JPH0720438B2 - インターロイキン−１に対する抗体 - Google Patents
インターロイキン−１に対する抗体Info
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- JPH0720438B2 JPH0720438B2 JP62283481A JP28348187A JPH0720438B2 JP H0720438 B2 JPH0720438 B2 JP H0720438B2 JP 62283481 A JP62283481 A JP 62283481A JP 28348187 A JP28348187 A JP 28348187A JP H0720438 B2 JPH0720438 B2 JP H0720438B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、インターロイキン−１（IL−１）に対する抗
体、詳しくはIL−１の免疫学的精製、測定等を可能とす
る新しいヒトIL−１に対する抗体に関する。
体、詳しくはIL−１の免疫学的精製、測定等を可能とす
る新しいヒトIL−１に対する抗体に関する。
従来の技術 ヒトIL−１は、マクロファージ・単球のみならず、多く
の細胞から産生され、多様な分子形態と生物活性とを示
すことが知られている。現在、該ヒトIL−１には等電点
が異なる２種のもの、即ちIL−１α及びIL−１βが知ら
れており、それらはそれぞれ一次構造も明らかにされて
いる〔Nature,315,p641（1985）;J.Exp.Med.,164,p237
（1986）等〕。
の細胞から産生され、多様な分子形態と生物活性とを示
すことが知られている。現在、該ヒトIL−１には等電点
が異なる２種のもの、即ちIL−１α及びIL−１βが知ら
れており、それらはそれぞれ一次構造も明らかにされて
いる〔Nature,315,p641（1985）;J.Exp.Med.,164,p237
（1986）等〕。
上記IL−１は、医薬品としての応用が種々研究されてい
ると共に、例えば各種の免疫欠損病や異常免疫応答の研
究並びに之等の臨床上の診断のために、殊に臨床サンプ
ルにおけるその測定が着目されている。
ると共に、例えば各種の免疫欠損病や異常免疫応答の研
究並びに之等の臨床上の診断のために、殊に臨床サンプ
ルにおけるその測定が着目されている。
しかして、現在該IL−１の測定技術としては、バイオア
ッセイ（生物学的検定法）が知られており、この方法に
おいてIL−１は被検サンプルの活性量として測定されて
いる。しかしながらこの方法は、操作性及び精度に劣
り、常に測定値を干渉する成分の存在を考慮する必要が
ある。しかも上記方法では、IL−１α及びIL−１βが同
一活性を示すことから、之等を区別して測定できないと
いう大きな欠点があった。
ッセイ（生物学的検定法）が知られており、この方法に
おいてIL−１は被検サンプルの活性量として測定されて
いる。しかしながらこの方法は、操作性及び精度に劣
り、常に測定値を干渉する成分の存在を考慮する必要が
ある。しかも上記方法では、IL−１α及びIL−１βが同
一活性を示すことから、之等を区別して測定できないと
いう大きな欠点があった。
発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記ヒトIL−１βに対する抗体を提供
することにある。
することにある。
また、本発明の目的はヒトIL−１βをヒトIL−１αとは
区別して測定できる新しい免疫学的測定手法に利用でき
るヒトIL−１に対する抗体を提供することにある。
区別して測定できる新しい免疫学的測定手法に利用でき
るヒトIL−１に対する抗体を提供することにある。
また、本発明の目的は、IL−１の異常産生を伴う各種疾
患において、上記IL−１の作用の抑制（中和）に利用で
きるヒトIL−１に対する抗体を提供することにある。
患において、上記IL−１の作用の抑制（中和）に利用で
きるヒトIL−１に対する抗体を提供することにある。
本発明の他の目的は、上記抗体の製造技術を提供するこ
とにある。
とにある。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、天然又は遺伝子組換え法により得られ
るヒトIL−１βを抗原として得られるヒトIL−１β抗体
であって、ヒトIL−１βの下記フラグメント（１）及び
（７）と、（１）、（５）、（６）及び（７）と、
（１）、（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）
と、又は（１）〜（７）の全てと、結合することを特徴
とするヒトIL−１βモノクローナル抗体が提供される。
るヒトIL−１βを抗原として得られるヒトIL−１β抗体
であって、ヒトIL−１βの下記フラグメント（１）及び
（７）と、（１）、（５）、（６）及び（７）と、
（１）、（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）
と、又は（１）〜（７）の全てと、結合することを特徴
とするヒトIL−１βモノクローナル抗体が提供される。
（１）24番目から153番目の配列からなるポリペプチ
ド。
ド。
（２）１番目から82番目の配列からなるポリペプチド。
（３）１番目から102番目の配列からなるポリペプチ
ド。
ド。
（４）１番目から120番目の配列からなるポリペプチ
ド。
ド。
（５）１番目から140番目の配列からなるポリペプチ
ド。
ド。
（６）１番目から144番目の配列からなるポリペプチ
ド。
ド。
（７）１番目から148番目の配列からなるポリペプチ
ド。
ド。
本発明抗体の利用によれば、ヒトIL−１βをヒトIL−１
αとは区別して高感度、高精度でしかも簡便に測定可能
な新しい免疫検定法（イムノアッセイ法）が提供され
る。
αとは区別して高感度、高精度でしかも簡便に測定可能
な新しい免疫検定法（イムノアッセイ法）が提供され
る。
また、本発明抗体はヒトIL−１βに特異的であるため、
その利用によれば、例えばアフィニティークロマトグラ
フィー等の手法による、それらの特異的精製手段も提供
される。
その利用によれば、例えばアフィニティークロマトグラ
フィー等の手法による、それらの特異的精製手段も提供
される。
更に本発明抗体には、ヒトIL−１の生物活性に対して中
和活性を有するタイプの抗体が包含され、かかる抗体
は、IL−１の異常産生を伴う各種の疾患、例えば慢性関
節リウマチ、甲状腺炎、肝炎，腎炎等の慢性炎症性疾
患、動脈硬化、川崎病等の血管炎、汎発性血管内凝固症
候群、血液ガン等において、その異常産生に基づく亢進
されたIL−１の生物活性を、抑制乃至中和するために有
用であり、かかる各種疾患の治療上極めて価値ある医薬
が提供される。
和活性を有するタイプの抗体が包含され、かかる抗体
は、IL−１の異常産生を伴う各種の疾患、例えば慢性関
節リウマチ、甲状腺炎、肝炎，腎炎等の慢性炎症性疾
患、動脈硬化、川崎病等の血管炎、汎発性血管内凝固症
候群、血液ガン等において、その異常産生に基づく亢進
されたIL−１の生物活性を、抑制乃至中和するために有
用であり、かかる各種疾患の治療上極めて価値ある医薬
が提供される。
本発明抗体は、ヒトIL−１βを免疫抗原として利用して
製造することができる。より具体的には、例えば上記免
疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺
乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞（hybridoma）を
作成し、これよりヒトIL−１βを認識する所望抗体を産
生するクローンを選択し、該クローンの培養により製造
できる。
製造することができる。より具体的には、例えば上記免
疫抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺
乳動物の形質細胞腫細胞との融合細胞（hybridoma）を
作成し、これよりヒトIL−１βを認識する所望抗体を産
生するクローンを選択し、該クローンの培養により製造
できる。
上記方法において用いられる免疫抗原としてのヒトIL−
１βとしては、特に限定はなく、既に公知のインビトロ
で誘導されたヒトIL−１βを含有する培養上清乃至その
精製標品、遺伝子組換え技術に従い製造されたヒトIL−
１β及びその一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチド
等のいずれでもよい。
１βとしては、特に限定はなく、既に公知のインビトロ
で誘導されたヒトIL−１βを含有する培養上清乃至その
精製標品、遺伝子組換え技術に従い製造されたヒトIL−
１β及びその一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチド
等のいずれでもよい。
また、上記方法において免疫抗原で免疫される哺乳動物
としては、特に制限はないが、細胞融合に使用する形質
細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが好まし
く、一般にはマウス、ラツト等が有利に用いられる。
としては、特に制限はないが、細胞融合に使用する形質
細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが好まし
く、一般にはマウス、ラツト等が有利に用いられる。
免疫は一般的方法により、例えば上記免疫抗原を哺乳動
物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等により投与する
ことにより実施できる。より具体的には、免疫抗原を、
所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に
２〜14日毎に数回投与し、総投与量が約100〜500μg/マ
ウス程度になるようにするのが好ましい。免疫抗原とし
ては、上記最終投与の約３日後に摘出した脾臓細胞を使
用するのが好ましい。
物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射等により投与する
ことにより実施できる。より具体的には、免疫抗原を、
所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に
２〜14日毎に数回投与し、総投与量が約100〜500μg/マ
ウス程度になるようにするのが好ましい。免疫抗原とし
ては、上記最終投与の約３日後に摘出した脾臓細胞を使
用するのが好ましい。
更に、上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての
哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々の
もの、例えばp3（p3/×63−Ag8）〔Nature,256,495−49
7（1975）〕、p3−U1〔Current Topics in Microbiolog
y and Immunology,81,1−７（1978）〕、NS−１〔Eur.
J.Immunol.,６,511−519（1976）〕、MPC−11〔Cell,
８,405−415（1976）〕、SP2/O〔Nature,276,269−270
（1978）〕、FO〔J.Immunol.Meth.,35,1−21（198
0）〕、×63.6.5.3.〔J.Immunol.,123,1548−1550（197
9）〕、S194〔J.Exp.Med.,148,313−323（1978）〕等
や、ラツトにおけるR210〔Nature,277,131−133（197
9）〕等の骨髄腫細胞等を使用できる。
哺乳動物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々の
もの、例えばp3（p3/×63−Ag8）〔Nature,256,495−49
7（1975）〕、p3−U1〔Current Topics in Microbiolog
y and Immunology,81,1−７（1978）〕、NS−１〔Eur.
J.Immunol.,６,511−519（1976）〕、MPC−11〔Cell,
８,405−415（1976）〕、SP2/O〔Nature,276,269−270
（1978）〕、FO〔J.Immunol.Meth.,35,1−21（198
0）〕、×63.6.5.3.〔J.Immunol.,123,1548−1550（197
9）〕、S194〔J.Exp.Med.,148,313−323（1978）〕等
や、ラツトにおけるR210〔Nature,277,131−133（197
9）〕等の骨髄腫細胞等を使用できる。
上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知の
方法、例えばMilsteinらの方法〔Method in Enzymolog
y,Vol.73,pp3（1981）〕等に準じて行なうことができ
る。より具体的には、上記融合反応は、通常の融合促進
剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイ
ウイルス（HVJ）等の存在下に、通常の培地中で実施さ
れ、培地には更に融合効率を高めるためにジメチルスル
ホキシド等の補助剤を必要に応じて添加することもでき
る。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方
法と変りはなく、例えば形質細胞腫細胞に対して免疫細
胞を約１〜10倍程度用いるのが普通である。融合反応時
の培地としては、形質細胞腫細胞の増殖に通常使用され
る各種のもの、例えばRPMI−1640培地、MEM培地、その
他のこの種細胞培養に一般に利用されるものを例示で
き、通常之等培地は牛胎児血清（FCS）等の血清補液を
抜いておくのがよい。融合は上記免疫細胞と形質細胞腫
細胞との所定量を、上記培地内でよく混合し、予め37℃
程度に加温したPEG溶液、例えば平均分子量1000〜6000
程度のものを、通常培地に約30〜60W/V％の濃度で加え
て混ぜ合せることにより行なわれる。以後、適当な培地
を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰返すこ
とにより所望のハイブリドーマが形成される。
方法、例えばMilsteinらの方法〔Method in Enzymolog
y,Vol.73,pp3（1981）〕等に準じて行なうことができ
る。より具体的には、上記融合反応は、通常の融合促進
剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイ
ウイルス（HVJ）等の存在下に、通常の培地中で実施さ
れ、培地には更に融合効率を高めるためにジメチルスル
ホキシド等の補助剤を必要に応じて添加することもでき
る。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通常の方
法と変りはなく、例えば形質細胞腫細胞に対して免疫細
胞を約１〜10倍程度用いるのが普通である。融合反応時
の培地としては、形質細胞腫細胞の増殖に通常使用され
る各種のもの、例えばRPMI−1640培地、MEM培地、その
他のこの種細胞培養に一般に利用されるものを例示で
き、通常之等培地は牛胎児血清（FCS）等の血清補液を
抜いておくのがよい。融合は上記免疫細胞と形質細胞腫
細胞との所定量を、上記培地内でよく混合し、予め37℃
程度に加温したPEG溶液、例えば平均分子量1000〜6000
程度のものを、通常培地に約30〜60W/V％の濃度で加え
て混ぜ合せることにより行なわれる。以後、適当な培地
を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰返すこ
とにより所望のハイブリドーマが形成される。
得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行な
われる。該HAT培地での培養は、目的とするハイブリド
ーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な
時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得られ
るハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とす
る抗体の検索及び単一クローン化に供される。
培地、例えばHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行な
われる。該HAT培地での培養は、目的とするハイブリド
ーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な
時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得られ
るハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的とす
る抗体の検索及び単一クローン化に供される。
目的抗体産生株の検索は、例えばELISA法〔Engvall,E.,
Meth.Enzymol.,70,419−439（1980）〕、プラーク法、
スポツト法、凝集反応法、オクテロニー（Ouchterlon
y）法、ラジオイムノアツセイ（RIA）法等の一般に抗体
の検出に用いられている種々の方法〔「ハイブリドーマ
法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング
発行、第30−53頁、昭和57年３月５日〕に従い実施する
ことができ、この検索には前記免疫抗原が利用できる。
Meth.Enzymol.,70,419−439（1980）〕、プラーク法、
スポツト法、凝集反応法、オクテロニー（Ouchterlon
y）法、ラジオイムノアツセイ（RIA）法等の一般に抗体
の検出に用いられている種々の方法〔「ハイブリドーマ
法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプラニング
発行、第30−53頁、昭和57年３月５日〕に従い実施する
ことができ、この検索には前記免疫抗原が利用できる。
かくして得られるヒトIL−１βを認識する所望のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地
で継代培養することができ、また液体窒素中で長期間保
存することができる。
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地
で継代培養することができ、また液体窒素中で長期間保
存することができる。
上記ハイブリドーマからの所望抗体の採取は、該ハイブ
リドーマを、常法に従って培養してその培養上清として
得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動
物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採
用される。前者の方法は，高純度の抗体を得るのに適し
ており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
リドーマを、常法に従って培養してその培養上清として
得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動
物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等が採
用される。前者の方法は，高純度の抗体を得るのに適し
ており、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
また上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析、ゲル
過法、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常の手
段により精製することができる。
過法、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常の手
段により精製することができる。
かくして得られる本発明のモノクローナル抗体は、ヒト
IL−１βに特異反応性を有するものである。
IL−１βに特異反応性を有するものである。
また本発明抗体中には、ヒトIL−１の生物活性に対し
て、中和活性を有するタイプの抗体が包含される。かか
る抗体は生物活性のあるヒトIL−１を特異的に測定する
のに好適である。またかかる中和活性を有するタイプの
抗体、殊にIL−１分子上のIL−１受容体との結合に関与
する部位を認識するタイプの抗体は、前記したIL−１の
異常産生を伴う各種疾患への適用に好適である。
て、中和活性を有するタイプの抗体が包含される。かか
る抗体は生物活性のあるヒトIL−１を特異的に測定する
のに好適である。またかかる中和活性を有するタイプの
抗体、殊にIL−１分子上のIL−１受容体との結合に関与
する部位を認識するタイプの抗体は、前記したIL−１の
異常産生を伴う各種疾患への適用に好適である。
更に本発明抗体中には、ヒトIL−１分子の異なる部位を
認識し、抗体相互の立体障害がなく、同時にヒトIL−１
分子に結合することができるタイプの抗体も包含されて
おり、かかる抗体は、例えばサンドイッチ法等による免
疫検定に利用するのに極めて有用である。
認識し、抗体相互の立体障害がなく、同時にヒトIL−１
分子に結合することができるタイプの抗体も包含されて
おり、かかる抗体は、例えばサンドイッチ法等による免
疫検定に利用するのに極めて有用である。
更に加えて、本発明抗体中には、液相系又は固相系での
反応性が特に優れたタイプの抗体が包含されている。そ
れらは液相系及び固相系免疫検定法に適用するのに極め
て好ましい。
反応性が特に優れたタイプの抗体が包含されている。そ
れらは液相系及び固相系免疫検定法に適用するのに極め
て好ましい。
発明の効果 本発明によれば、ヒトIL−１βに特異的なモノクローナ
ル抗体が提供され、この本発明抗体の採用によれば、測
定感度が極めて高く、特異性に優れ、従って、例えば臨
床サンプル等の極めて低濃度のヒトIL−１βを含有する
検体中の該ヒトIL−１βを正確に測定可能な免疫検定法
による測定手法が提供される。
ル抗体が提供され、この本発明抗体の採用によれば、測
定感度が極めて高く、特異性に優れ、従って、例えば臨
床サンプル等の極めて低濃度のヒトIL−１βを含有する
検体中の該ヒトIL−１βを正確に測定可能な免疫検定法
による測定手法が提供される。
実施例 以下、本発明をより詳しく説明するため実施例を挙げる
が、本発明は之等に限定されない。
が、本発明は之等に限定されない。
実施例１ ヒトIL−１βに対する抗体の製造 遺伝子組換え技術に従い製造したヒトIL−１β〔生化
学，58,8号,p840（1986）;EPO187991号〕の10μｇを、B
ALB/Cマウスに、完全フロインドアジュバントと共に腹
腔内投与した。３〜４週間おきに同量を不完全アジュバ
ントと共に２回追加投与して免疫した。３〜４週間後に
最終免疫として30μｇのヒトIL−１βの生食溶液を静脈
内投与した。最終免疫の３〜４日後に、常法に準じて、
細胞融合を行なった〔Method in Enzymology,73,pp3（1
981）等参照〕。即ち、該細胞融合は、上記免疫された
脾細胞と骨髄腫細胞〔P3U1、Current Topics in Microb
iology and Immunology,81,1−７（1978）〕とを10:1の
割合で用い、ポリエチレングリコール（PEG−4000）を
用いて行なった。
学，58,8号,p840（1986）;EPO187991号〕の10μｇを、B
ALB/Cマウスに、完全フロインドアジュバントと共に腹
腔内投与した。３〜４週間おきに同量を不完全アジュバ
ントと共に２回追加投与して免疫した。３〜４週間後に
最終免疫として30μｇのヒトIL−１βの生食溶液を静脈
内投与した。最終免疫の３〜４日後に、常法に準じて、
細胞融合を行なった〔Method in Enzymology,73,pp3（1
981）等参照〕。即ち、該細胞融合は、上記免疫された
脾細胞と骨髄腫細胞〔P3U1、Current Topics in Microb
iology and Immunology,81,1−７（1978）〕とを10:1の
割合で用い、ポリエチレングリコール（PEG−4000）を
用いて行なった。
ハイブリドーマを、HAT培地で選別後、その上清を上記
ヒトIL−１βをコートした96穴マイクロプレート及びパ
ーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスグロブリン抗体〔イ
ー．ワイ．ラブ（E.Y.Lab.）社製〕を用いた酵素免疫測
定法により試験して、目的のヒトIL−１βに対する抗体
産生株を検出した。
ヒトIL−１βをコートした96穴マイクロプレート及びパ
ーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスグロブリン抗体〔イ
ー．ワイ．ラブ（E.Y.Lab.）社製〕を用いた酵素免疫測
定法により試験して、目的のヒトIL−１βに対する抗体
産生株を検出した。
限界希釈法によりクローニングを繰返して、所望の抗体
産生クローン７株を得た。
産生クローン７株を得た。
各クローンから得られたそれぞれの抗体の特性を以下の
方法に従い求めた。
方法に従い求めた。
抗体のサブクラス マウス抗体サブクラス検出キット（バイオ・ラッド（Bi
o−Rad）社製）を用いて決定した。
o−Rad）社製）を用いて決定した。
抗体産生レベル ハイブリドーマが最大細胞密度になった時の培養上清中
のIgG量（μg/ml）により示した。
のIgG量（μg/ml）により示した。
力価 下記に従い、それぞれ求めた。
RIA:ヨードゲン法〔B.B.R.C.,80,849−857（1978）〕に
従い125Iで標識したヒトIL−１βの100μｌ（約10000cp
m）、ハイブリドーマの培養上清の希釈液100μｌ並びに
0.01％NaN3、5mM EDTA及び0.1％BSAを含むPBSの100μｌ
を混合して反応（４℃）させ、これにキャリヤー蛋白と
して正常ヤギ血清50μｌを加え、更に20％PEGのPBS溶液
600μｌを加えて混合し、氷溶中で20分放置した後、遠
心分離して沈渣の放射能をγ−カウンターで測定した。
125I標識IL−１βが15％沈渣にくる培養上清の希釈率を
RIA力価とした。
従い125Iで標識したヒトIL−１βの100μｌ（約10000cp
m）、ハイブリドーマの培養上清の希釈液100μｌ並びに
0.01％NaN3、5mM EDTA及び0.1％BSAを含むPBSの100μｌ
を混合して反応（４℃）させ、これにキャリヤー蛋白と
して正常ヤギ血清50μｌを加え、更に20％PEGのPBS溶液
600μｌを加えて混合し、氷溶中で20分放置した後、遠
心分離して沈渣の放射能をγ−カウンターで測定した。
125I標識IL−１βが15％沈渣にくる培養上清の希釈率を
RIA力価とした。
EIA:96穴マイクロプレートに20μg/mlに調製したヒトIL
−１βを分注（100μl/ウエル）し、１時間室温で放置
した。PBSで洗浄後、非特異吸着を防ぐためにBSAでブロ
ックし、PBS−トウィーン20で洗浄した。希釈したハイ
ブリドーマの培養上清を分注（100μl/ウエル）し、37
℃で２時間反応させた後、洗浄し、更にパーオキシダー
ゼ標識抗マウス免疫グロブリン（カペル社製、X5000）
を100μl/ウエル加えて、同様に反応させた。洗浄後、
結合した酵素活性を比色分析し、OD492＝1.0をとる培養
上清の希釈倍率をもつてEIA力価とした。
−１βを分注（100μl/ウエル）し、１時間室温で放置
した。PBSで洗浄後、非特異吸着を防ぐためにBSAでブロ
ックし、PBS−トウィーン20で洗浄した。希釈したハイ
ブリドーマの培養上清を分注（100μl/ウエル）し、37
℃で２時間反応させた後、洗浄し、更にパーオキシダー
ゼ標識抗マウス免疫グロブリン（カペル社製、X5000）
を100μl/ウエル加えて、同様に反応させた。洗浄後、
結合した酵素活性を比色分析し、OD492＝1.0をとる培養
上清の希釈倍率をもつてEIA力価とした。
RIA/IgG及びEIA/IgG:之等は、上記RIA力価及びEIA力価
を、抗体産生レベルでそれぞれ除した値である。
を、抗体産生レベルでそれぞれ除した値である。
また、RIA/IgGは液相系での反応性〔125I−標識ヒトIL
−１βと本発明抗体との反応性〕を、EIA/IgGは固相系
での反応性〔固相化したヒトIL−１βと本発明抗体との
反応性〕を示している。
−１βと本発明抗体との反応性〕を、EIA/IgGは固相系
での反応性〔固相化したヒトIL−１βと本発明抗体との
反応性〕を示している。
分子量 ハイブリドーマをマウスの腹腔内で培養した後、IgG精
製キット〔MOPS Kit、バイオ・ラッド社製〕により、Ig
G1に精製したものの分子量を示す〔SDS−PAGEによる重
鎖と軽鎖の分子量の和を抗体の分子量とする〕。
製キット〔MOPS Kit、バイオ・ラッド社製〕により、Ig
G1に精製したものの分子量を示す〔SDS−PAGEによる重
鎖と軽鎖の分子量の和を抗体の分子量とする〕。
交叉反応性 遺伝子組換え技術により製造された被検蛋白（いずれも
ヒト）を用い、ウエスタン・ブロッティング〔Western
blotting;Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,76,4350（1979）;A
nal.Biochem.,112,195（1981）〕により求めた。“−”
は交叉反応性がないことを示している。
ヒト）を用い、ウエスタン・ブロッティング〔Western
blotting;Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,76,4350（1979）;A
nal.Biochem.,112,195（1981）〕により求めた。“−”
は交叉反応性がないことを示している。
結合定数（kd） スキャチャード・プロット・アナリシス（Scatchard pl
ot analysys）により求めた。
ot analysys）により求めた。
中和活性 LAF活性〔J.Immunol.,116,1466（1976）〕により求めた
結果であり、“＋”は中和活性があることを示してい
る。
結果であり、“＋”は中和活性があることを示してい
る。
上記各特性を求めた結果を下記第１表に示す。
結合部位の決定 ヒトIL−１βの製造〔EPO187991号〕に準じて、下記に
示すヒトIL−１βの各フラグメントを製造した。
示すヒトIL−１βの各フラグメントを製造した。
〈フラグメント〉 Ｎ−10:ヒトIL−１βのアミノ酸番号11〜153からなるポ
リペプチド Ｎ−16:ヒトIL−１βのアミノ酸番号17〜153からなるポ
リペプチド Ｎ−23:ヒトIL−１βのアミノ酸番号24〜153からなるポ
リペプチド Ｃ−82:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜82からなるポ
リペプチド Ｃ−102:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜102からなる
ポリペプチド Ｃ−120:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜120からなる
ポリペプチド Ｃ−140:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜140からなる
ポリペプチド Ｃ−144:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜144からなる
ポリペプチド Ｃ−148:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜148からなる
ポリペプチド ヒトIL−１β及び上記各フラグメントを発現しているそ
れぞれの大腸菌に、6.25mMトリス緩衝液（pH6.8、２％S
DS、５％2ME、10％グリセロール、0.001％BPBを含む）1
00μｌを加えて溶解し、100℃で２分間煮沸して電気泳
動用サンプルとし、ウエスタン・ブロッティングによ
り、本発明抗体との反応性を試験した。
リペプチド Ｎ−16:ヒトIL−１βのアミノ酸番号17〜153からなるポ
リペプチド Ｎ−23:ヒトIL−１βのアミノ酸番号24〜153からなるポ
リペプチド Ｃ−82:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜82からなるポ
リペプチド Ｃ−102:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜102からなる
ポリペプチド Ｃ−120:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜120からなる
ポリペプチド Ｃ−140:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜140からなる
ポリペプチド Ｃ−144:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜144からなる
ポリペプチド Ｃ−148:ヒトIL−１βのアミノ酸番号１〜148からなる
ポリペプチド ヒトIL−１β及び上記各フラグメントを発現しているそ
れぞれの大腸菌に、6.25mMトリス緩衝液（pH6.8、２％S
DS、５％2ME、10％グリセロール、0.001％BPBを含む）1
00μｌを加えて溶解し、100℃で２分間煮沸して電気泳
動用サンプルとし、ウエスタン・ブロッティングによ
り、本発明抗体との反応性を試験した。
得られた結果を下記第２表に示す。
上記第２表より、抗体ANOC201、同206及び同207は、い
ずれもヒトIL−１βのアミノ酸番号121から140の配列中
に、抗体ANOC202及び同204は、同24から82の配列中に、
抗体ANOC203は、同83から102の配列中に、抗体ANOC205
は、同145から148の配列中に、それぞれ認識部位を有す
ることが判る。
ずれもヒトIL−１βのアミノ酸番号121から140の配列中
に、抗体ANOC202及び同204は、同24から82の配列中に、
抗体ANOC203は、同83から102の配列中に、抗体ANOC205
は、同145から148の配列中に、それぞれ認識部位を有す
ることが判る。
本発明抗体の立体障害試験 本発明抗体を、ヨードゲン法により125Iで標識して標識
抗体を得た。
抗体を得た。
また、本発明抗体を、物理的吸着法〔Clin.Chem.Acta.,
135,263（1983）〕に従い、ポリスチレンビーズ（6.4m
m）に吸着させて不溶化抗体を得た。
135,263（1983）〕に従い、ポリスチレンビーズ（6.4m
m）に吸着させて不溶化抗体を得た。
上記で得られた不溶化抗体と20ngのヒトIL−１βとを0.
1％BSA及び0.01％チメロザールを含む0.5mlのPBS溶液中
で、37℃で２時間反応させ、ビーズを洗浄後、上記で得
た標識抗体の約100000cpmの上記PBS溶液0.5mlを加え
て、37℃で２時間振盪下に反応させた。
1％BSA及び0.01％チメロザールを含む0.5mlのPBS溶液中
で、37℃で２時間反応させ、ビーズを洗浄後、上記で得
た標識抗体の約100000cpmの上記PBS溶液0.5mlを加え
て、37℃で２時間振盪下に反応させた。
ビーズを洗浄後、ビーズに結合した放射能をカウントし
て、各抗体間での反応性（不溶化抗体−ヒトIL−１β−
標識抗体のサンドイッチが形成されるか否か）を試験し
た。
て、各抗体間での反応性（不溶化抗体−ヒトIL−１β−
標識抗体のサンドイッチが形成されるか否か）を試験し
た。
その結果、抗体ANOC201、同206及び同207の各抗体間で
は、サンドイッチが形成されず、それら抗体は、IL−１
βのほぼ同一の部位を認識する抗体であることが推定さ
れた。
は、サンドイッチが形成されず、それら抗体は、IL−１
βのほぼ同一の部位を認識する抗体であることが推定さ
れた。
上記以外の試験されたすべての抗体間（同一抗体を除
く）では、いずれもその反応に障害が認められなかっ
た。
く）では、いずれもその反応に障害が認められなかっ
た。
線維芽細胞上IL−１受容体への結合阻害試験Ｉ ６ウェルプレート上で、一面にほぼ均一にまで増殖させ
たBALB/c3T3線維芽細胞（ATCC CCL−163、１×106細胞
／ウェル）に、125Iで標識したIL−１β（ボルトン−ハ
ンター法〔Biochem.J.,133,529（1973）〕による、比活
性250μCi/μｇ蛋白以上）の8500cpm/ウェルと共に、予
め10％FCS添加Ｄ−MEM中で37℃下にインキュベートした
本発明抗体（抗IL−１βモノクローナル抗体）の所定量
を加え、37℃下に４時間反応させた。次いで、反応液に
ラット血清50μｌ及び20％PEG250μｌを加え、４℃下に
20分間反応させ、遠心分離（12000rpm15分間）して沈澱
（結合物）と上清（非結合物）とを分離した後、放射能
（結合放射能）をγ−カウンターにて測定した。
たBALB/c3T3線維芽細胞（ATCC CCL−163、１×106細胞
／ウェル）に、125Iで標識したIL−１β（ボルトン−ハ
ンター法〔Biochem.J.,133,529（1973）〕による、比活
性250μCi/μｇ蛋白以上）の8500cpm/ウェルと共に、予
め10％FCS添加Ｄ−MEM中で37℃下にインキュベートした
本発明抗体（抗IL−１βモノクローナル抗体）の所定量
を加え、37℃下に４時間反応させた。次いで、反応液に
ラット血清50μｌ及び20％PEG250μｌを加え、４℃下に
20分間反応させ、遠心分離（12000rpm15分間）して沈澱
（結合物）と上清（非結合物）とを分離した後、放射能
（結合放射能）をγ−カウンターにて測定した。
本発明抗体を使用しない対照における上記放射能測定値
を（Ａ）、プレートへの非特異的吸着放射能値を
（Ｂ）、本発明抗体の所定量使用による上記測定値を
（Ｃ）として、下式により、本発明抗体による線維芽細
胞上IL−１受容体へのIL−１βの結合の阻害能（％）を
算出した。
を（Ａ）、プレートへの非特異的吸着放射能値を
（Ｂ）、本発明抗体の所定量使用による上記測定値を
（Ｃ）として、下式により、本発明抗体による線維芽細
胞上IL−１受容体へのIL−１βの結合の阻害能（％）を
算出した。
尚、上記試験におけるＡ値は3895cpm/ウェルであり、上
記Ｃ値は301cpmであった。
記Ｃ値は301cpmであった。
本発明抗体としてANOC203及びANOC205を用いて得られた
結果を、第３表に示す。
結果を、第３表に示す。
上記第３表より、本発明抗体ANOC203は、IL−１受容体
への125I−IL−１βの結合を阻害し、従ってIL−１βの
IL−１受容体結合部位を認識するものであることが判
る。また本発明抗体ANOC205は上記阻害能を実質的に有
しておらず、従ってこれはIL−１βのIL−１受容体結合
部位とは異なる部位を認識するものであることが判る。
への125I−IL−１βの結合を阻害し、従ってIL−１βの
IL−１受容体結合部位を認識するものであることが判
る。また本発明抗体ANOC205は上記阻害能を実質的に有
しておらず、従ってこれはIL−１βのIL−１受容体結合
部位とは異なる部位を認識するものであることが判る。
線維芽細胞上IL−１受容体への結合阻害試験II 上記結合阻害試験Ｉと同様にして線維芽細胞を増殖させ
た各ウェルに、125Iで標識したIL−１αと共にIL−１β
の10ng/ml及び所定量の本発明抗体を加えて反応させ、
次いで、同様にして遠心分離後、各ウェルの放射能を測
定し、本発明抗体による線維芽細胞上IL−１受容体への
IL−１βの結合の阻害能（％）を算出した。
た各ウェルに、125Iで標識したIL−１αと共にIL−１β
の10ng/ml及び所定量の本発明抗体を加えて反応させ、
次いで、同様にして遠心分離後、各ウェルの放射能を測
定し、本発明抗体による線維芽細胞上IL−１受容体への
IL−１βの結合の阻害能（％）を算出した。
尚、上記試験におけるＡ値は8278cpm/ウェルであり、上
記Ｃ値は410cpmであった。
記Ｃ値は410cpmであった。
本発明抗体としてANOC203及びANOC205を用いて得られた
結果を、第４表に示す。
結果を、第４表に示す。
上記第４表より、125I−IL−１αのIL−１受容体への結
合はIL−Ｉβによって阻害されるが、本発明抗体ANOC20
3はIL−１βのIL−１受容体結合部位を認識し、該IL−
１βのIL−１受容体への結合を阻害するため、結合阻害
能の回復が認められる。本発明抗体ANOC205はIL−１β
のIL−１受容体結合部位を認識するものではないため、
その利用では結合阻害能の回復は認められないことが明
らかである。
合はIL−Ｉβによって阻害されるが、本発明抗体ANOC20
3はIL−１βのIL−１受容体結合部位を認識し、該IL−
１βのIL−１受容体への結合を阻害するため、結合阻害
能の回復が認められる。本発明抗体ANOC205はIL−１β
のIL−１受容体結合部位を認識するものではないため、
その利用では結合阻害能の回復は認められないことが明
らかである。
尚、上記実施例で得られたハイブリドーマの代表例とし
て、下記３種のものが通産省工業技術院微生物工業研究
所（微工研）に寄託されており、それらの表示及び寄託
番号は次の通りである。
て、下記３種のものが通産省工業技術院微生物工業研究
所（微工研）に寄託されており、それらの表示及び寄託
番号は次の通りである。
○抗体ANOC203産生ハイブリドーマ 表示:KOCO203 微工研条寄第1551号（FERM BP−1551） ○抗体ANOC205産生ハイブリドーマ 表示:KOCO205 微工研条寄第1552号（FERM BP−1552） ○抗体ANOC206産生ハイブリドーマ 表示:KOCO206 微工研条寄第1553号（FERM BP−1553）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 1/16 8318−4Ｈ 16/18 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙ ｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，40［３］（1986. ９）Ｐ．276−277
Claims (2)
- 【請求項１】天然又は遺伝子組換え法により得られるヒ
トインターロイキン−１βを抗原として得られるヒトイ
ンターロイキン−１β抗体であって、ヒトインターロイ
キン−１βの下記フラグメント（１）及び（７）と、
（１）、（５）、（６）及び（７）と、（１）、
（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）と、又は
（１）〜（７）の全てと、結合することを特徴とするヒ
トインターロイキン−１βモノクローナル抗体。 （１）24番目から153番目の配列からなるポリペプチ
ド。 （２）１番目から82番目の配列からなるポリペプチド。 （３）１番目から102番目の配列からなるポリペプチ
ド。 （４）１番目から120番目の配列からなるポリペプチ
ド。 （５）１番目から140番目の配列からなるポリペプチ
ド。 （６）１番目から144番目の配列からなるポリペプチ
ド。 （７）１番目から148番目の配列からなるポリペプチ
ド。 - 【請求項２】通産省工業技術院微生物工業研究所にKOCO
203（微工研条寄第1551号、FERM BP−1551）、KOCO205
（微工研条寄第1552号、FERM BP−1552）及びKOCO206
（微工研条寄第1553号、FERM BP−1553）なる表示で寄
託された抗体産生細胞により産生される特許請求の範囲
第１項に記載のヒトインターロイキン−１βモノクロー
ナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62283481A JPH0720438B2 (ja) | 1986-11-13 | 1987-11-10 | インターロイキン−１に対する抗体 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27099286 | 1986-11-13 | ||
| JP61-270992 | 1986-11-13 | ||
| JP62283481A JPH0720438B2 (ja) | 1986-11-13 | 1987-11-10 | インターロイキン−１に対する抗体 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6086564A Division JPH06339394A (ja) | 1986-11-13 | 1994-04-25 | ヒトインターロイキン−１αに対するモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63258595A JPS63258595A (ja) | 1988-10-26 |
| JPH0720438B2 true JPH0720438B2 (ja) | 1995-03-08 |
Family
ID=26549482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62283481A Expired - Lifetime JPH0720438B2 (ja) | 1986-11-13 | 1987-11-10 | インターロイキン−１に対する抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0720438B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0630788A (ja) * | 1992-07-16 | 1994-02-08 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | ヒトインターロイキン−１に対する組換え抗体 |
| US6270758B1 (en) | 1998-10-08 | 2001-08-07 | Duke University | Substantially non-toxic biologically active mucosal adjuvants in vertebrate subjects |
| EP2391652A4 (en) * | 2009-01-29 | 2013-01-02 | Abbott Lab | IL-1 BINDING PROTEINS |
| JP6456015B2 (ja) * | 2013-07-19 | 2019-01-23 | 国立大学法人三重大学 | 閉塞性動脈硬化症モデル動物、るい痩研究用モデル動物、及び全身性アミロイドーシスモデル動物としての非ヒト哺乳動物 |
-
1987
- 1987-11-10 JP JP62283481A patent/JPH0720438B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢｉｏｌｏｇｙ，４０［３（１９８６．９）Ｐ．２７６−２７７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63258595A (ja) | 1988-10-26 |
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