JPH04281792A - 組換え抗原を用いるｃ型肝炎アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料中のＣ型肝炎ウイ
ルス抗原と免疫学的に反応性の抗体の存在を同定するた
めのアッセイ、特に、抗体とＨＣＶゲノムの別々の領域
を表わす組換え抗原との複合体を検出するためのアッセ
イに関する。ＨＣＶゲノムの別々の抗原領域を表わす合
成ＤＮＡ配列を異種発現系にて分子クローニングおよび
発現によって得られる組換え抗原はＣ型肝炎ウイルス（
ＨＣＶ）に暴露された個体の体液中の抗体および抗原を
検出する試薬として用いられる。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】急性
ウイルス肝炎は、黄疸や肝圧痛など所定の患者の症状や
、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および
アスパルテートアミノトランスフェラーゼの血中濃度増
加によって臨床的に診断されている。また血清免疫アッ
セイが特殊な型のウイルス病原体の診断に用いられてい
る。歴史的には、臨床的に肝炎症状を示すがＡ型肝炎、
Ｂ型肝炎、エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂ
ａｒｒ）、またはサイトメガロウイルスには感染してい
ない患者は非Ａ−非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）として臨床的
に診断されていた。この疾病は慢性肝疾患に至る。

【０００３】よく知られている免疫学的特徴を有する肝
炎誘発ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝
炎ウイルス（ＨＢＶ）、およびＤ型肝炎ウイルス（ＨＤ
Ｖ）はそれぞれ別々の科のウイルスに属し、異なったウ
イルス組織、蛋白質構造、および複製形態を持っている
。ＮＡＮＢＨを公知の肝炎ウイルスの１つとの遺伝子的
類似性に基づいて同定しようとした試みは失敗に終わっ
ており、それから、ＮＡＮＢＨが異なった組織および構
造を有することが伺われる［フォーラーら（Ｆｏｗｌｅ
ｒ　　ｅｔ　　ａｌ）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，１
２：２０５−２１３（１９８３）およびウェイナーら（
Ｗｅｉｎｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒ
ｏｌ．，２１：２３９−２４７（１９８７）］。

【０００４】ＮＡＮＢＨに特異的な抗体を検出するアッ
セイの開発は、ＮＡＮＢＨに関連する抗原を誤って同定
してしまうという難点のためきわめて難しい。例えば、
ヴァンズら（Ｗａｎｄｓ，Ｊ．ｅｔ　　ａｌ）、米国特
許第４，８７０，０７６号、ヴァンズら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：６６０８−６６
１２（１９８２）、オーリら（Ｏｈｏｒｉ　　ｅｔ　　
ａｌ），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，１２：１６１−１
７８（１９８３）、ブラッドリィら（Ｂｒａｄｌｅｙ　
　ｅｔ　　ａｌ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．，８４：６２７７−６２８１（１９８７）、ア
カツカら（Ａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．ｅｔ　　ａｌ），Ｊ
．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，２０：４３−５６（１９８６
）、セトら（Ｓｅｔｏ，Ｂ．ｅｔ　　ａｌ），米国特許
出願第０７／２３４，６４１号（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔ
ｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｃｏｍｍｅｒｃｅ　　Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ　　ＴｅｃｈｎｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
　　Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖｉｒ
ｇｉｎｉａから入手可、番号８９１３８１６８）、タカ
ハシら（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ　　ａｌ），ヨ
ーロッパ特許出願第０２９３２７４号（１９８８年１１
月３０日公開）、およびシーリッグら（Ｓｅｅｌｉｇ，
Ｒ．ｅｔ　　ａｌ），ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ８８／０
０１２３を参照。

【０００５】最近、ヒュートンら（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，
Ｍ．ｅｔ　　ａｌ）により、他の肝炎誘発ウイルスが見
出され、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）として同定されて
いる（ヨーロッパ特許出願第０３１８２１６号、１９８
９年５月３１日）。 このウイルスについて述べる関連報文として、クオら（
Ｋｕｏ，Ｇ．ｅｔ　　ａｌ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４
：３５９−３６１（１９８９）およびチョーら（Ｃｈｏ
ｏ，Ｑ　　ｅｔ　　ａｌ），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：
３６２−３６４（１９８９）がある。ヒュートンらは、
ＮＡＮＢＨ感染患者にある抗体と免疫学的に反応する抗
原をコードするＨＣＶのｃＤＮＡ配列を単離し、ＨＣＶ
がＮＡＮＢＨを引き起すウイルスの１種であることを確
立したと報告している。そのＨＣＶに関連したｃＤＮＡ
配列は慢性ＨＣＶ感染症のチンパンジーからのプールし
た血清から得られたＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライ
ブラリィより単離された。そのｃＤＮＡライブラリィは
ほゞ平均サイズの約２００塩基対のｃＤＮＡ配列を含ん
でいた。そのｃＤＮＡライブラリィを、以前にＮＡＮＢ
Ｈにかかったことのある患者から得た血清中の抗体に結
合しうるクローン中で発現するコードしたエピトープに
ついてスクリーニングした。

【０００６】上記ヨーロッパ特許出願において、ヒュー
トンらは、数種のスーパーオキシドディスムターゼ融合
ポリペプチド（ＳＯＤ）の調製およびこれらＳＯＤ融合
ポリペプチドをＨＣＶスクリーニングアッセイの開発に
用いたことを記載している。このヨーロッパ特許出願に
記載されるもっとも複雑なＳＯＤ融合ポリペプチド（ｃ
１００−３と命名される）は、そのアミノ末端にヒトＳ
ＯＤの１５４アミノ酸、ＥｃｏＲＩ制限部位を含む合成
ＤＮＡアダプターの発現で導かれる５アミノ酸残基、ク
ローン化ＨＣＶｃＤＮＡフラグメントの発現で導かれる
３６３アミノ酸、およびＭＳ２クローニングベクターヌ
クレオチド配列から導かれる５カルボキシ末端アミノ酸
を含むと報告されている。このポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列をプラスミドを用いて酵母細胞で形質転換
した。 その形質転換細胞を培養し、分子量５４０００のポリペ
プチドを発現した。このものは分別抽出により約８０％
純度に精製された。

【０００７】ＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１およびＳＯＤ
−ＮＡＮＢ８１と命名された他のＳＯＤ融合ポリペプチ
ドが組換えバクテリアで発現された。その大腸菌融合ポ
リペプチドは分別抽出およびアニオンおよびカチオン交
換カラムを用いたクロマトグラフィによって精製された
。この精製によりＳＯＤ−ＮＡＮＢ５−１−１を約８０
％純度、ＳＯＤ−ＮＡＮＢ８１を約５０％純度で得た。

【０００８】ヒュートンらの組換えＳＯＤ融合ポリペプ
チドを微量滴定ウエルまたはポリスチレンビーズに被覆
し、血清試料のアッセイに用いた。被覆した微量滴定ウ
エルを希釈した試料とインキュベートし、インキュベー
ト後、そのウエルを洗浄し、放射性物質で標識した羊抗
ヒト抗体またはマウス抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ）結合体を用いて展色させた。これ
らのアッセイを急性後および慢性段階のＨＣＶ感染症の
検出に用いた。予備方法であるため、試料中の酵母また
は大腸菌抗体と望ましくない免疫反応を起すことを防ぐ
ために、酵母または大腸菌の抽出物を試料に添加してア
ッセイの特異性をもたらす必要がある。

【０００９】オルソ・ダイアグノスティック・システム
ズ・インコーポレイテッド（ＯｒｔｈｏＤｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ　　Ｉｎｃ．）がＨＣＶ抗原
に対する抗体を検出するイムノエンザイムアッセイを開
発している。このオルソ社のアッセイ法は、組換え酵母
／Ｃ型肝炎ウイルスＳＯＤ融合ポリペプチドｃ１００−
３で被覆したマイクロウエル中で、血清／血漿について
３段階で行なう方法である。 第１段階では、試料を試験ウエル中で直接希釈し、所定
期間インキュベートする。その試料中にＨＣＶ抗原に対
する抗体がある場合は、マイクロウエル表面に抗原−抗
体複合体が形成される。もし抗体が存在しなければ、複
合体は形成されず、非結合血清蛋白質または血漿蛋白質
は洗浄工程で除去される。

【００１０】第２段階では、抗ヒトＩｇＧネズミモノク
ローナル抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ配合体をマイ
クロウエルに加える。この配合体は該抗原−抗体複合体
の抗体部分に特異的に結合する。抗原−抗体複合体が存
在しなければ、この配合体も洗浄工程で除去される。第
３段階では、ｏ−フェニレンジアミン２ＨＣｌ（ＯＰＤ
）と過酸化水素からなる酵素検出系を試験ウエル中に加
える。結合した配合体が存在すれば、該ＯＰＤが酸化さ
れ、着色した最終生成物を得る。該着色生成物の形成後
、マイクロウエルに希硫酸を添加して発色形成反応を停
止させる。その発色最終生成物の色強度をマイクロウエ
ルリーダーで測定する。このアッセイは患者の血清およ
び血漿をスクリーニングするのに使用されうる。

【００１１】ＨＣＶは汚染された血液および血液製品に
より伝染されることが明らかにされている。輸血患者の
１０％が輸血後肝炎に羅っている。これらのうち約９０
％がＨＣＶの感染症であると診断されている。血液また
は血液製品による伝染を防ぐには、ＨＣＶキャリアなら
びに汚染した血液および血液製品を同定するための信頼
性が高く、高感度で特異性の高い診断および予知手段が
必要である。このように、信頼のおける有効な試薬を用
いるＨＣＶアッセイおよび試料中のＨＣＶ抗体の存在を
精確に検定する方法が要望されている。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料をＨＣＶ
ゲノムの別々の抗原領域を表わす組換え蛋白質の少なく
とも１種と接触させることを特徴とする試料中のＨＣＶ
抗原に対する抗体の存在を検定するための改良アッセイ
を提供するものである。

【００１３】合成ＤＮＡ配列を異種宿主で分子クローニ
ングおよび発現させて得られる組換え抗原も提供される
。簡単に言えば、ＨＣＶゲノムの別個の抗原領域を表わ
す所望の蛋白質をコードする合成ＤＮＡ配列を特定のコ
ドン選択によって大腸菌で発現させるのに最適となるよ
うに調製する。特に、ｃ１００−３抗原の免疫領域およ
びそのｃ１００−３領域の上流の２つの重複しない領域
を含む、ＨＣＶゲノムの３つの別個の抗原領域を表わす
２個の組換え蛋白質を提供する。両蛋白質は大腸菌ＣＭ
Ｐ−ＫＤＯシンセターゼ（ＣＫＳ）遺伝子とキメラ融合
の形で発現される。プラスミドｐＨＣＶ−３４で発現さ
れる第１蛋白質はＨＣＶ配列の１〜１５０アミノ酸を有
し、他のフラビウイルスの遺伝子組織との類似性からＨ
ＣＶ　　ＣＫＳ−コア（Ｃｏｒｅ）と命名された。

【００１４】ｐＨＣＶ−３４の用語は融合蛋白質自体も
指し、またｐＨＣＶ−３４’は、他の組換法または合成
法によって調製されたＨＣＶ配列の約１〜１５０アミノ
酸からのコア領域を表わすポリペプチドの命名に用いら
れる。他の組換法は異なる発現系を用いてｐＨＣＶ−３
４’を調製する場合に用いられる。ＨＣＶの合成ペプチ
ドの調製法は本発明者らの米国特許出願第４５６，１６
２号（１９８９年１２月２２日出願）に記載されている
。

【００１５】他の蛋白質はプラスミドｐＨＣＶ−３１で
発現され、ＮＳ−３およびＮＳ−４と命名される、ＨＣ
Ｖの推定的非構造領域にある２つの非連続コード領域か
らなっている。その２つの領域の第１のＨＣＶ配列のほ
ゞ１１９２−１４５７アミノ酸（クローン３３として知
られる）を示し、プラスミドｐＨＣＶ−２９で発現され
る。融合蛋白質自体もｐＨＣＶ−２９として表示され、
ｐＨＣＶ−２９’は他の組換法または合成法で調製され
るＨＣＶ配列のほゞ１１９２−１４５７アミノ酸で表わ
されるＮＳ−３領域からのポリペプチドを意味する。第
２領域はＨＣＶ配列のほゞ１６７６−１９３１アミノ酸
を示し、プラスミドｐＨＣＶ−２３で発現される。その
融合蛋白質はｐＨＣＶ−２３として表わされ、ｐＨＣＶ
−２３’は他の組換法または合成法で調製されるＨＣＶ
配列のほゞ１６７６−１３９１アミノ酸を有するＮＳ４
領域からのポリペプチドを意味する。

【００１６】クローンＢＣＤはその構築に用いられた用
法に基づいて命名された。クローンＢＣＤはｃ１００−
３のカルボキシ末端２５６アミノ酸からなり、ｃ１００
−３のアミノ末端１０８アミノ酸はクローンＳＣＤには
含まれない。ｐＨＣＶ−３１で得られる組換え抗原はＣ
ＫＳ−３３ｃ−ＢＣＤと命名される。この融合蛋白質も
ｐＨＣＶ−３１で示され、ｐＨＣＶ−３１’は異なる組
換法または合成法で調製されるＨＣＶ配列のほゞ１１９
２−１４５７アミノ酸およびほゞ１６７６−１９３１ア
ミノ酸からなる、ＮＳ−３およびＮＳ−４と命名される
ＨＣＶの推定上の非構造領域にある２つの非連続コード
領域からなるポリペプチドを意味する。図１にＨＣＶゲ
ノム内の該３つのＨＣＶ領域の位置を示す。これらの抗
原は、本発明の試料中のＨＣＶ抗体の存在を検出するイ
ムノアッセイに用いられる。

【００１７】本発明のアッセイの１態様は、ＨＣＶ抗原
と免疫学的に反応性の抗体の存在を同定するスクリーニ
ングアッセイである。簡単に言えば、液体試料を、２つ
の常法により結合させたＨＣＶ組換え蛋白質ｐＨＣＶ−
３４およびｐＨＣＶ−３１を含有する固体支持体とイン
キュベートし、最後に、抗体−抗原複合体を検出する。 このスクリーニングアッセイの変法として、固体支持体
にさらに組換えポリペプチドｃ１００−３を含有させる
方法がとられる。

【００１８】本発明の他のアッセイ態様は、ＨＣＶ抗原
と免疫学的に反応性の抗体の存在を明瞭に同定する確認
アッセイである。この確認アッセイは、ＨＣＶゲノムの
３つの別個の領域内の主エピトープを表わす合成ペプチ
ドまたは組換え抗原を含み、それらは上記スクリーニン
グアッセイに記載の２つの組換え蛋白質と同じ領域にあ
る。これらの領域は、ｐＨＣＶ−２３で示されるＮＳ４
（ｃ１００−３領域）、ｐＨＣＶ−２９で示されるＮＳ
３（３３ｃ領域）、それはｐＨＣＶ−２３（ｃ１００−
３領域）と一緒にｐＨＣＶ−３１で表わされ、さらにＨ
ＣＶのコア構造蛋白質と考えられるＨＣＶゲノムの５’
末端付近の領域（ｐＨＣＶ−３４）を含む。この確認ア
ッセイで用いられる組換え蛋白質は、第１のスクリーニ
ングアッセイで用いたものと異種源の抗原を有するべき
である（すなわち、大腸菌由来の組換え抗原でもまた１
部がＣＫＳ配列からなる組換え抗原であってもいけない
）。

【００１９】簡単に説明すると、第１のスクリーニング
アッセイで繰返し反応性であった検体について確認アッ
セイで再試験する。同定量の検体を含有するアリコート
を、固体支持体に個々に被覆した合成ペプチドまたは組
換え抗原と接触させ、最後に、抗体−抗原複合体を検出
する。

【００２０】ＨＣＶゲノムのｃ１００−３領域内のエピ
トープの血液反応性を合成ペプチドｓｐ６７およびｓｐ
６５を用いて確認する。このｃ１００−３領域内の血液
反応性の確認に、合成ペプチドｓｐ１１７も用い得る。 ＨＣＶの推定上のコア領域内のＨＣＶエピトープの血液
反応性は合成ペプチドｓｐ７５を用いて確認し得る。Ｈ
ＣＶの３３ｃ領域内のＨＣＶエピトープの血液反応性を
確認するために、組換え抗原を酵母中でスーパーオキシ
ドディスムターゼ（ＳＯＤ）でキメラ蛋白質として発現
される。合成ペプチドｓｐ６５（ＨＣＶ配列のｐ１８６
６−１９３０アミノ酸からなる）、ｓｐ６７（ｐ１６８
４−１７５０アミノ酸）、ｓｐ７５（ｐ１−７５アミノ
酸）、およびｓｐ１１７（ｐ１６８５−１８０５アミノ
酸）は本発明者らの米国特許出願第４５６，１６２号（
１９８９年１２月２２日出願、発明の名称：Ｃ型肝炎ア
ッセイ）に記載されている。

【００２１】他のアッセイ法としては、液体試料中のＨ
ＣＶ抗原と免疫学的に反応性の抗体の存在を同定するこ
とにより、陽性の結果が偽りではないことを確認するた
めの競合アッセイまたは中和アッセイであり、該アッセ
イにおいて試料は第一および第二の免疫学的に等価なア
リコートを調製するために用いられる。第一のアリコー
トは、ＨＣＶ抗原の少なくとも一つのエピトープを有す
るポリペプチドを結合させた固相支持体と、該抗体と複
合体を形成し得る条件下で接触させて検出可能な抗体−
ポリペプチド複合体を生成させるのに用い、第二のアリ
コートは、まず同じポリペプチドを結合させた固相支持
体と接触させるのに用いる。好ましい組換えポリペプチ
ドは、ｐＨＣＶ−２３に由来するものである。

【００２２】他のアッセイ法は、それぞれＨＣＶ抗原の
別個のエピトープを有する複数の組換えポリペプチドと
試料とを、該抗体がこれらポリペプチドの少なくとも一
つと複合体を生成するのに適した条件下で同時に接触さ
せ、該複合体を発色試薬と反応させることにより抗体−
ポリペプチド複合体を検出することによる、ＨＣＶ抗原
と免疫学的に反応性の抗体の存在を同定するためのイム
ノドットアッセイ法である。該方法で使用される好まし
い組換えポリペプチドとしては、ｐＨＣＶ−２３、ｐＨ
ＣＶ−２９、ｐＨＣＶ−３１、ｐＨＣＶ−３４に由来す
るポリペプチド、並びに酵母中でスーパーオキシドジス
ムターゼ（ＳＯＤ）とのキメラタンパク質として発現さ
れるｃ１００−３に由来するポリペプチドが挙げられる
。

【００２３】上記すべてのアッセイにおいて、固相支持
体上に吸着させたポリペプチドに試料を接触させる前に
試料を希釈するのが好ましい。試料は、全血、血清、血
漿、脳脊髄液、およびリンパ球や細胞培養上澄み液など
の種々の生物学的試料から得ることができる。固相支持
体物質としては、セルロース物質（紙やニトロセルロー
スなど）、天然および合成のポリマー物質（ポリアクリ
ルアミド、ポリスチレン、および綿など）、多孔質ゲル
（シリカゲル、アガロース、デキストランおよびゼラチ
ンなど）、および無機物質（不活化アルミナ、硫酸マグ
ネシウムおよびガラスなど）などを用いることができる
。適当な固相支持体物質は、アッセイにおいてよく知ら
れた種々の物理形態、たとえばマイクロタイターウエル
、試験管、ビーズ、ストリップ、膜および微細粒子など
で用いることができる。非イムノドットアッセイのため
に好ましい固相支持体は、ポリスチレンビーズである。 イムノドットアッセイのために好ましい固相支持体は、
ニトロセルロースである。

【００２４】本発明のアッセイに使用する抗体−抗原複
合体を検出するための適当な方法および試薬は、市販さ
れているか、または当該技術分野でよく知られている。 代表的な方法においては、酵素試薬、放射性同位元素試
薬、蛍光試薬、発光試薬または化学発光試薬などの検出
試薬を用いる。これら試薬は、公知方法に従ってハプテ
ン−標識抗ハプテン抗体検出系、たとえばビオチン−標
識抗ビオチン抗体系を調製して抗体−抗原複合体を検出
するのに用いる。

【００２５】本発明はまた、固相支持体に結合したＨＣ
Ｖ抗原の少なくとも一つのエピトープを有するポリペプ
チド並びに必要な試料調製試薬、洗浄試薬、検出試薬お
よびシグナル生成試薬などを含むアッセイキットをも包
含する。本発明の構築物に有用なプラスミドを含有する
大腸菌株は、１９９０年８月１０日にアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーラ
ンド）にＡＴＣＣ６８３８０（ｐＨＣＶ−２３）、ＡＴ
ＣＣ６８３８１（ｐＨＣＶ−２９）、ＡＴＣＣ６８３８
２（ｐＨＣＶ−３１）、ＡＴＣＣ６８３８３（ｐＨＣＶ
−３４）の受託番号にて寄託してある。

【００２６】以下、本発明をさらに詳しく説明する。本
発明は、試料中に存在するＨＣＶ抗原に対する抗体を検
出するためのアッセイ法に関する。好ましくは、ヒト血
清または血漿を試料希釈液中で希釈し、ＨＣＶゲノムの
別個の抗原領域を示す組換えポリペプチドをコーティン
グしたポリスチレンビーズとともにインキュベートする
。試料中に抗体が存在しておれば、該抗体は該抗原ポリ
ペプチドと複合体を形成し、ポリスチレンビーズに固定
されるであろう。複合体が形成された後、ビーズを洗浄
することにより未結合の物質および試薬を除き、該ビー
ズ−抗原−抗体複合体を、ヒト抗体に向けられた西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗体を含有する溶液と反
応させる。ついで、このペルオキシダーゼ酵素は、ビー
ズにすでに固定化された抗原−抗体複合体に結合する。 最後の反応において、該西洋ワサビペルオキシダーゼを
ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素と接触させる
と黄色−オレンジ色が生成する。この色の強度は、ビー
ズに固定化した抗原に最初に結合した抗体の量に正比例
する。

【００２７】ＨＣＶ抗原エピトープを有する好ましい組
換えポリペプチドは、他の公知の免疫学的に反応性の試
薬と同様のアミノ酸配列を有しある種の免疫学的反応性
を有することが同定されたポリペプチドをコードするＨ
ＣＶゲノムの部分から選択された。（ポリペプチドの免
疫学的反応性は、ＨＣＶゲノムのｃＤＮＡ断片で形質転
換した大腸菌クローンの細胞抽出物をＨＣＶ感染血清と
反応させることにより最初に同定した。ｃＤＮＡが組み
込まれたクローンにより発現されたポリペプチドは、Ｈ
ＣＶ抗原に対する抗体を含有することが知られている血
清に対して免疫学的に反応性であった）。しかしながら
、所定のアミノ酸配列を分析するだけでは、免疫学的反
応性の予測は大まかなものでしかない。所定のアミノ酸
配列を調製し、この推定配列をアッセイで試験する以外
には、免疫活性を確かめるための常に予測可能な方法は
存在しない。

【００２８】ＨＣＶ抗原に対する抗体の存在を検出する
ためのＨＣＶゲノムの別個の抗原領域を示す組換えポリ
ペプチドの使用を、下記表１に示す。 表１

【表１】 チンパンジーＰａｎにおけるＨＣＶ感染の経過を、組換
えｃ１００−３ポリペプチドを用いた１のアッセイ、お
よびそれぞれプラスミドｐＨＣＶ−３４およびｐＨＣＶ
−３１により発現された２つの組換え抗原であるＣＫＳ
−コア（ｐＨＣＶ−３４）およびｐＨＣＶ−３３ｃ−Ｂ
ＣＤ（ｐＨＣＶ−３１）を用いた別の改良アッセイによ
り追跡した。組換えｐＨＣＶ−３４および組換えｐＨＣ
Ｖ−３１タンパク質を用いたアッセイでは、ｃ１００−
３を用いたアッセイにより抗体を検出する３週間前に血
漿抗体を検出することができた。

【００２９】上記２つのアッセイによりＰａｎおよび他
の６つのチンパンジーにおいてＨＣＶ感染の経過を追跡
した研究の結果を、図２にまとめて示す。両方のアッセ
イとも接種前には陰性の結果を示し、被験動物をＨＣＶ
で接種した後には両方のアッセイで抗体の存在が検出さ
れた。しかしながら、これら２つのアッセイの比較にお
いて、ｐＨＣＶ−３４およびｐＨＣＶ−３１を用いた改
良スクリーニングアッセイでは、７匹のチンパンジーの
うち６匹において一層早いまたは同じ採血日にＨＣＶ抗
原に対する血清変換を検出することができた。これらチ
ンパンジーを用いた研究から得られたデータは、ｐＨＣ
Ｖ−３４およびｐＨＣＶ−３１タンパク質を用いたアッ
セイによりＨＣＶ抗体の全検出が著しく増大することを
明らかに示している。この試験は、殆どの動物において
該疾患の急性期（ＡＬＴレベルの上昇として示される）
における血清変換を検出するのに充分の感度を有する。 同様に重要な点は、前以て接種していない試料で反応性
のものはないという、試験の高特異性である。

【００３０】本発明を実施するのに有用なポリペプチド
は、組換え法を用いて製造する。所望のポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列は、所望の全配列の断片から組み
立てるのが好ましい。ＨＣＶゲノムの合成ＤＮＡ断片は
、それらの対応アミノ酸配列に基づいて合成することが
できる。一旦アミノ酸配列が選択されたら、ついで選択
した系での発現を容易にするように最適化したコドンを
用い、逆翻訳して（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｌａｔ
ｅｄ）相補的ＤＮＡ配列を決定する。一般に、これら断
片は、よく知られた自動化法および装置を用いて調製す
る。完全な配列が調製されたら所望の配列を発現ベクタ
ー中に組み込み、該ベクターを宿主細胞中に形質転換す
る。ついで、該ＤＮＡ配列を宿主細胞により発現させて
所望のポリペプチドを得、生成したポリペプチドを宿主
細胞から、または宿主細胞を培養した培地から回収する
。小さなペプチドを組換え法により調製する場合は、一
つの鎖の中で所望のポリペプチドの幾つかのコピーをコ
ードする単一のＤＮＡ配列を調製するのが有利である。 ついで、この長い鎖を単離し、該鎖を短い所望の配列に
開裂させる。

【００３１】複製連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いてＨＣＶ
ゲノムのいかなる部分からもＰＣＲ増幅遺伝子を生成さ
せ、ついで、これをクローニングし、合成遺伝子の場合
と同様にして発現させることもできる。使用可能なベク
ター系の例としては、植物発現系、細菌発現系、酵母発
現系、昆虫発現系、および哺乳動物発現系などが挙げら
れる。使用した発現系での発現が最適となるようにコド
ンを選択することが好ましい。

【００３２】好ましい発現系では、融合系のための担体
遺伝子を利用し、組換えＨＣＶタンパク質を大腸菌酵素
であるＣＫＳ（ＣＴＰ：ＣＭＰ−３−デオキシ−マンノ
−オクツロソン酸シチジリルトランスフェラーゼまたは
ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ）との融合タンパク質とし
て発現させる。タンパク合成のＣＫＳ法は、ボリング（
Ｂｏｌｌｉｎｇ）による米国特許出願第１６７，０６７
号（１９８８年３月１１日出願）および同第２７６，２
６３号（１９８８年１１月２３日出願）（ＥＰＯ　８９
１０２９２８２）に開示されている。ラムダＰＬベクタ
ー系（その特徴は、強力なラムダＰＬプロモーター、強
力な３−フレーム（ｔｈｒｅｅ−ｆｒａｍｅ）翻訳ター
ミネーターｒｒｎＢｔ１、およびＡＴＧコドンにおける
翻訳開始）を含む他の発現系も利用することができる。

【００３３】本発明においては、大腸菌中での高レベル
の発現を容易にするように最適化したコドンを用い、目
的組換えＨＣＶ抗原をコードするアミノ酸配列を逆翻訳
した。個々のオリゴヌクレオチドの合成は、マンデツキ
（Ｍａｎｄｅｃｋｉ）らの米国特許出願第８８３，２４
２号（１９８６年７月８日出願）（ＥＰＯ　８７１０９
３５７．１）に開示されたオリゴヌクレオチド特異的二
本鎖切断修復法により行った。別法として、個々のオリ
ゴヌクレオチドの合成はまた、製造業者により推奨され
る方法および試薬を用い、アプライドバイオシステム３
８０Ａ　ＤＮＡ合成機上で行うこともできる。個々のオ
リゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、サンガーのチェイン
ターミネーター法（サンガーら、Ｊ．Ｍｏｌｅ．Ｂｉｏ
ｌ．，１６２：７２９（１９８２））により確認した。

【００３４】ついで、これら個々の遺伝子断片をアニー
ルおよびライゲートし、ＣＫＳ融合ベクターｐＪＯ２０
０中のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサブフラグメントとして
クローニングした。ついでサンガーのチェインターミネ
ーター法によりＤＮＡ配列を確認した後、このサブフラ
グメントを適当な制限酵素で消化し、ゲル精製し、ライ
ゲートし、上記ＣＫＳ融合ベクターｐＪＯ２００中にＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして再びクローニ
ングした。得られたクローンのマッピングをして、ＣＫ
Ｓ（ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼ）遺伝子の３’末端に
挿入されたＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ　ＨＣＶフラグメン
トからなるハイブリッド遺伝子を同定した。得られた融
合タンパク質は、ｌａｃプロモーターの制御下で、ＣＫ
Ｓタンパク質の２３９個のアミノ酸がＨＣＶの種々の領
域に融合されていた。

【００３５】組換えタンパク質の合成、クローニングお
よび特徴付け、並びにこれらポリペプチドを用いたアッ
セイの好ましい態様は、下記実施例に示してある。実施
例１および２は、それぞれＣＫＳ−コアおよびＣＫＳ−
３３−ＢＣＤの合成およびクローニングを示す。実施例
３はスクリーニングアッセイを記載する。実施例４は確
認アッセイを記載する。実施例５は競合アッセイを記載
する。実施例６はイムノドットアッセイを記載する。

【００３６】試薬および酵素 ルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（Ｌ
Ｂ）およびスーパーブロース（Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）
ＩＩ（乾燥形）などの培地は、ギブコ・ラボラトリーズ
・ライフ・テクノロジーズ（マジソン、ウイスコンシン
）から入手した。制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノー断片、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ、核酸分子量標準、Ｍ１３シークエンシン
グシステム、Ｘ−ｇａｌ（５−ブロモ−４ークロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）、ＩＰＴＧ（イ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）、グリセリン
、ジチオトレイトール、４−クロロ−１−ナフトールは
、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（イン
ディアナポリス、インディアナ）またはニュー・イング
ランド・バイオラブズ（ビバーリー、マサチューセッツ
）またはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ・ライフ
・テクノロジーズ（ガイセルスバーグ、メリーランド）
から購入した。

【００３７】前染色タンパク質分子量標準、アクリルア
ミド（結晶化、電気泳動グレード９９％）、Ｎ，Ｎ’−
メチレン−ビス−アクリルアミド（ＢＩＳ）、Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥ
Ｄ）およびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、バイ
オラド・ラボラトリーズ（リッチモンド、カリフォルニ
ア）から購入した。リゾチームおよびアンピシリンは、
シグマ・ケミカル（セントルイス、ミズーリ）から購入
した。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識第二抗体は、キ
ルケガール＆ペリー・ラボラトリーズ（ガイセルスバー
グ、メリーランド）から入手した。シープラーク（Ｓｅ
ａｐｌａｑｕｅ）Ｒアガロース（低融点アガロース）は
、ＦＭＣバイオプロダクツ（ロックランド、メイン）か
ら購入した。

【００３８】Ｔ５０Ｅ１０は、５０ｍＭトリス（ｐＨ８
．０）、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含有しており、１×ＴＧ
は、１００ｍＭトリス（ｐＨ７．５）および１０％グリ
セリンを含有しており、２×ＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷緩衝
液は、１５％グリセリン、５％ＳＤＳ、１００ｍＭトリ
ス塩基、１Ｍ　β−メルカプトエタノールおよび０．８
％ブロモフェノールブルー染色を含有しており、ＴＢＳ
は、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）および１５０ｍＭ塩
化ナトリウムを含有しており、ブロッキング溶液は、Ｔ
ＢＳ中の５％カーネーション（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）無
脂乾燥乳を含有していた。

【００３９】宿主細胞培養、ＤＮＡ源およびベクター大
腸菌ＪＭ１０３細胞、およびｐＵＣ８、ｐＵＣ１８、ｐ
ＵＣ１９およびＭ１３クローニングベクターは、ファル
マシア・ＬＫＢ・バイオテクノロジー（ピスカタウエイ
、ニュージャージー）から購入し、コンピテントなエピ
キュリアン・コリ（ＥｐｉｃｕｒｅａｎＴＭ　ｃｏｌｉ
）株ＸＬ１−ブルーおよびＪＭ１０９は、ストラタジー
ン・クローニング・システムズ（ラジョラ、カリフォル
ニア）から購入した。ＲＲ１細胞は、コリ・ジェネティ
ック・ストック・センター、エール大学、ニューヘブン
、コネチカットから入手し、大腸菌ＣＡＧ４５６細胞は
カロル・グロス（ＣａｒｏｌＧｒｏｓｓ）博士（ウイス
コンシン大学、マジソン、ウイスコンシン）から入手し
た。ベクターｐＲＫ２４８．ｃｌｔｓは、ドナルド・ア
ール・ヘリンスキー（Ｄｏｎａｌｄ　Ｒ．Ｈｅｌｉｎｓ
ｋｉ）博士（カリフォルニア大学、サンジエゴ、カリフ
ォルニア）から入手した。

【００４０】一般的方法 制限酵素消化はすべて、提供者の指示に従って行った。 １μｇのＤＮＡ当たり少なくとも５単位の酵素を用い、
ＤＮＡの消化を完了するのに充分なインキュベーション
を行った。ミニセルライセートＤＮＡ調製、フェノール
−クロロホルム抽出、ＤＮＡのエタノール沈殿、アガロ
ース上でのＤＮＡの制限分析、ＤＮＡ断片の低融点アガ
ロースゲル精製については標準法を用いた［マニアチス
ら、モレキュラー・クローニング．ア・ラボラトリー・
マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）（ニューヨーク
、コールド・スプリング・ハーバー、１９８２）］。大
腸菌株からのプラスミドの単離には、アルカリ溶解法お
よびセシウムクロライド−臭化エチジウム密度勾配法（
マニアチスら、上記文献）を用いた。Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼには標準緩衝液
を用いた（マニアチスら、上記文献）。

【００４１】

【実施例】つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。 実施例１（ＣＫＳ−コア） Ａ．プラスミドｐＪＯ２００の構築：クローニングベク
ターｐＪＯ２００は、ＣＫＳタンパク質への組換えタン
パク質の融合を可能にする。このプラスミドは、修飾ｌ
ａｃプロモーターをＫｄｓＢ遺伝子断片（ＣＫＳタンパ
ク質の大腸菌ＣＭＰ−ＫＤＯシンセターゼの全２４８ア
ミノ酸のうち最初の２３９アミノ酸をコードする）に融
合させたｐＢＲ３２２、および該ＫｄｓＢ遺伝子断片の
末端に融合させた合成リンカーからなる。このクローニ
ングベクターｐＪＯ２００は、ベクターｐＴＢ２１０を
修飾したものである。上記合成リンカーには、遺伝子の
挿入のための複数の制限部位、翻訳停止シグナル、およ
びｔｒｐＡ　ｒｈｏ独立翻訳ターミネターが含まれてい
る。タンパク質合成のためのＣＫＳ法並びにｐＴＢ２１
０を含むＣＫＳベクターは、ボリングの米国特許出願第
１６７，０６７号（１９８８年３月１１日出願）および
同第２７６，２６３号（１９８８年１１月２３日出願）
（ＥＰＯ　８９１０２９２８２）にそれぞれ開示されて
いる。

【００４２】Ｂ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−コア発現ベクターの
調製：ＨＣＶゲノムのアミノ酸１−１５０を示す６つの
個々のヌクレオチドをライゲートし、４６６塩基対のＥ
ｃｏＲ１−ＢａｍＨ１としてＣＫＳ融合ベクターｐＪＯ
２００中にクローニングした（図３）。このプラスミド
（ｐＨＣＶ−３４と称する）の完全なＤＮＡ配列、およ
び生成したｐＨＣＶ−３４組換え抗原の全アミノ酸配列
を図４〜８に示す。得られた融合タンパク質ＨＣＶ　Ｃ
ＫＳ−コアは、ＣＫＳの２３９個のアミノ酸、リンカー
ＤＮＡ配列による７個のアミノ酸、およびＨＣＶの最初
の１５０個のアミノ酸からなる（図９）。

【００４３】上記ｐＨＣＶ−３４プラスミドおよびＣＫ
ＳプラスミドｐＴＢ２１０を、塩化カルシウム法でコン
ピテントにした大腸菌Ｋ−１２株ＸＬ−１（ｒｅｃＡ１
、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｈｓｄＲ１
７、ｓｕｐＥ４４、ｒｅｌＡ１、ｌａｃ／Ｆ’、ｐｒｏ
ＡＢ、ｌａｃｌｑＺＤＭ１５、ＴＮ１０）中に形質転換
した。これら構築物において、ＣＫＳ融合タンパク質の
発現はｌａｃプロモーターの制御下で行われ、ＩＰＴＧ
を添加することにより誘発した。独立の要素として複製
させたこれらプラスミドは移動できないものであり、細
胞当たり約１０〜３０コピーにて維持した。

【００４４】Ｃ．組換えＨＣＶ−コアの特徴付け：クロ
ーンｐＨＣＶ−３４が独特のＨＣＶ−コアタンパク質を
発現したことを確立するため、酵母エキス、トリトン、
リン酸塩、グルコースおよびアンピシリンからなる増殖
培地中、３７℃にてｐＨＣＶ−３４／ＸＬ−１培養液を
一夜増殖させた。培養液のＯＤ６００が１．０に達した
ときにＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで加えて発現を誘発し
た。 試料（１．５ｍｌ）を１時間間隔で取り、細胞をペレッ
ト化し、２×ＳＤＳ／ＰＡＧＥ負荷緩衝液中にＯＤ６０
０が１．０となるまで再懸濁した。これら調製試料のア
リコート（１５μｌ）を、２つずつの１２．５％ＳＤＳ
／ＰＡＧＥゲル上に分離した。

【００４５】一方のゲルを５０％メタノールおよび１０
％酢酸からなる溶液中に室温で２０分間固定し、ついで
５０％メタノールおよび１０％酢酸からなる溶液中の０
．２５％クーマシーブルー染料で３０分間染色した。 １０％メタノールおよび７％酢酸からなる溶液を用いて
３〜４時間、または透明な背景が得られるまで脱染色を
行った。

【００４６】図１０は、大腸菌中でのｐＨＣＶ−３４タ
ンパク質の発現を示す。分子量標準はレーンＭ（図示せ
ず）で行った。レーン１は、ＨＣＶ配列を含まないプラ
スミドｐＪＯ２００−ＣＫＳベクターである。左端の矢
印は、分子量マーカー（上から下へ１１０，０００；８
４，０００；４７，０００；３３，０００；２４，００
０および１６，０００ダルトン）の移動度を示す。右側
の矢印は、組換えＨＣＶタンパク質の移動度を示す。レ
ーン２は、誘発前のｐＨＣＶ−３４発現ＣＫＳ−コア（
アミノ酸１〜１５０）を含有する大腸菌溶解液である。 レーン３は、誘発３時間後のものである。これら結果は
、組換えタンパク質ｐＨＣＶ−３４が４８，０００ダル
トンの分子サイズに対応する見かけの移動度を有するこ
とを示している。このことは、予測される分子量の４３
，７５０ダルトンに対比して許容されるものである。

【００４７】第二の１２．５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルか
らのタンパク質は、イムノブロッティングのため電気泳
動によりニトロセルロースに移した。移動したタンパク
質を含有するニトロセルロースシートをブロッキング溶
液とともに１時間インキュベートし、大腸菌Ｋ−１２株
ＸＬ−１溶解液を含有するＴＢＳ中に希釈したＨＣＶ患
者血清とともに４℃で一夜インキュベートした。このニ
トロセルロースシートをＴＢＳ中で３回洗浄し、ついで
ＨＲＰＯ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧとともにインキュベート
し、１０％ウシ胎仔血清を含有するＴＢＳ中に希釈した
。このニトロセルロースをＴＢＳで３回洗浄し、４−ク
ロロ−１−ナフトール（２ｍｇ／ｍｌ）、０．０２％過
酸化水素および１７％メタノールを含有するＴＢＳ中で
発色させた。クローンＨＣＶ−３４は、ＨＣＶ患者血清
を用いたときに４８，０００ダルトンの強い免疫反応バ
ンドを示した。それゆえ、クーマシー染色タンパク質ゲ
ル中の主要なタンパク質は免疫反応性であった。正常な
ヒト血清は、ｐＨＣＶ−３４のいかなる成分とも反応し
なかった。

【００４８】実施例２（ＨＣＶ　ＣＫＳ−３３Ｃ−ＢＣ
Ｄ） Ａ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−３３Ｃ−ＢＣＤ発現ベクターの調
製：このＨＣＶ　ＣＫＳ−３３−ＢＣＤ抗原発現組換え
クローンの構築は、下記３段階で行った。まず、ＨＣＶ
　ＣＫＳ−ＢＣＤ抗原を発現するクローンを構築し、ｐ
ＨＣＶ−２３と称した。第二に、ＨＣＶ　ＣＫＳ−３３
抗原を発現するクローンを構築し、ｐＨＣＶ−２９と称
した。最後に、ｐＨＣＶ−２３からＨＣＶＢＣＤ領域を
切り出し、ｐＨＣＶ−２９中に挿入してＨＣＶ　ＣＫＳ
−３３−ＢＣＤ抗原を発現するクローンを構築し、ｐＨ
ＣＶ−３１と称した。

【００４９】プラスミドｐＨＣＶ−２３を構築するため
、ＨＣＶゲノムのアミノ酸１６７６〜１９３１を示す１
３の個々のオリゴヌクレオチドをライゲートし、３つの
別々のＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１サブフラグメントとして
ＣＫＳ融合ベクターｐＪＯ２００中にクローニングした
。ＤＮＡ配列を確認した後、これら３つのサブフラグメ
ント（それぞれＢ、ＣおよびＤと称する）を適当な制限
酵素で消化し、ゲル精製し、ライゲートし、７８１塩基
対のＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１断片としてＣＫＳ融合ベク
ターｐＪＯ２００中にクローニングした（図１１）。得
られたプラスミド（ｐＨＣＶ−２３と称する）は、ｌａ
ｃプロモーターの制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−ＢＣＤ抗原
を発現する。このＨＣＶ　ＣＫＳ−ＢＣＤ抗原は、ＣＫ
Ｓの２３９個のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列による７
個のアミノ酸、ＨＣＶ　ＮＳ４領域からの２５６個のア
ミノ酸（アミノ酸１６７６〜１９３１）、およびリンカ
ーＤＮＡ配列によるさらに１０個のアミノ酸からなって
いる。

【００５０】プラスミドｐＨＣＶ−２９を構築するため
、ＨＣＶゲノムのアミノ酸１１９２〜１４５７を示す１
２の個々のオリゴヌクレオチドをライゲートし、２つの
別々のＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１サブフラグメントとして
ＣＫＳ融合ベクターｐＪＯ２００中にクローニングした
。ＤＮＡ配列を確認した後、これら２つのサブフラグメ
ントを適当な制限酵素で消化し、ゲル精製し、ライゲー
トし、８１６塩基対のＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１断片とし
てＣＫＳ融合ベクターｐＪＯ２００中にクローニングし
た（図１２）。得られたプラスミド（ｐＨＣＶ−２９と
称する）は、ｌａｃプロモーターの制御下でＣＫＳ−３
３抗原を発現する。このＨＣＶ　ＣＫＳ−３３抗原は、
ＣＫＳの２３９個のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列によ
る８個のアミノ酸、およびＨＣＶ　ＮＳ３領域からの２
６６個のアミノ酸（アミノ酸１１９２〜１４５７）から
なっている。

【００５１】プラスミドｐＨＣＶ−３１を構築するため
、ＨＣＶ−ＢＣＤ領域を示すｐＨＣＶ−２３からの７８
１塩基対ＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１断片をリンカー適合さ
せて（ｌｉｎｋｅｒ−ａｄａｐｔｅｄ）Ｃｌａ１−Ｂａ
ｍＨ１断片を生成させ、ついで該断片をゲル精製し、ｐ
ＨＣＶ−２９中のＣｌａ１−ＢａｍＨ１部位にライゲー
トした（図１３）。得られたプラスミド（ｐＨＣＶ−３
１と称する）は、ｌａｃプロモーターの制御下でｐＨＣ
Ｖ−３１抗原を発現する。ｐＨＣＶ−３１の完全ＤＮＡ
配列、および生成したＨＣＶ　ＣＫＳ−３３−ＢＣＤ組
換え抗原のアミノ酸配列を図１４〜２０に示す。このＨ
ＣＶ　ＣＫＳ−３３−ＢＣＤ抗原は、ＣＫＳの２３９個
のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列による８個のアミノ酸
、ＨＣＶ　ＮＳ３領域からの２６６個のアミノ酸（アミ
ノ酸１１９２〜１４５７）、リンカーＤＮＡ配列による
２個のアミノ酸、ＨＣＶ　ＮＳ４領域からの２５６個の
アミノ酸（アミノ酸１６７６〜１９３１）、およびリン
カーＤＮＡ配列によるさらに１０個のアミノ酸からなっ
ている。図２１は、ｐＨＣＶ−３１抗原の模式図である
。このｐＨＣＶ−３１プラスミドを、実施例１のｐＨＣ
Ｖ−３４およびＣＫＳ−ｐＴＢ２１０プラスミドと同様
にして大腸菌Ｋ−１２株ＸＬ−１中に形質転換した。

【００５２】Ｂ．組換えＨＣＶ　ＣＫＳ−３３−ＢＣＤ
の特徴付け：実施例１のｐＨＣＶ　ＣＫＳ−コアと同様
にしてｐＨＣＶ　ＣＫＳ−３３−ＢＣＤの特徴付けを行
った。それぞれ組換え融合タンパク質ＣＫＳ−３３ｃ、
ＣＫＳ−ＢＣＤおよびＣＫＳ−３３−ＢＣＤを発現する
プラスミドｐＨＣＶ−２９（図２２）、ｐＨＣＶ−２３
（図２３）およびｐＨＣＶ−３１（図２４）を含有する
大腸菌溶解液について、ｐＨＣＶ−２３、ｐＨＣＶ　Ｓ
ＤＳ／ＰＡＧＥゲルを行った。これら３つのものすべて
について、レーンＭで分子量標準を用い、左側の矢印は
分子量マーカーの移動度を示す（上から下へ１１０，０
００；８４，０００；４７，０００；３３，０００；２
４，０００および１６，０００ダルトン）。図２２にお
いて、レーン１は、誘発前のＨＣＶ　ＣＫＳ−３３ｃ（
アミノ酸１１９２〜１４５７）発現ｐＨＣＶ−２９を含
有する大腸菌溶解液であり、レーン２は誘発４時間後の
ものである。これらの結果は、組換えｐＨＣＶ−２９融
合タンパク質が６０，０００ダルトンの分子サイズに対
応する見かけの移動度を有することを示している。この
ことは、５４，９１１の予測される分子量に対比して許
容されるものである。

【００５３】図２３において、レーン１は、ＨＣＶ配列
を含まないｐＪＯ２００　ＣＫＳベクターを含有する大
腸菌溶解液である。レーン２は、ＨＣＶ　ＣＫＳ−Ｂ（
アミノ酸１６７６〜１７９０）を発現するｐＨＣＶ−２
０のものである。レーン３は、融合タンパク質ｐＨＣＶ
−２３（アミノ酸１６７６〜１９３１）のものである。 これらの結果は、組換えｐＨＣＶ−２３融合タンパク質
が５５，０００ダルトンの分子サイズに対応する見かけ
の移動度を有することを示している。このことは、５５
，０７０の予測される分子量に対比して許容されるもの
である。

【００５４】図２４において、レーン１は、ＨＣＶ配列
を含まないｐＪＯ２００　ＣＫＳベクターを含有する大
腸菌溶解液である。レーン２は、誘発前のＣＫＳ−３３
ｃ−ＢＣＤ融合タンパク質（アミノ酸１１９２〜１４５
７および１６７６〜１９３１）を発現するｐＨＣＶ−３
１のものであり、レーン３は誘発２時間後のものである
。これらの結果は、組換えｐＨＣＶ−３１（ＣＫＳ−３
３ｃ−ＢＣＤ）融合タンパク質が９０，０００ダルトン
の分子サイズに対応する見かけの移動度を有することを
示している。このことは、８２，９９５の予測される分
子量に対比して許容されるものである。

【００５５】ｐＨＣＶ−３１／Ｘ１−１培養液からのＳ
ＤＳ／ＰＡＧＥゲルの一つについてもイムノブロット分
析を行った。ＨＣＶに暴露された個体からのヒト血清は
、９０，０００ダルトンにおける主要なｐＨＣＶ−３１
バンドと強く反応した。しかしながら、正常なヒト血清
は、ｐＨＣＶ−３１（ＣＫＳ−３３−ＢＣＤ）調製物の
いかなる成分とも反応しなかった。

【００５６】実施例３（スクリーニングアッセイ）ＨＣ
Ｖゲノムからの他の抗原領域からのエピトープとともに
ｃ１００−３内のエピトープを有する組換えポリペプチ
ドの使用により、ｃ１００−３を単独で用いたＨＣＶ免
疫アッセイに比べてアッセイの感度が増大し特異性の優
れた免疫アッセイが得られる。

【００５７】現在のところ好ましいスクリーニングアッ
セイにおいては、大腸菌により発現された２つの組換え
タンパク質であるＣＫＳ−コア（ｐＨＣＶ−３４）およ
びＣＫＳ−３３−ＢＣＤ（ｐＨＣＶ−３１）（ＨＣＶゲ
ノムの３つの別個の領域を示す）を用いて行う。これら
の組換えポリペプチドは、上記方法により調製した。ス
クリーニングアッセイにおいて、同じポリスチレンビー
ズ上に両方の組換え抗原をコーティングする。スクリー
ニングアッセイの変法においては、ポリスチレンビーズ
をＳＯＤ−融合ポリペプチドであるｃ１００−３でコー
ティングしてもよい。

【００５８】ポリスチレンビーズをまず蒸留水およびプ
ロパノールで洗浄し、ついで０．４Ｍ　ＮａＣｌおよび
０．００２２％トリトンＸ−１００（ｐＨ６．５）を含
有する０．１Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ中に０．５〜
２．０μｇ／ｍｌに希釈したｐＨＣＶ−３１および０．
１〜０．５μｇ／ｍｌに希釈したｐＨＣＶ−３４を含有
する溶液とともにインキュベートする。これらビーズを
抗原溶液中、３８〜４２℃で２時間（±１０分）インキ
ュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％（
ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００中に浸漬する。ついで、３
８〜４２℃にて６０分間、ビーズをリン酸緩衝食塩水（
ＰＢＳ）で２回洗浄し、ＰＢＳ中の５．０％（ｗ／ｖ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液でオーバーコーテ
ィングし、ＰＢＳで１回洗浄する。最後に、ビーズをＰ
ＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）ショ糖でオーバーコーティング
し、窒素または空気下で乾燥させる。

【００５９】上記ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４
をコーティングしたポリスチレンビーズを抗体捕捉アッ
セイに用いる。試料（１０μｌ）を試料希釈液（４００
μｌ）および組換え抗原コーティングビーズとともに反
応トレイのウエルに加える。試料希釈液は、０．１５％
（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ
、１％大腸菌溶解液および５００μｇ／ｍｌ以下のＣＫ
Ｓ溶解液を含有する２０ｍＭトリスリン酸緩衝液中の１
０％（ｖ／ｖ）ウシ血清および２０％（ｖ／ｖ）ヤギ血
清からなっている。組換え酵母ｃ１００−３ポリペプチ
ドを用いる場合は、試料中に存在するかもしれない酵母
抗原に対する抗体を、酵母抽出物（試料希釈液に一般に
約２００μｇ／ｍｌにて加える）と反応させる。試料希
釈液に酵母抽出物を加えるのは、偽陽性を防ぐためであ
る。最後に得られた物質を滅菌濾過し、プラスチック容
器中に入れ、０．１％アジ化ナトリウムとともに貯蔵す
る。

【００６０】好ましい結合体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−西
洋ワサビペルオキシダーゼ結合体である。濃縮結合体の
力価を測定して実際の濃度を決定する。ついで、該濃縮
物を希釈液中で希釈することにより結合体溶液の２０倍
濃縮物を調製する。この２０×濃縮物を滅菌濾過し、プ
ラスチック容器中に貯蔵する。上記結合体希釈液には、
０．０１％硫酸ゲンタマイシン、０．０１％チメロサー
ルおよび赤色染料を含有する２０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）中に１０％（ｖ／ｖ）ウシ血清、１０％（ｖ
／ｖ）ヤギ血清および０．１５％トリトンＸ−１００が
含まれていた。この結合体を滅菌濾過し、プラスチック
容器中に入れた。

【００６１】ＨＣＶに対する抗体について陽性の血漿ユ
ニットから抗ＨＣＶ抗体陽性コントロールを調製した。 使用したユニットのプールには、ｐＨＣＶ−３１および
ｐＨＣＶ−３４に対して反応性の抗体を含有する血漿が
含まれていた。これらユニットを再石灰化し（ｒｅｃａ
ｌｃｉｆｉｅｄ）、常に撹拌しながら５９〜６１℃で１
２時間加熱不活化する。このプールをアリコートし、−
２０℃または２〜８℃で貯蔵する。陽性コントロールの
各ロットについて、保存剤として０，１％アジ化ナトリ
ウムを含有する陰性コントロールでストック溶液を希釈
する。最後に得られた調製物を滅菌希釈し、プラスチッ
ク容器中に入れる。

【００６２】抗ＨＣＶ抗体陰性コントロールの調製は、
ＨＣＶのｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４タンパク
質に対する抗体について陰性である再石灰化ヒト血漿を
用いて行った。この血漿はまた、ヒト免疫不全症候群ウ
イルス（ＨＩＶ）について陰性でありＢ型肝炎表面抗原
（ＨＢｓＡｇ）についても陰性である。上記ユニットを
プールし、保存剤として０．１％アジ化ナトリウムを加
える。最後の調製物を滅菌濾過し、プラスチック容器中
に入れる。結合体とともに４０℃で１時間インキュベー
トした後、ビーズを洗浄し、ＯＰＤ基質に室温にて３０
分間暴露し、１Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を添加して反応停止させ
る。 ４９２ｎｍにおける吸光度を読み取る。

【００６３】許容し得る特異性を保持するため、アッセ
イのカットオフ値は正規集団平均よりも少なくとも５〜
７の標準偏差を有していなければならない。加えて、許
容し得る特異性は、０．２５以下の試料／カットオフ（
Ｓ／ＣＯ）値で集団平均を行った場合に得られることが
一般に観察されている。これらの基準と一致して、スク
リーニングアッセイの「前臨床」カットオフを選択した
。これは、「真の陰性」と思われる試料の殆どを「真の
陽性」と思われる試料から明瞭に識別した。カットオフ
値の計算は、陽性コントロールの平均吸光度の値を０．
２５倍したものと陰性コントロールの平均吸光度の値と
の合計として行った。カットオフ値は、下記数式により
表される。 カットオフ値　　＝　　０．２５ＰＣｘ　　＋　　ＮＣ
ｘ

【００６４】試験は、自動化の程度およびアッセイに
おいて得られる発色の読み取り機構が主として異なる２
つの方法により行うことができる。一つの方法は、手動
法、または４９２ｎｍにおける吸光度の読み取りをクオ
ンタムまたはクオンタマティックを用いて行うのでクオ
ンタムト（Ｑｕａｎｔｕｍｔ）法と呼ばれる。この方法
はまた、適当に検量したピペット、ディスペンサーおよ
び洗浄装置を用い、試料のピペッティング、洗浄および
試薬の添加を技術者により一般に手動で行うので手動法
とも呼ばれる。第二の方法はＰＰＣ法と呼ばれ、自動化
アボットコマンダーＲシステムを利用して行う。このシ
ステムでは、サンプルマネジメントセンター（ＳＭＣ）
と呼ばれるピペッティング装置およびパラレルプロセシ
ングセンター（ＰＰＣ）と呼ばれる洗浄／分配／読み取
り装置を用いる（アボット・ラボラトリーズの出願にか
かる米国特許出願第１７２５６号；発明の名称「１種ま
たは２種以上の分析対象物の同時アッセイ法」；発明者
、ウイリアム・イー・ブラウン（ＷｉｌｌｉａｍＥ．Ｂ
ｒｏｗｎ，ＩＩＩ））。このＰＰＣに用いる光学読み取
り装置は、試料ウエルから差異吸光度（ピークバンドお
よびサイドバンド）の測定が可能な二重波長能を有して
いる。これらの読み取りは、プロセッサーのコントロー
ルセンターにより結果に変換される。

【００６５】スクリーニングアッセイ法１．接種チンパ
ンジーからの血清／血漿：すでに記載したように、表１
には、ｃ１００−３ポリペプチドを利用したスクリーニ
ングアッセイ、およびｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−
３４を利用したスクリーニングアッセイによる、７匹の
チンパンジーにおけるＨＣＶ感染の経過を追跡した研究
の結果をまとめて示してある。両方のアッセイとも、接
種前には陰性の結果となり、被験動物をＨＣＶで感染さ
せた後にはアッセイにより抗体の存在が検出された。し
かしながら、これら２つのアッセイの比較において、ｐ
ＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利用したアッセイ
では、７匹のチンパンジーのうち６匹において一層早い
かまたは同じ採血日にＨＣＶ抗原に対する血清変換が検
出された。これらチンパンジーを用いた研究から得られ
たデータは、ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４タン
パク質を利用したアッセイによりＨＣＶ抗体の全検出が
著しく増大することを示している。この試験は、殆どの
動物において、該疾患の急性期における血清変換を検出
するのに充分な感度（ＡＬＴレベルの上昇として示され
る）を有している。同様に重要なことは、前以て接種し
た試料が反応性でなく、この試験は高程度の特異性を有
することである。

【００６６】２．非Ａ非ＢパネルＩＩ（アルター、ＮＩ
Ｈ）：アルター（Ｈ．Ａｌｔｅｒ）博士（ＮＩＨ、ベセ
スダ、ＭＤ）から入手した高純種ヒト血清のパネル（感
染性ＨＣＶ血清、陰性血清および他の疾患コントロール
を含む）を試験した。全部で４４の試料が該パネル中に
存在していた。

【００６７】ｃ１００−３を使用したスクリーニングア
ッセイおよび組換えタンパク質ｐＨＣＶ−３１およびｐ
ＨＣＶ−３４を利用したスクリーニングアッセイの両方
において、チンパンジーにおいて「感染性であると確認
された」７つの血清のうち６つが陽性であった。これら
６つの反応性試料は、慢性肝炎の個体から得たものであ
った。これら反応性の６つの試料のすべてが、合成ペプ
チドｓｐ６７を用いて陽性であることが確認された。Ｎ
ＡＮＢ輸血後肝炎の急性期に得た一つの試料は、両方の
スクリーニングアッセイにおいて非反応性であった。

【００６８】「感染の可能性がある」というラベルを付
したグループには、同じ輸血後肝炎患者から採取した３
つの試料が含まれていた。最初の２つの急性期試料は両
方のアッセイにおいて陰性であったが、第三の試料は両
方のアッセイにおいて反応性であった。疾患コントロー
ル試料および純種陰性コントロールは一様に陰性であっ
た。

【００６９】両方のスクリーニングアッセイで陽性と検
出された１６の試料すべてについて、ｓｐ１１７確認ア
ッセイにより確認した（表２）。 表２

【表２】 （注）＊：ｓｐ１１７（ｃ１００−３の免疫優性領域内
からの１１７個のアミノ酸からなる合成ペプチド）を用
いて確認試験を行った。

【表３】 （注）Ｓ／ＣＯ＝（試料ＯＤ）／（カットオフＯＤ）Ｓ
／ＣＯ≦１．０のものは非反応性 Ｓ／ＣＯ≧１．０のものは反応性 ＊：この試料は２つ用いて再試験した場合には陰性であ
った（Ｓ／ＣＯ値は０．５６および０．５１）。 加えて、試料１０および２９は、組換えｐＨＣＶ−３１
およびｐＨＣＶ−３４抗原を利用したスクリーニングア
ッセイで新たに検出され、ｓｐ７５確認アッセイにより
反応性であった。試料３９はｐＨＣＶ−３４およびｐＨ
ＣＶ−３１を利用したスクリーニングアッセイにおいて
最初反応性であったが、再試験したところ陰性であり、
確認アッセイにより確認することができなかった。

【００７０】以上をまとめると、両方のスクリーニング
アッセイにより、６つの慢性ＮＡＮＢＨキャリヤーのう
ち６つが同定され、４つの急性ＮＡＮＢＨ試料のうち１
つが同定された。互いに関連のあるドナー（ｉｍｐｌｉ
ｃａｔｅｄ　ｄｏｎｏｒ）からの一対の試料は、ｃ１０
０−３を利用したスクリーニング試験では非反応性であ
ったが、ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を用いた
スクリーニング試験では反応性であった。従って、組換
え抗原ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利用した
スクリーニング試験はｃ１００−３を利用したスクリー
ニングアッセイに比べて感度が良好であるように思われ
る。疾患コントロール試料および純種陰性コントロール
試料のいずれも、いずれのスクリーニングアッセイでも
反応性であった。

【００７１】３．ＣＢＥＲ参考パネル：センター・フォ
ア・バイオロジックス・エバリュエーション・アンド・
リサーチ（ＣＢＥＲ）から、Ｃ型肝炎に対する抗体に関
する参考パネルを得た。この１０の試料からなるパネル
は、ＨＣＶに対する抗体について陰性の正常ヒト血清中
に希釈した８つの反応性試料およびＨＣＶに対する検出
可能な抗体を含有しない２つの血清試料からなっていた
。このパネルについて、オルソ（Ｏｒｔｈｏ）第一世代
ＨＣＶ　ＥＩＡアッセイ、ｃ１００−３を利用したスク
リーニングアッセイ、およびｐＨＣＶ−３１およびｐＨ
ＣＶ−３４を利用したスクリーニングアッセイを行った
。これらアッセイの結果を下記表３に示す。 表３

【表４】 （注）＊：非常に低レベルの抗ＨＣＶ抗体を含有。現在
のＨＣＶアッセイで検出する必要なし。

【００７２】ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利
用したスクリーニングアッセイにより、６つのすべての
ＨＣＶ陽性または境界の試料希釈液が検出された。２つ
の非反応性試料希釈液（７０９および７１０）は、両ス
クリーニングアッセイの抗体検出能の終点を越えて希釈
されたように思われる。３つの成員について、ｐＨＣＶ
−３１およびｐＨＣＶ−３４を利用したスクリーニング
アッセイではｃ１００−３を利用したスクリーニングア
ッセイおよびオルソ第一世代試験に比べて、試料／カッ
トオフ値において著しい増加が認められた。すべての再
現的に反応性の試料が確認された。

【００７３】実施例４（確認アッセイ）確認アッセイに
より、ＨＣＶ抗原に対して免疫学的に反応性の抗体の存
在を明確に同定する手段が提供される。 この確認アッセイには、ＨＣＶゲノムの３つの別個の領
域（スクリーニングアッセイにおいて記載した２つの組
換え抗原により示されるのと同じ領域）内に含まれる主
要なエピトープを示す合成ペプチドまたは組換え抗原が
含まれる。この確認アッセイに用いる組換えタンパク質
は、第一のスクリーニングアッセイに使用するものとは
異なる採取源の抗原でなければならない（すなわち、大
腸菌由来の組換え抗原であってはならず、また部分的に
もＣＫＳ配列を含む組換え抗原であってもならない）。

【００７４】第一のスクリーニングアッセイにおいて繰
り返し反応性であった試料を確認アッセイにおいて再試
験する。同一量の試料を含有するアリコートを、個々に
ポリスチレンビーズ上にコーティングした合成ペプチド
または組換え抗原と接触させる。ＨＣＶゲノムのｃ１０
０−３領域内のエピトープに対する血清反応性は、合成
ペプチドｓｐ６７およびｓｐ６５を用いて確認する。ｃ
１００−３領域との血清反応性を確認するため、合成ペ
プチドｓｐ１１７を用いることもできる。ＨＣＶの推定
コア領域内のＨＣＶエピトープに対する血清反応性は、
合成ペプチドｓｐ７５を用いて確認する。ＨＣＶの３３
ｃ領域内のＨＣＶエピトープに対する血清反応性を確認
するためには、酵母中でスーパーオキシドジスムターゼ
（ＳＯＤ）とのキメラタンパク質として発現される組換
え抗原を用いる。最後に、抗体−抗原複合体を検出する
。

【００７５】アッセイのプロトコールは、上記実施例３
に記載したものと同じであった。上記ペプチドを個々に
ポリスチレンビーズ上にコーティングし、スクリーニン
グアッセイについて記載したのと同様の抗体捕捉態様で
使用する。試料（１０μｌ）を試料希釈液（４００μｌ
）およびペプチドコーティングビーズとともに反応トレ
イのウエルに添加する。４０℃で１時間インキュベート
した後、ビーズを洗浄し、結合体（実施例３に記載した
ものと同じもの）を反応トレイのウエルに加える。４０
℃で１時間インキュベートした後、ビーズを洗浄し、Ｏ
ＰＤ基質に室温で３０分間暴露し、１Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を
添加して反応を停止させる。４９２ｎｍにおける吸光度
を読み取る。ペプチドアッセイのカットオフ値は、陰性
コントロール吸光度値の平均の４倍である。

【００７６】１．ＨＣＶ感染の「危険のある」試料を含
有するパネル：２３人の血液透析患者（すべて臨床的に
ＮＡＮＢＨと診断された）からの２３３の試料群を、ゲ
リー・ギトニック（Ｇａｒｙ　Ｇｉｔｎｉｃｋ）（カリ
フォルニア大学、ロサンジェルス・センター・フォア・
ザ・ヘルス・サイエンスィズ（Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ
　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）の医師）から入手した。ｃ１００−３を
利用したスクリーニングアッセイで試験したこれら試料
を、ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利用したス
クリーニングアッセイで引き続き試験した。ｃ１００−
３スクリーニングアッセイでは、全部で７／２３の患者
（３０．４４％）が反応性であり、繰り返し反応性の試
料は全部で３６であった。ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣ
Ｖ−３４を利用したスクリーニングアッセイでは、２３
人の患者のうち１０人（４３．４８％）が反応性であり
、利用できる試料のうち繰り返し反応性のものは全部で
７０であった（下記表４）。 表４

【表５】

【表６】

【表７】 （注）ＮＴ＝試験せず ＮＡ＝利用できず

【００７７】２つの試料が試験に利用できなかった。ｃ
１００−３スクリーニングアッセイにおいて繰り返し反
応性であると検出された３６の試料のすべてについて、
合成ペプチド確認アッセイにより確認した。ｐＨＣＶ−
３１およびｐＨＣＶ−３４を利用したＨＣＶ　ＥＩＡで
は、これら３６の試料のうち全部で３４が繰り返し反応
性であった。残りの２つの試料は試験に利用できなかっ
た。ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利用したス
クリーニングアッセイによりさらに検出された３６の試
料のうち、９つの試料はコアペプチド確認アッセイ（ｓ
ｐ７５）により確認され、２７の試料はＳＯＤ−３３ｃ
確認アッセイにより確認された。

【００７８】以上をまとめると、上記データは、ｐＨＣ
Ｖ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利用したスクリーニン
グアッセイによる抗ＨＣＶ抗体の検出が、ｃ１００−３
スクリーニングアッセイと比較した場合に、同じ日か最
大９カ月も早い採血日に起こることを示している。図２
５は、血液透析患者においてｐＨＣＶ−３１およびｐＨ
ＣＶ−３４を利用したスクリーニングアッセイにより早
期の検出が可能であることを示している。

【００７９】２．急性／慢性非Ａ非Ｂ肝炎：急性または
慢性ＮＡＮＢＨと診断された個体から試料群を同定した
。急性のＮＡＮＢＨの個体からの試料は、ゲリー・ギト
ニック（カリフォルニア大学、ロサンジェルス・センタ
ー・フォア・ヘルス・サイエンスィズの医師）から入手
した。急性肝炎の診断は、少なくとも２つの血清試料に
ついて細胞溶解症候群（正常上限の２倍を越えるＡＬＴ
レベル）が６カ月未満にわたって存在すること（他の生
物学的異常および臨床兆候は存在してもしていなくても
よい）に基づいて行った。これら試料はすべて、市販の
試験を用いて試験した場合にＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ
）に対するＩｇＭ抗体について陰性であり、Ｂ型肝炎表
面Ａｇについても陰性であった。慢性ＮＡＮＢＨの症例
からの試料は、２つの臨床現場から得た。下記基準：永
続的に上昇したＡＬＴレベル、肝臓の生検結果、および
／または検出可能なＨＢｓＡｇの不在、に基づき個体を
慢性ＮＡＮＢＨであると診断した。生検結果を有する試
料は、慢性的に活性のＮＡＮＢＨ、慢性的に永続するＮ
ＡＮＢＨまたは肝硬変を有する慢性ＮＡＮＢＨのいずれ
かにさらに分類した。これら試料を、ｃ１００−３スク
リーニングアッセイおよびｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣ
Ｖ−３４を利用したスクリーニングアッセイの両方で試
験した。後者の試験は、クオンタム法およびＰＰＣ法の
両方で２つの複製について行った。

【００８０】３．集団罹患（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ　Ａｃ
ｑｕｉｒｅｄ）ＮＡＮＢＨ（急性）：ｃ１００−３スク
リーニングアッセイにより１０の試料のうち２つ（２０
．０％）が繰り返し反応性として検出され、その両方と
も確認した。ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利
用したスクリーニングアッセイにより、これら試料の両
方とさらに２つの試料が検出された（表５）。これら２
つの試料をｓｐ７５により確認した（表６） 表５（急性ＮＡＮＢＨの個体からの試料についての第一
世代ＨＣＶアッセイおよび第二世代ＨＣＶアッセイの比
較）

【表８】 （注）＊：ｃ１００−３陽性であった１つの試料は、ｐ
ＨＣＶ−３１／ｐＨＣＶ−３４アッセイにおいてカット
オフのすぐ下にある。 ＊＊：２つの試料は確認に利用することができなかった
。

【００８１】表６（アボットＨＣＶ２．０ＥＩＡにより
反応性であることがさらに認められた試料についての確
認試験）

【表９】 （注）＊：２つの試料は確認に利用できなかった。 ＊＊：試験せず

【００８２】４．急性輸血後ＮＡＮＢＨ：ｃ１００−３
アッセイにより３２の試料のうち４つ（１２．５０％）
が繰り返し反応性として検出され、そのすべてについて
確認した。ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利用
したスクリーニングアッセイにより、これら４つの試料
のうち３つ（７５％）が反応性として検出された。検出
されなかった残りの１つの試料は、後のスクリーニング
試験で０．９５のＳ／ＣＯを有していた。この試験は、
ｓｐ６７ペプチドにより確認した（表５）。加えて、ｐ
ＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利用したスクリー
ニングアッセイにより、ｃ１００−３スクリーニングア
ッセイでは反応性ではなかった１１の試料が検出された
。確認に利用することのできた９つの試料のうち、８つ
の試料はｓｐ７５により確認し、１つの試料は確認する
ことができなかったが、ｓｐ６５確認試験では０．９０
のＳ／ＣＯを有していた（表６）。

【００８３】５．慢性ＮＡＮＢＨ：この集団の結果は、
下記表７にまとめてある。 表７（慢性非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）患者における抗
ＨＣＶ抗体の普及度）

【表１０】 ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利用したスクリ
ーニングアッセイ（クオンタムまたはＰＰＣのいずれか
を使用）により、全体で１６４の慢性ＮＡＮＢＨ試料の
うち１５５（９４．５％）の試料が検出された。これら
１５５の試料はすべて、ＨＣＶゲノムのｃ１００、３３
ｃまたはコア領域のいずれかからの配列の基づいた合成
ペプチドを用いた別のアッセイで確認された。これとは
対照的に、１６４の試料のうちわずかに１３８の試料の
み（８４．１％）が、ｃ１００−３アッセイにより陽性
であった。これら１３８のｃ１００−３試料のうち１つ
の試料を除くすべての試料は、ｐＨＣＶ−３１およびｐ
ＨＣＶ−３４を利用したスクリーニングアッセイで陽性
として検出された。この例外的な１つの試料は、合成ア
ッセイまたは中和アッセイのいずれによっても確認され
なかった。逆に、ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４
を利用したスクリーニングアッセイによってのみ陽性と
確認された試料が１７あった。以上の結果は、慢性的に
感染したＮＡＮＢＨ集団内のＨＣＶ陽性個体の検出にお
いて、ｐＨＣＶ−３１およびｐＨＣＶ−３４を利用した
スクリーニングアッセイが従来の試験法に比べて感度が
高いことを示している。

【００８４】実施例５（競合アッセイ）抗原性ＨＣＶエ
ピトープを有する組換えポリペプチドは、競合アッセイ
に有用である。中和アッセイを行うため、ＣＫＳ−ＢＣ
Ｄ（ｐＨＣＶ−２３）などのｃ１００−３領域内のエピ
トープを示す組換えポリペプチドを可溶化し、試料希釈
液と最終濃度０．５〜５０μｇ／ｍｌにて混合する。１
０μｌの試料または希釈試料を反応ウエルに加え、つい
で組換えポリペプチドを含有する試料希釈液（４００μ
ｌ）を加え、さらに所望なら、この混合物を約１５分〜
２時間プレインキュベートする。ついで、ｃ１００−３
抗原をコーティングしたビーズを反応ウエルに加え、４
０℃で１時間インキュベートする。洗浄後、結合体希釈
液中のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（２００
μｌ）を加え、４０℃で１時間インキュベートする。洗
浄後、ＯＰＤ基質を加え、室温で３０分間インキュベー
トする。１Ｎ　硫酸を加えて反応を停止させ、４９２ｎ
ｍでの吸光度を読み取る。

【００８５】ｃ１００−３抗原に対する抗体を含有する
試料は、上記ペプチドが溶液中で該抗体へ競合結合する
ため、シグナルは減少する。競合結合の％は、組換えポ
リペプチドの存在下での試料の吸光度値を、同じ希釈で
の組換えポリペプチドの不在下でアッセイした試料の吸
光度値と比較することにより計算することができる。

【００８６】実施例６（イムノドットアッセイ）イムノ
ドットアッセイシステムでは、ニトロセルロース固体支
持体上に一列に並べた精製組換えポリペプチドのパネル
を用いる。かく調製した固体支持体を、試料およびＨＣ
Ｖ抗原に特異的な捕捉抗体と接触させる。捕捉された抗
体は、結合体特異的反応により検出する。結合体特異的
反応は、装置内の反射光学器（ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ
　ｏｐｔｉｃｓ　ａｓｓｅｍｂｌｙ）（米国特許出願第
０７／２２７，４０８号（１９８８年８月２日出願）に
記載）を用いて定量するのが好ましい。関連出願である
米国特許出願第０７／２２７，２７２号、同第０７／２
２７，５８６号および同第０７／２２７，５９０号には
さらに、イムノドットアッセイを行うための特別の方法
および装置が記載されている。 このアッセイはまた、米国特許出願第０７／５３２，４
９８号（１９９０年６月６日出願）にも記載されている
。

【００８７】簡単に説明すると、ニトロセルロースベー
スの試験カートリッジを複数の抗原ポリペプチドで処理
する。各ポリペプチドは、該試験カートリッジの特定反
応ゾーンに含まれている。すべての抗原ポリペプチドが
ニトロセルロース上に置かれたら、ニトロセルロース上
の過剰の結合部位をブロッキングする。ついで、試験カ
ートリッジに試料を接触させ、試料が適当な抗体を含有
している場合に各反応ゾーン中の各抗原ポリペプチドが
反応するようにする。反応後、試験カートリッジを洗浄
し、よく知られた適当な試薬を用いて抗体−抗原反応を
同定する。上記米国特許出願明細書に記載されているよ
うに、全工程を自動化することができる。

【００８８】好ましいイムノドットアッセイにおいて、
下記表８に示す好ましい緩衝液、ｐＨ条件、およびスポ
ッティング濃度で組換えポリペプチドｐＨＣＶ−２３、
ｐＨＣＶ−２９、およびｃ１００−３を希釈し、前以て
配列したニトロセルロース試験カートリッジに適用した
。試験カートリッジを室温（３７℃）にて一夜乾燥させ
た後、ニトロセルロース相の非特異的結合能をブロッキ
ングした。ブロッキング溶液には、１％ブタゼラチン、
１％カゼイン酵素加水分解物、５％ツイーン２０、０．
１％アジ化ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび
２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）が含まれていた。 表８（ＨＣＶポリペプチドスポッティング条件）

【表１
１】

【００８９】４０の正常ドナーを上記方法によりアッセ
イした。ついで、各組換えタンパク質について平均反射
率濃度（ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ）値
を決定した。カットオフ値は、陰性平均プラス６標準偏
差として計算した。試験カートリッジを試料Ａ００６４
２および４２３とともにインキュベートした（下記表９
参照）。 表９

【表１２】 試料Ａ００６４２は、回復期の非Ａ非Ｂ肝炎患者からの
もので、陰性ヒト血漿中に１：１００〜１：１２８００
に希釈したものであった。他の試料である４２３は、組
換えｃ１００−３ポリペプチドを使用したアッセイで陽
性と試験された血漿ドナーからのもので、陰性ヒト血漿
中に１：４０〜１：２５６０に希釈したものであった。 試料をインキュベート後、ビオチン結合ヤギ抗ヒト免疫
グロブリン特異的抗体、アルカリホスファターゼ結合ウ
サギ抗ビオチン特異的抗体、および５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルホスフェートとともに順番にイン
キュベートして、反応部位に発色生成物を生成させた。 すべてのＨＣＶ組換えタンパク質について、試料／カッ
トオフ値（Ｓ／ＣＯ）を決定した。１．０よりも大きい
かまたは等しいＳ／ＣＯ値は、反応性であるとした。限
界希釈は、Ｓ／ＣＯ値が１．０よりも大きいかまたは等
しい最小の希釈として定義した。上記表９に示すように
、各試料はすべてのＨＣＶ組換えタンパク質に対して陽
性と試験された。このデータは、試料Ａ００６４２の反
応性はｐＨＣＶ−２９に対するものが最大であり、残り
の他の抗原ｐＨＣＶ−２３、ｃ１００−３およびｐＨＣ
Ｖ−３４に対しては低いことを示している。試料４２３
は、ｐＨＣＶ−２９およびｐＨＣＶ−３４を発現する組
換えタンパク質との反応が最も強く、ｐＨＣＶ−２３お
よびｃ１００−３との反応性は低かった。

【００９０】実施例７（ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５発現ベ
クター） Ａ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｅの調製：ＨＣＶゲノムの
アミノ酸１９３２〜２１９１を示す８つの個々のオリグ
ヌクレオチドをライゲートし、ＣＫＳ融合ベクターｐＪ
Ｏ２００中に７９３塩基対のＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１断
片としてクローニングした。得られたプラスミド（ｐＨ
ＣＶ−４５と称する）は、ｌａｃプロモーターの制御下
でＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｅ抗原を発現する。このＨＣ
Ｖ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｅ抗原は、ＣＫＳの２３９個のアミ
ノ酸、リンカーＤＮＡ配列による９つのアミノ酸、およ
びＨＣＶ　ＮＳ４／ＮＳ５領域からの２６０個のアミノ
酸（アミノ酸１９３２〜２１９１）からなっている。

【００９１】図２６は、ｐＨＣＶ−４５により発現され
る組換え抗原の模式図を示す。図２７〜２９は、ｐＨＣ
Ｖ−４５により産生されるＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｅ組
換え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。図３
０は、大腸菌中でのｐＨＣＶ−４５タンパク質の発現を
示す。レーン１は、誘発前のＨＣＶＣＫＳ−ＮＳ５Ｅ抗
原（アミノ酸１９３２〜２１９１）を発現するｐＨＣＶ
−４５を含有する大腸菌溶解液であり、レーン２および
３は、それぞれ誘発２時間後および４時間後のものであ
る。これらの結果は、ｐＨＣＶ−４５が分子サイズ５５
，０００ダルトンに対応する見かけの移動度を有するこ
とを示している。このことは、５７，５９７ダルトンの
予測される分子量と対比して許容されるものである。

【００９２】Ｂ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｆの調製：Ｈ
ＣＶゲノムのアミノ酸２１８８〜２４８１を示す１１の
個々のオリグヌクレオチドをライゲートし、ＣＫＳ融合
ベクターｐＪＯ２００中に８９５塩基対のＥｃｏＲ１−
ＢａｍＨ１断片としてクローニングした。得られたプラ
スミド（ｐＨＣＶ−４８と称する）は、ｌａｃプロモー
ターの制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｆ抗原を発現す
る。このＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｆ抗原は、ＣＫＳの２
３９個のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列による８つのア
ミノ酸、およびＨＣＶ　ＮＳ５領域からの２９４個のア
ミノ酸（アミノ酸２１８８〜２４８１）からなっている
。

【００９３】図３１は、ｐＨＣＶ−４８により発現され
る組換え抗原の模式図を示す。図３２〜３４は、ｐＨＣ
Ｖ−４８により産生されるＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｆ組
換え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。図３
５は、大腸菌中でのｐＨＣＶ−４８タンパク質の発現を
示す。レーン１は、誘発前のＨＣＶＣＫＳ−ＮＳ５Ｆ抗
原（アミノ酸２１８８〜２４８１）を発現するｐＨＣＶ
−４８を含有する大腸菌溶解液であり、レーン２および
３は、それぞれ誘発２時間後および４時間後のものであ
る。これらの結果は、ｐＨＣＶ−４８が分子サイズ６５
，０００ダルトンに対応する見かけの移動度を有するこ
とを示している。このことは、５８，９８５ダルトンの
予測される分子量と対比して許容されるものである。

【００９４】Ｃ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｇの調製：Ｈ
ＣＶゲノムのアミノ酸２４８０〜２７２９を示す７つの
個々のオリグヌクレオチドをライゲートし、ＣＫＳ融合
ベクターｐＪＯ２００中に７６９塩基対のＥｃｏＲ１−
ＢａｍＨ１断片としてクローニングした。得られたプラ
スミド（ｐＨＣＶ−５１と称する）は、ｌａｃプロモー
ターの制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｇ抗原を発現す
る。このＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｇ抗原は、ＣＫＳの２
３９個のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列による８つのア
ミノ酸、およびＨＣＶ　ＮＳ５領域からの２５０個のア
ミノ酸（アミノ酸２４８０〜２７２９）からなっている
。

【００９５】図３６は、ｐＨＣＶ−５１により発現され
る組換え抗原の模式図を示す。図３７〜３９は、ｐＨＣ
Ｖ−５１により産生されるＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｇ組
換え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。図４
０は、大腸菌中でのｐＨＣＶ−５１タンパク質の発現を
示す。レーン１は、誘発前のＨＣＶＣＫＳ−ＮＳ５Ｇ抗
原（アミノ酸２４８０〜２７２９）を発現するｐＨＣＶ
−５１を含有する大腸菌溶解液であり、レーン２および
３は、それぞれ誘発２時間後および４時間後のものであ
る。これらの結果は、ｐＨＣＶ−５１が分子サイズ５５
，０００ダルトンに対応する見かけの移動度を有するこ
とを示している。このことは、５４，７２０ダルトンの
予測される分子量と対比して許容されるものである。

【００９６】Ｄ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｈの調製：Ｈ
ＣＶゲノムのアミノ酸２７２８〜２８６７を示す６つの
個々のオリグヌクレオチドをライゲートし、ＣＫＳ融合
ベクターｐＪＯ２００中に４３９塩基対のＥｃｏＲ１−
ＢａｍＨ１断片としてクローニングした。得られたプラ
スミド（ｐＨＣＶ−５０と称する）は、ｌａｃプロモー
ターの制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｈ抗原を発現す
る。このＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｈ抗原は、ＣＫＳの２
３９個のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列による８つのア
ミノ酸、およびＨＣＶ　ＮＳ５領域からの１４０個のア
ミノ酸（アミノ酸２７２８〜２８６７）からなっている
。

【００９７】図４１は、ｐＨＣＶ−５０により発現され
る組換え抗原の模式図を示す。図４２〜４３は、ｐＨＣ
Ｖ−５０により産生されるＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｈ組
換え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。図４
４は、大腸菌中でのｐＨＣＶ−５０タンパク質の発現を
示す。レーン１は、誘発前のＨＣＶＣＫＳ−ＮＳ５Ｈ抗
原（アミノ酸２７２８〜２８６７）を発現するｐＨＣＶ
−５０を含有する大腸菌溶解液であり、レーン２および
３は、それぞれ誘発２時間後および４時間後のものであ
る。これらの結果は、ｐＨＣＶ−５０が分子サイズ４５
，０００ダルトンに対応する見かけの移動度を有するこ
とを示している。このことは、４２，７８３ダルトンの
予測される分子量と対比して許容されるものである。

【００９８】Ｅ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｉの調製：Ｈ
ＣＶゲノムのアミノ酸２８６６〜３０１１を示す６つの
個々のオリグヌクレオチドをライゲートし、ＣＫＳ融合
ベクターｐＪＯ２００中に４６０塩基対のＥｃｏＲ１−
ＢａｍＨ１断片としてクローニングした。得られたプラ
スミド（ｐＨＣＶ−４９と称する）は、ｌａｃプロモー
ターの制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｉ抗原を発現す
る。このＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｉ抗原は、ＣＫＳの２
３９個のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列による８つのア
ミノ酸、およびＨＣＶ　ＮＳ５領域からの１４６個のア
ミノ酸（アミノ酸２８６６〜３０１１）からなっている
。

【００９９】図４５は、ｐＨＣＶ−４９により発現され
る組換え抗原の模式図を示す。図４６〜４７は、ｐＨＣ
Ｖ−４９により産生されるＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｉ組
換え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列である。図４
８は、大腸菌中でのｐＨＣＶ−４９タンパク質の発現を
示す。レーン１は、誘発前のＨＣＶＣＫＳ−ＮＳ５Ｉ抗
原（アミノ酸２８６６〜３０１１）を発現するｐＨＣＶ
−４９を含有する大腸菌溶解液であり、レーン２および
３は、それぞれ誘発２時間後および４時間後のものであ
る。これらの結果は、ｐＨＣＶ−４９が分子サイズ４２
，０００ダルトンに対応する見かけの移動度を有するこ
とを示している。このことは、４３，４９７ダルトンの
予測される分子量と対比して許容されるものである。

【０１００】Ｆ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５抗原のイムノ
ブロット：ｐＨＣＶ−２３、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨＣＶ
−４８、ｐＨＣＶ−５１、ｐＨＣＶ−５０またはｐＨＣ
Ｖ−４９を含有する誘発大腸菌溶解液を分取ＳＤＳ／Ｐ
ＡＧＥゲルにかけて、他の大部分の大腸菌タンパク質か
ら種々のＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５またはＨＣＶ　ＣＫＳ
−ＢＣＤ組換え抗原を分離させた。ついで、分離された
個々のＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５抗原またはＨＣＶ　ＣＫ
Ｓ−ＢＣＤ組換え抗原を含有するゲルスライスをニトロ
セルロースに電気泳動的に移し、ニトロセルロースシー
トをストリップにカッティングした。

【０１０１】図４９は、これらニトロセルロースストリ
ップを用いて種々の血清または血漿をウエスタンブロッ
ト分析した結果を示す。右側にある矢印は各ＨＣＶ　Ｃ
ＫＳ−ＢＣＤまたはＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５組換え抗原
の位置を示しており、上から順にｐＨＣＶ−２３（ＨＣ
Ｖ　ＣＫＳ−ＢＣＤ）、ｐＨＣＶ−４５（ＨＣＶ　ＣＫ
Ｓ−ＮＳ５Ｅ）、ｐＨＣＶ−４８（ＨＣＶ　ＣＫＳ−Ｎ
Ｓ５Ｆ）、ｐＨＣＶ−５１（ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｇ
）、ｐＨＣＶ−５０（ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｈ）、ｐ
ＨＣＶ−４９（ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｉ）、およびｐ
ＪＯ２００（ＣＫＳ）である。パネルＡには５つの正常
ヒト血漿が含まれ、パネルＢには５つの正常ヒト血清が
含まれ、パネルＣにはアボットＨＣＶ　ＥＩＡ試験で陽
性の２０のヒト血清が含まれ、パネルＤにはＣＫＳに向
けられた２つのマウス血清が含まれ、パネルＥには２つ
の正常マウス血清が含まれていた。ｐＨＣＶ−４５によ
って発現されたＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５ＥおよびｐＨＣ
Ｖ−４８によって発現されたＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｆ
の両方とも、ＨＣＶ抗体を含有するヒト血清試料を用い
てスクリーニングした場合に免疫反応性であった。

【０１０２】実施例８（ＨＣＶ　ＣＫＳ−Ｃ１００）Ａ
．ＨＣＶ　ＣＫＳ−Ｃ１００ベクターの調製：ＨＣＶゲ
ノムのアミノ酸１５６９〜１９３１を示す１８の個々の
オリゴヌクレオチドをライゲートし、ＣＫＳ融合ベクタ
ーｐＪＯ２００中に４つの別々のＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ
１サブフラグメントとしてクローニングした。ついで、
ＤＮＡ配列を確認した後、これら４つのサブフラグメン
トを適当な制限酵素で消化し、ゲル精製し、ライゲート
し、ＣＫＳ融合ベクターｐＪＯ２００中に１１０２塩基
対のＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１断片としてクローニングし
た。得られたプラスミド（ｐＨＣＶ−２４と称する）は
、ｌａｃプロモーターの制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−Ｃ１
００抗原を発現する。このＨＣＶ　ＣＫＳ−Ｃ１００抗
原は、ＣＫＳの２３９個のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配
列による８つのアミノ酸、ＨＣＶ　ＮＳ４領域からの３
６３個のアミノ酸（アミノ酸１５６９〜１９３１）およ
びリンカーＤＮＡ配列によるさらに１０個のアミノ酸か
らなっている。このＨＣＶ　ＣＫＳ−Ｃ１００抗原は、
ｐＨＣＶ−２４により非常に低レベルで発現された。

【０１０３】このＨＣＶ　ＣＫＳ−Ｃ１００組換え抗原
の不良な発現レベルは、ＨＣＶ　Ｃ１００領域のアミノ
最末端部分が欠失したさらに２つのクローンを構築する
ことにより克服することができた。これらクローンのう
ち第一のもの（ｐＨＣＶ−５７と称する）は、２３個の
アミノ酸欠失（ＨＣＶアミノ酸１５７５〜１５９７）を
有しており、６９塩基対のＤｄｅｌ制限断片を欠失させ
ることにより構築した。これらクローンの第二のもの（
ｐＨＣＶ−５８と称する）は、２１個のアミノ酸欠失（
ＨＣＶアミノ酸１６００〜１６２０）を有しており、６
３塩基対のＮｌａｌＶ−Ｈａｅ１１１制限断片を欠失さ
せることにより構築した。

【０１０４】図５０は、ｐＨＣＶ−２４、ｐＨＣＶ−５
７およびｐＨＣＶ−５８により発現される組換え抗原の
模式図である。図５１〜５３は、ｐＨＣＶ−５７により
産生されるＨＣＶ−Ｃ１００Ｄ１組換え抗原のＤＮＡ配
列およびアミノ酸配列を示す。図５４〜５６は、ｐＨＣ
Ｖ−５８により発現されるＨＣＶ−Ｃ１００Ｄ２組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。図５７は
、大腸菌中でのｐＨＣＶ−２４、ｐＨＣＶ−５７および
ｐＨＣＶ−５８タンパク質の発現を示す。レーン１は、
誘発前のＨＣＶ　ＣＫＳ−Ｃ１００抗原（アミノ酸１５
６９〜１９３１）を発現するｐＨＣＶ−２４を含有する
大腸菌溶解液であり、レーン２および３はそれぞれ誘発
２時間後および４時間後のものである。レーン４は、誘
発前のＨＣＶ−ＣＫＳ−Ｃ１００Ｄ１抗原（アミノ酸１
５６９〜１５７４および１５９８〜１９３１）を発現す
るｐＨＣＶ−５７を含有する大腸菌溶解液であり、レー
ン５および６はそれぞれ誘発２時間後および４時間後の
ものである。レーン７は、誘発前のＨＣＶ−ＣＫＳ−Ｃ
１００Ｄ２抗原（アミノ酸１５６９〜１５９９および１
６２１〜１９３１）を発現するｐＨＣＶ−５８を含有す
る大腸菌溶解液であり、レーン８および９はそれぞれ誘
発２時間後および４時間後のものである。これらの結果
は、ｐＨＣＶ−５７およびｐＨＣＶ−５８の両方の融合
タンパク質とも、ｐＨＣＶ−２４融合タンパク質に比べ
て有意に高いレベルで発現されること、およびｐＨＣＶ
−５７およびｐＨＣＶ−５８の両方の融合タンパク質と
も６５，０００ダルトンの分子サイズに対応する見かけ
の移動度を有することを示している。このことは、ｐＨ
ＣＶ−５７については６４，４５０ダルトン、ｐＨＣＶ
−５８については６４，４５８の予測される分子量と対
比して許容されるものである。

【０１０５】実施例９（ＨＣＶ　ＰＣＲ由来発現ベクタ
ー） Ａ．ＨＣＶ　ＤＮＡ断片の調製：ＨＣＶに感染した種々
のチンパンジーまたはヒトの血清からＲＮＡを抽出する
ため、試料をまずプロテイナーゼＫおよびＳＤＳを用い
て３７℃で１時間消化し、ついでフェノール：クロロホ
ルムで何回も抽出した。ついで、エタノールで数回沈殿
させてＲＮＡを濃縮し、水中に再懸濁した。ついで、特
定プライマーを用い、供給者の指示に従ってＲＮＡ試料
を逆転写した。ついで、第二のプライマーを加え、供給
者の指示に従ってＰＣＲ増幅を行った。ついで、最初の
プライマーセットの内部に位置するひとそろいのプライ
マーを用い、このＰＣＲ反応のアリコートをさらにＰＣ
Ｒに付した。一般に、これらプライマーは、引き続き行
うクローニングに使用するための制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位をも有していた。ついで、この２回目のＰＣ
Ｒ反応物のアリコートをアガロースゲル電気泳動および
サザーンブロット分析に供してＰＣＲ反応物の特異性を
確認した。ついで、上記ＰＣＲ反応物の残りを適当な制
限酵素で消化し、所望ＨＣＶ　ＤＮＡ断片をゲル精製し
、適当なクローニングベクターにライゲートした。つい
で、このライゲート物を大腸菌中に形質転換し、単一コ
ロニーを単離し、ＤＮＡ配列分析のためプラスミドＤＮ
Ａを調製した。ついで、これらＤＮＡ配列を評価したと
ころ、所望の特定ＨＣＶコード領域が完全であることが
確認された。ついで、このようにして得られたＨＣＶ　
ＤＮＡ断片を発現分析のため適当なベクター中にクロー
ニングした。

【０１０６】Ｂ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ３の調製：上記
で詳述した方法を用い、ＨＣＶの推定ＮＳ３領域からの
４７４塩基対ＤＮＡ断片をＰＣＲにより製造した。この
断片は、ＨＣＶアミノ酸の＃１４７３〜１６２９に対応
し、ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２０１中に平滑末端ライ
ゲーションによりクローニングした。得られたクローン
（ｐＨＣＶ−１０５と称する）は、ｌａｃプロモーター
の制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ３抗原を発現する。こ
のＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ３抗原は、ＣＫＳの２３９個の
アミノ酸、リンカーＤＮＡ配列からの１２個のアミノ酸
、ＨＣＶ　ＮＳ３領域からの１５７個のアミノ酸（アミ
ノ酸１４７３〜１６２９）およびリンカーＤＮＡ配列か
らのさらに９個のアミノ酸からなっている。

【０１０７】図５８は、ｐＨＣＶ−１０５抗原を示す模
式図である。図５９〜６０は、ｐＨＣＶ−１０５により
産生されるＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ３組換え抗原のＤＮＡ
配列およびアミノ酸配列を示す。図６１は、大腸菌中で
のｐＨＣＶ−１０５タンパク質の発現を示す。レーン１
は、誘発前のＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ３抗原（アミノ酸１
４７２〜１６２９）を発現するｐＨＣＶ−１０５を含有
する大腸菌溶解液であり、レーン２および３はそれぞれ
誘発２時間後および４時間後のものである。これらの結
果は、ｐＨＣＶ−１０５融合タンパク質が分子量４３，
０００ダルトンに対応する見かけの移動度を有すること
を示している。このことは、４６，４５４ダルトンの予
測される分子量と対比して許容されるものである。

【０１０８】Ｃ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−５’ＥＮＶの調製：
上記で詳述した方法を用い、ＨＣＶの推定エンベロープ
領域からの４８９塩基対ＤＮＡ断片をＰＣＲにより製造
した。この断片はＨＣＶアミノ酸１１４〜２７６に対応
し、ＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１制限部位を用いてＣＫＳ発
現ベクターｐＪＯ２０２中にクローニングした。得られ
たクローン（ｐＨＣＶ−１０３と称する）は、ｌａｃプ
ロモーターの制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−５’ＥＮＶ抗原
を発現する。このＨＣＶ　ＣＫＳ−５’ＥＮＶ抗原は、
ＣＫＳの２３９個のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列から
の７個のアミノ酸、ＨＣＶエンベロープ領域からの１６
３個のアミノ酸（アミノ酸１１４〜２７６）、およびリ
ンカーＤＮＡ配列からのさらに１６個のアミノ酸からな
っている。

【０１０９】図６２は、ｐＨＣＶ−１０３抗原を示す模
式図である。図６３〜６４は、ｐＨＣＶ−１０３により
産生されるＨＣＶ　ＣＫＳ−５’ＥＮＶ組換え抗原のＤ
ＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。図６１は、大腸菌
中でのｐＨＣＶ−１０３の発現を示す。レーン４は、誘
発前のＨＣＶ　ＣＫＳ−５’ＥＮＶ抗原（アミノ酸１１
４〜２７６）を発現するｐＨＣＶ−１０３を含有する大
腸菌溶解液であり、レーン５および６はそれぞれ誘発２
時間後および４時間後のものである。これらの結果は、
ｐＨＣＶ−１０３融合タンパク質が分子量４７，０００
ダルトンに対応する見かけの移動度を有することを示し
ている。このことは、４６，０９１ダルトンの予測され
る分子量と対比して許容されるものである。

【０１１０】Ｄ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−３’ＥＮＶの調製：
上記で詳述した方法を用い、ＨＣＶの推定エンベロープ
領域からの６２１塩基対ＤＮＡ断片をＰＣＲにより製造
した。この断片はＨＣＶアミノ酸２６３〜４６９に対応
し、ＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１制限部位を用いてＣＫＳ発
現ベクターｐＪＯ２０２中にクローニングした。得られ
たクローン（ｐＨＣＶ−１０１と称する）は、ｌａｃプ
ロモーターの制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−３’ＥＮＶ抗原
を発現する。このＨＣＶ　ＣＫＳ−３’ＥＮＶ抗原は、
ＣＫＳの２３９個のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列から
の７個のアミノ酸、ＨＣＶエンベロープ領域からの２０
７個のアミノ酸（アミノ酸２６３〜４６９）、およびリ
ンカーＤＮＡ配列からのさらに１５個のアミノ酸からな
っている。

【０１１１】図６５は、ｐＨＣＶ−１０１抗原を示す模
式図である。図６６〜６８は、ｐＨＣＶ−１０１により
産生されるＨＣＶ　ＣＫＳ−３’ＥＮＶ組換え抗原のＤ
ＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。図６１は、大腸菌
中でのｐＨＣＶ−１０１の発現を示す。レーン７は、誘
発前のＨＣＶ　ＣＫＳ−３’ＥＮＶ抗原（アミノ酸２６
３〜４６９）を発現するｐＨＣＶ−１０１を含有する大
腸菌溶解液であり、レーン８および９はそれぞれ誘発２
時間後および４時間後のものである。これらの結果は、
ｐＨＣＶ−１０１融合タンパク質が分子量４７，０００
ダルトンに対応する見かけの移動度を有することを示し
ている。このことは、５１，１８１ダルトンの予測され
る分子量と対比して許容されるものである。

【０１１２】Ｅ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ２の調製：上記
で詳述した方法を用い、ＨＣＶの推定ＮＳ２領域からの
６３６塩基対ＤＮＡ断片をＰＣＲにより製造した。この
断片はＨＣＶアミノ酸９９４〜１２０５に対応し、Ｅｃ
ｏＲ１−ＢａｍＨ１制限部位を用いてＣＫＳ発現ベクタ
ーｐＪＯ２０１中にクローニングした。得られたクロー
ン（ｐＨＣＶ−１０２と称する）は、ｌａｃプロモータ
ーの制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ２抗原を発現する。 このＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ２抗原は、ＣＫＳの２３９個
のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列からの７個のアミノ酸
、ＨＣＶ　ＮＳ２領域からの２１２個のアミノ酸（アミ
ノ酸９９４〜１２０５）、およびリンカーＤＮＡ配列か
らのさらに１６個のアミノ酸からなっている。

【０１１３】図６９は、ｐＨＣＶ−１０２抗原を示す模
式図である。図７０〜７２は、ｐＨＣＶ−１０２により
産生されるＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ２組換え抗原のＤＮＡ
配列およびアミノ酸配列を示す。図７３は、大腸菌中で
のｐＨＣＶ−１０２の発現を示す。レーン１は、誘発前
のＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ２抗原（アミノ酸９９４〜１２
０５）を発現するｐＨＣＶ−１０２を含有する大腸菌溶
解液であり、レーン２および３はそれぞれ誘発２時間後
および４時間後のものである。これらの結果は、ｐＨＣ
Ｖ−１０２融合タンパク質が分子量５３，０００ダルト
ンに対応する見かけの移動度を有することを示している
。 このことは、５１，２１３ダルトンの予測される分子量
と対比して許容されるものである。

【０１１４】Ｆ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ１の調製：上記
で詳述した方法を用い、ＨＣＶの推定ＮＳ１領域からの
６５４塩基対ＤＮＡ断片をＰＣＲにより製造した。この
断片はＨＣＶアミノ酸６１７〜８３４に対応し、Ｅｃｏ
Ｒ１−ＢａｍＨ１制限部位を用いてＣＫＳ発現ベクター
ｐＪＯ２００中にクローニングした。得られたクローン
（ｐＨＣＶ−１０７と称する）は、ｌａｃプロモーター
の制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ１抗原を発現する。こ
のＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ１抗原は、ＣＫＳの２３９個の
アミノ酸、リンカーＤＮＡ配列からの１０個のアミノ酸
、およびＨＣＶ　ＮＳ１領域からの２１８個のアミノ酸
（アミノ酸６１７〜８３４）からなっている。図７４は
、ｐＨＣＶ−１０７抗原を示す模式図である。図７５〜
７７は、ｐＨＣＶ−１０７により産生されるＨＣＶ　Ｃ
ＫＳ−ＮＳ１組換え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配
列を示す。

【０１１５】Ｇ．ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＥＮＶの調製：上記
で詳述した方法を用い、ＨＣＶの推定エンベロープ領域
からの１０６８塩基対ＤＮＡ断片をＰＣＲにより製造し
た。この断片はＨＣＶアミノ酸の＃１１４〜４６９に対
応し、ＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１制限部位を用いてＣＫＳ
発現ベクターｐＪＯ２０２中にクローニングした。得ら
れたクローン（ｐＨＣＶ−１０４と称する）は、ｌａｃ
プロモーターの制御下でＨＣＶ　ＣＫＳ−ＥＮＶ抗原を
発現する。このＨＣＶ　ＣＫＳ−ＥＮＶ抗原は、ＣＫＳ
の２３９個のアミノ酸、リンカーＤＮＡ配列からの７個
のアミノ酸、ＨＣＶエンベロープ領域からの３５６個の
アミノ酸（アミノ酸１１４〜４６９）、およびリンカー
ＤＮＡ配列からのさらに１５個のアミノ酸からなってい
る。 図７８は、ｐＨＣＶ−１０４抗原を示す模式図である。 図７９〜８１は、ｐＨＣＶ−１０４により産生されるＨ
ＣＶ　ＣＫＳ−ＥＮＶ組換え抗原のＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を示す。

【０１１６】上記抗原は、単独または組み合わせて、本
明細書中に提示もしくは実施例で例示したアッセイ態様
において用いることができる。これら組換え抗原はまた
、ウイルス複製の抑制剤を開発するため、およびワクチ
ンなどの治療目的に用いることができることも考えられ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　ＨＣＶゲノムを示す図である。

【図２】　　ｐＨＣＶ−３４およびｐＨＣＶ−３１抗原
を用いたスクリーニングアッセイにより感度および特異
性が増大することを示す図である。

【図３】　　プラスミドｐＨＣＶ−３４の構築を示す模
式図である。

【図４】　　ｐＨＣＶ−３４の完全ＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を示す図である。

【図５】　　ｐＨＣＶ−３４の完全ＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を示す図である。

【図６】　　ｐＨＣＶ−３４の完全ＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を示す図である。

【図７】　　ｐＨＣＶ−３４の完全ＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を示す図である。

【図８】　　ｐＨＣＶ−３４の完全ＤＮＡ配列およびア
ミノ酸配列を示す図である。

【図９】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−３４を示す模式
図である。

【図１０】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−３４タンパク質
の発現を示す模式図である。

【図１１】　　プラスミドｐＨＣＶ−２３の構築を示す
模式図である。

【図１２】　　プラスミドｐＨＣＶ−２９の構築を示す
模式図である。

【図１３】　　プラスミドｐＨＣＶ−３１の構築を示す
模式図である。

【図１４】　　ｐＨＣＶ−３１の完全ＤＮＡ配列および
アミノ酸配列を示す図である。

【図１５】　　ｐＨＣＶ−３１の完全ＤＮＡ配列および
アミノ酸配列を示す図である。

【図１６】　　ｐＨＣＶ−３１の完全ＤＮＡ配列および
アミノ酸配列を示す図である。

【図１７】　　ｐＨＣＶ−３１の完全ＤＮＡ配列および
アミノ酸配列を示す図である。

【図１８】　　ｐＨＣＶ−３１の完全ＤＮＡ配列および
アミノ酸配列を示す図である。

【図１９】　　ｐＨＣＶ−３１の完全ＤＮＡ配列および
アミノ酸配列を示す図である。

【図２０】　　ｐＨＣＶ−３１の完全ＤＮＡ配列および
アミノ酸配列を示す図である。

【図２１】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−３１を示す模
式図である。

【図２２】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−２９の発現を示
す模式図である。

【図２３】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−２３の発現を示
す模式図である。

【図２４】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−３１の発現を示
す模式図である。

【図２５】　　スクリーニングアッセイを用いた、血液
透析患者でのＨＣＶの早期検出を示す模式図である。

【図２６】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−４５を示す模
式図である。

【図２７】　　ｐＨＣＶ−４５により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図２８】　　ｐＨＣＶ−４５により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図２９】　　ｐＨＣＶ−４５により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図３０】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−４５の発現を示
す模式図である。

【図３１】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−４８を示す模
式図である。

【図３２】　　ｐＨＣＶ−４８により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図３３】　　ｐＨＣＶ−４８により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図３４】　　ｐＨＣＶ−４８により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図３５】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−４８の発現を示
す模式図である。

【図３６】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−５１を示す模
式図である。

【図３７】　　ｐＨＣＶ−５１により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図３８】　　ｐＨＣＶ−５１により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図３９】　　ｐＨＣＶ−５１により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図４０】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−５１の発現を示
す模式図である。

【図４１】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−５０を示す模
式図である。

【図４２】　　ｐＨＣＶ−５０により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図４３】　　ｐＨＣＶ−５０により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図４４】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−５０の発現を示
す模式図である。

【図４５】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−４９を示す模
式図である。

【図４６】　　ｐＨＣＶ−４９により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図４７】　　ｐＨＣＶ−４９により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図４８】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−４９の発現を示
す模式図である。

【図４９】　　ｐＨＣＶ−２３、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨ
ＣＶ−４８、ｐＨＣＶ−５１、ｐＨＣＶ−５０およびｐ
ＨＣＶ−４９のイムノブロットを示す図である。

【図５０】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−２４、ｐＨＣ
Ｖ−５７、ｐＨＣＶ−５８を示す模式図である。

【図５１】　　ｐＨＣＶ−５７により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図５２】　　ｐＨＣＶ−５７により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図５３】　　ｐＨＣＶ−５７により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図５４】　　ｐＨＣＶ−５８により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図５５】　　ｐＨＣＶ−５８により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図５６】　　ｐＨＣＶ−５８により発現された組換え
抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である。

【図５７】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−２４、ｐＨＣＶ
−５７およびｐＨＣＶ−５８の発現を示す模式図である
。

【図５８】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−１０５を示す
模式図である。

【図５９】　　ｐＨＣＶ−１０５により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図６０】　　ｐＨＣＶ−１０５により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図６１】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−１０５の発現を
示す模式図である。

【図６２】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−１０３を示す
模式図である。

【図６３】　　ｐＨＣＶ−１０３により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図６４】　　ｐＨＣＶ−１０３により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図６５】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−１０１を示す
模式図である。

【図６６】　　ｐＨＣＶ−１０１により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図６７】　　ｐＨＣＶ−１０１により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図６８】　　ｐＨＣＶ−１０１により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図６９】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−１０２を示す
模式図である。

【図７０】　　ｐＨＣＶ−１０２により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図７１】　　ｐＨＣＶ−１０２により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図７２】　　ｐＨＣＶ−１０２により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図７３】　　大腸菌中でのｐＨＣＶ−１０２の発現を
示す模式図である。

【図７４】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−１０７を示す
模式図である。

【図７５】　　ｐＨＣＶ−１０７により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図７６】　　ｐＨＣＶ−１０７により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図７７】　　ｐＨＣＶ−１０７により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図７８】　　融合タンパク質ｐＨＣＶ−１０４を示す
模式図である。

【図７９】　　ｐＨＣＶ−１０４により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図８０】　　ｐＨＣＶ−１０４により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

【図８１】　　ｐＨＣＶ−１０４により発現された組換
え抗原のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す図である
。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ｐＨＣＶ−２３、ｐＨＣＶ−２９、ｐ
   ＨＣＶ−３１、ｐＨＣＶ−３４、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨ
   ＣＶ−４８、ｐＨＣＶ−４９、ｐＨＣＶ−５０、ｐＨＣ
   Ｖ−５１、ｐＨＣＶ−５７、ｐＨＣＶ−５８、ｐＨＣＶ
   −１０１、ｐＨＣＶ−１０２、ｐＨＣＶ−１０３、ｐＨ
   ＣＶ−１０４、ｐＨＣＶ−１０５、およびｐＨＣＶ−１
   ０７から選ばれる組換え融合蛋白質。
2. 【請求項２】　　ｐＨＣＶ−２３′、ｐＨＣＶ−２９′
   、ｐＨＣＶ−３１′、ｐＨＣＶ−３４′、ｐＨＣＶ−４
   ５′、ｐＨＣＶ−４８′、ｐＨＣＶ−４９′、ｐＨＣＶ
   −５０′、ｐＨＣＶ−５１′、ｐＨＣＶ−５７′、ｐＨ
   ＣＶ−５８′、ｐＨＣＶ−１０１′、ｐＨＣＶ−１０２
   ′、ｐＨＣＶ−１０３′、ｐＨＣＶ−１０４′、ｐＨＣ
   Ｖ−１０５′、およびｐＨＣＶ−１０７′から選ばれる
   ポリペプチド。
3. 【請求項３】　　液体試料中のＨＣＶ抗原と免疫学的に
   反応性の抗体の存在を同定するアッセイにおいて、ｐＨ
   ＣＶ−２３、ｐＨＣＶ−２９、ｐＨＣＶ−３１、ｐＨＣ
   Ｖ−３４、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨＣＶ−４８、ｐＨＣＶ
   −４９、ｐＨＣＶ−５０、ｐＨＣＶ−５１、ｐＨＣＶ−
   ５７、ｐＨＣＶ−５８、ｐＨＣＶ−１０１、ｐＨＣＶ−
   １０２、ｐＨＣＶ−１０３、ｐＨＣＶ−１０４、ｐＨＣ
   Ｖ−１０５、ｐＨＣＶ−１０７、ｐＨＣＶ−４５′、ｐ
   ＨＣＶ−４８′、ｐＨＣＶ−４９′、ｐＨＣＶ−５０′
   、ｐＨＣＶ−５１′、ｐＨＣＶ−５７′、ｐＨＣＶ−５
   ８′、ｐＨＣＶ−１０１′、ｐＨＣＶ−１０２′、ｐＨ
   ＣＶ−１０３′、ｐＨＣＶ−１０４′、ｐＨＣＶ−１０
   ５′、ｐＨＣＶ−１０７′、ｐＨＣＶ−２３′、ｐＨＣ
   Ｖ−２９′、ｐＨＣＶ−３１′、およびｐＨＣＶ−３４
   ′、から選ばれるポリペプチドの少なくとも１種を、該
   ペプチドと抗体が複合体を形成する条件下に、該試料と
   接触させ、生成した抗体−ポリペプチド複合体を検出す
   ることを特徴とするアッセイ。
4. 【請求項４】　　該ポリペプチドがｐＨＣＶ−３１とｐ
   ＨＣＶ−３４またはｐＨＣＶ−３１′とｐＨＣＶ−３４
   ′である請求項３のアッセイ。
5. 【請求項５】　　ＨＣＶ抗原と免疫学的に反応性の液体
   試料中の抗体の存在を同定する確認アッセイにおいて、
   該試料を第１および第２の免疫学的に均等なアリコート
   を調製するために用い、該第１アリコートを、ｐＨＣＶ
   −２３、ｐＨＣＶ−２９、ｐＨＣＶ−３１、ｐＨＣＶ−
   ３４、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨＣＶ−４８、ｐＨＣＶ−４
   ９、ｐＨＣＶ−５０、ｐＨＣＶ−５１、ｐＨＣＶ−５７
   、ｐＨＣＶ−５８、ｐＨＣＶ−１０１、ｐＨＣＶ−１０
   ２、ｐＨＣＶ−１０３、ｐＨＣＶ−１０４、ｐＨＣＶ−
   １０５、ｐＨＣＶ−１０７、ｐＨＣＶ−４５′、ｐＨＣ
   Ｖ−４８′、ｐＨＣＶ−４９′、ｐＨＣＶ−５０′、ｐ
   ＨＣＶ−５１′、ｐＨＣＶ−５７′、ｐＨＣＶ−５８′
   、ｐＨＣＶ−１０１′、ｐＨＣＶ−１０２′、ｐＨＣＶ
   −１０３′、ｐＨＣＶ−１０４′、ｐＨＣＶ−１０５′
   、ｐＨＣＶ−１０７′、ｐＨＣＶ−２３′、ｐＨＣＶ−
   ２９′、ｐＨＣＶ−３１′、およびｐＨＣＶ−３４′か
   ら選ばれるポリペプチドの少なくとも１種と、該ポリペ
   プチドと抗体とが複合体を形成する条件下に、接触させ
   、ついで、該第２アリコートをｓｐ６５、ｓｐ６７、ｓ
   ｐ７５、ｓｐ１１７、ＳＯＤ−３３ｃ、ｐＨＣＶ−２３
   ′、ｐＨＣＶ−２９′、ｐＨＣＶ−３１′、ｐＨＣＶ−
   ３４′、ｐＨＣＶ−４５′、ｐＨＣＶ−４８′、ｐＨＣ
   Ｖ−４９′、ｐＨＣＶ−５０′、ｐＨＣＶ−５１′、ｐ
   ＨＣＶ−５７′、ｐＨＣＶ−５８′、ｐＨＣＶ−１０１
   ′、ｐＨＣＶ−１０２′、ｐＨＣＶ−１０３′、ｐＨＣ
   Ｖ−１０４′、ｐＨＣＶ−１０５′、およびｐＨＣＶ−
   １０７′から選ばれるポリペプチドと、第２抗体−抗原
   複合体を形成する条件下に接触させる工程からなり、該
   第１アリコートにおいて選ばれるポリペプチドと第２ア
   リコートにおいて選ばれるポリペプチドとが同一でない
   ことを特徴とする抗体同定のための確認アッセイ。
6. 【請求項６】　　第１アリコートをポリペプチドｐＨＣ
   Ｖ−３１およびｐＨＣＶ−３４またはｐＨＣＶ−３１′
   およびｐＨＣＶ−３４′と接触させる請求項５のアッセ
   イ。
7. 【請求項７】　　液体試料中のＨＣＶ抗原と免疫学的に
   反応性の抗体の存在を同定するためのイムノドットアッ
   セイにおいて、該試料を、固体支持体の別々の領域に結
   合させた、各々ＨＣＶ抗原の別個のエピトープを含有す
   る少なくとも２種のポリペプチドと、該ポリペプチドと
   抗体とが複合体を形成する条件下に、同時に接触させ、
   生じた抗体−ポリペプチドを検出する方法であって、該
   ポリペプチドが、ｐＨＣＶ−２３、ｐＨＣＶ−２９、ｐ
   ＨＣＶ−３１、ｐＨＣＶ−３４、ｐＨＣＶ−２３′、ｐ
   ＨＣＶ−２９′、ｐＨＣＶ−３１′、ｐＨＣＶ−３４′
   、Ｃ１００、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨＣＶ−４８、ｐＨＣ
   Ｖ−４９、ｐＨＣＶ−５０、ｐＨＣＶ−５１、ｐＨＣＶ
   −５７、ｐＨＣＶ−５８、ｐＨＣＶ−１０１、ｐＨＣＶ
   −１０２、ｐＨＣＶ−１０３、ｐＨＣＶ−１０４、ｐＨ
   ＣＶ−１０５、ｐＨＣＶ−１０７、ｐＨＣＶ−４５′、
   ｐＨＣＶ−４８′、ｐＨＣＶ−４９′、ｐＨＣＶ−５０
   ′、ｐＨＣＶ−５１′、ｐＨＣＶ−５７′、ｐＨＣＶ−
   ５８′、ｐＨＣＶ−１０１′、ｐＨＣＶ−１０２′、ｐ
   ＨＣＶ−１０３′、ｐＨＣＶ−１０４′、ｐＨＣＶ−１
   ０５′、およびｐＨＣＶ−１０７′から選ばれるもので
   あることを特徴とするイムノドットアッセイ。
8. 【請求項８】　　液体試料中のＨＣＶ抗原と免疫学的に
   反応性の抗体の存在を同定する競合アッセイにおいて、
   該試料を第１および第２の免疫学的に均等なアリコート
   の調製に用い、該第１アリコートを、該ポリペプチドが
   該抗体と検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を形成す
   る条件下に、固体支持体に結合したポリペプチドと接触
   させ、第２アリコートを未結合ポリペプチドとまず接触
   させ、ついで該結合ポリペプチドと接触させ、該ポリペ
   プチドがｐＨＣＶ−２３、ｐＨＣＶ−２９、ｐＨＣＶ−
   ３１、ｐＨＣＶ−３４、ｐＨＣＶ−２３′、ｐＨＣＶ−
   ２９′、ｐＨＣＶ−３１′、ｐＨＣＶ−３４′、ｐＨＣ
   Ｖ−４５、ｐＨＣＶ−４８、ｐＨＣＶ−４９、ｐＨＣＶ
   −５０、ｐＨＣＶ−５１、ｐＨＣＶ−５７、ｐＨＣＶ−
   ５８、ｐＨＣＶ−１０１、ｐＨＣＶ−１０２、ｐＨＣＶ
   −１０３、ｐＨＣＶ−１０４、ｐＨＣＶ−１０５、ｐＨ
   ＣＶ−１０７、ｐＨＣＶ−４５′、ｐＨＣＶ−４８′、
   ｐＨＣＶ−４９′、ｐＨＣＶ−５０′、ｐＨＣＶ−５１
   ′、ｐＨＣＶ−５７′、ｐＨＣＶ−５８′、ｐＨＣＶ−
   １０１′、ｐＨＣＶ−１０２′、ｐＨＣＶ−１０３′、
   ｐＨＣＶ−１０４′、ｐＨＣＶ−１０５′、およびｐＨ
   ＣＶ−１０７′から選ばれたものであることを特徴とす
   るアッセイ。
9. 【請求項９】　　液体試料中のＨＣＶ抗原と免疫学的に
   反応性の抗体の存在を同定する競合アッセイにおいて、
   該試料を第１および第２の免疫学的に均等なアリコート
   の調製に使用し、該第１アリコートを、固体支持体に結
   合したポリペプチドと、該ポリペプチドと該抗体が複合
   して検出しうる抗体−ポリペプチド複合体を形成する条
   件下に、接触させ、該第２アリコートを未結合ポリペプ
   チドとまず接触し、ついで該結合ポリペプチドと接触さ
   せ、さらに第２アリコートを未結合および結合ポリペプ
   チドと同時に接触させ、該ポリペプチドがｐＨＣＶ−２
   ３、ｐＨＣＶ−２９、ｐＨＣＶ−３１、ｐＨＣＶ−３４
   、ｐＨＣＶ−２３′、ｐＨＣＶ−２９′、ｐＨＣＶ−３
   １′、ｐＨＣＶ−３４′、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨＣＶ−
   ４８、ｐＨＣＶ−４９、ｐＨＣＶ−５０、ｐＨＣＶ−５
   １、ｐＨＣＶ−５７、ｐＨＣＶ−５８、ｐＨＣＶ−１０
   １、ｐＨＣＶ−１０２、ｐＨＣＶ−１０３、ｐＨＣＶ−
   １０４、ｐＨＣＶ−１０５、ｐＨＣＶ−１０７、ｐＨＣ
   Ｖ−４５′、ｐＨＣＶ−４８′、ｐＨＣＶ−４９′、ｐ
   ＨＣＶ−５０′、ｐＨＣＶ−５１′、ｐＨＣＶ−５７′
   、ｐＨＣＶ−５８′、ｐＨＣＶ−１０１′、ｐＨＣＶ−
   １０２′、ｐＨＣＶ−１０３′、ｐＨＣＶ−１０４′、
   ｐＨＣＶ−１０５′、およびｐＨＣＶ−１０７′から選
   ばれるものであることを特徴とするアッセイ。
10. 【請求項１０】　　液体試料中のＨＣＶ抗原と免疫学的
    に反応性の抗体の存在を同定する中和アッセイにおいて
    、該試料を第１および第２の免疫学的に均等なアリコー
    トを調製するために使用し、該第１アリコートを固体支
    持体に結合したポリペプチドと、該ポリペプチドと該抗
    体が複合して検出しうる抗体−ポリペプチド複合体を形
    成する条件下に、接触させ、該結合ポリペプチドがｐＨ
    ＣＶ−２３、ｐＨＣＶ−２９、ｐＨＣＶ−３１、ｐＨＣ
    Ｖ−３４、ｐＨＣＶ−２３′、ｐＨＣＶ−２９′、ｐＨ
    ＣＶ−３１′、ｐＨＣＶ−３４′、ｐＨＣＶ−４５、ｐ
    ＨＣＶ−４８、ｐＨＣＶ−４９、ｐＨＣＶ−５０、ｐＨ
    ＣＶ−５１、ｐＨＣＶ−５７、ｐＨＣＶ−５８、ｐＨＣ
    Ｖ−１０１、ｐＨＣＶ−１０２、ｐＨＣＶ−１０３、ｐ
    ＨＣＶ−１０４、ｐＨＣＶ−１０５、ｐＨＣＶ−１０７
    、ｐＨＣＶ−４５′、ｐＨＣＶ−４８′、ｐＨＣＶ−４
    ９′、ｐＨＣＶ−５０′、ｐＨＣＶ−５１′、ｐＨＣＶ
    −５７′、ｐＨＣＶ−５８′、ｐＨＣＶ−１０１′、ｐ
    ＨＣＶ−１０２′、ｐＨＣＶ−１０３′、ｐＨＣＶ−１
    ０４′、ｐＨＣＶ−１０５′、およびｐＨＣＶ−１０７
    ′から選ばれたものであり、さらに、該第２アリコート
    を未結合ポリペプチドとまず接触させ、ついで該結合ポ
    リペプチドと接触させ、該未結合ポリペプチドがｐＨＣ
    Ｖ−２３、ｐＨＣＶ−２９、ｐＨＣＶ−３１、ｐＨＣＶ
    −３４、ｐＨＣＶ−２３′、ｐＨＣＶ−２９′、ｐＨＣ
    Ｖ−３１′、ｐＨＣＶ−３４′、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨ
    ＣＶ−４８、ｐＨＣＶ−４９、ｐＨＣＶ−５０、ｐＨＣ
    Ｖ−５１、ｐＨＣＶ−５７、ｐＨＣＶ−５８、ｐＨＣＶ
    −１０１、ｐＨＣＶ−１０２、ｐＨＣＶ−１０３、ｐＨ
    ＣＶ−１０４、ｐＨＣＶ−１０５、ｐＨＣＶ−１０７、
    ｐＨＣＶ−４５′、ｐＨＣＶ−４８′、ｐＨＣＶ−４９
    ′、ｐＨＣＶ−５０′、ｐＨＣＶ−５１′、ｐＨＣＶ−
    ５７′、ｐＨＣＶ−５８′、ｐＨＣＶ−１０１′、ｐＨ
    ＣＶ−１０２′、ｐＨＣＶ−１０３′、ｐＨＣＶ−１０
    ４′、ｐＨＣＶ−１０５′、およびｐＨＣＶ−１０７′
    から選ばれるものであって、該結合ポリペプチドが未結
    合ポリペプチドとは同じものではないことを特徴とする
    中和アッセイ。
11. 【請求項１１】　　液体試料中のＨＣＶ抗原と免疫学的
    に反応性の抗体の存在を同定する中和アッセイにおいて
    、該試料を第１および第２の免疫学的に均等なアリコー
    トの調製に使用し、該第１アリコートを固体支持体に結
    合したポリペプチドと、該ポリペプチドと該抗体とが複
    合して検出しうる抗体−ポリペプチド複合体を形成する
    条件下に、接触させ、該結合ポリペプチドがｐＨＣＶ−
    ２３、ｐＨＣＶ−２９、ｐＨＣＶ−３１、ｐＨＣＶ−３
    ４、ｐＨＣＶ−２３′、ｐＨＣＶ−２９′、ｐＨＣＶ−
    ３１′、ｐＨＣＶ−３４′、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨＣＶ
    −４８、ｐＨＣＶ−４９、ｐＨＣＶ−５０、ｐＨＣＶ−
    ５１、ｐＨＣＶ−５７、ｐＨＣＶ−５８、ｐＨＣＶ−１
    ０１、ｐＨＣＶ−１０２、ｐＨＣＶ−１０３、ｐＨＣＶ
    −１０４、ｐＨＣＶ−１０５、ｐＨＣＶ−１０７、ｐＨ
    ＣＶ−４５′、ｐＨＣＶ−４８′、ｐＨＣＶ−４９′、
    ｐＨＣＶ−５０′、ｐＨＣＶ−５１′、ｐＨＣＶ−５７
    ′、ｐＨＣＶ−５８′、ｐＨＣＶ−１０１′、ｐＨＣＶ
    −１０２′、ｐＨＣＶ−１０３′、ｐＨＣＶ−１０４′
    、ｐＨＣＶ−１０５′、およびｐＨＣＶ−１０７′から
    選ばれ、該第２アリコートを未結合ポリペプチドとまず
    接触させ、ついで該結合ポリペプチドと接触させ、該未
    結合ポリペプチドがｐＨＣＶ−２３、ｐＨＣＶ−２９、
    ｐＨＣＶ−３１、ｐＨＣＶ−３４、ｐＨＣＶ−２３′、
    ｐＨＣＶ−２９′、ｐＨＣＶ−３１′、ｐＨＣＶ−３４
    ′、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨＣＶ−４８、ｐＨＣＶ−４９
    、ｐＨＣＶ−５０、ｐＨＣＶ−５１、ｐＨＣＶ−５７、
    ｐＨＣＶ−５８、ｐＨＣＶ−１０１、ｐＨＣＶ−１０２
    、ｐＨＣＶ−１０３、ｐＨＣＶ−１０４、ｐＨＣＶ−１
    ０５、ｐＨＣＶ−１０７、ｐＨＣＶ−４５′、ｐＨＣＶ
    −４８′、ｐＨＣＶ−４９′、ｐＨＣＶ−５０′、ｐＨ
    ＣＶ−５１′、ｐＨＣＶ−５７′、ｐＨＣＶ−５８′、
    ｐＨＣＶ−１０１′、ｐＨＣＶ−１０２′、ｐＨＣＶ−
    １０３′、ｐＨＣＶ−１０４′、ｐＨＣＶ−１０５′、
    およびｐＨＣＶ−１０７′から選ばれたものであって、
    該結合ポリペプチドが該未結合ポリペプチドと同じもの
    ではなく、該第２アリコートを未結合および結合ポリペ
    プチドと同時に接触させることを特徴とする中和アッセ
    イ。
12. 【請求項１２】　　該ポリペプチドがｐＨＣＶ−２３ま
    たはｐＨＣＶ−２３′である請求項１１のアッセイ。
13. 【請求項１３】　　ｐＨＣＶ−２３、ｐＨＣＶ−２９、
    ｐＨＣＶ−３１、ｐＨＣＶ−３４、ｐＨＣＶ−２３′、
    ｐＨＣＶ−２９′、ｐＨＣＶ−３１′、ｐＨＣＶ−３４
    ′、ｐＨＣＶ−４５、ｐＨＣＶ−４８、ｐＨＣＶ−４９
    、ｐＨＣＶ−５０、ｐＨＣＶ−５１、ｐＨＣＶ−５７、
    ｐＨＣＶ−５８、ｐＨＣＶ−１０１、ｐＨＣＶ−１０２
    、ｐＨＣＶ−１０３、ｐＨＣＶ−１０４、ｐＨＣＶ−１
    ０５、ｐＨＣＶ−１０７、ｐＨＣＶ−４５′、ｐＨＣＶ
    −４８′、ｐＨＣＶ−４９′、ｐＨＣＶ−５０′、ｐＨ
    ＣＶ−５１′、ｐＨＣＶ−５７′、ｐＨＣＶ−５８′、
    ｐＨＣＶ−１０１′、ｐＨＣＶ−１０２′、ｐＨＣＶ−
    １０３′、ｐＨＣＶ−１０４′、ｐＨＣＶ−１０５′、
    およびｐＨＣＶ−１０７′から選ばれる少なくとも１つ
    のＨＣＶ抗原を含有するポリペプチド、１またはそれ以
    上の試料調製試薬、および１またはそれ以上の検出およ
    びシグナル生成試薬とからなることを特徴とする免疫ア
    ッセイ用キット。
14. 【請求項１４】　　該ポリペプチドが固体支持体に結合
    されている請求項１３のキット。
15. 【請求項１５】　　ｐＨＣＶ−２３、ｐＨＣＶ−２９、
    ｐＨＣＶ−３１、およびｐＨＣＶ−３４から選ばれるプ
    ラスミド。