JPH0615559B2

JPH0615559B2 - 心房ペプチド

Info

Publication number: JPH0615559B2
Application number: JP60034281A
Authority: JP
Inventors: ニードルマンフイリツプ
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1984-05-04
Filing date: 1985-02-22
Publication date: 1994-03-02
Anticipated expiration: 2009-03-02
Also published as: EP0162032A2; FI79119B; DK163930C; IL74426A; GR850474B; DK81685A; JPS6127924A; US4508712A; EP0162032B1; ATE68503T1; FI79119C; IE57880B1; ZA851376B; AU569776B2; CA1244407A; DK81685D0; NO850709L; DE3584388D1; DK163930B; IE850436L

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景本発明は、有用なナトリウム利尿、利尿および血管拡張
活性を有する、新規な、高分子量の心房ペプチドに関す
る。

哺乳類動物の心房心筋の細胞は多数の膜結合貯蔵顆粒を
有することが知られている。ラット、イヌ、ネコおよび
ヒト心房に認められているこれらの特徴的な分泌顆粒
は、ペプチドホルモン産生細胞のもつ顆粒に類似してい
る〔デ・ボールドほか（DeBold et al.）：ジャーナル
・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミスト
リ−（J.Histochem.Cytochem.），２６：１０９４〜１
１０２（１９７８）参照〕。心房心筋組織の粗抽出液を
非利尿ラットに静脈内投与すると、急速かつ強力なナト
リウム利尿を生じることも報告されている〔デ・ボール
ドほか（DeBold et al）：ライフ・サイエンシズ（Life
Sci.），２８：８９〜９４（１９８１）参照〕。ラッ
トの心房ホモジネートを短時間煮沸し、セファデックス
（Sephadex）上で分画することによる部分精製はトリ
ポードほか（Trippodo et al.）によって行われた〔プ
ロシーディングズ・オブ・ソサイアティ・オブ・エクス
ペリメンタル・アンド・バイオロジカル・メディシン
（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.）、１７０：５０２〜５０８
（１９８２）〕。これらの研究者により、ナトリウム利
尿活性は、分子量3,６００〜４4,０００ダルトンの全範
囲に、また３6,０００〜４4,０００ダルトンの高分子量
範囲および3,６００〜5,０００ダルトンの低分子量範囲
の両ペプチド分画に見出されている。

ラットの心房抽出物も低分子量分画（10,000ダルトン以
下）と高分子量分画（２0,０００〜３0,０００ダルト
ン）に分画化され、量分画ともに、in vitroで平滑筋を
弛緩させること、ラットに静脈内投与すると強力なナト
リウム利尿作用を示すことが明らかにされている〔カリ
ーほか（Currie et al.）：サイエンス（Science），２
２１：７１〜７３（１９８３）参照〕。

その後、約１９個から５９個のアミノ酸の範囲のアミノ
酸配列をもつ、様々な低分子量および中間分子量の心房
性、ナトリウム利尿ペプチドが多くの研究者によって開
始されてきた。デ・ボールドほか〔De Bold et al.：フ
ェデレーション・プロシーディングズ（Fed.Proc.），
４２（３）：抄録１８７０，６１１頁（１９８３）〕は
分子量５１５０ダルトン、アミノ酸４７個の配列を有す
る心房性ナトリウム利尿ペプチドを精製し、これをカル
ジオナトリンＩ（Cardionatrin I）と命名した。さらに
３個のナトリウム利尿活性を有するピークが、高速流体
クロマトグラフィー（HPLC）によって得られている。

最近、グラマーほか〔Grammer et al.：バイオケミカル
・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション（Biochem.Biophys.Res.Commun.），１１６
（２）：６９３〜７０３，１９８３年１０月３１日〕
は、分子量約3,８００、アミノ酸残基３６個のラット心
房性ナトリウム利尿因子の部分精製について報告してい
る。

さらに最近になって、２８個のアミノ酸配列を有するラ
ットおよびヒトの心房性ナトリウム利尿ペプチドが開示
されている〔それぞれ、フリンほか（Flynn et al.）：
バイオケケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサー
チ・コミュニケーション（Biochem.Biophys.Res.Commu
n.），１１７（３）：８５９〜８６５〔１９８３年１２
月２８日）、およびカンガワほか、（Kangawa & Matsu
o）：同誌、１１８（１）：１３１〜１３９（１９８４
年１月１３日〕。

チボーほか〔Thibault et al.：エフイービーエス・レ
ターズ（FEBS Lett.），１６７：３５２〜３５６（１９
８４）〕は７３個のアミノ酸を有する中間分子量の心房
性ナトリウム利尿ペプチドの精製を、またカンガワほか
〔Kangawa et al.：バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.），１１９（３）：９３３〜９４０
（１９８４）〕は、４８個のアミノ酸を有する中間分子
量のβ−ラット心房性ナトリウム利尿ペプチドの精製を
報告している。

本出願人による係属中の米国特許出願、第５５１,3７２
号（１９８３年１１月１０日出願）および第５６９,6８
４号（１９８４年１月１０日出願）にはアミノ酸約１９
個から約２４個を有する低分子量の心房ペプチドが開示
され、請求されている。これらのペプチドの中の数種に
ついてはさらに、本出願人の指導する研究グループによ
って報告されている〔カリーほか（Currie et al.）：
サイエンス（Science），２２３：６７〜６９（１９８
４）〕。

発明の簡単な記述本発明は、有用なナトリウム利尿、利尿および血管拡張
活性を示す、新規な高分子量ペプチドを提供するもので
ある。この生物学的に活性なペプチドは、以下のアミノ
酸配列を有する。

このペプチド構造中のアミノ酸成分は、以下の慣用の略
記号によって示した。

本発明のペプチド物質は、それが最初得られたラット心
筋中には存在しなかった部分精製型で単離されている。
すなわち、低分子量ペプチドを実質的に含まず、他の細
胞成分や組織物質を含まない形に調製されている。この
新規な心房ペプチドの生理学的特徴は、それが、細胞外
容量、ナトリウムおよび血管抵抗性を改変する体液性物
質に関する心房内分泌系の研究に際してきわめて重要で
あることを示唆している。

本発明の新規ペプチドは、とくに、利尿剤、ナトリウム
利尿剤、腎血管拡張剤および平滑筋弛緩剤として治療的
に応用できる。すなわち、このペプチドは、ナトリウ
ム、尿量、に影響し、腎血管を拡張し、平滑筋の緊張を
緩和する。

要約すれば、この新規ペプチドはラット心房抽出物のゲ
ル濾過クロマトグラフィーによる分画化で得られた。こ
の操作で高分子量および低分子量分画が得られ、いずれ
も有用なナトリウム利尿活性を有する。低分子量分画は
本発明者の係属中の上記出願に記載されているように、
分離され、数種の低分子量心房性ナトリウム利尿ペプチ
ドに精製された。

ラット心房抽出物の上記ゲル濾過クロマトグラフィーに
よって得られた高分子量分画〔アトリオペプチゲン（at
riopeptigen）−APG〕は本発明に従って、等電点電気泳
動および逆相HPLCにより分画され、部分精製APGとし
た。部分精製高分子量分画の臭化シアン分解物の精製に
より、上記APGのアミノ酸１９〜１１１からなる９３個
のアミノ酸の、単一な生物活性臭化シアン分解ペプチド
を生じた。これらのペプチドの配列分析と、中間分子量
心房ペプチドの配列分析に関する最近の報告〔チボーほ
か（Thibault,et al.）：エフイービーエス・レターズ
（FEBS Lett.），１６７：３５２〜３５６（１９８４）
およびカンガワほか（Kangawa,et al.）：バイオケミカ
ル・アンド・バイオフイジカル・リサータ・コミュニケ
ーション（Biochem.Biophys.Res,Commun.），１１９：
９３３〜９４０（１９８４）〕とを組合せて、上記１１
１残基のAPGの全一次構造を明らかにした。

発明の詳細な記述本発明を形成する主題に関しては特許請求の範囲にとく
に指摘され、明確に請求されているが、以下の本発明の
好ましい実施態様についての詳細な記述により、本発明
はよりよく理解できるものと確信する。引用文献は、こ
の詳細な記述の末尾にもとめて示した。

ゲル濾過クロマトグラフィーの結果、ラット心房抽出物
のナトリウム利尿および利尿活性は、高分子量（２0,０
００〜３0,０００）および低分子量（１0,０００以下）
の分画に見出され、この両分画は平滑筋鎮痙活性（in v
itro）も示すことが明らかにされた(1)。トリプシンに
よる部分蛋白分解の影響から、本発明者は、高分子量分
画は低分子量分画の前駆体であると結論した。高分子量
分画のトリプシン処理により鎮痙活性は著明に増大した
のである。ゲル濾過において低分子量分画と共移動する
活性物質(2)は、逆相HPLCでアトリオペプチンＩ、IIお
よびIIIに分離される(3)。したがって、高分子量分画の
活性成分は、低分子量生物活性心房ペプチドであるアト
リオペプチン（AP）の前駆体、アトリオペプチゲン（AP
G）と命名された。これらのアトリオペプチンは、アト
リオペプチゲンの全１１１個のアミノ酸のうち、上述の
本発明者の係属中の特許出願に記載されているような以
下の部分配列を有するものである。

APＩ＝アミノ酸８８〜１０８ APII＝アミノ酸８８〜１１０ APIII＝アミノ酸８８〜１１１高分子量心房ペプチドおよびその誘導体の精製には、各
分画を部分トリプシン分解によって活性化したのち、平
滑筋を用いた生物検定を実施した（１，２）。活性分画
は低分子量アトリオペプチンの配列を含有する(3)。高
分子量分画（Ｇ−７５セファデックス・クロマトグラフ
ィーにより得る）の精製の第一工程は等電点電気泳動で
あって、これにより上記分画が生物活性物質群の混合物
（見かけの等電点：pH4.９１、5.０１、5.１７、5.３４
および6.０３）であることが明らかにされた。生物活性
物質群（pH4.６〜5.４）の混合物を、両性電解質および
蔗糖の除去後、逆相HPLCに付した。典型的なクロマトグ
ラムでは、生物活性ペプチドの複合混合物が３１および
３４％アセトニトリルのところに集まった。これらのペ
プチドのうち、最も多い成分はゲル分析により十分純粋
であって（見かけの分子量：１7,０００）、これを本発
明の方法に従ってさらに精製し、特性づけするアトリオ
ペプチゲンとして選択した。

アトリオペプチゲンから誘導されるアトリオペプチン類
の単純な配列に比べて、アトリオペプチゲンの複雑さか
らみて、本発明者は、アトリオペプチゲンも、もっと大
きいあるペプチドの誘導体であろうと結論した。したが
って、化学的分解の影響を検討した。低分子量アトリオ
ペプチン配列にはメチオニンがない(5)ことから、臭化
シアン分解が選ばれた。臭化シアン分解はアトリオペプ
チゲンの１１１個の全アミノ配配列の１８位のメチオニ
ンの位置で起こり、９３個のアミノ酸からなる高分子量
ペプチド断片が得られる。全高分子量分画の臭化シアン
消化物の分画化における初期工程で生物活性物質（３０
〜３１％アセトニトリル部に見出される）が得られ、こ
れを逆相HPLCで精製すると、電気泳動による見かけの分
子量が9,５００、HPLCで単一の成分が生成した。

両ペプチドの配列データを以下に示す。

これらのペプチドの配列とチボーほか〔Thibault et a
l.：エフイービーエス・レターズ（FEBS Lett.），１６
７：３５２〜３５６（１９８４）〕およびカンガワほか
〔Kangawa et.al：バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.），１１９：９３３〜９４０（１９
８４）〕の配列の重複から、１１１個の残基を有するア
トリオペプチゲンの一次構造が明らかである。Ｃ末端分
析の結果もこれと一致する。APGのカルボキシペプチダ
ーゼ処理では直ちにPheが除去されたが、TyrまたはArg
の放出は検知されなかった。一方、臭化シアン分解ペプ
チドを同様に処理した場合は、Tyr、ArgおよびPheの急
速な放出を認めた（第１表）。これから、このプレパレ
ーションは、同じ配列を有し、Tyr、ArgおよびPheで終
わる３種のペプチドを含むことがわかる。

この１１１個のアミノ酸残基配列には、そのＣ末端に最
近報告された低分子量ペプチド（配列にアンダーラインを付した）が導入されていて、
一対の塩基性アミノ酸残基（この場合Arg-Arg）と結合
している。これは多くの分泌ペプチドおよびタンパク質
の前駆体にみられる典型的な切断部位の形である。

上に示した１１１個のアミノ酸からなるアトリオペプチ
ゲンの全一次構造は、アトリオペプチゲンの最初の残基
３４個のＡアミノ酸配列、臭化シアン分解ペプチドの最
初の残基３９個のＢアミノ酸配列、中間Mr型心房ナトリ
ウム利尿因子のＣアミノ酸配列（１１）、およびβ−ラ
ット心房ナトリウム利尿ポリペプチドのＤ全アミノ酸配
列（１２）から推断された。

以下の実施例には、高分子量（２0,０００〜３0,００
０）分画の上記成分（アミノ酸１１１個）およびこの分
画から誘導された臭化シアン分解ペプチド断片（アミノ
酸９３個）について、精製、性質の一部、ならびにナト
リウム利尿、利尿および血管拡張活性を示す。

例１アトリオペプチゲンの調製１２００匹のラットの心臓から心房抽出物を調製し、す
でに報告されているように（３）、一般操作によってＧ
−７５セファデックス上クロマトグラフィーに付した。
高分子量分画を凍結乾燥し、両電解質キャリヤーである
pH４〜６のアンホリン（エルビーケー・インストリュー
メンツ、ロックヴィル、メリーランド）に溶解し、１１
０mlの蔗糖濃度勾配カラム（エルビーケー）を用い1,00
0Ｖで４０時間電気泳動を行った（４）。次にカラムを
４８ml／時の速度で溶出し、２mlずつの分画を集めた。
pHを測定したのち、カラム分画の一部（５０μ）をと
ってpHを８に調整し〔0.1Ｍトリス緩衝液（pH8.4）４５
０μを添加）、トリプシン（シグマ・ケミカル、セン
トルイス、ミズリー、１mlにつき１単位）と２２°で１
時間インキュベートした。これらのプレパレーションに
ついて、既報の一般操作（１，２）により、ヒヨコ直腸
弛緩活性を測定した。生物活性を有するカラム分画（約
３０ml）を合し（pH4.6〜5.4）、０．５Ｍ酢酸中Ｇ−５
０セファデックス（８０×2.７cm）を用いてクロマトグ
ラフィーに付し、両電解質と蔗糖を除去した。凍結乾燥
後、この物質を、ブラウンリーRP−３００アクアポアカ
ラムおよび既報（３）の溶媒系により逆相HPLCに付し
た。勾配は(a)０〜２４％Ａ、8.8分、(b)２４〜２８％
Ａ、２５分、(c)２８〜３６％Ａ、１００分以上から構
造された。HPLCカラム分画（２ml）の一部（５０μ）
をとり、真空中で乾燥し、0.１Ｍトリス（pH８）５００
μにとり、トリプシン処理し、上述のように生物測定
を実施した。

高分子量分画からの臭化シアン分解ペプチドの調製６００匹のラット心臓からの心房抽出物をＧ−７５セフ
ァデックス上クロマトグラフィーに付して得られた高分
子量分画の凍結乾燥物（１，３）を７０％ギ酸１０mlに
溶解し、ガラス栓付チューブ中、臭化シアン（イースト
マン・オーガニック・ケミカルズ・ロチェスター、N.
Y.）５００mgに加えた。１６時間（２２℃）後、水９０
mlを加え、この溶液を凍結乾燥した。上述のシステムを
用い、(a)０〜２7.２％Ａ、１０分、ついで(b)２7.２〜
３２％、６０分で、残留物を逆相HPCLに付した。生物活
性分画（２9.６〜３1.２％Ａで得られた）を真空中で乾
燥し、溶媒Ａ′（プロパノール−１中0.1％トリフルオ
ロ酢酸）およびＢ（水中0.１％トリフルオロ酢酸）の混
合物を、０.6７ml／分の速度、(a)０〜１５％Ａ′、５
分、ついで(b)１５〜２４％Ａ′、９０分で用いる第２
のプロトコールによって精製した。生物活性分画（２２
〜２2.５％Ａ′）を真空中で乾燥し、溶媒Ａ″（プロパ
ノール−１中0.０８５％リン酸）およびＢ″（水中0.０
８５％リン酸）を、0.６７ml／分の速度、０〜５０％
Ａ″、５０分で用いる第３のプロトコールに付した。生
物活性生成物（３2.１％Ａで得られた）を上記第２のプ
ロトコールを用いて２回HPLCに付して、２2.１％Ａ′に
単一の生物活性成分（２１５nmで検出）１１０μｇ（蛋
白質）を最終的に得た。

ペプチドの分析アミノ酸分析は、１nmolのペプチドを6N-HC1中１１０℃
で２２時間加水分解して行った。加水分解物を凍結乾燥
し、Ｏ−フタルアルデヒド・プレカラム・デリヴィティ
ゼーション（６）を用い、ついで逆相HPLCによるウォー
ターのアミノ酸分析システムに適用した。

ペプチドの配列決定Ｎ末端配列決定は、アプライド・バイオシステムズ４７
０Ａ型気相シクエンサーを使用して、２〜４nmolの配列
決定エドマン分解により実施し（７）、フェニルチオヒ
ダントイン誘導体をHPLCにより検出した（８）。平均反
応収率は９３％以上であった。

Ｃ末端配列決定は、５０nM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.
5）２８０μに１〜２nmolのペプチドを溶かし、これ
にカルボキシペプチダーゼＹ（２μｇ、２０μ、ピア
ス・ケミカル、ロックフォード、イリノイ）を加えて実
施した。間隔をおいて、サンプル５０μを採取し、２
５μの１％トリフルオロ酢酸に加え（９）、放出され
たアミノ酸を上述のアミノ酸分析によって測定した。

ゲル分析ペプチド（１〜２μｇ）の電気泳動はレムリ（Laemml
i、１０）に従い、１５％ポリアクリルアミドゲル（0.4
％ビスアクリルアミド）を用いて行った。ゲルは0.8％
硝酸銀で２０分間染色し、0.００５％クエン酸および0.
２％ホルムアルデヒドの溶液で展開した。

例２例１に記載したようにして精製した、臭化シアン分解高
分子量ラット心房ペプチドのナトリウム利尿活性をイヌ
で試験した。

高分子量ペプチドはそのまま、またはトリプシン処理後
に注射した。トリプシン（１単位１ml）インキュベーシ
ョンは、精製臭化シアン分解高分子量ペプチド１００mg
を用い、室温で６０分間実施した。アトリオペプチンＩ
およびIIペニンスラ・ラボズ（サンカルロス、カリフオ
ルニア）から購入した。アトリオペプチンIIIおよびSer
-Leu-Arg-Arg−アトリオペプチンIII〔フリンら（Flynn
et al.）のペプチド（１３）〕は自動ペプチド合成に
より合成した。

いずれかの性のモングレルイヌをペントバルビタールナ
トリウム（３０mg／kg、静注）により麻酔した。脇腹を
切開して右腎の腹膜を露出させた。尿管にPE１６０（レ
イー・アダムス）管を挿管し、これをフラクションコレ
クターにつないで尿を採取した。電磁流量計（径８mm、
カロリーナ・インストリューメント）を右腎動脈の周囲
に置いて、腎血流を測定した。２２ゲージの針（PE５０
管およびシリンジに連結）を流量計上の腎血管に挿入し
た。イヌには食塩水（0.９％NaCL）を1.3ml／分の割合
で連続的に注入した。尿サンプルは５分間隔で集め、容
量、ナトリウム、カリウムおよび浸透圧を測定した。ペ
プチドは３０分間隔で注射した（腎動脈内）。

結果高分子量（臭化シアン）ペプチドは濃度依存性の利尿を
生じ、これはトリプシン処理によって有意な変化を示さ
なかった。閥値反応（尿量の５０％増加）は0.3nmolで
達成されたが、３nmolでは尿流量は４５０％増加した。
容量の２００％増加を生じるのに必要なペプチドの量を
比較したところ、Ser-Leu-Arg-Arg-APIII0.3nmol、高分
子量＋トリプシン処理、高分子量のまま0.7nmol、アト
リオペプチンIIおよびIII１０nmolで、アリトオペプチ
ンＩでは３０nmolでも尿量は５０％しか増えなかった。
腎血流量を２０ml／分増加させるのに必要な用量を比較
した血管拡張作用の強さは次の順序であった。すなわ
ち、Ser-Leu-Arg-ArgAPIII１nmol、臭化シアン処理高分
子ペプチド（トリプシン前処理の有無いずれでも）３nm
ol、アトリオペプチンIII８nmol、アトリオペプチンII
１７nmolで、アトリオペプチンＩは３０nmolでも腎血流
量を６ml／分しか変化させなかった。各ペプチドにつき
３〜４匹の別のイヌを用いて試験した。

要約すると、精製した高分子量アトリオペプチゲン臭化
シアン断片は著明な利尿作用を示し、その作用は低分子
量ペプチドのうち最も強力なものと差がなかった。これ
から、このペプチドは腎臓で直ちに変換するか、または
腎臓がこのペプチドのまま直接認識するかのいずれかが
考えられる。ペプチドの作用強度の順序が、腎血管拡張
作用とナトリウム利尿作用とで一致しないのは、これら
の反応が別個のレセプターを介するためであろう。アミ
ノ酸１１１個のアトリオペプチゲン（臭化シアン分解前
の）の部分精製物をイヌで試験した場合も、ほぼ同様の
利尿作用が認められた。

以上の本発明の詳細な記載において引用された文献は次
の通りである。

文献１）カリーほか（Currie et al.）：サイエンス（Scien
ce），２１１：７１〜７３（１９８３）２）カリーほか（Currie et al.）：プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.），８１：１２３０〜１
２３３（１９８４）３）カリーほか（Currie et al.）：サイエンス（Scien
ce），２２３：６７〜６９（１９８４）４）ゲラーほか（Geller et al.）：バイオケミカル・
ジャーナル（Biochem.J.），１２７：８６５〜８７４
（１９７２）５）グロスほか（Gross & Witkop）：ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），２
３７：１８５６〜１８６０（１９６２）６）ヒルほか（Hill et al.）：アナリティカル・ケミ
ストリー（Anal.Chem.），５１：１３３８〜１３４１
（１９７９）７）ハンカピラーほか（Hunkapiller et al.）：メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.），９
１：３９９〜４１３（１９８３）８）ハンカピラーほか（Hunkapiller & Hood）：同誌，
４８６〜４９３９）ハヤシ（Hayashi）：メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー（Methods Enzymol.），４７：８４〜９３（１９
７７） 10)レムリ（Laemmli）：ネイチャー（Nature），２２
７：６８０〜６８５（１９７０） 11)チボーほか（Thibault et al.）：エフイービーエス
・レターズ（FEBS Lett.），１６７：３５２〜３５６
（１９８４） 12)カンガワほか（Kangawa et al.）：バイオケミカル
・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション（Biochem.Biophys.Res.Commun.），１１９：９
３３〜９４０（１９８４） 13)フリンほか（Flynn et al.）：バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ン（Biochem.Biophys.Res.Commun.），１１７：８５９
〜８６５（１９８３）本明細書の記載から、本技術分野における熟練者には、
本発明の精神および範囲から逸脱しない範囲で多くの他
の例が自明であろう。これらは本発明の範囲に包含され
るものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下のアミノ酸配列を有するペプチド。