤＴＴを、反応液全容量に対し、それぞれ１０〜３０ｍ
Ｍ当量と０．５〜２ｍＭ当量となるよう緩衝液に添加す
る。ＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素の液量は、通常、１ｍＭ当
量のＫＤＮに対して５〜５０ｍｌを添加する。ＣＭＰ−
ＫＤＮの合成反応は、通常、１０〜５０℃程度、好まし
くは２０〜４０℃程度の温度条件下で行われる。反応時
間は、使用するＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素の液量にもよる
が、通常、３０分間〜１５時間程度、好ましくは１〜８
時間程度でよい。

【０００９】このようにして生成したＣＭＰ−ＫＤＮ
は、比較的不安定な物質であるので、ＣＭＰ−ＫＤＮの
合成反応を停止した後、直ちにＣＭＰ−ＫＤＮを分離・
精製する必要がある。ＣＭＰ−ＫＤＮの分離・精製は、
公知の手段に従って行うことが可能であり、例えば、Ｕ
Ｆ膜による限外濾過、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの操作によっ
て、反応液中からＣＭＰ−ＫＤＮを分離することができ
る。この場合、ＣＭＰ−ＫＤＮの分解を極力防止して回
収率を上げるため、すべての操作を４℃以下の温度条件
下で行うことが望ましい。

【００１０】次に本発明を実施例を挙げて具体的に説明
する。

【実施例１】ウシ顎下腺１００ｇに対して、０．４Ｍ塩
化カリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
９．０）２００ｍｌを加え、ワーリングブレンダー中で
２０秒間づつ２回磨砕処理を行った。このようにして得
られた磨砕物について、１時間攪拌抽出を行った後、１
５，０００×ｇ、２０分間遠心分離を行って脂肪層を除
去し、上澄液を回収した。また、沈殿物についても同様
の操作によって再抽出を行い、上澄液を回収した。これ
らの上澄液３５０ｍｌについて、３５〜６０％飽和硫安
分画処理を行った後、１ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、４℃、６時
間透析を行った。透析後、２０，０００×ｇ、２０分間
遠心分離を行い、上澄液としてＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素
の抽出液２８ｍｌを得た。

【００１１】この酵素抽出液について、以下の方法によ
り、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成能を測定した。ＣＭＰ−ＫＤＮ
合成の反応液を次のような配合で調製した。¹⁴Ｃでラベ
ルした〔¹⁴Ｃ〕Ｄ−マンノースとピルビン酸を出発原料
とし、シアル酸アルドラーゼの触媒作用によって合成し
た０．８ｎＭ当量の〔¹⁴Ｃ〕ＫＤＮ（３．４×１０⁵ｃ
ｐｍ）と０．５μＭ当量のラベルしていないＫＤＮ、さ
らに、２．０μＭ当量のＣＴＰを１５ｍＭ塩化マグネシ
ウムを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．
０）中に溶解させた。この反応液にＣＭＰ−ＫＤＮ合成
酵素抽出液４０μｌを加え、全量を１００μｌとした。
酵素反応を３７℃、２時間行った後、９８％冷エタノー
ルを７０％濃度となるように加えて反応を停止した。酵
素反応で生成したＣＭＰ−〔¹⁴Ｃ〕ＫＤＮとＣＭＰ−Ｋ
ＤＮを反応液から分離するために３０，０００×ｇ、２
０分間遠心分離を行って変性した蛋白質を除去し、上澄
液を回収した。この上澄液をＨＰＴＬＣプレート上で１
−プロパノール：水＝２：１の溶媒を用いて２度展開し
た。ＨＰＴＬＣプレート上の２５４ｎｍにおける吸収を
確認した後、オートラジオグラフィーによって〔¹⁴Ｃ〕
ＫＤＮの放射活性スポットのやや下に新たな放射活性ス
ポットの生成が認められた。このスポットは、２５４ｎ
ｍにおけるＣＭＰの吸収も示すことから、ＣＭＰ−〔¹⁴
Ｃ〕ＫＤＮであると判断された。ラベルしていないＣＭ
Ｐ−ＫＤＮを含むＣＭＰ−〔¹⁴Ｃ〕ＫＤＮのスポットを
掻き取り、７０％エタノールで抽出した。そして、抽出
したＣＭＰ−〔¹⁴Ｃ〕ＫＤＮにシンチレーションカクテ
ルを加え、シンチレーションカウンターによって放射活
性を測定した。

【００１２】ＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素の活性は、最初に
加えた〔¹⁴Ｃ〕ＫＤＮの放射活性に対するＣＭＰ−〔¹⁴
Ｃ〕ＫＤＮの放射活性の相対比を合成率として表した。
また、反応液から回収したＣＭＰ−〔¹⁴Ｃ〕ＫＤＮとＣ
ＭＰ−ＫＤＮを含む７０％エタノール抽出液を凍結乾燥
してアルコール分を除去し、適量の水を加えて再溶解し
たもの（ＫＤＮとして０．６〜３μｇ／４０μｌ）に対
して、２．７Ｍ水素化ホウ素ナトリウム溶液２０μｌを
加え、室温で１５分間処理した。この処理により、未反
応のＫＤＮは分解されるが、ＣＭＰ−ＫＤＮは分解され
ない。次に、アセトン２０μｌを加えて過剰量の水素化
ホウ素ナトリウムを分解し、Ｗａｒｒｅｎのチオバルビ
ツール酸（ＴＢＡ）法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．，Ｃｈｅｍ．，
２３４，１９７１−１９７５，１９５９）に従って、５
４９ｎｍにおける吸収を測定した。

【００１３】一方、ウシ脳、ウシ肝臓、ウシ腎臓につい
ても、同様の処理を行ってＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素抽出
液を調製し、同様の方法でＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素の活
性を測定した。各抽出液のＣＭＰ−ＫＤＮ合成率を表１
に示す。

【００１４】

【表１】

【００１５】

【実施例２】ＫＤＮ２６８．２ｍｇ（１ｍＭ当量）とＣ
ＴＰ１，６４７．３ｍｇ（３ｍＭ当量）を１５ｍＭ塩化
マグネシウムを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９．０）６０ｍｌに溶解した後、実施例１で調製した
酵素抽出液４０ｍｌを加え、全量を１００ｍｌとした。
３７℃、２時間酵素反応を行った後、反応液を３０，０
００×ｇ、２０分間遠心分離し、上澄液９５ｍｌを回収
した。そして、この上澄液にアンモニア水でｐＨ９．０
に調整した冷蒸留水２００ｍｌを加えて希釈した後、ア
ミコン社製ＹＣ０５膜（分画分子量５００）を用いて限
外濾過を行った。３０ｍｌまで濃縮した段階で、さら
に、同様の冷蒸留水１００ｍｌを加え、再び限外濾過を
行った。これらの操作をもう一度繰り返し行い、得られ
た濾液４７０ｍｌを全て回収して、凍結乾燥を行った。

【００１６】この凍結乾燥物に、アンモニア水でｐＨ
９．０に調整した１−プロパノール：水＝２：１の溶液
を適量加えて再溶解したものを、同溶液で平衡化させた
イアトロビーズカラム（２×１２０ｃｍ）に供給し、同
溶液によるシリカカラムクロマトグラフィーを行った。
得られた各溶出画分をＨＰＴＬＣプレート上で１−プロ
パノール：水＝２：１の溶媒を用いて２度展開した。Ｈ
ＰＴＬＣプレート上の２５４ｎｍにおける吸収を確認し
た後、ジフェニルアミン−アニリン試薬で発色させた。
未反応のＫＤＮのスポットのやや下に２５４ｎｍにおけ
るＣＭＰの吸収をも示すＣＭＰ−ＫＤＮのスポットを検
出した。未反応のＫＤＮは、４３４〜５０３ｍｌ溶出画
分（６９ｍｌ）に、ＣＭＰ−ＫＤＮは、４５６〜５３８
ｍｌ溶出画分（８２ｍｌ）にそれぞれ認められた。ＫＤ
ＮとＣＭＰ−ＫＤＮが混在する４５６〜５０３ｍｌの溶
出画分（５３ｍｌ）を凍結濃縮したものについて、再度
クロマトグラフィーを行った。２回のクロマトグラフィ
ーで得られたＫＤＮが若干混在するＣＭＰ−ＫＤＮ画分
を合わせて回収し、凍結濃縮を行った。

【００１７】そして、この濃縮液をアンモニア水でｐＨ
９．０に調整した冷蒸留水で平衡化したバイオ−ゲルＰ
−２カラム（２×１１０ｃｍ）に供給し、同溶液による
ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。ＣＭＰ−ＫＤＮ
は、３４５〜４０５ｍｌ溶出画分（６０ｍｌ）に、ＫＤ
Ｎは、３９０〜４２０ｍｌ溶出画分（３０ｍｌ）にそれ
ぞれ認められた。ＫＤＮとＣＭＰ−ＫＤＮが混在する３
９０〜４０５ｍｌの溶出画分（１５ｍｌ）を凍結濃縮し
たものについて、再度クロマトグラフィーを行った。２
回のクロマトグラフィーで得られたＣＭＰ−ＫＤＮ画分
を合わせて回収し、凍結乾燥を行った。このようにし
て、ＣＭＰ−ＫＤＮ２４９．３ｍｇ（０．４０ｍＭ当
量）を得ることができた。なお、収率は、４０．０％で
あった。

【００１８】

【実施例３】ブタ肝臓１００ｇに対して０．４Ｍ塩化カ
リウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．
０）２００ｍｌを加え、ワーリングブレンダー中で２０
秒間づつ２回磨砕処理を行った。このようにして得られ
た磨砕物について１時間攪拌抽出を行った後、１５，０
００×ｇ、２０分間遠心分離を行って脂肪層を除去し、
上澄液を回収した。また、沈澱物についても同様の操作
によって再抽出を行い、上澄液を回収した。これらの上
澄液３５０ｍｌについて、３５〜６０％飽和硫安分画処
理を行った後、１ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ９．０）に対して、４℃、６時間透析を
行った。透析後、２０，０００×ｇ、２０分間遠心分離
を行い、上澄液としてＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素抽出液４
５ｍｌを得た。

【００１９】この酵素抽出液について、実施例１と同様
の方法でＣＭＰ−ＫＤＮ合成能を測定した。

【００２０】一方、ウシ脳及びブタ脳、ブタ顎下腺、ブ
タ小腸、ブタ腎臓、ブタ脾臓についても、同様の処理を
行ってＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素抽出液を調製し、同様の
方法でＣＭＰ−ＫＤＮ合成酵素活性を測定した。各抽出
液のＣＭＰ−ＫＤＮ合成率を表２に示す。

【００２１】

【表２】

【００２２】

【実施例４】ＫＤＮ２６８．２ｍｇの（１ｍＭ当量）と
ＣＴＰ１，６４７．３ｍｇの（３ｍＭ当量）を１５ｍＭ
塩化マグネシウムを含む１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）６０ｍｌに溶解した後、実施例３で調製
した酵素抽出液４０ｍｌを加え、全量を１００ｍｌとし
た。３７℃、２時間酵素反応を行った後、反応液を３
０，０００×ｇ、２０分間遠心分離し、上澄液９５ｍｌ
を回収した。そして、この上澄液にアンモニア水でｐＨ
９．０に調整した冷蒸留水２００ｍｌを加えて希釈した
後、アミコン社製ＹＣ０５膜（分画分子量５００）を用
いてＵＦ濾過した。３０ｍｌまで濃縮した段階で、さら
に、同冷蒸留水１００ｍｌを加えて再びＵＦ濾過した。
この操作をもう一度繰り返し行って、得られた濾液４７
０ｍｌを全て回収し、凍結乾燥を行った。

【００２３】この凍結乾燥物に、アンモニア水でｐＨ
９．０に調整した１−プロパノール：水＝２：１の溶液
を適量加えて再溶解したものを、同溶液で平衡化させた
イアトロビーズカラム（２×１２０ｃｍ）に供給し、同
溶液によるシリカカラムクロマトグラフィーを行った。
得られた各溶出画分をＨＰＴＬＣプレート上で１−プロ
パノール：水＝２：１の溶媒を用いて２度展開した。Ｈ
ＰＴＬＣプレート上の２５４ｎｍにおける吸収を確認し
た後、ジフェニルアミン−アニリン試薬で発色させた。
未反応のＫＤＮのスポットのやや下に２５４ｎｍにおけ
るＣＭＰの吸収をも示すＣＭＰ−ＫＤＮのスポットを検
出した。未反応のＫＤＮは、４３２〜５１０ｍｌ溶出画
分（７８ｍｌ）に、ＣＭＰ−ＫＤＮは、４５３〜５２
３ｍｌ溶出画分（７０ｍｌ）にそれぞれ認められた。Ｋ
ＤＮとＣＭＰ−ＫＤＮが混在する４５３〜５１０ｍｌの
溶出画分（５７ｍｌ）を凍結濃縮したものについて再度
クロマトグラフィーを行った。２回のクロマトグラフィ
ーで得られたＫＤＮが若干混在するＣＭＰ−ＫＤＮ画分
を合わせて回収し、凍結濃縮を行った。

【００２４】そして、この濃縮液をアンモニア水でｐＨ
９．０に調整した冷蒸留水で平衡化したバイオ−ゲルＰ
−２カラム（２×１１０ｃｍ）に供給し、同溶液による
ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。ＣＭＰ−ＫＤＮ
は、３４５〜３９９ｍｌ溶出画分（５４ｍｌ）に、ＫＤ
Ｎは、３８７〜４３５ｍｌ溶出画分（４８ｍｌ）にそれ
ぞれ認められた。ＫＤＮとＣＭＰ−ＫＤＮが混在する３
８７〜３９９ｍｌの溶出画分（１２ｍｌ）を凍結濃縮し
たものについて、再度クロマトグラフィーを行った。２
回のクロマトグラフィーで得られたＣＭＰ−ＫＤＮ画分
を合わせて回収し、凍結乾燥を行った。このようにし
て、ＣＭＰ−ＫＤＮ１１２．２ｍｇ（０．１８ｍＭ当
量）を得ることができた。なお、収率は、１８．０％で
あった。

【００２５】

【発明の効果】本発明によれば、ＣＭＰ−ＫＤＮ合成能
の高いウシ顎下腺またはブタ肝臓の酵素抽出液の存在下
にＣＴＰとＫＤＮとを反応させてＣＭＰ−ＫＤＮを生成
せしめるので、効率的にＣＭＰ−ＫＤＮを合成すること
ができる。このＣＭＰ−ＫＤＮは、生化学などの分野に
おける研究試薬として有用性が期待される。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シチジントリホスフェイトと２−ケト−
３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノノン酸
とを、ウシ顎下腺またはブタ肝臓の酵素抽出液の存在下
に反応させてシチジンモノホスフェイト−２−ケト−３
−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノノン酸を
生成せしめることを特徴とするシチジンモノホスフェイ
ト−２−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラ
クト−ノノン酸の製造法。
【請求項２】ウシ顎下腺またはブタ肝臓の酵素抽出液
が、ウシ顎下腺またはブタ肝臓の水性抽出物上澄液の３
５〜６０％飽和硫安分画画分である請求項１記載の製造
法。