JPH06153987A

JPH06153987A - １４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの新規製造法

Info

Publication number: JPH06153987A
Application number: JP32989592A
Authority: JP
Inventors: Hideki Yoshioka; 秀樹吉岡; So Asada; 創浅田; Shinji Fujita; 真司藤田
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1992-11-17
Filing date: 1992-11-17
Publication date: 1994-06-03

Abstract

(57)【要約】【構成】マイロセシウム属に属し、４−アンドロステン
−３，１７−ジオンを水酸化し、１４−α−ヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを生産する能
力を有する微生物を４−アンドロステン−３，１７−ジ
オンを含む培地にて培養し、培養物より１４α−ヒドロ
キシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを採取す
ることを特徴とする。【効果】本発明の方法を用いることにより、ホルモンの
合成の為に利用されるアンドロステン誘導体、１４α−
ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの
生産性が高まり、より効率的に製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ホルモンの合成の為に
利用されるアンドロステン誘導体、１４α−ヒドロキシ
−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの新規製造法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、下記構造式で示される１４α−ヒ
ドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンの製
造法としては、クルブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）
属に属する菌株、例えばクルブラリア・ルナタ（Ｃｕｒ
ｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａ）を栄養源含有培地で培
養し、培養物より１４α−ヒドロキシ−４−アンドロス
テン−３，１７−ジオンを採取する方法（ソビエト特許
第８０１５１７号「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ α−
ｈｙｄｒｏｘｙ−ａｎｄｒｏｓｔｅｎｅ−ｄｉｏｎｅ
ｂｙｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｈｙｄｒｏｌ
ｙｓｉｓｏｆａｎｄｒｏｓｔｅｎｅ−ｄｉｏｎｅｕ
ｓｉｎｇＣｕｒｖｕｌａｒｉａｌｕｎａｔａｂａ
ｃｔｅｒｉａ，ｉｎａｑ．ｏｒａｌｃｏｈｏｌｉｃ
ｍｅｄｉｕｍ」）が知られている。

【０００３】しかし、この方法によると、出発物質の４
−アンドロステン−３，１７−ジオンの濃度を１．５ｇ
／ｌ以上にすると、生成物の１４α−ヒドロキシ−４−
アンドロステン−３，１７−ジオンの収量が低く、同時
に生成する副生成物の為品質並びに精製収率が低下する
等の問題がある。

【０００４】

【化１】

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、さらに効率
のよい１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，
１７−ジオンの製造法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、効率の良
い１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７
−ジオンの製造法を目的として多数の微生物を土壌中よ
り分離し、その生成効率を調べたところ、マイロセシウ
ム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属する微生物が効率
良く１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１
７−ジオンを生産していることを見出した。

【０００７】本発明を概説すれば、本発明の第１の発明
は、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属
し、４−アンドロステン−３，１７−ジオンを水酸化し
１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−
ジオンを生成する能力を有する微生物を４−アンドロス
テン−３，１７−ジオンを含む培地にて培養し、培養物
より１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１
７−ジオンを採取することを特徴とする。

【０００８】また、本発明の第２の発明は、マイロセシ
ウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）属に属し、４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンを水酸化し、１４α−ヒド
ロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオンを生成
する能力を有する微生物に関する。

【０００９】前記培養物からこの生産物を単離し、理化
学的性質を調べた結果、１４α−ヒドロキシ−４−アン
ドロステン−３，１７−ジオンの標準品と一致した。

【００１０】本発明で用いられる微生物として具体的に
は、例えば前記マイロセシウム・ストリアチスポラム
（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍｓｔｒｉａｔｉｓｐｏｒｕ
ｍ）ＮＫ−９２８４６１株〔微工研菌寄第１３１７５号
（FERM P- １３１７５）〕があげられる。

【００１１】また該菌株の自然的および人工的変異株は
もちろん、マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ）
属に属する菌株で４−アンドロステン−３，１７−ジオ
ンを水酸化し１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン
−３，１７−ジオンを生成する能力を有する微生物はす
べて本発明において使用することができる。

【００１２】ＮＫ−９２８４６１株は次の菌学的性質を
有する。

【００１３】（１）各種培地における成育状態各種寒天培地におけるＮＫ−９２８４６１株の生育状態
は下表のとおりである。観察は２５℃で１０日後に行っ
た。

【００１４】

【表１】

【００１５】本菌は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地上
で直径１ｍｍ以下の分生子座を集落周辺部に形成する。
分生子座は、分生子が粘塊状に存在するために、暗緑色
〜黒緑色を呈する。

【００１６】分生子柄は、子座層から形成され、無色、
枝状に分岐していて、表面はややいぼ状。分生子形成細
胞は、フィアライド構造を有し、数本が輪生し、互いに
密生して平行した層になる。円形状（１０〜１５×１．
５〜２．５μｍ）、無色、分生子形成部周辺が暗色とな
る。

【００１７】分生子は、舟形〜紡錘形（６．９〜９．８
×２．３〜３．９μｍ）、基部は突き出て裁断状、灰褐
色〜オリーブ褐色、表面には、縦方向にらせん状にねじ
れた細い溝を有する。

【００１８】（２）生理学的性質至適生育温度は２５℃前後で、１０℃〜３３℃で生育
し、好ましい生育温度は２０〜３０℃、３７℃では生育
しない。至適生育ｐＨは、４．０〜６．０である。

【００１９】以上の各種菌学的性質より本菌は、Ｍｏｒ
ｅＤｅｍａｔｉａｃｅｏｕｓＨｙｐｈｏｍｙｃｅｔ
ｅｓ（１９７６．ＣＭＩ，Ｋｅｗ．Ｅｌｌｉｓ，Ｍ．
Ｂ．）に従い、真正菌類、不完全菌亜目、不完全糸状菌
亜網のマイロセシウム・ストリアチスポラム（Ｍｙｒｏ
ｔｈｅｃｉｕｍｓｔｒｉａｔｉｓｐｏｒｕｍ）に属す
る一菌株であることが明らかになり本菌株をマイロセシ
ウム・ストリアチスポラム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ
ｓｔｒｉａｔｉｓｐｏｒｕｍ）ＮＫ−９２８４６１株と
命名した。

【００２０】本発明による１４α−ヒドロキシ−４−ア
ンドロステン−３，１７−ジオンの生産は、炭素源、窒
素源、無機物その他使用菌株の必要とする微量の栄養素
をほどよく含有する通常の培地に基質となる４−アンド
ロステン−３，１７−ジオンを添加し培養する。炭素源
としては、グリセリンの他に、例えばグルコース、フラ
クトース、シュークロース、マルトース、ラクトース、
デキストリン、澱粉、水飴、糖蜜、油脂類、有機酸類な
どを用いることができる。

【００２１】窒素源としては、例えば大豆粉、綿実粉、
コーンスチープリカー、ペプトン、カゼイン、カザミノ
酸、酵母エキス、胚芽、肉エキス、尿素、アミノ酸、ア
ンモニウム塩などの有機窒素化合物や無機窒素化合物が
使用可能である。

【００２２】さらに無機物としてはナトリウム塩、カリ
ウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩など
の無機塩類が単独あるいは適宜組み合わせて用いられ
る。

【００２３】さらに必要に応じて鉄塩、銅塩、亜鉛塩、
マンガン塩、コバルト塩などの重金属、ビオチン、ビタ
ミンＢ₁などのビタミン類を適宜添加してもよい。ま
た、シリコーンオイル、ポリアルキレングリコールエー
テルなどの界面活性剤を培地に加えてもよい。

【００２４】培養法としては、微生物の培養に用いられ
る一般的方法が採用されるが、液体培養法、特に振盪ま
たは深部通気攪拌培養が最適である。培養温度は１０℃
〜３３℃の範囲で可能であるが通常１５〜３０℃が好ま
しく、培養ｐＨは通常２〜８が好ましい。

【００２５】また培養日数は培養条件によって異なる
が、通常１〜１０日である。培地中の４−アンドロステ
ン−３，１７−ジオン濃度は微生物の生育を阻害しない
濃度であれば特に制限はなく、最高１０％（Ｗ／Ｖ）程
度まで可能であるが、通常０．０２〜２．０％濃度にな
るように添加するのがよい。

【００２６】また４−アンドロステン−３，１７−ジオ
ンの添加時期は、培養開始時に培地の一部として存在さ
せてもよいし、培養中連続的または間欠的に添加しても
よい。培養中、グルコースやマルトースあるいはシュー
クロースなどの炭素源またはペプトンや酵母エキスなど
の窒素源を添加する場合、これに伴って添加してもよ
い。

【００２７】培養終了後、培養物中に蓄積された１４α
−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン
を培養物中から採取する為には本物質の理化学的性質を
利用することにより行う。

【００２８】即ち、１４α−ヒドロキシ−４−アンドロ
ステン−３，１７−ジオンは菌体を含む不溶性画分及び
培養濾液中に含まれるので培養物を遠心分離または濾過
により培養菌体を含む不溶性画分と濾液とに分離してか
ら１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７
−ジオンを抽出採取することができる。

【００２９】また、培養物を直接非親水性有機溶媒、た
とえばクロロホルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノ
ール、メチルイソブチルケトンなどの有機溶媒で抽出す
ることにより分離し、採取することもできる。

【００３０】培養濾液から１４α−ヒドロキシ−４−ア
ンドロステン−３，１７−ジオンを分離採取するには、
培養濾液を活性炭、粉末セルロース、吸着性樹脂などの
担体に吸着させ、次いで適宜の溶媒で溶出することがで
きる。

【００３１】これらの担体から１４α−ヒドロキシ−４
−アンドロステン−３，１７−ジオンを溶出するために
は、水溶性有機溶剤例えば含水アルコールや含水アセト
ンなどで溶出することができる。

【００３２】菌体からの１４α−ヒドロキシ−４−アン
ドロステン−３，１７−ジオンの分離採取はアセトン、
エタノールなどの親水性有機溶媒で抽出し、ステロイド
類の通常知られた分離精製法を用い、さらに精製するこ
とができる。例えばシリカゲル、活性アルミナ、吸着性
樹脂などの担体を用いるカラムクロマトグラフィーによ
る方法である。

【００３３】担体としてシリカゲルを用いたカラムクロ
マトグラフィーでは、溶出溶媒としてクロロホルム、酢
酸エチル、アセトン、メタノール、水などを単独あるい
は適宜組み合わせた混合溶媒を用いて溶出することがで
きる。また高速液体クロマトグラフィーによる分離精製
も有利に利用できる。用いる担体としてはシリカゲル、
オクタデシル基、アミノ基、オクチル基、などが結合し
た化学結合型シリカゲル、またはポリスチレン系ポーラ
スポリマーゲルなどを用いる。

【００３４】移動層としてはヘキサン、イソプロピルア
ルコール、含水メタノール、含水アセトニトリルなどを
用いて溶出することができる。また液相間の分配に基づ
く分離、精製法である交流分配法も有利に利用できる。
分配液系としてはヘキサン−酢酸エチル−アセトニトリ
ル系、クロロホルム−メタノール−水系などの混合溶媒
を用いることができる。

【００３５】

【実施例】以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

【００３６】実施例ＮＫ−９２８４６１株〔微工研菌寄第１３１７５号（FE
RM P- １３１７５）〕の斜面培養から一白金耳を１００
ｍｌの液体培地（Ｍａｌｔｅｘｔ．３．０％、ポリペ
プトン２．０％、ソイビーンミール（Ｓｏｙｂｅａｎ
ｍｅａｌ）１．０％、ＫＨ₂ＰＯ₄０．５％、ＭｇＳＯ
₄７Ｈ₂Ｏ０．５％（以上の濃度はすべてＷ／Ｖ））を
入れた５００ｍｌ容の三角フラスコに接種し、２７℃で
３日間、振盪し、一次種培養液を得た。

【００３７】この種培養液全量を２０Ｌの液体培地Ａ
（砂糖５％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．２．０％、ソイビーンミール
（Ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ）１．０％、ＫＨ₂ＰＯ₄
０．５％、ＭｇＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ０．５％（以上の濃度は
すべてＷ／Ｖ））を入れた３０Ｌ容のジャーファメンタ
ーに接種し、２７℃で３日間、通気攪拌培養を行い、二
次種培養液を得た。

【００３８】この種培養液６Ｌを２０Ｌの液体培地Ｂ
（砂糖１０％、Ｃ．Ｓ．Ｌ．２．０％、ソイビーンミー
ル（Ｓｏｙｂｅａｎｍｅａｌ）１．０％、ＫＨ₂ＰＯ
₄０．５％、ＭｇＳＯ₄７Ｈ₂Ｏ０．５％、４−アンド
ロステン−３，１７−ジオン０．７５％（以上の濃度は
すべてＷ／Ｖ））を入れた３０Ｌ容のジャーファメンタ
ーに接種し、２７℃で５日間、通気攪拌培養を行った。

【００３９】このようにして得た培養液２リットルを遠
心分離により上澄と菌体に分離した。得られた菌体画分
をメタノールで３回抽出する（１リットル、１リット
ル、０．８リットル）。アセトン抽出液を減圧下１５０
ｍｌに濃縮し、ジクロロメタンで３回抽出する（０．５
リットル、０．５リットル、０．４リットル）。

【００４０】ジクロロメタン抽出液を無水硫酸ナトリウ
ムで脱水後、濃縮乾固し粗結晶を得た。更に、この結晶
を１６０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、予め２％メタ
ノールを含むジクロロメタンで平衡化した１００ｇのシ
リカゲルカラムに通液し、上記組成の溶媒で展開し所望
生成物６．３ｇを含む精製画分を得た。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、１４α−ヒドロキシ−
４−アンドロステン−３，１７−ジオンの生産性が著し
く高く、この化合物をより効率的に製造できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉ
ｕｍ）属に属し、４−アンドロステン−３，１７−ジオ
ンを水酸化し１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステン
−３，１７−ジオンを生成する能力を有する微生物を４
−アンドロステン−３，１７−ジオンを含む培地にて培
養し、培養物より１４α−ヒドロキシ−４−アンドロス
テン−３，１７−ジオンを採取することを特徴とする方
法。
【請求項２】マイロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉ
ｕｍ）属に属し、４−アンドロステン−３，１７−ジオ
ンを水酸化し、１４α−ヒドロキシ−４−アンドロステ
ン−３，１７−ジオンを生成する能力を有する微生物。