JPH0615604B2

JPH0615604B2 - β―ヒドロキシブチレート共重合体

Info

Publication number: JPH0615604B2
Application number: JP56185153A
Authority: JP
Inventors: ポ−ル・ア−サ−・ホルムス; スチ−ブン・ヒユ−・コリンズ; レオナ−ド・フレデリツク・ライト
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1980-11-18
Filing date: 1981-11-18
Publication date: 1994-03-02
Anticipated expiration: 2009-03-02
Also published as: JPH0469186B2; EP0052460B1; US4393167A; DE3168826D1; JPS57111349A; JPH0470342B2; EP0052460A1; JPH03149255A; JPS57150393A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、ポリβ−ヒドロキシ酪酸（以下ＰＨＢと略
記する）に関している。

ＰＨＢは、多くの微生物、特に細菌、例えばアルカリゲ
ネス属、アチオロジウム属、アゾトバクター属、バシラ
ス属、ノカルジア属、シュードモナス属、リゾビウム属
およびスピリルム属の細菌によって、エネルギー貯蔵物
質として蓄積される、式−ＣＨ（ＣＨ_３）・ＣＨ_２・Ｃ
Ｏ・Ｏ−なる繰返し単位から構成される熱可塑性ポリエ
ステルである。

この重合体は微生物を水性培地中で、エネルギーおよび
炭素源として炭水化物またはメタノールのような適当な
基質で培養することにより製造するのが便宜である。そ
の基質は、もちろん、微生物によって資化されうるもの
でなければならない。重合体の蓄積を促進するため、培
養の少なくとも一部分は、当該微生物の繁殖にとって必
須であるが、重合体の蓄積のためには要求されないある
栄養源を制限した条件下で実施するのが好ましい。適当
な培養方法の例は、欧州特許第１５６６９号明細書およ
び欧州特許出願第８１．３０３３７３号明細書に記載さ
れている。

このような方法で培養された微生物の細胞から抽出した
ＰＨＢは、前記のような熱可塑性ポリエステルであり、
このものは、急速に比較的高いレベルまで結晶化し、例
えば７０％またはそれ以上のオーダーである。この結晶
化挙動は、重合体を例えば成形用材料として使用すると
きには、しばしば欠点となる。

この発明により、ＰＨＢの結晶化は、重合体鎖に非類似
単量体単位を組み入れることで変性できることが判明し
た。

下記の重合体合成を導く代謝経路の説明では、次の略号
を用いた：ＣｏＡＳＨは、未エステル化補酵素Ａである。したがつ
てＣＨ_３ＣＯＳＣｏＡは補酵素Ａのアセチルチオエステ
ルで、一般にアセチルＣｏＡと命名している。

ＮＡＤＰは、酸化状態のニコチン酸アミドアデニンジヌ
クレオチドホスフェートである。ＮＡＤＰＨ_２は、還元
したＮＡＤＰである。

微生物によるＰＨＢの生合成における第１工程は、アセ
チルＣｏＡの合成と考えられる。これは、例えば補酵素
Ａと酢酸エステル、またはピルベート〔（炭水化物のグ
リコリシス（解糖）生成物またはオキサロアセテート
（トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルまたはクレブサイ
クル）の一員である）の脱カルボキシル化で生成する〕
の脱カルボキシル化により形成される。

したがつて、アセチルＣｏＡ源としての酢酸エステル
で、ＰＨＢは次の反応を含む代謝経路で製造される：ここで（−OCH(CH₃)CH₂CO−）_n-1（ｎ−１）個の繰返し
単位を含むＰＨＢである。したがつて、反応(4)は、−O
CH(CH₃)CH₂CO−単位を重合体鎖に附加する。

この発明により、ある種の有機酸の存在下に、一定条件
下で微生物を培養することにより、重合体鎖に少割合の
共単量体単位を導入できることが判明した。プラスチツ
ク材料として実用的用途のためには、重量平均分子量
（Mw）１０，０００以上（例えばゲル透過クロマトグラ
フイーで測定）でなければならない。

したがつて、この発明により重量平均分子量１０，００
０以上で繰返し単位 (I) −OCH(CH₃)CH₂CO− ９９．９ないし５０モル％および繰返し単位 (II) −ＯＣＨ（Ｃ_２Ｈ_５）ＣＨ_２ＣＯ− ０．１ないし５０モル％を有する共重合体を提供する。

用いる各酵素はある程度の非特異性を有しているので、
このような共重合体が製造できる。

反応(1)に関与する酵素チオキナーゼは、広範な特異性
を有し、チオキナーゼは次の反応により、補酵素Ａを種
々の他のカルボキシ基に結合させる：酵素β−ケトチオラーゼが関与する反応(2)は、次のよ
うに示される： (2) CH₃COSCoA+CH₃COSCoA→ CH₃COCH₂COSCoA+CoASH この反応は一部特異的で、一方の反応体はアセチルCoA
でなければならない。したがつて、一般的な反応は、次
の通りである： (2a) R・COSCoA+CH₃COSCoA→ RCOCH₂COSCoA+CoASH 同様に、反応(3)のレグクターゼ酵素の特異性は、変性
し次のようにして一般式RCOCH₂COSCoAの脂肪族アシルチ
オエステルを還元する： (3a) R・COCH₂COSCoA+NADPH₂→ RCHOHCH₂COSCoA+NADP 反応(4)のポリメラーゼ酵素は、絶対特異性ではない。
一般的反応は、次のように示される：（ＲとＲ′とは異つていてもよい）したがつて、このルートは、次の単位を含む重合体にな
る： −OCHR¹CH₂CO− 即ち単位−COR¹R²CR³R⁴CO− （Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４はそれぞれ水素原子）もし、若干の繰返し単位中、Ｒ^１がメチルでなければ、
共重合体が得られる。

反応（4a）の反応体であるβ−ヒドロキシチオエステ
ル、例えばRCHOHCH₂COSCoAは、場合により、非特異性脂
肪酸代謝酵素エノイルヒドラターゼにより触媒される反
応によつても製造される：〔反応（5a）、（5b）は、逆にすることもできる、即ち
炭素−炭素二重結合の水素化は、チオエステル化反応の
後に起きてもよい〕。Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、必ずし
も水素原子でなくてもよい。

したがつて、反応（5a）、（5b）および（4a）を用い
て、次式の単位を重合体鎖に導入することもできる： −OCR¹R²CHR³CO− 即ち、単位−OCR¹R²CR³R⁴O−（R⁴＝Ｈ）。したがつて、
もしＲ^２およびＲ^３がそれぞれ水素原子でなく、繰返し
単位Ｒ^１の若干がメチル基でなければ、共重合体が得ら
れる。

反応（4a）のポリメラーゼ酵素も非特異性であつて、ａ
−位置にヒドロキシ基を有する反応体、例えば次のタイ
プのもの −OCR¹R²CO− 即ち単位 −OCR¹R²CR³R⁴)_nCO−（ｎ＝０）を重合体鎖に導入する。

場合によつては、このポリメラーゼ酵素は、次の一般式
のβ−ヒドロキシ反応体も資化する： R¹R²C(OH)CR³R⁴COSCoA これらの反応体は、反応（1b）により対応するβ−ヒド
ロキシ酸から作られる：例えば、β−ヒドロキシ酪酸はβ−ヒドロキシブチリル
CoAを与え、ピバリン酸はピバリルCoAを与える： CH₂(OH)C(CH₃)₂COO^-+CoASH→ CH₂(OH)C(CH₃)COSCoA+OH^- このような反応体は、次の一般式の単位 −OCR¹R²CR³R⁴CO− を重合体に導入し、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４がそれぞれ水
素原子で、繰返し単位Ｒ^１の若干がメチル基でなけれ
ば、共重合体が得られる。

不飽和酸では、反応（5a）の代りに反応（5b）が起き、
重合体合成は反応（2a）および（3a）を含むルートの外
に、例えば反応（5a）による炭素−炭素二重結合の水素
化または炭素−炭素二重結合の還元により進行し、例え
ば次の反応による：したがつて、一つの可能な順序は、次の通りである：したがつて、これらのルートは、次の単位を含む共重合
体を与える： −OCHR¹CH₂CO− 即ち −OCHR¹R²CR³R⁴CO− この場合Ｒ^２Ｒ^３およびＲ^４は、それぞれ水素原子で、
Ｒ^１は −CHRCHR′R″および／または−CHRC(OH)R′R″で
ある。

共重合体中の繰返し単位IIの割合は、共重合体の全繰返
し単位の０．１ないし５０モル％、特に１ないし４０モ
ル％である。場合によつては、微生物により得られる重
合体は、繰返し単位Ｉのホモ重合体と繰返し単位Ｉおよ
びIIを含む共重合体との混合物である。この場合、重合
体中の繰返し単位IIの全体の割合は、全繰返し単位の
０．１ないし５０モル％である。好ましくは、繰返し単
位IIの割合は、３ないし３０モル％である。

この発明により、上記の反応のコースに従う代りに、微
生物は、上記の反応に加えてまたはその若干の代りに脱
離反応を行い、３−位置のヒドロキシ基を介して重合体
鎖に結合したβ−ヒドロキシバレリン酸単位を含む重合
体を与える。したがって、共重合体は、単位−ＯＣＨ
（Ｃ_２Ｈ_５）ＣＨ_２ＣＯ−を含んでいる。

β−ヒドロキシ酪酸単位、即ち次の単位 −OCH(CH₃)CH₂CO− および他の単位を含むある種の重合体は、既に文献に記
載されている。

エチレン性不飽和を示す赤外バンドを示す重合体が、Da
visによりApplied Microbiology１２（１９６４）ｐ．
３０１〜３０４に発表されている。Davisによれば、β
−ヒドロキシ酪酸単位および次の３−ヒドロキシ−２−
ブテノン酸単位 −OC(CH₃)=CHCO− を含む共重合体であるとされているこれら重合体は、Ｎ
ｏｃａｒｄｉａをｎ−ブタンに培養して製造できる。

Wallen外はEnvironmentel Science and Technology６
（１９７２）ｐ．１６１〜１６４および８（１９７４）
ｐ．５７６〜５７９に、活性汚泥から単離し反覆洗浄後
融点９７〜１００℃で、β−ヒドロキシ酪酸単位および
次のβ−ヒドロキシバレリン酸単位 −OCH(C₂H₅)CH₂CO− を１：５の比で含む重合体を発表している。

Marchessault外は、IUPAC Macro Florence１９８０ In
ternatinal Symposium on Macromoles Preprints２（１
９８０）ｐ．２７２〜２７５に、この化合物の研究を報
告し、主としてβ−ヒドロキシバレリン酸単位を含むこ
とを確認している。

ＵＳＰ３２７５６１０には、ある種の微生物、特にNoca
rdia salmonicolorを炭素数４個を含むカルボン酸に培
養するポリエステルの微生物学的製造法が示されてい
る。実施例２および３では、それぞれ３−ブテノン酸お
よびα−ヒドロキシ酪酸を用い、重合体は示された融点
の１７８〜１８４℃のオーダーからポリβ−ヒドロキシ
酪酸である。しかし、実施例１では、２−メチルアクリ
ル酸（メタクリル酸）を用い、得られる重合体は固定し
てないが、融点２１５〜２２０℃を有しかつメチルエチ
ルケトンに可溶性と説明されている。これに対し、この
発明の主としてβ−ヒドロキシ酪酸残基を含む共重合体
は、融点１８０℃以下で冷メチルエチルケトンに不溶性
である。

ＰＨＢ蓄積性微生物を、適当な基質、即ちエネルギーお
よび炭素源に好気的に培養すると、微声物は増殖のため
の必須要件の一つまたはそれ以上が消費されるまで増殖
する。以下においてこの微生物の増殖を、“繁殖”と称
する。繁殖必須要件の一つが消費されたとき、その後の
繁殖は、もしあつたとしても極めて限られた程度である
が、基質は消費されない限り、ＰＨＢは微生物に蓄積さ
れる。

ある種の微生物では、ＰＨＢ誘発抑制因子、例えば１つ
またはそれ以上の繁殖必須要件の制限が存在しなくて
も、微生物の繁殖中にＰＨＢは蓄積するであろう；しか
し、このように蓄積したPHBの量は一般に少量で、代表
的には得られる細胞の約１０wt%以下である。したがつ
て、バツチ式培養で繁殖したとき、１つまたはそれ以上
の繁殖必須要件が消費されるまでは、殆んどＰＨＢ蓄積
なしで微生物は繁殖し、その後微生物はＰＨＢを合成す
る。

この発明により、共重合体を製造するために、繁殖のた
めの必須要件の１つまたはそれ以上の量を抑制するが、
ＰＨＢ蓄積は制限しない条件下での微生物の培養中、基
質の少なくとも一部として一般に共単量体単位になる酸
を用いる必須があることが判明した。繁殖の必須要件の
制限を行わないときは、一般に酸は微生物により別の経
過で代謝され、例えばアセチルCoAまたはＴＣＡサイク
ルの一員になり、共重合体は製造されなくなる。したが
つて、一例として、何らの繁殖制限なしではプロピオン
酸は微生物により代謝され、プロピオニルCoAを経て炭
酸ガスを取り込みメチルマロニルCoA、次いでＴＣＡサ
イクルの一員であるサクシネートになる。

したがつて、この発明により、ポリエステルを蓄積でき
る微生物を、水溶性、同化性炭素含有基質の水性培地
で、培養の少なくとも一部は微生物繁殖の１つまたはそ
れ以上の必須要件を制限するがポリエステル蓄積は制限
しない条件下で培養を実施して、熱可塑性ポリエステル
を製造する方法において、培養を制限した期間の少なく
とも一部の間で、基質がこの制限された条件下で微生物
により、−OCH(CH₃)CH₂CO−繰返し単位のみよりなる以
外のポリエステルに代謝できる有機酸またはその塩より
なることを特徴とする方法を提供する。

この点に関し、前記のＵＳＰ３２７５６１０では得られ
る細胞の量は、繁殖制限が行われなかつたような量であ
る。

基質および酸素（これは一般に醗酵器の水性培地に空気
を注入して供給される）に加えて、各種の栄養塩類が微
生物が繁殖でかきために必要である。したがつて、一般
に同化できる形態の次の元素源（普通は水溶性塩）が必
要である：窒素、リン、イオウ、カリ、ナトリウム、マ
グネシウム、カルシウムおよび鉄とともに微量元素、例
えばマンガン、亜鉛および銅。酸素の醗酵器への供給を
制限してポリエステル蓄積を誘発することも可能である
が、１種またはそれ以上の栄養塩の量を制限するのが好
ましい。制限するのに最も実用的な元素は、窒素、リン
であり、好ましくないのはマグネシウム、イオウまたは
カリである。これらの中でも、窒素（これはアンモニウ
ム塩で供給するのが便利である）の量を制限するのが最
も好ましい。必要とする同化性窒素の量は、ポリエステ
ル蓄積の少ない細胞の所望重量の約８〜１５％である。

醗酵は、水性培地１当りポリエステル含有細胞の乾燥
重量が少なくとも５ｇになるように行うのが好ましい。
したがつて、もし例えばＰＨＢ含有量４０wt%のＰＨＢ
含有細胞を１０ｇ／で作ろうとすれば、細胞繁殖量制
限に用いるのに醗酵器に供給する必須栄養の量は、ＰＨ
Ｂを含まない細胞６ｇ／の繁殖を支持するのに要する
量である；したがつて、もし窒素を繁殖制限栄養として
用いれば、ＰＨＢを含まない細胞の窒素含有量は約８〜
１５wt%であるから、必須な同化性窒素の量は約０．５
〜０．９ｇ／であり、例えばアンモニアイオン０．６
〜１．２ｇ／である。

醗酵は、例えばｐＨ、温度および曝気の程度（酸素を制
限栄養源としないとき）を微生物に対し常用する条件下
で行う。同様に、用いる栄養塩類（その使用量は上記の
条件を考慮して決定した、繁殖制限栄養源以外）は、微
生物の繁殖に通常用いる量である。

微生物は、容易に代謝できる基質、例えば炭水化物に対
し、重合体蓄積段階で制限すべき繁殖用に必要な充分の
栄養源の存在下に、培養により所望の重量まで繁殖させ
るのが好ましい。場合により、繁殖段階の少なくとも一
部、また場合によつては全部に対する基質は、重合体蓄
積段階で繰返し単位IIになる酸である。

醗酵は、繁殖には必要であるが重合体蓄積には必要でな
い栄養源の量が消耗したときに、重合体蓄積が起こるバ
ツチ式醗酵で行われる。別法として、醗酵は、新鮮な水
性培地および基質の添加速度に対応する速度で、醗酵容
器からバクテリア細胞を含む水性培地を連続的または間
欠的に除去する連続式醗酵で行う。醗酵容器に供給する
制限した栄養源の量は、容器から除去した水性培地がこ
の栄養源を殆んど含まぬような量で、容器から除去した
水性培地を、次いでバツチ式または好ましくは連続式で
操業する第２醗酵容器に供給し、共重合体生産性酸を含
む新鮮な基質の添加で、通気培養を継続して重合体蓄積
を起こさせる。この追加醗酵工程で、追加量の基質およ
び栄養塩類を添加するが、追加繁殖は一般に好ましくな
いので、制限繁殖に用いる栄養源は加えるべきではな
い。しかし、第１醗酵器から別の１個またはそれ以上の
醗酵器に供給した水性培地に、制限栄養源が若干の残留
量を含むことおよび／またはその少量を添加すること
が、効果的な操業に好ましい。

上記のバツチ式または連続式の何れの場合も、共重合体
繰返し単位IIを与えるのに用いる酸は、繁殖に必要な栄
養が消耗したときに起きる、重合体蓄積段階中の基質の
一部または全部として用いる。この酸は、反復単位Ｉを
与える基質、例えば炭水化物との混合物で用いるか、ま
たは唯一の基質が用いられる；後者の場合、十分な酸
が、アセチルCoAへの別の経路で代謝されて繰返し単位
Ｉを与え、もし別の経路が反応（2a）を含めば、繰返し
単位IIを得るのに必要な任意のアセチルCoAが用いられ
る。しかし、酸が唯一の基質であれば、重合体収量は往
々にして低下する。

繰返し単位IIを与える酸は、重合体蓄積段階の一部のみ
に存在させることもできる；酸が存在する重合体蓄積段
階の部分の前および／または後に起きる、重合体蓄積段
階の残りでは、繰返し単位Ｉのみを与える基質が、唯一
の基質である。

場合によつては、この経路に必要な酸素をブロツクする
ことおよび／または必要な酵素合成の能力のない微生物
を用いることにより、酸のアセチルCoAへの通常の代謝
を阻止することも可能である。しかし、実質的収量の重
合体を得るために、繁殖に要する栄養を制限し、好まし
くは消耗した条件下での一定期間の培養が、一般に好ま
しい。

醗酵は、蓄積したポリエステルの量が、バクテリア細胞
の約５０〜８０wt%になるように行うのが好ましい。

共重合体を得るのに用いられる酸は、培養が繁殖制限状
態であるとき、繰返し単位Ｉのみにならないものであ
る。したがつて、不適当な酸には酢酸およびβ−ヒドロ
キシ酪酸、ＴＣＡサイクルのメンバー、および培養が繁
殖制限状態になるときアセチルCoAのみを与える酸およ
び／またはTCAサイクルのメンバーである。したがつ
て、不適当な酸には、ホスホグリセリン酸、ピルピン
酸、クエン酸、イソクエン酸、α−ケトグルタン酸、コ
ハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、オキサル酢
酸、オキサロコハク酸、アコニツト酸およびメチルマロ
ン酸がある。アミノ酸も、同様に不適当である。β−酸
化によつてβ−ヒドロキシ酪酸になる酪酸も、同じく不
適当である。酵素チオキナーゼは補酵素Ａをギ酸エステ
ルに附加しないので、ギ酸は共重合体を与えない。

適当な酸は、プロピオン酸、イソ酪酸、これらおよび酪
酸のハロまたはヒドロキシ置換誘導体、例えば３−クロ
ロプロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、α−ヒ
ドロキシ酪酸（β−ヒドロキシ酪酸は不適当）、ピバリ
ン酸、ハロ酢酸、フエニル酢酸および安息香酸、および
これらの不飽和酸またはハロ置換誘導体、例えばアクリ
ル酸、メタクリル酸（２−メチルアクリル酸）、３，３
−ジメチルアクリル酸、２，３−ジメチルアクリル酸、
３−クロロプロピオン酸および２−クロロプロピオン酸
である。

基質は水溶性でなければならず、酸は水溶性であればそ
のまま、または水溶性塩例えばアルカリ金属塩で添加す
る。上記の通り、場合によつては、微生物はさらに酸と
の反応を行うこともある、したがつて、イソ酪酸ｎ＝
１、Ｒ^２＝Ｒ^３＝Ｒ^４＝Ｈ、Ｒ＝イソプロピル基の繰返
し単位IIを与える。ｎ＝１、Ｒ^２＝Ｒ^３＝Ｒ^４＝Ｈ、Ｒ
^１＝エチル基の繰返し単位IIがあり、微生物が共重合体
への代謝経路中で、メチル基を水素で置換することを示
している。

種々の酸に対する、繰返し単位IIのｎ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ
^３およびＲ^４は次の通りである。

使用できる微生物は、共重合体を製造しようとする酸ま
たはその塩を同化できる任意のポリβ−ヒドロキシ酪酸
蓄積性微生物である。バクテリアAlcaligenes eutrophu
s（従来はHydrogeno-monas eutrophaとして知られてい
た）種、例えばこの種の学術的研究に広く用いられたＨ
１６株、（ATCCNo.１７６９９、Ｊ General Microbi-o
logy（１９７９）１１５、ｐ．１８５〜１９２参照）お
よびＨ１６株の変異株、例えば１１／7B、S301／C5、S5
01／C41（それぞれthe Natinal Collectino of Industr
ial Bacteria、Torry、Research Station、Aberdeen,Scotl
andに、１９８０年８月１８日に寄託した、ＮＣＩＢNo.
１１６００、１１５９９、１１５９７および１１５９
８）が特に適している。ＡＴＣＣ番号は、the American
Type Culture Collqction,１２３０１ Park Lawn Dri
ve,Rockville,Maryland ２０８５２U.S.A.で与えられ
た番号である。上記の通り、繁殖段階中、炭水化物を基
質として用いるのが好ましい。Alcaligenes eutrophus
Ｈ１６株（ＡＴＣＣNo.１７６９９）は、グルコース
を資化しないが、その変異株例えば上記の１１／7B、S3
01／C5、S501／C29およびS501／Ｃ４１は、グルコース
を資化できる。炭水化物、特にグルコースは、コストの
面および微生物が効果的に繁殖できるので、繁殖段階で
の好ましい基質である。

ポリエステルは、微生物細胞内部の顆粒として製造され
る。ポリエステルを含有する細胞は、例えばＵＳＰ３１
０７１７２に示すように、そのままで成形材料として用
いられるが、一般にポリエステルを、バクテリア細胞か
ら分離するのが好ましい。これは、細胞を細胞崩壊、次
いで適当な溶剤でポリエステルを抽出することで達成さ
れる。適当な抽出処理の例は、ヨーロツパ特許出願第１
５１２３号に記載されている。

上記の通り、重合体が実用できるためには、ゲル透過ク
ロマトグラフイーで測定した重量平均分子量（Mw）１
０，０００以上でなければならない。

好ましくは、Mwは５０，０００以上、より好ましくは１
００，０００以上、特に２００，０００以上である。

共重合体は、常にＤ−立体配置を有し、β−ヒドロキシ
酪酸ホモ重合体よりも低い融点を示す。

共重合体は、溶融成形品の製造に特に有用であり、この
場合β−ヒドロキシ酪酸ホモ重合体に匹敵する還元結晶
化度が好ましい。

特に興味深いのは、少量の共重合体の塩化ビニル系重合
体の高分子量加工助剤としての用途である。この応用で
は、共重合体の量は、塩化ビニル重合体に対し０．５〜
１０wt％である。最良の結果を得るには、共重合体はラ
ンダムでなければならない。ランダム共重合体を得るに
は、共単量体単位IIを得るのに用いる酸は、少なくとも
繁殖要件制限条件下での微生物の培養期間を通じて唯一
の基質として存在するのが好ましい。

共重合体は、溶融押出し後、好ましくは重合体のガラス
転移点（Tg）と融点との間の温度で、一対またはそれ以
上のロールを通過させて、フイルムの厚さを減少しかつ
若干の分子配向を導入するフイルムの製造にも用いられ
る。

この発明を、以下の実施例で説明する。

実施例 1. プロピオネートの通常の代謝では、プロピオネートはサ
クシネートに変換し、これはＴＣＡサイクルのオキサロ
酢酸への酸化、次いで脱カルボキシル化によりアセチル
CoAになる。オキサロ酢酸の脱カルボキシル化では、両
方の末端酸基は炭酸ガスとして除去される。したがつ
て、もしカルボキシ基に放射性ラベルした炭素原子を有
するプロピオネート、即ち１−¹⁴Ｃ−プロピオネート
を、アセチルCoAへの細胞変換に供給すれば、¹⁴ＣＯ_２
として放射能は失われる。重合体への何らかの¹⁴Ｃの組
込みは、プロピオニルCoAのβ−ヒドロキシバレリルCoA
への変換、引き続く重合からもたらされる。

Alcaligenes eutrophus変異株NCIB１１５９９を、３．
５ｇ／の蓄積ポリエステルを支持するに充分な同化性
窒素および基質としてのグルコースを含む水性培地Ａを
用いるバツチ式醗酵器で、通気培養により繁殖させた。
水性培地Ａは、脱イオン水１当り次の組成を有してい
た。

(NH₄)₂SO₄ ２ｇ MgSO₄・7H₂O ０．８ｇ K₂SO₄ ０．４５ｇ H₃PO₄（１．１Ｍ）１２ml FeSO₄・7H₂O １５mg 微量元素溶液２４ml 微量元素溶液は、脱イオン水１当り次の組成を有して
いた。

CuSO₄・5H₂O ０．０２ｇ ZnSO₄・6H₂O ０．１ｇ MnSO₄・4H₂O ０．１ｇ CaCl₂・2H₂O ２．６ｇ生体濃度が４．５ｇ／に達したとき、即ち系の同化性
窒素が枯渇した後、１−¹⁴Ｃ−プロピオネートを含むプ
ロピオン酸ソーダ１ｇ／をグルコースとともに醗酵器
に加え、醗酵を５分間継続した。次いで、細胞を過に
より回収し、重合体をクロロホルムで抽出した。ラベル
した炭素は、殆んど完全にクロロホルム溶液にあり、ラ
ベルした末端炭素原子が炭酸ガスとして損失しなかつた
ことを示した。したがつて、少なくとも幾らかのプロピ
オネートは、代謝されてアセチルＣｏＡになることなく
重合体に組み込まれた。

実施例 2.（比較例） Alcaligenes eutrophus 変異株ＮＣＩＢ１１５９９を、
脱イオン１当り次の組成を有する水性培地Ｂ４００ml
を含む５バツチ式醗酵器で、ｐＨ６．８、３４℃で通
気培養により繁殖させた。

(NH₄)₂SO₄ ４ｇ MgSO₄・7H₂O ０．８ｇ K₂SO₄ ０．４５ｇ H₃PO₄(1.1M) １２ml FeSO₄・7H₂O １５mg 実施例１で用いた２４ml 微量元素溶液グルコースを、８ｇ／hrの割合で醗酵器に供給した。培
地Ｂの同化性窒素の量は、ＰＨＢを含まない２６ｇの細
胞の生存を維持するに充分であつた。

４０時間後、細胞を遠心分離で回収した。細胞を凍結乾
燥し、重合体をクロロホルムで抽出した。

実施例 3. 実施例２を繰返したが、細胞重量３４ｇに達したとき、
グルコースの代りにプロピオン酸を２．８ｇ／hrの割合
で醗酵器に供給した。

実施例 4. 実施例３を繰返したが、プロピオン酸の供給は細胞重量
３９ｇに達したときに開始した。

実施例 5. 実施例３を繰返したが、プロピオン酸の供給は、細胞重
量５６ｇに達したときに始めた。

実施例 6. 実施例３を繰返したが、細胞重量４８ｇに達したとき、
プロピオン酸１２ｇを一度に添加した。

実施例 7. 実施例２を繰返したが、培地Ａを用い、グルコースの代
りにプロピオン酸を４ｇ／hrの割合で、醗酵中を全体を
通じて供給した。

実施例 8. 実施例２を繰返したが、細胞重量が３８ｇになつたと
き、グルコースの代りに、グルコース５．２ｇ／hr、プ
ロピオン酸２．８ｇ／hrの割合で、グルコースおよびプ
ロピオン酸の混合物を醗酵器に供給した。

実施例９実施例８を繰返したが、細胞重量２８ｇに達したとき、
グルコース６．８ｇ／hrおよびプロピオン酸１．２ｇ／
hrの割合で、混合物の供給を開始した。

実施例２〜９では、プロピオン酸は４００ｇ／を含む
溶液として添加した。

実施例 10. 実施例２を繰返したが、細胞重量が２８ｇに達したと
き、グルコースの代りにイソ酪酸を醗酵品に２ｇ／hrの
割合で供給した。イソ酪酸は、150ｇ／を含む溶液で
添加した。

実施例３〜６および８〜１０では、醗酵器に供給した酸
の重量対細胞重量が２６ｇに達した後（即ち系の窒素が
枯渇したとき）に醗酵器に供給したグルコースの重量お
よび醗酵器に供給した酸の重量の合計の比が、第１表に
示す値に達するまで、醗酵を継続した。

実施例 11. 実施例２を繰返したが、細胞重量が２６．４ｇに達した
とき、グルコースの代りに３クロロプロピオン酸を４ｇ
／hrの割合で５時間醗酵器に供給した。

実施例 12 実施例１１を繰返したが、３−クロロプロピオン酸の供
給は、細胞重量３４．４ｇに達したときに開始した。

実施例 13. 実施例１２を繰返したが、細胞重量３０ｇに達したと
き、３−クロロプロピオン酸４ｇを一度に添加し、次い
でグルコースを６．８ｇ／hrの割合で７時間供給した。

実施例１１〜１３では、３−クロロプロピオン酸は、５
０ｇ／を含む溶液で添加した。

実施例 14. 実施例２を繰返したが、細胞重量３１ｇになつたとき、
グルコースの代りにアクリル酸を４ｇ／hrの割合で５時
間醗酵器に供給した。アクリル酸は、１００ｇ／を含
む溶液で添加した。

実施例２〜１４の重合体の共単量体単位の量は、(a)加
水分解およびガスクロマトグラフイおよび(b)¹³Ｃ核磁
気共鳴スペクトロスコープにより決定した。

重合体の分子量は、ゲル透過クロマトグラフイで決定し
た。

塩素分析も、実施例２、１１、１２および１３の重合体
について行つた。

結果を第２表に示した。

３−クロロプロピオン酸からの塩素は、殆んど重合体に
見出されなかつた。したがつて、３−クロロプロピオン
酸の代謝中にHClが失われて、得られる炭素−炭素二重
結合は、水素化および水和されて、予期された２−クロ
ロエチル基の代りに、Ｒ^１としてエチルおよび２−ヒド
ロキシエチル置換基になつた。しかし、実施例１１〜１
３の重合体の塩素含有量は、若干の塩素が２−クロロエ
チル基として存在することを示している。

高分解能¹³Ｃ NMRを用いて、実施例３〜１０の共重合
体の単量体序列を調べた。カルボニル基の炭素原子から
得られるジグナルは、その環境に応じて、異なる化学シ
フトで起きることが判明した。したがつて、単位Ｉおよ
びII（ｎ＝１、Ｒ^１＝Ｃ_２Ｈ_５、Ｒ^２＝Ｒ^３＝Ｈ）を含
む重合体では、可能な序列は次の通りである。

A. ブチレート−ブチレート B. ペンタノエート−ペンタノエート C. ブチレート−ペンタノエート実施例２〜１０の重合体のＮＭＲ検査は、それぞれ１６
９．０７、１６９．２５および１６９．４４ppmで起き
る３個の共鳴を示した。Ｍ．Iida外〔Mcromoles１１
（１９７８）ｐ４９０〕によれば、１６９．０７ppmで
の共鳴は、ブチレート−ブチレートの序列Ａであり、１
６９．４４ppmはペンタノエート−ペンタノエートの序
列Ｂである。推論によれば、１６９．２５ppmでのシグ
ナルは、ブチレート−ペンタノエートの序列Ｃから生じ
る。

実施例１０の重合体のＮＭＲの結果の定量的分析は、次
の結果を与えた。

序列Ａ（ブチレート−ブチレート）５５％序列Ｂ（ペンタノエート−ペンタノエート）１４％序列Ｃ（ブチレート−ペンタノエート）３１％これらの結果は、実施例１０の重合体が単位ＩおよびII
（ｎ＝１、Ｒ^１＝C₂H₅Ｒ^２＝Ｒ^３＝Ｒ^４＝Ｈ）の共重合
体を実質的量で含むことを、明らかに示している。しか
し、繰返し単位Ｉのホモ重合体の若干も存在する可能性
がある。

実施例２〜１４の重合体は、全部Ｄ（−）立体配置を有
していた。なお、このＤ（−）立体配置において、Ｄは
フィッシャーの投影式による立体配置の系列を意味し、
（−）は当該化合物が偏光面を左へ回転させることを意
味する。

抽出したままの共重合体の熱的挙動は、コンピューター
データー分析付のジュボン１０９０システムを用いて、
先ず示差走査測熱法（ＤＳＣ：differential scanning
calorimetry）で決定した。ＤＳＣを、１９０℃で圧縮
成形し、完全に結晶化した製品を得るために、プレス中
に冷却した後の試料でも実施した。それぞれの場合、見
本は空気中で２０℃／分で加熱し、スタート時の温度
（Ｔｓ）および溶融吸熱量のピーク時の温度（Ｔｐ）を
その面積とともに記録した。アニーリングした試料の加
熱を２００℃まで継続し、完全に溶融させるため１分間
等温にした後、試料を液体窒素中で急冷した。非晶領域
のガラス転移温度（Ｔｇ）を決定するために、ＤＳＣを
再び行つた。最後に、密度勾配浮遊法により、アニーリ
ングした共重合体の密度を測定した。なお、密度勾配浮
遊法とは、メスシリンダー中に密度の異なる二つ以上の
溶融を使用して連続的な密度勾配をもつ液を作り、この
密度勾配管を用いてポリマーの密度を測定する方法であ
る。

共重合体の広い融点範囲は、共重合体がむしろ不均質組
成物であることを示している。しかし、溶融加熱がより
シャープになりかつ面積が僅かに減少しているので、ア
ニーリングしたとき、エステル交換による顕著なランダ
ム化が起きている。このことは、重合体はホモ重合体の
物理的混合物でなく、真の共重合体の指標である。

多くのＤＳＣピークが、実施冷３、５、８および１０の
抽出したままの重合体で観察された。

溶融吸熱面積は、結晶化度の指標である。アニーリング
後の実施例３〜１４の重合体は、全部実施例２の対照ホ
モ重合体よりも、著るしく結晶化度は低かつた。

実施例 15. Alcaligenes eutrophus変異株NCIR１１５９９を、水性
培地Ｃ（これは培地Ｂと同じであるが、ＰＨＢを含まぬ
細胞８．５ｇ／を支持するのに充分な硫酸アンモニア
５．２ｇ／であつた）４０００mlを含む５バツチ式
醗酵器で、ｐＨ６．８、３４℃で通気培養により繁殖さ
せた。

基質は、５．５ｇ／／hrの割合で供給するグルコース
であつた。細胞濃度が７ｇ／に達したとき、グルコー
スに加えてプロピオン酸を１．５８ｇ／／hrの割合で
供給した。細胞乾燥重量が１５ｇ／に達したとき、細
胞を回収した。細胞懸濁液を憤霧乾燥し、脂質を乾燥細
胞のメタノール還流で抽出し、重合体をクロロホルム還
流で抽出した。クロロホルム溶液をメタノール／水混合
物に添加する沈澱法により、重合体を回収した。

共重合体は、反覆単位II（Ｒ＝C₂H₅Ｒ^２＝Ｒ^３＝Ｒ^４＝
Ｈ、ｎ＝１）２０モル％を含んでいた。共重合体は分子
量３５０，０００を有し、冷メチルエチルケトンに不溶
性であつた。共重合体２ｇを、メチルエチルケトン１０
０mlで１時間還流すると、全量溶解した。溶液を冷却す
ると、ゲル状マスを生じた。これに対し、β−ヒドロキ
シ酪酸のホモ重合体２ｇをメチルエチルケトン１００ml
と還流したとき、溶解したホモ重合体は０．１ｇ以下で
あつた。メチルエチルケトンの代りにエタノールで、溶
解度テストを反覆すると、１時間還流後、共重合体約
０．７ｇ、ホモ重合体０．０４ｇ以下が溶解した。

これに対し、Wallen外によりEnvironmental Science an
d Technology ８（１９７４）ｐ．５７６〜５７９に記
載の重合体は、熱エタノールに可溶性とされている。

実施例 16. 水性培地Ｄ、ＥおよびＦを脱イオン水１当り次の組成
で作つた。

培地Ｄ (NH₄)₂SO₄ １２ｇ MgSO₄・7H_2O １．２ｇ K₂SO₄ １．５ｇ CaCl₂ ０．１２ｇ F₆SO₄・7H₂O ０．１ｇ ZnSO₄・7H₂O ０．００６ｇ MnOS₄・4H₂O ０．００６ｇ CuSO₄・5H₂O ０．００１５ｇ H₂SO₄（濃厚）１ml 培地Ｅ H₃PO₄（１．１Ｍ）２．４ml グルコース４０ｇ培地Ｆ H₃PO₄（１１Ｍ）２．４ml プロピオン酸４０ｇ消毒した公称容量２５０バツチ式醗酵器に、培地Ｄお
よびＥのほぼ等容量混合物を、１３０のマークまで満
たした。醗酵器中の培地の少量の試料で、窒素含有量を
分析した。次いで、培養器にAlcaligenes eutrophus変
異株NCIB１１５９９を接種し、醗酵を３４℃で、苛性ソ
ーダ溶液の添加でｐＨ６．８に自動的にコントロールし
て好気的に行つた。

醗酵器に存在した同化性窒素の量は、ＰＨＢを含まぬ細
胞約１．２kgのみまでの微生物繁殖を行うのに充分であ
つた。細胞重量が約１．０５kgに達したとき、培地Ｅの
供給を、６．５／hrの割合で開始した。

細胞重量が約１７００ｇに達したとき、培地Ｅの供給を
停止し、培地Ｆの供給を６．５／hrの割合で開始し、
細胞約２．６kgが製造されるまで醗酵を継続した。

次いで、細胞懸濁を、遠心分離により濃度約６０ｇ／
まで濃縮し、懸濁液１容量を１，２−ジクロロエタン
（ＤＣＥ）２容量とシルバーソンミキサーで２０℃で１
５分間接触させて重合体を抽出した。ＤＣＥ相を、細胞
の残骸を含む水性相から分離し、過した。過したＤ
ＣＥ相１容量を、メタノール／水（４／１、容量）混合
物４容量に加えて、重合体を沈澱させた。沈澱重合を
別し、メタノールで洗浄してから、オーブンで１００℃
で４時間乾燥した。

重合体は、ＤＳＣで決定して溶融吸熱での168℃のピー
クを有し約１００〜１８０℃の溶融範囲を有していた。

実施例 17. 実施例１６の醗酵処理を反覆したが、培地Ｅの供給から
培地Ｆの供給への切換えは、細胞重量が約３．５kgに達
したときに行つた。培地Ｆは、１１．４／hrの割合で
４時間供給してから３．２／hrに低下させこのレベル
をさらに９時間維持し、この段階で細胞重量は約３．９
kgであつた。

この実施例では、醗酵器に存在した同化性窒素の量は、
重合体を含まぬ細胞約１．５kgのみに微生物を繁殖させ
るに充分であつた。

細胞懸濁物を遠心分離で濃縮し、次いで実施例１５の方
法で、重合体を濃縮細胞懸濁液から抽出した。

実施例 18. 実施例１６のようにして、２５０醗酵器に装入、接種
を行つた。同化性窒素の量は、重合体を含まぬ細胞約
１．９kgのみに、微生物を繁殖させるに充分であつた。
実施例１６のようにして、醗酵を３４℃、ｐＨ６．８で
好気的に行つた。

細胞重量が約１．０kgに達したとき、培地Ｅおよび培地
Ｇをそれぞれ８．７／hrおよび４．６／hrの割合で
供給を開始し、細胞重量が３．９kgになるまで継続し
た。

培地Ｇは、脱イオン水１当り次の組成を有していた： H₃PO₄(1.1M) １．２ml プロピオン酸２０ｇ細胞懸濁液を遠心分離で濃縮し、実施例１５の方法で、
重合体を濃縮細胞懸濁液から抽出した。

実施例 19. 実施例１７の処理を大規模で反覆し、公称容積１０００
の醗酵器を用い、ほぼ等容量の培地ＤおよびＥで５０
０マークまで満たした。この実施例では、培地Ｅの供
給は細胞重量約４kgになつたときに２５／hrの割合で
開始し、培地Ｆの供給は細胞重量約８kgになつたとき３
７．５／hrの割合で開始した。培地ＥおよびＦの供給
は、細胞重量が約１０kgに達するまで継続した。存在す
る同化性窒素の量は、重合体を含まぬ細胞約４．１kgま
で微生物を繁殖させるに充分であつた。

実施例 20. 実施例１９を反覆したが、培地Ｆの供給割合は２５／
hrで、醗酵は細胞重量約１１kgになるまで継続した。こ
の場合、同化性窒素の量は、重合体を含まぬ細胞約４kg
まで微生物が繁殖するに充分であつた。

実施例１６〜２０の重合体は、それぞれβ−ヒドロキシ
酪酸（ＨＢ）単位およびβ−ヒドロキシバレリン酸（Ｈ
Ｖ）単位を含む共重合体であり、重量平均分子量は３０
０，０００以上であつた。共重合体は、それぞれＤ
（−）立体配置を有していた。

実施例１６〜２０の各共重合体およびβ−ヒドロキシ酪
酸ホモ重合体１００重量部を、クロロホルム約１０重量
部およびタルク１重量部でスラリー化し、家庭用肉ひき
機で室温で粒状化した。次いで、組成物を乾燥してクロ
ロホルムを除去し、１９０℃で押出してから、再び粒状
化した。得られる粒状物を、１８５℃で試験用バーに射
出成形し、型温度６５℃および冷却時間２０秒を用い
た。引張特性を、ASTM Ｄ６３８−７７ａにより５０／
mm／分の速度で測定し、衝撃強度をASTM Ｄ２５６−
７８によりアイゾツト衝撃試験で評価した。

結果を、第４表に示した。表中、「ＧＣ」はガスクロマ
トグラフィーの略である。

実施例 21. 下記成分を室温で乾式混合し、ＰＶＣ配合物を作つた：重量部 (i) 塩化ビニルホモ重合体（Ｋ62）１００ (ii) ジ−Ｎ−ジチオグリコール酸エステルベースのチオオクチルスズ錯体の安定化剤１．５ (iii) メチルメタクリレート／ブタジエン／スチレンＰＶＣ衝撃改善剤８ (iv) ワックス（外部油滑剤）０．８ (v) グリセリンモノエステル（内部油滑剤）１ (vi) ＨＢ重合体（加工助剤）２ＨＢ重合体加工助剤は、次のものであつた： (a) 実施例２で得たβ−ヒドロキシ酪酸ホモ重合体 (b) 実施例７の共重合体（共重合体Ａ） (c) 実施例１６の共重合体（共重合体Ｂ）加工助剤は、約１０wt%でスラリー化し、家庭用肉ひき
機で室温で粒状化し、乾燥し、１９０℃で溶融押出し、
再度粒状化し、ＰＶＣ乾燥混合物に配合する前に、粒子
寸法１５０μｍ以下に粉砕した。

乾燥混合物を、次のようにして試験した： 1. 混合物５０ｇを、５kgの重錘で負荷した圧力ラムの
下で１８rpmで回転し、１８０℃に維持したBrabender P
lastographの混合ヘツドに投入した。ゲル化が起きるに
要した時間を、記録した。

2. 混合物を冷圧縮してキヤンドルにし、これを１７０
℃に維持し、直径１mmおよびランド長２０mmの円形オリ
フイスを有するダイを取付けた押出しレオメーターに装
入した。装入物が１７０℃に加熱された後、速度を増加
させながら押出した。押出し物の外観を記録し、押出し
物をダイから引張つて溶融伸長性を評価した。

結果を、第５表に示した。

この実施例は、塩化ビニル重合体加工助剤として、共重
合体は、β−ヒドロキシ酪酸ホモ重合体より優れている
ことを示している。よりランダムな共重合体Ａは、明ら
かに共重合体Ｂより秀れている。

実施例 22. 培地Ｈを、次の組成で作つた： (NH₄)₂SO₄ １ｇ KH₂PO₄ ２ｇ (Na)₂HPO₄ ３ｇ MgSO₄・7H₂O ０．２ｇ CaCl₂ ０．０１ｇ FeSO₄・7H₂O ０．００５ｇ MnSO₄・4H₂O ０．００２ｇ Na₂CO₃・10H₂O ０．１ｇ (NH₂)₂CO １．５ｇ脱イオン水全体で１にする培地のｐＨは、７であつた。

予じめメタクリル酸０．５ｇを溶解した培地Ｈ５００ml
をそれぞれ含む８個の１振とうフラスコに、Nocardia
salmonicolor株ATCC１９１４９の種培養物５mlを接種
し、旋回振とう機上で３２℃で培養した。

接種後２４時間、４８時間および７２時間の間隔で、各
フラスコにメタクリル酸０．５ｇづつを添加し、メタク
リル酸０．２５ｇの最終添加を９６時間後に行つた。接
種後１０８時間で、各フラスコを検査した。どのフラス
コでも、微生物の繁殖は殆んどなかつた。フラスコ内容
物を一緒にし、遠心分離して細胞のペレツトにして、オ
ーブンで乾燥してから計量した。ペレツト重量は、２．
８１ｇであつた。接種物の細胞含有量も決定し、６９．
７５ｇ／であつた。したがつて、接種物としてフラス
コに添加した細胞の全重量は、２．７９ｇであつた。

用いたメタクリル酸濃度では、この菌株は、メタクリル
酸を同化しなかつた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スチ−ブン・ヒユ−・コリンズイギリス国クリ−ブランド・ストツクトン −オン−テイ−ズ・ノ−トン・ザ・グリ− ン・ノ−トン・ホ−ル（番地なし) (72)発明者レオナ−ド・フレデリツク・ライトイギリス国クリ−ブランド・ストツクトン −オン−テイ−ズ・ノ−トン・ザ・グリ− ン・ノ−トン・ホ−ル（番地なし) (56)参考文献西独特許2948023（ＤＥ，Ａ) 村橋俊介他著「合成高分子Ｖ」（昭50、３、30、朝倉書店発行、Ｐ．207〜208、表４、13)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】５０〜９９モル％のβ−ヒドロキシブチレ
ート繰返し単位と１〜５０モル％のβ−ヒドロキシバレ
レート繰返し単位を含み、５０，０００以上の重量平均
分子量を有するβ−ヒドロキシブチレート共重合体。
【請求項２】Ｄ（−）立体配置を有する請求項１記載の
β−ヒドロキシブチレート共重合体。
【請求項３】２００，０００以上の重量平均分子量を有
する請求項１または請求項２項載のβ−ヒドロキシブチ
レート共重合体。
【請求項４】５０〜９９モル％のβ−ヒドロキシブチレ
ート繰返し単位と１〜５０モル％のβ−ヒドロキシバレ
レート繰返し単位を含み、１０，０００以上５０，００
０未満の重量平均分子量とＤ（−）立体配置を有するβ
−ヒドロキシブチレート共重合体。