JPH0438763B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、ポリβ−ヒドロキシ酪酸（以下
PHBと略記する）に関している。 PHBは、微生物細胞内部で粒子状のエネルギ
ー貯蔵物質として、種々の微生物、主としてバク
テリアにより蓄積される。 このような細胞から抽出したPHBは、次の繰
返し単位の熱可塑性ポリエステルであり、 −Ｏ・CH（CH₃）CH₂CO− 急速に比較的高いレベル例えば70％またはそれ以
上のオーダーまで結晶化する。この結晶化挙動
は、重合体を例えば成形用材料として使用すると
きには、しばしば欠点となる。 このPHBの結晶化は、重合体鎖に非類似単量
体の単位を組み入れることで変性できることが判
明した。 かくして微生物をある種の有機酸の存在下にお
いて特定の条件下で培養することにより小割合の
コモノマー単位を重合体鎖中へ導入することがで
きる。そのような酸の一例はプロピオン酸であ
る。 この発明は以下の理論に何ら拘束されるもので
はないが、そのような重合体をもたらす代謝経路
は下記の如くであると考えられる。下記におい
て、 CoASHは、末エステル化補酵素Ａである。し
たがつてCH₃COSCoAは補酵素Ａのアセチルチ
オエステルで、一般にアセチルCoAと称されて
いる。 NADPは、酸化状態のニコチン酸アミドアデ
ニンジヌクレオチドホスフエートである。
NADPH₂は、還元されたNADPである。 微生物によるPHBの生合成における第１工程
は、アセチルCoAの合成と考えられる。これは、
例えば補酵素Ａと酢酸エステルから、またはピル
ベート〔炭水化物のグリコリシス（解糖）生成物
であるか、またはオキサロアセテート（トリカル
ボン酸（TCA）サイクルまたはクレブスサイク
ルの一員である）の脱カルボキシル化で生成す
る〕の脱カルボキシル化により形成される。 したがつて、アセチルCoA源としての酢酸エ
ステルで、PHBは次の諸反応を含む代謝経路で
産生される： (1) CH₃・CO・O^-＋CoA・SHチオキナーゼ ―――――――→ CH₃・CO・Ｓ・CoA＋OH^- (2) 2CH₃・CO・Ｓ・CoAβ−ケトチオラーゼ ―――――――――――→ CH₃・CO・CH₂・CO・Ｓ・CoA＋CoA・SH (3) CH₃・CO・CH₂・CO・Ｓ・CoA＋NADPH₂リダク
ターゼ ――――――――→ CH₃・CHOH・CH₂・CO・
Ｓ・CoA＋NADP （３−ヒドロキシブチリルCoA） (4) CH₃・CHOH・CH₂・CO・Ｓ・CoAポリメラーゼ ―――――――→ −Ｏ・CH（CH₃）・CH₂・CO−＋CoASH （重合体中の繰返し単位） 従つて反応(4)は、生長中の重合体鎖に一つの−
Ｏ・CH（CH₃）・CH₂・CO−単位を付加する。 関与する酵素類がプロピオン酸に関して特異性
を欠くので、対応する経路は下記の如くであると
考えられる。 （1a） CH₃・CH₂・COO^-＋CoA・SH―――→ CH₃・CH₂・CO・Ｓ・CoA＋OH^- （2a） CH₃・CH₂・CO・Ｓ・CoA＋CH₃・
CO・Ｓ・CoA―→ CH₃・CH₂・CO・CH₂・CO・Ｓ・CoA＋
CoA・SH （3a） CH₃・CH₂・CO・CH₂・CO・Ｓ・CoA
＋NADPH₂―→ CH₃・CH₂・CHOH・CH₂・CO・Ｓ・CoA
＋NADP （4a） CH₃・CH₂・CHOH・CH₂・CO・Ｓ・
CoA――→ −Ｏ・CH（C₂H₅）・CH₂・CO^-＋CoA・SH すなわち、PHBがペンダント状メチル基を有
するのと対照的にペンダント状エチル基を有する
繰返し単位が重合体鎖中へ導入される。 ３−ヒドロキシ酪酸単位、即ち次の単位 −OCH（CH₃）CH₂CO− および他の単位をその他の単位と共に含むある種
の重合体は、既に文献に記載されている。 エチレン性不飽和を示すといわれる赤外バンド
を示す重合体が、Davisにより「Applied
Microbiology」12（1964）p.301〜304に発表さ
れている。Davisによつて、３−ヒドロキシ酪酸
単位および次の３−ヒドロキシ−２−ブテノン酸
単位 −OC（CH₃）＝CHCO− を含む共重合体であるとされているこれら重合体
は、Nocordiaをｎ−ブタンで培養して産生され
た。 Wallen外は「Environmentel Science and
Technology６（1972）p.161〜164および８
（1974）p.576〜579に、活性汚泥から単離し反覆
洗浄後融点97〜100℃で、β−ヒドロキシ酪酸単
位および次の３−ヒドロキシバレリアン酸単位 −OCH（C₂H₅）CH₂CO− を１：５の比で含む重合体を発表している。 Marchessault外は、「IUPAC Macro
Florence1980 Internatinal Symposium on
Macromoles Preprints」２（1980）p.272〜275
に、この重合体の研究を報告し、主として３−ヒ
ドロキシバレリアン酸単位を含むことを確認して
いる。 USP3275610には、ある種の微生物、特に
Nocardia salmonicolorを炭素原子４個を含むカ
ルボン酸で培養することによるポリエステルの微
生物学的産生法が示されている。その実施例２お
よび３では、それぞれ３−ブテノン酸および２−
ヒドロキシ酪酸を用い、重合体は示された融点の
178〜184℃のオーダーからポリ−３−ヒドロキシ
酪酸エステルであると見られる。しかし、実施例
１では、２−メチルアクリル酸（すなわちメタク
リル酸）を用い、得られた重合体は同定してない
が、融点215〜220℃を有しかつメチルエチルケト
ンに可溶性と説明されている。これと対照的に、
この発明の主とし３−ヒドロキシ酪酸残基を含む
共重合体は、融点180℃以下で冷メチルエチルケ
トンに不溶性である。 PHB蓄積性微生物を、適当な基質、即ちエネ
ルギーおよび炭素源で好気培養すると、微生物は
増殖のための必須要素の一つまたはそれ以上が消
尽されるまで増殖する。以下においてこの微生物
の増殖を、“繁殖”と称する。繁殖必須要素の一
つが消尽されたとき、その後の繁殖は、もしあつ
たとしても極めて限られた程度であるが、基質が
消尽されない限り、PHBは微生物に蓄積される。 ある種の微生物では、PHB誘発抑制因子（例
えば１つまたはそれ以上の繁殖必須要素の制限）
が存在しなくても、微生物の繁殖中にPHBは蓄
積するであろう；しかし、構造的にPHBを産生
する微生物の場合を除き、このように蓄積した
PHBの量は一般に少量で、代表的には得られる
細胞の約10wt％以下である。したがつて、バツ
チ式培養で繁殖したとき、構造的にPHBを産生
しない微生物は、１つまたはそれ以上の繁殖必須
要素が消尽されるまでは、殆んどまたは全く
PHBを蓄積せず繁殖し、その後微生物はPHBを
合成する。 従つて共重合体を産生させるには、３−ヒドロ
キシ酪酸単位以外のコポリマー単位を与える酸ま
たはその誘導体を、重合体蓄積期間中に存在する
基質の少なくとも一部として使用することが必要
である。３−ヒドロキシ酪酸単位以外のコポリマ
ー単位を与える酸またはその誘導体を、この明細
書では「基質のコモノマー成分」（または単に
「コモノマー成分」）と称することがある。 培養条件が、ポリエステル（例えばPHB）が
顕著には蓄積されないような培養条件であると基
質のコモノマー成分は、しばしば微生物により別
の経過で代謝され、例えばアセチルCoAまたは
TCAサイクルの一員になり、共重合体は産生さ
れなくなる。したがつて、一例として、何らの繁
殖制限なしてはプロピオン酸は微生物により代謝
され、プロピオニルCoAを経て次いで炭酸ガス
を取り込みメチルマロニルCoA、次いでTCAサ
イクルの一員であるサクシネートになる。 そのような別の経過による「基質のコモノマー
成分」の代謝は、PHBを構造的に産生する微生
物を用いる場合にも起こる。従つて、構造的
PHB蓄積微生物を用いる場合でさえも、繁殖の
ためには必須であるがPHB蓄積のためには必須
ではない一またはそれ以上の要素の量が制限され
た条件下で微生物を培養することにより重合体を
蓄積させるのが好ましい。繁殖のための必須要素
を制限し、かくして重合体が微生物によつて蓄積
される条件下で、微生物を培養する場合でさえ
も、基質のコモノマー成分の幾分かは、アセチル
CoAまたはTCAサイクルのメンバーをもたらす
経路により代謝されることがある。このことによ
り、コモノマー成分が重合体蓄積段階中の唯一の
基質であるときにさえも、微生物は、共重合体へ
導入されるための３−ヒドロキシ酪酸単位ならび
にそれ以外のコポリマー単位を合成しうるのであ
る。またプロピオネートからの３−ヒドロキシバ
レレートの産生について上記に示唆した代謝経路
によつて示されるように、一つの工程、すなわち
反応（2a）では、プロピオニルCoAとアセチル
CoAとの反応が行われる。従つて、プロピオネ
ートが唯一の基質であるときには、プロピオネー
トの幾分かは代謝されてアセチルCoAとなり、
３−ヒドロキシバレリアン酸単位が産生されう
る。 上記に示した共重合体中に３−ヒドロキシバレ
リアン酸単位をもたらす諸代謝経路に加えて、基
質のコモノマー成分として種々の他の物質を用い
ることによりその他の反応が起こりうる。 例えば、その他のヒドロキシ置換カルボン酸
は、（もし例えばアセチルCoAまたはプロピオニ
ルCoAをもたらす他の経路によつて代謝されな
ければ）場合によつては、ポリメラーゼによつて
重合体中へ導入することも可能であり、例えば、 HO・CR¹R²・（CR³R⁴）_o・CO・CoA――→ −Ｏ・CR¹R²（CR³R⁴）_o・CO−＋CoASH 〔ここにｎはゼロまたは整数であり、R¹，R²，
R³およびR⁴は同一かまたは相異なつていてよく、
炭化水素基（例：アルキル、アラルキル、アリー
ルまたはアルカリール基）；ハロ−およびヒドロ
キシ−置換炭化水素；ヒドロキシ；ハロゲン原
子；および水素原子；から選択される〕。もちろ
ん、ｎ＝１およびR²＝R³＝R⁴＝水素である場合、
もしR¹がメチル基であるならば、ヒドロキシカ
ルボン酸は、代謝されて直接に３−ヒドロキシ酪
酸単位を与える３−ヒドロキシ酪酸である。 好ましくは、基R¹，R²，R³およびR⁴のそれぞ
れは、４より少ない炭素原子を含む。一般にR¹，
R²，R³およびR⁴のうちの少なくとも一つは水素
である。ｎはゼロ、１または２であるのが好まし
い。 そのようなヒドロキシカルボン酸は、そのまま
の状態で基質のコモノマー成分の一部または全部
として添加されても、あるいはその他のコモノマ
ー成分材料から微生物によつて合成されてもよ
い。 アクリル酸、３−クロルプロピオン酸および３
−ヒドロキシプロピオン酸のような酸は、３−ヒ
ドロキシ酪酸単位とその他の単位を含む重合体を
与えうることが判明した。若干の場合に、これら
の他の単位のすべては、３−ヒドロキシバレリア
ン酸単位であるが、別の場合には他の単位（すな
わち前記定義の単位Ａであつて、３−ヒドロキシ
バレリアン酸単位と関連して生じうるもの）は、
就中、下記(i)，(ii)を示すプロトンおよび¹³Cnmr
スペクトルによつて同定される。 (i) 4.3ppmにおけるプロトンnmrトリプレツト。 (ii) 59.89および33.83ppmにおける¹³Cnmrのピー
ク（テトラメチルシラン標準対照）。 これらのnmrデータから、これらの単位は３−
ヒドロキシプロピオン酸単位（ｎ＝１、R¹＝R²
＝R³＝R⁴＝Ｈ）であると確信される。 共重合体は４−ヒドロキシバレリアン酸単位
（ｎ＝２、R¹＝CH₃、R²＝R³＝R⁴＝Ｈ）を含むこ
ともある。 ３−ヒドロキシプロピオン酸単位および／また
は４−ヒドロキシバレリアン酸単位は、中間体の CH₃・OH・CH₂・CO・Ｓ・CoAおよび CH₃・CHOH・CH₂・CH₂・CO・Ｓ・CoAか
ら由来することもありうる。前者は３−ヒドロキ
シプロピオネートおよびCoA・SHから生成され
うる。それ自体で供給される以外に、３−ヒドロ
キシプロピオネートはアクリレートの水和反応 CH₂＝CH・COO^-＋H₂O――→CHOH・CH₂・
COO^- により、または３−クロルプロピオネートの加水
分解 CH₂Cl・CH₂・COO^-＋OH^-――→CHOH・
CH₂・COO^-＋Cl^- により生成されうる。４−ヒドロキシバレリル
CoAは、アセチルCoAとアクリルCoAの縮合、
それに続く還元、すなわち CH₃・CO・Ｓ・CoA＋CH₂＝CH・CO・Ｓ・
CoA――→ CH₃・CO・CH＝CH・CO・Ｓ・CoA＋
CoA・SH CH₃・CO・CH＝CH・CO・Ｓ・CoA＋
2NADPH₂――→ CH₃・CHOH・CH₂CH₂・CO・Ｓ・CoA＋
2NADP によつて生成されうる。 同様に４−ヒドロキシバレリルCoAは、３−
ヒドロキシ−または３−クロル−プロピオネート
から、アセチルCoAとの縮合および脱水（３−
クロルプロピオネートの場合には中間の加水分解
工程を行う）の反応により生成しうる。 従つて、この発明の方法により、３−ヒドロキ
シ酪酸単位 −Ｏ・CH（CH₃）・CH₂・CO− を下記式の単位 −Ｏ・CR¹R²・（CR³R⁴）_o・CO− と共に含む共重合体を得ることが可能である。 〔上記式においてｎはゼロまたは整数であり、
R¹，R²，R³およびR⁴のそれぞれは、炭化水素基
（例えばアルキル、アラルキル、アリールまたは
アルカリール基）；ハロ−およびヒドロキシ−置
換炭化水素基；ヒドロキシ基；ハロゲン原子；お
よび水素原子；から選択されるが、ｎが１、そし
てR²，R³およびR⁴がそれぞれ水素原子であるな
らばR¹はメチル基でないことを条件とする〕。好
ましくは、R¹，R²，R³およびR⁴のそれぞれは４
個より少ない炭素原子を含む。好ましくはｎはゼ
ロ、１または２である。 共重合体は単位の２以上のタイプを含むこと
がある。 好ましくは単位の少なくとも幾分かにおいて
ｎ＝１、R²＝R³＝R⁴＝ＨそしてR¹＝エチルであ
る。 プラスチツク材料として実用的であるために
は、重合体は10000以上の重量平均分子量M_w（例
えばゲル滲透クロマトグラフ法によつて測定）を
有すべきである。 共重合体中の繰返し単位の割合は、共重合体
の全繰返し単位の0.1ないし50モル％、特に１な
いし40モル％である。場合によつては、微生物に
より得られる重合体は、繰返し単位のホモ重合
体と繰返し単位およびを含む共重合体との混
合物である。この場合、重合体中の繰返し単位
の全体の割合は、全繰返し単位の0.1ないし50モ
ル％である。最も好ましくは、繰返し単位の割
合は、３ないし30モル％である。 顕著な割合のコモノマー単位を得るには、基
質のコモノマー成分中の化学結合炭素の量は、微
生物によつて重合体が蓄積されつつあるような培
養条件期間中に存在する基質中の全化学結合炭素
の少なくとも２重量％、好ましくは少なくとも10
重量％であるべきである。 そのような期間中は、コモノマー成分は基質中
に存在するカルボン酸（またはその誘導体）のみ
であるのが好ましいが、場合によつてはアセテー
トが存在することもある。 この発明によれば、ポリエステルを蓄積できる
微生物を、水性培地中において水溶性の資化性炭
素含有基質で培養し、その際に培養の少なくとも
一部期間はその微生物によつてポリエステルが蓄
積される条件下で培養を行うことにより、熱可塑
性ポリエステルを産生させる方法において、少な
くともポリエステルが蓄積する培養期間部分中
は、該資化性炭素含有基質は、該ポリエステル蓄
積条件下で微生物によつて代謝されて、−Ｏ・
CH（CH₃）・CH₂・CO−繰返し単位からもつぱら
構成されるもの以外のポリエステルとなる有機酸
もしくは有機酸誘導体を含むこと、かつ該酸もし
くは酸誘導体中の化学結合炭素の量は該ポリエス
テル蓄積期間中に存在する基質中の全化学結合炭
素の少なくとも２重量％をなすことを特徴とする
上記熱可塑性ポリエステルの微生物学的産生方法
が提供される。 水性培地中のコモノマー成分の濃度は0.05ｇ／
以上であるべきであり、好ましくは0.1〜５
ｇ／の濃度であろう。従つて、コモノマー成分
の水溶解度は0.05ｇ／以上であるべきで、また
培養温度において所望のコモノマー成分濃度を与
えるのに充分でなければならないことは明かであ
ろう。 コモノマー成分は、酸自体であつても、あるい
は、塩、エステル（ヒドロキシ置換酸の場合、ラ
クトン類を含む）、無水物、アミドまたはハライ
ドであつてよい。 前述のように、培養期間の少なくとも一部は、
微生物の増殖にとつて必須であるがポリエステル
の蓄積のためには必須でない要素を制限した条件
下で培養を行うのが好ましい。最も便宜な増殖要
素の制限は窒素の制限である。この理由のため、
窒素制限を採用する場合、基質は窒素を含まない
ことが好ましく、従つてアミド類は余り好ましい
基質ではない。 共重合体を生じうる酸は、培養が重合体蓄積段
階にあるときに繰返し単位のみを与えない酸で
あるべきである。従つてこの点から望ましくない
酸の例としては、酢酸、３−ヒドロキシ酪酸、
TCAサイクルのメンバー、ならびに培養が重合
体蓄積段階にあるときにアセチルCoAおよび／
またはTCAサイクルのメンバーのみを与える酸
類がある。かくして、不適当な酸としては、ホス
ホグリセリン酸、ピルビン酸、クエン酸、イソク
エン酸、α−ケトグルタル酸、サクシン酸、フマ
ル酸、マレイン酸、リンゴ酸、オキサル酢酸、オ
キサロサクシン酸、アコニチン酸、およびメチル
マロン酸がある。アミノ酸も同様に不適当であ
る。共重合体を与えないことが判明したその他の
酸としては、ギ酸、酪酸、フエニル酢酸、安息香
酸、クロル酢酸、２−クロルプロピオン酸、３−
ヒドロキシ酪酸、４−ヒドロキシ酪酸、２−クロ
ロ酪酸、２−メチルアクリル酸、２，３−ジメチ
ルアクリル酸、３，３−ジメチルアクリル酸、乳
酸、グリオキシル酸およびグリコール酸がある。 共重合体を与えることが判明した酸としては、
プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３
−クロロプロピオン酸、３−エトキシプロピオン
酸、２−ヒドロキシ酪酸、イソ酪酸、およびアク
リル酸がある。使用しうるその他の酸としては、
奇数の炭素原子を含む高級飽和カルボン酸、例え
ばバレリン酸、ヘプタン酸、ピパリン酸および置
換プロペン酸（例：２−および３−クロロプロペ
ン酸）がある。 前述の通り、場合によつては、微生物は酸に別
の作用を行うこともある。したがつて、イソ酪酸
はｎ＝１、R²＝R³＝R⁴＝Ｈ、Ｒ＝イソプロピル
基の繰返し単位を与える。ｎ＝１、R²＝R³＝
R⁴＝Ｈ、R¹＝エチル基の繰返し単位は、微生
物が共重合体への代謝経路中で、メチル基を水素
で置換することを示している。 共重合体を与えうる好ましい酸は、プロピオン
酸、イソラク酸およびアクリル酸である。そのよ
うな酸の適当な誘導体としては、アルカリ金属塩
および低級アルキルエステル（アルキル基が１〜
４個の炭素原子を含むもの）がある。特に適当な
エステルとしては、プロピオン酸のメチル、エチ
ル、イソプロピル、プロピル、ブチルおよびイソ
ブチルエステル類；イソ酪酸のメチルおよびエチ
ルエステル類；ならびにアクリル酸のメチルおよ
びエチルエステル類；がある。 共重合体形成性の酸（または酸誘導体）の混合
物は、基質のコモノマー成分として使用できる。
例えばプロピオン酸とアクリル酸との混合物を用
いて興味ある結果が得られている。 前述のように、PHBを構造的に産生する微生
物を用いる場合でさえも、ポリエステルが蓄積さ
れる微生物培養期間を、増殖には必須であるがポ
リエステル蓄積には必須でない栄養素の制限の条
件下に実施するのが好ましい。 基質および酸素（これは一般に培養槽の水性培
地に空気を注入して供給される）に加えて、各種
の栄養塩類が微生物が繁殖できるために必要であ
る。したがつて、一般に資化できる形態の次の元
素源（普通は水溶性塩）が必要である：窒素、リ
ン、イオウ、カリ、ナトリウム、マグネシウム、
カルシウムおよび鉄とともに微量元素、例えばマ
ンガン、亜鉛および銅。酸素の醗酵器への供給を
制限してポリエステル蓄積を誘導することも可能
であるが、１種またはそれ以上の栄養塩の量を制
限するのが好ましい。制限するのに最も実用的な
元素は、窒素、リンであり、余り好ましくないの
はマグネシウム、イオウまたはカリである。これ
らの中でも、窒素（これはアンモニウム塩で供給
するのが便利である）の量を制限するのが最も好
ましい。必要とされる資化性窒素の量は、ポリエ
ステル蓄積の少ない細胞の所望重量の約８〜15％
である。 醗酵は、水性培地１当りポリエステル含有細
胞の乾燥重量が少なくとも５ｇになるように行う
のが好ましい。したがつて、もし例えばPHB含
有量40wt％のPHB含有細胞を10ｇ／で作ろう
とすれば、細胞繁殖制限のために培養槽に供給さ
れる必須栄養の量は、PHBを含まない細胞６
ｇ／の繁殖を支持するのに要する量である；し
たがつて、もし窒素を繁殖制限栄養として用いれ
ば、PHBを含まない細胞の窒素含有量は約８〜
15wt％であるから、必要な資化性窒素の量は約
0.5〜0.9ｇ／であり、例えばアンモニアイオン
0.6〜1.2ｇ／である。 培養は、例えばPH、温度および曝気の程度（酸
素を制限栄養源としないとき）を当該微生物に対
し常用する条件下で行う。同様に、用いる栄養塩
類（その使用量は上記の条件を考慮して決定され
る繁殖制限栄養源以外のもの）は、当該微生物の
繁殖に通常用いる量である。 微生物は、容易に代謝できる基質、例えば炭水
化物で、重合体蓄積段階で制限すべき繁殖に必要
な栄養源の充分な量の存在下に、培養により所望
の重量まで繁殖させ、次いで重合体蓄積を生じさ
せる繁殖要素制限の条件下で培養するのが好まし
い。場合により、繁殖段階の少なくとも一部（ま
た場合によつては全部）についての基質は、重合
体蓄積段階で繰返し単位になる酸（またはその
誘導体）であつてよい。 培養は、繁殖には必要であるが重合体蓄積には
必要でない栄養源の量が不足ないし消尽したとき
に、重合体蓄積が起こるバツチ式培養で行うこと
ができる。別法として、培養は、新鮮な水性培地
および基質の添加速度に対応する速度で、培養槽
からバクテリア細胞を含む水性培地を連続的また
は間欠的に除去する連続式培養で行うことができ
る。培養槽に供給する制限栄養源の量は、槽から
除去した水性培地がこの栄養源を殆んど含まぬよ
うな量であり、そして槽から除去した水性培地
を、次いでバツチ式または好ましくは連続式で操
業する第２培養槽に供給し、コモノマー成分を含
む新鮮な基質の添加で、通気培養を継続して重合
体蓄積を起こさせるのが好ましい。この追加の培
養工程で、追加量の基質および栄養塩類を添加し
てよいが、追加繁殖は一般に好ましくないので、
繁殖を制限するのに用いる栄養源はさらに加える
べきではない。 しかし、第１培養槽から別の１個またはそれ以
上の培養槽に供給した水性培地に、制限栄養源が
若干の残留量含まれることおよび／またはその少
量を添加することが、効果的な操業に好ましいこ
とは了解されよう。 別法として、培養は一段連続式プロセスとして
実施することもできる。栄養制限によりポリエス
テル蓄積を達成するには、培養槽における培地の
滞留時間を、微生物が増殖して培養槽に供給され
た制限栄養を用い尽し、かつ次いで微生物がポリ
エステルを蓄積するのに充分であるように、長く
する。 上記のバツチ式または連続式の何れの場合も、
共重合体繰返し単位を与えるのに用いる酸（ま
たはその誘導体）は、繁殖に必要な栄養が消耗し
たときに起きる重合体蓄積段階中の基質の一部ま
たは全部として用いられる。この酸は、繰返し単
位を与える基質（例えば炭水物）との混合物で
用いるか、または唯一の基質であることもある；
後者の場合、十分なコモノマー成分が、アセチル
CoAへの別の経路で代謝されて繰返し単位を
与え、例えばもし別の経路が反応（2a）を含め
ば、繰返し単位を得るのに必要な任意のアセチ
ルCoAが用いられる。しかし、コモノマー成分
が唯一の基質であれば、重合体収量は往々にして
低下する。 コモノマー成分は、重合体蓄積段階の一部のみ
に存在させることもできる；コモノマー成分が存
在する重合体蓄積段階の部分の前および／または
後に起きる、重合体蓄積段階の残部では、繰返し
単位のみを与える基質が、唯一の基質であるこ
とがある。 場合によつては、通常の経路に必要な酵素をブ
ロツクすることおよび／または必要な酵素合成の
能力のない微生物を用いることにより、酸のアセ
チルCoAへの通常の代謝を阻止することも可能
である。しかし、実質的収量の重合体を得るため
に、繁殖に要する栄養を制限し、好ましくは消耗
した条件下での一定期間の培養が、一般に好まし
い。 培養は、蓄積ポリエステルの量が、バクテリア
細胞の約50〜80wt％になるように行うのが好ま
しい。 使用できる微生物は、共重合体を製造しようと
する酸またはその塩を同化できる任意のポリ（３
−ヒドロキシ酪酸エステル蓄積性微生物である。
バクテリアAlcaligenes entrophus（従来は
Hydrogenomonas eutrophaとして知られてい
た）種、例えばこの種の学術的研究に広く用いら
れたH16株、〔ATCC No.17699、Ｊ General
Microbiology（1979）115、p.185〜192参照〕お
よびH16株の変異株、例えば11／7B、S301／C5、
S501／C29およびS501／C41（それぞれthe
Natinal Collection of Industrial Bacteria、
Torry Research Station、Aberdeen、Scotland
に、1980年８月18日に寄託した、NCIB No.
11600、11599、11597および11598）が特に適して
いる。ATCC番号は、the American Type
Culture Collection，12301 Park Lawn Drive，
Rockville，Maryland 20852U.S.A.で与えられ
た番号である。上記の通り、繁殖段階中、炭水化
物を基質として用いるのが好ましい。
Alcaligenes eutrophus H16株（ATCC No.
17699）は、グルコースを資化しないが、その変
異株例えば上記の11／7B、S301／C5、S501／
C29およびS501／C41は、グルコースを資化でき
る。炭水化物、特にグルコースは、コストの面お
よび微生物が効果的に繁殖できるので、繁殖段階
での好ましい基質である。 ポリエステルは、微生物細胞内部の顆粒として
産生される。ポリエステルを含有する細胞は、例
えばUSP3107172に示すように、そのままで成形
材料として用いられるが、一般にポリエステル
を、バクテリア細胞から分離するのが好ましい。
これは、細胞を細胞破壊、次いで適当な溶剤でポ
リエステルを抽出することで達成される。適当な
抽出処理の例は、ヨーロツパ特許出願第15123号
に記載されている。 上記の通り、共重合体が実用できるためには、
共重合体はゲル滲透クロマトグラフ法で測定した
重量平均分子量（M_w）10000以上を有しなければ
ならない。好ましくは、M_wは50000以上、より好
ましくは100000以上、特に200000以上である。 共重合体は、常にＤ−立体配置を有し、３−ヒ
ドロキシ酪酸ホモ重合体よりも低い融点を示す。 共重合体は、溶融成形品の製造に特に有用であ
り、この場合３−ヒドロキシ酪酸ホモ重合体に匹
敵する還元結晶化度が好ましい。 特に興味深いのは、少量の共重合体の塩化ビニ
ル系重合体の高分子量加工助剤としての用途であ
る。この応用では、共重合体の量は、塩化ビニル
重合体に対し0.5〜10wt％である。この応用で最
良の結果を得るには、共重合体はランダムでなけ
ればならない。ランダム共重合体を得るには、コ
モノマー単位を得るのに用いる酸は、少なくと
も繁殖要素制限条件下での微生物の培養期間を通
じて唯一の基質として存在するのが好ましい。 共重合体は、溶融押出し後、好ましくは重合体
のガラス転移点（Tg）と融点との間の温度で、
一対またはそれ以上のロールを通過させて、フイ
ルムの厚さを減少しかつ若干の分子配向を導入す
るフイルムの製造にも用いられる。 この発明を、以下の実施例で説明する。 実施例 １ プロピオネートの通常の代謝では、プロピオネ
ートはサクシネートに変換し、これはTCAサイ
クルのオキサロ酢酸への酸化、次いで脱カルボキ
シル化によりアセチルCoAになる。オキサロ酢
酸の脱カルボキシル化では、両方の末端酸基は炭
酸ガスとして除去される。したがつて、もしカル
ボキシ基に放射性ラベルした炭素原子を有するプ
ロピオネート、即ち１−¹⁴C−プロピオネートを、
アセチルCoAへの細胞変換に供給すれば、¹⁴CO₂
として放射性は失われる。重合体への何らかの
¹⁴Cの組込みは、プロピオニルCoAの３−ヒドロ
キシバレリルCoAへの変換、引き続く重合から
もたらされる。 Alcaligenes eutrophus変異株NCIB11599を、
3.5ｇ／の蓄積ポリエステルを支持するに充分
な資化性窒素および基質としてのグルコースを含
む水性培地Ａを用いるバツチ式醗酵器で、好気培
養により繁殖させた。水性培地Ａは、脱イオン水
１当り次の組成を有していた。 （NH₄）₂SO₄ ２ｇ MgSO₄・7H₂O 0.8ｇ K₂SO₄ 0.45ｇ H₃PO₄（1.1M） 12ml FeSO₄・7H₂O 15mg 微量元素溶液 24ml 微量元素溶液は、脱イオン水１当り次の組成
を有していた。 CuSO₄・5H₂O 0.02ｇ ZnSO₄・6H₂O 0.1ｇ MnSO₄・4H₂O 0.1ｇ CaCl₂・2H₂O 2.6ｇ バイオマス濃度が4.5ｇ／に達したとき、即
ち系の資化性窒素が枯渇した後、１−¹⁴C−プロ
ピオネートを含むプロピオン酸ソーダ１ｇ／を
グルコースとともに醗酵器に加え、醗酵を５分間
継続した。次いで、細胞を過により回収し、重
合体をクロロホルムで抽出した。ラベルした炭素
は、殆んど完全にクロロホルム溶液にあり、ラベ
ルした末端炭素原子が炭酸ガスとして損失しなか
つたことを示した。したがつて、少なくとも幾ら
かのプロピオネートは、アセチルCoAとして以
外に重合体に組み込まれた。 実施例 ２（比較例） AlCaligenes eutrophus変異株NCIB11599を、
脱イオン水１当り次の組成を有する水性培地
B4000mlを含む５バツチ式醗酵器で、PH6.8、
34℃で好気培養により繁殖させた。 （NH₄）₂SO₄ ４ｇ MgSO₄・7H₂O 0.8ｇ K₂SO₄ 0.45ｇ H₃PO₄（1.1M） 12ml FeSO₄・7H₂O 15mg 実施例１で用いた 24ml 微量元素溶液 グルコースを、８ｇ／hrの割合で醗酵器に供給
した。培地Ｂの資化性窒素の量は、26ｇのPHB
を含まぬ細胞を支持するに充分であつた。 40時間後、細胞を遠心分離で回収した。細胞を
凍結乾燥し、重合体をクロロホルムで抽出した。 実施例 ３ 実施例２を繰返したが、細胞重量34ｇに達した
とき、グルコースの代りにプロピオン酸を2.8
ｇ／hrの割合で醗酵器に供給した。 実施例 ４ 実施例３を繰返したが、プロピオン酸の供給は
細胞重量39ｇに達したときに開始した。 実施例 ５ 実施例３を繰返したが、プロピオン酸の供給
は、細胞重量56ｇに達したときに始めた。 実施例 ６ 実施例３を繰返したが、細胞重量48ｇに達した
とき、プロピオン酸12ｇを一度に添加した。 実施例 ７ 実施例２を繰返したが、培地Ａを用い、グルコ
ースの代りにプロピオン酸を４ｇ／hrの割合で、
醗酵中を全体を通じて供給した。 実施例 ８ 実施例２を繰返したが、細胞重量が38ｇになつ
たとき、グルコースの代りに、グルコース5.2
ｇ／hr、プロピオン酸2.8ｇ／hrの割合で、グル
コースおよびプロピオン酸の混合物を醗酵器に供
給した。 実施例 ９ 実施例８を繰返したが、細胞重量28ｇに達した
とき、グルコース6.8ｇ／hrおよびプロピオン酸
1.2ｇ／hrの割合で、混合物の供給を開始した。 実施例２〜９では、プロピオン酸は400ｇ／
を含む溶液として添加した。 実施例 10 実施例２を繰返したが、細胞重量が28ｇに達し
たとき、グルコースの代りにイソ酪酸を醗酵器に
２ｇ／hrの割合で供給した。イソ酪酸は、150
ｇ／を含む溶液で添加した。 実施例３〜６および８〜10では、「醗酵器に供
給した酸の重量」対「細胞重量が26ｇに達した後
（即ち系の窒素が枯渇したとき）に醗酵器に供給
したグルコースの重量および醗酵器に供給した酸
の重量の合計」の比が、表１に示す値に達するま
で、醗酵を継続した。 実施例 11 実施例２を繰返したが、細胞重量が26.4ｇに達
したとき、グルコースの代りに３−クロロプロピ
オン酸を４ｇ／hrの割合で５時間醗酵器に供給し
た。 実施例 12 実施例11を繰返したが、３−クロロプロピオン
酸の供給は、細胞重量34.4ｇに達したときに開始
した。 実施例 13 実施例12を繰返したが、細胞重量30ｇに達した
とき、３−クロロプロピオン酸４ｇを一度に添加
し、次いでグルコースを6.8ｇ／hrの割合で７時
間供給した。 実施例11〜13では、３−クロロプロピオン酸
は、50ｇ／を含む溶液で添加した。 実施例 14 実施例２を繰返したが、細胞重量31ｇになつた
とき、グルコースの代りにアクリル酸を４ｇ／hr
の割合で５時間醗酵器に供給した。アクリル酸
は、100ｇ／を含む溶液の形で添加した。

【表】 ルコースの重量および醗酵器に供給した酸の重
量の合計で除した商である。
実施例２〜14の重合体中の各コモノマー単位の
量は、(a)加水分解およびガスクロマトグラフ法お
よび(b)¹³C核磁気共鳴スペクトル法により決定し
た。 重合体の分子量は、ゲル滲透過クロマトグラフ
法で決定した。 塩素分析も、実施例２，11，12および13の重合
体について行つた。 結果を表２に示した。 表２において、３−HVは３−ヒドロキシバレ
リアン酸単位を示し、ま現単位Ａは前述の単位
で、３−ヒドロキシプロピオン酸単位と考えられ
るものである。 ３−クロロプロピオン酸からの塩素は、殆んど
重合体に見出されなかつた。したがつて、３−ク
ロロプロピオン酸の代謝中に塩素が失なわれて、
その結果の生成物が代謝されて単位Ａおよび３−
ヒドロキシバレリアン酸単位を与えるようであ
る。実施例11〜13の重合体の塩素含量は、若干の
塩素が単位中に塩素含有基Ｒとして存在してい
ることを示し、おそらく、R¹＝クロロエチル、
R²＝R³＝R⁴＝Ｈ、ｎ＝１となつているのであろ
う。

【表】

【表】 高分解能¹³C NMRを用いて、実施例３〜10の
共重合体の単量体配列を調べた。カルボニル基の
炭素原子から得られるシグナルは、その環境に応
じて、異なる化学シフトで起きることが判明し
た。したがつて、単位および（ｎ＝１、R²
＝C₂H₅、R²＝R³＝Ｈ）を含む重合体では、可能
な配列は次の通りである。 Ａ ブチレート−ブチレート Ｂ バレレート−バレレート Ｃ ブチレート−バレレート 実施例２〜10の重合体のNMR試験は、それぞ
れ169.07、169.25および169.44ppmで起きる３つ
の共鳴を示した。M.Iida外〔Macromoles 11
（1978）p490〕によれば、169.07ppmでの共鳴は、
ブチレート−ブチレートの配列Ａであり、
169.44ppmはバレレート−バレレートの配列Ｂで
ある。推論によれば、169.25ppmでのシグナル
は、ブチレート−バレレートの配列Ｃから生じ
る。 実施例10の重合体のNMRの結果の定量的分析
は、次の結果を与えた。 配列Ａ（ブチレート−ブチレート） 55％ 配列Ｂ（バレレート−バレレート） 14％ 配列Ｃ（ブチレート−バレレート） 31％ これらの結果は、実施例10の重合体が単位お
よび（ｎ＝１、R¹＝C₂H₅、R²＝R³＝R⁴＝Ｈ）
の共重合体を実質的量で含むことを、明らかに示
している。しかし、繰返し単位のホモ重合体の
若干も存在する可能性がある。 実施例２〜14の重合体は、全部Ｄ（−）立体配
置を有していた。 抽出したままの共重合体の溶融挙動は、コンピ
ユーターデーター分析付のジユポン1090システム
を用いて、先ず差動走査熱計量法（DSC）で決
定した。DSC法を、190℃で圧縮成形し、完全に
結晶化した製品を得るために、プレス中に冷却し
た後の試料でも実施した。それぞれの場合、見本
は空気中で20℃／分で加熱し、吸熱溶融のスター
ト（Ts）およびピーク（Tp）の温度をその面積
とともに記録した。アニーリングした試料の加熱
を200℃まで継続し、完全に溶融させるため１分
間等温にした後、試料を液体窒素中で急冷した。
非晶領域のガラス転移温度（Tg）を決定するた
めに、DSC試験に再び行つた。最後に、密度勾
配浮遊法により、アニーリングした共重合体の密
度を測定した。 結果を、表３に示す。

【表】 各共重合体の広い融点範囲は、共重合体がむし
ろ不均質組成物であることを示している。しか
し、溶融吸熱がよりシヤープになりかつ面積が僅
かに減少しているので、アニーリングしたとき、
エステル交換による顕著なランダム化が起きてい
る。このことは、重合体はホモ重合体の物理的混
合物でなく、真正共重合体であることの指標であ
る。 多重DSCピークが、実施例３，５，８および
10の抽出したままの重合体で観察された。 溶融吸熱面積は、結晶化度の指標である。アニ
ーリング後の実施例３〜14の重合体は、全部実施
例２の対照ホモ重合体よりも、著るしく結晶化度
は低かつた。 実施例 15 Alcaligenes eutrophus 変異株NCIB11599
を、水性培地Ｃ（これは培地Ｂと同じであるが、
PHBを含まぬ細胞8.5ｇ／を支持するのに充分
な硫酸アンモニア5.2ｇ／であつた）4000mlを
含む５バツチ式醗酵器で、PH6.8、34℃で好気
培養により繁殖させた。 基質は、5.5ｇ／／hrの割合で供給するグル
コースであつた。細胞濃度が７ｇ／に達したと
き、グルコースに加えてプロピオン酸を1.58ｇ／
／hrの割合で供給した。細胞乾燥重量が15ｇ／
に達したとき、細胞を回収した。細胞懸濁液を
噴霧乾燥し、脂質を乾燥細胞のメタノール還流で
抽出し、重合体をクロロホルム還流で抽出した。
クロロホルム溶液をメタノール／水混合物に添加
する沈澱法により、重合体を回収した。 共重合体は、反覆単位（Ｒ＝C₂H₅、R²＝R³
＝R⁴＝Ｈ、ｎ＝１）20モル％を含んでいた。共
重合体は、分子量350000を有し、冷メチルエチル
ケトンに不溶性であつた。共重合体２ｇを、メチ
ルエチルケトン100mlで１時間還流すると、全量
溶解した。溶液を冷却すると、ゼラチン状マスを
生じた。これに対し、３−ヒドロキシ酪酸エステ
ルホモ重合体２ｇをメチルエチルケトン100mlと
還流したとき、溶解したホモ重合体は0.1ｇ以下
であつた。メチルエチルケトンの代りにエタノー
ルで、溶解度テストを反覆すると、１時間還流
後、共重合体は約0.7ｇが、ホモ重合体は0.04ｇ
以下が溶解した。 これに対し、Wallen外によりEnvironmen−
tal Science and Technology８（1974）p.576〜
579に記載の重合体は、熱エタノールに可溶性と
されている。 実施例 16 水性培地Ｄ，ＥおよびＦを、脱イオン水１当
り次の組成で作つた。 培地Ｄ （NH₄）₂SO₄ 12ｇ MgSO₄・7H₂O 1.2ｇ K₂SO₄ 1.5ｇ CaCl₂ 0.12ｇ FeSO₄・7H₂O 0.1ｇ ZnSO₄・7H₂O 0.006ｇ MnSO₄・4H₂O 0.006ｇ CuSO₄・5H₂O 0.0015ｇ H₂SO₄（濃厚） １ml 培地Ｅ H₃PO₄（1.1M） 2.4ml グルコース 40ｇ 培地Ｆ H₃PO₄（1.1M） 2.4ml プロピオン酸 40ｇ 殺菌した公称容量250バツチ式醗酵器に、培
地ＤおよびＥのほぼ等容量混合物を、130のマ
ークまで満たした。醗酵器中の培地の少量の試料
で、窒素含有量を分析した。次いで、培養器に
Alcaligenes eutrophus変異株NCIB 11599を接
種し、醗酵を34℃で、苛性ソーダ溶液の添加でPH
を6.8に自動的にコントロールして好気的に行つ
た。 醗酵器に存在した資化性窒素の量は、PHBを
含まぬ細胞約1.2Kgのみまでの微生物繁殖を行う
のに充分であつた。細胞重量が約1.05Kgに達した
とき、培地Ｅの供給を、6.5／hrの割合で開始
した。 細胞重量が約1700ｇに達したとき、培地Ｅの供
給を停止し、培地Ｆの供給を6.5／hrの割合で
開始し、細胞約2.6Kgが産生されるまで醗酵を継
続した。 次いで、細胞懸濁液を、遠心分離により濃度約
60ｇ／まで濃縮し、懸濁液１容量を１，２−ジ
クロロエタン（DCE）２容量とシルバーソンミ
キサーで20℃で15分間接触させて重合体を抽出し
た。DCE相を、細胞の残骸を含む水性相から分
離し、過した。過したDCE相１容量を、メ
タノール／水（4/1、容量）混合物４容量に加え
て、重合体を沈澱させた。沈澱重合体を別し、
メタノールで洗浄してから、オープンで100℃で
４時間乾燥した。 重合体は、DSC法で決定して168℃で溶融吸熱
のピークを有し約100〜180℃の溶融範囲を有して
いた。 実施例 17 実施例16の醗酵処理を反覆したが、培地Ｅの供
給から培地Ｆの供給への切換えは、細胞重量が約
3.5Kgに達したときに行つた。培地Ｆは、11.4
／hrの割合で４時間供給してから3.2／hrに
低下させ、このレベルをさらに９時間維持し、こ
の段階で細胞重量は約3.9Kgであつた。 この実施例では、醗酵器に存在した資化性窒素
の量は、重合体を含まぬ細胞わずか約1.5Kgに微
生物を繁殖させるに充分であつた。 細胞懸濁物を遠心分離で濃縮し、次いで実施例
15の方法で、重合体を濃縮細胞懸濁液から抽出し
た。 実施例 18 実施例16のようにして、250醗酵器に装入、
接種を行つた。資化性窒素の量は、重合体を含ま
ぬ細胞わずか約1.9Kgに、微生物を繁殖させるに
充分であつた。実施例16のようにして、醗酵を34
℃、PH6.8で好気的に行つた。 細胞重量が約1.0Kgに達したとき、培地Ｅおよ
び培地Ｇをそれぞれ8.7／hrおよび4.6／hrの
割合で供給を開始し、細胞重量が3.9Kgになるま
で継続した。 培地Ｇは、脱イオン水１当り次の組成を有し
ていた： H₃PO₄（1.1M） 1.2ml プロピオン酸 20ｇ 細胞懸濁液を遠心分離で濃縮し、実施例15の方
法で、重合体を濃縮細胞懸濁液から抽出した。 実施例 19 実施例17の処理を大規模で反覆し、公称容積
1000の醗酵器を用い、ほぼ等容量の培地Ｄおよ
びＥで500マークまで満たした。この実施例で
は、培地Ｅの供給は細胞重量約４Kgになつたとき
に25／hrの割合で開始し、培地Ｆの供給は細胞
重量約８Kgになつたとき37.5／hrの割合で開始
した。培地ＥおよびＦの供給は、細胞重量が約10
Kgに達するまで継続した。存在する資化性窒素の
量は、重合体を含まぬ細胞約4.1Kgまで微生物を
繁殖させるに充分であつた。 実施例 20 実施例19を反覆したが、培地Ｆの供給割合は25
／hrで、醗酵は細胞重量約11Kgになるまで継続
した。この場合、資化性窒素の量は、重合体を含
まぬ細胞約４Kgまで微生物が繁殖するに充分であ
つた。 実施例16〜20の重合体は、それぞれ３−ヒドロ
キシ酪酸（HB）単位およびβ−ヒドロキシバレ
リアン酸（HV）単位を含む共重合体であり、重
量平均分子量は300000以上であつた。共重合体
は、それぞれＤ（−）立体配置を有していた。 実施例16〜20の各共重合体および３−ヒドロキ
シ酪酸ホモ重合体100重量部を、クロロホルム約
10重量部およびタルク１重量部でスラリー化し、
家庭用肉ひき機で室温で粒状化した。次いで、組
成物を乾燥してクロロホルムを除去し、190℃で
抽出してから、再び粒状化した。得られる粒状物
を、185℃で試験用バーに射出成形し、型温度65
℃および冷却時間20秒を用いた。引張特性を、
ASTM D638−77aにより50mm／分の速度で測定
し、衝撃強度をASTM D256−78によりアイゾ
ツト衝撃試験で評価した。 結果を、表４に示した。

【表】 実施例 21 下記成分を室温で乾式混合し、PVC配合物を
作つた： 重量部 (i) 塩化ビニルホモ重合体（K62） 100 (ii) ジ−Ｎ−ジチオグリコール酸エステルベース
のチオオクチルスズ錯体の安定化剤 1.5 (iii) メチルメタクリレート／ブタジエン／スチレ
ンPVC衝撃改善剤 ８ (iv) ワツクス（外部油滑剤） 0.8 (v) グリセリルモノエステル（内部油滑剤） １ (vi) HB重合体（加工助剤） ２ HB重合体加工助剤は、次のものであつた： (a) 実施例２で得た３−ヒドロキシ酪酸エステル
ホモ重合体 (b) 実施例７の共重合体（共重合体Ａ） (c) 実施例16の共重合体（共重合体Ｂ） 加工助剤は、約10wt％のクロロホルムでスラ
リー化し、家庭用肉ひき機で室温で粒状化し、乾
燥し、190℃で溶融押出し、再度粒状化し、PVC
乾燥混合物に配合する前に、粒子寸法150μｍ以
下に粉砕した。 乾燥混合物を、次のようにして試験した： １ 混合物50ｇを、５Kgの重錘で負荷した圧力ム
ラの下で18rpmで回転し、180℃に維持した
Brabender Plastographの混合ヘツドに投入し
た。ゲル化が起きるに要した時間を、記録し
た。 ２ 混合物を冷圧縮したキヤンドルにし、これを
170℃に維持し、直径１mmおよびランド長20mm
の円形オリフイスを有するダイを取付けた押出
しレオメーターに装入した。装入物が170℃に
加熱された後、速度を増加させながら押出し
た。押出し物の外観を記録し、押出し物をダイ
から引張つて溶融伸長性を評価した。 結果を、表５に示す。

【表】 この実施例は、塩化ビニル重合体加工助剤とし
て、共重合体は、３−ヒドロキシ酪酸ホモ重合体
より優れていることを示している。よりランダム
共重合体Ａは、明らかに共重合体Ｂより秀れてい
る。 実施例 22 培地Ｈを、次の組成で作つた： （NH₄）₂SO₄ １ｇ KH₂PO₄ ２ｇ （Na）₂HPO₄ ３ｇ MgSO₄・7H₂O 0.2ｇ CaCl₂ 0.01ｇ FeSO₄・7H₂O 0.005ｇ MnSO₄・4H₂O 0.002ｇ Na₂CO₃・10H₂O 0.1ｇ （NH₂）₂CO 1.5ｇ 脱イオン水 全体で１にする 培地のPHは、７であつた。 予じめメタクリル酸0.5ｇを溶解した培地H500
mlをそれぞれ含む８個の１振とうフラスコに、
Nocardia salmonicolor株ATCC19149の種培養
物５mlを接種し、旋回振とう機で32℃で培養し
た。 接種後24時間、48時間および72時間の間隔で、
各フラスコにメタクリル酸0.5ｇづつを添加し、
メタクリル酸0.25ｇの最終添加を96時間後に行つ
た。接種後108時間で、各フラスコを検査した。
どのフラスコでも、微生物の繁殖は殆んどなかつ
た。フラスコ内容物を一緒にし、遠心分離して細
胞のペレツトにして、オーブンで乾燥してから計
量した。ペレツト重量は、2.81ｇであつた。接種
物の細胞含有量も決定し、69.75ｇ／であつた。
したがつて、接種物としてフラスコに添加した細
胞の全重量は、2.79ｇであつた。 用いたメタクリル酸濃度では、この菌株は、メ
タクリル酸を資化しなかつた。 実施例 23−45 これらの実施では、ある範囲の酸および酸誘導
体を、共重合体を与えうるか否かについてスクリ
ーニング試験した。 使用した方法は下記の通りであつた。 Alcaligenes eutrophus変異株NCIB11599を、
脱イオン水１当り下記の組成の水性培地3500〜
4000mlを入れた５のバツチ式醗酵器中でPH6.8
および34℃において好気培養した。 グルコース 17ｇ （NH₄）₂SO₄ ４ｇ MgSO₄・7H₂O 0.8ｇ H₃PO₄（1.1M） 12ml FeSO₄・7H₂O 15mg 微量元素溶液 36ml （実施例１のもの） PHは4M水酸化カリウム溶液および4M水酸化ナ
トリウムの９：１（容／容）混合物の自動添加に
より6.8に制御した。このようなPH制御のための
KOH／NaOH混合物の添加は、培地にカリウム
およびナトリウムを供給する機能も果した。 資化性窒素（上記４ｇ／の硫酸アンモニウム
によつて与えられる）の量は、わずかに約6.5
ｇ／のHB重合体不含有細胞を支持するに足る
量であつた。約16ｇ／のグルコースが6.5ｇ／
のHB重合体不含有細胞を生じさせるのに必要
とされるから、存在したグルコースの量は、少し
の炭素過剰を与えるのに足るものであつた。残留
グルコース濃度を監視し、また溶存酸素張力を追
跡することにより、系が資化性窒素に欠乏した時
点の明かな指示が得られた。この段階でコモノマ
ー成分（すなわち試験用の酸または酸誘導体）の
供給を開始し、合計で約0.1〜５ｇ／のコモノ
マー成分が添加されるまでその供給を続けた。 コモノマー成分の添加終了後、細胞を遠心分離
で回収した。遠心分離した細胞の試料を凍結乾燥
し、その重合体をクロロホルムで抽出した。重合
体をガスクロマトグラフ／質量スペクトル
（GCMS）法（これには予備的なエステル交換工
程が含まれる）またはnmrスペクトル法
（NMR）によつて分析した。 結果を表６に示す。この表において、NMRの
結果は、NMR法がエステル交換工程を含まず一
層明確であると考えられるので、可能な場合に表
示してある。

【表】 同様な結果は、実施例23−44において窒素が用
い尽された後にグルコースおよびコモノマー成分
の混合物を連続的に添加するように改変した培養
を繰返えして実施したときにも得られた。 実施例 46〜51 0.085／hrの稀釈率（滞留時間の逆数）で約４
の有効培地液容積を用いて、５の醗酵器中で
PH6.8および34℃において Alcaligenes eutrophus変異株NCIB11599を連続
好気培養した。使用水性培地は、脱イオン水１
当り下記の組成であつた。 MgSO₄・7H₂O 0.8ｇ K₂SO₄ 0.45ｇ Na₂SO₄ 0.05ｇ H₃PO₄（1.1M）溶液 12ml 微量元素溶液（実施例１のもの） 36ml また表７に示した各成分も醗酵器に連続的に供
給した。

【表】 窒素の量は、わずかに6.5ｇ／のHB重合体不
含有細胞を支持するに足る量であつた。 pHは、4M水酸化カリウム溶液および4M水酸
化ナトリウム溶液の９：１（容／容）混合物の自
動添加制御した。 醗酵は唯一の基質としてプロピオン酸を用いて
開始した。定常状態に達してから３日後に、水性
細胞懸濁生成物のサンプルを採取し、次いでアク
リル酸を、次第に増加する量で補助基質として添
加した。少なくとめ３日間定状態下での醗酵を各
アクリル酸濃度において実施し、その後にそれぞ
れサンプルを採取した。水性細胞懸濁生成物の各
サンプルを遠心分離して細胞を回収し、次いで凍
結乾燥した。重合体を、クロロホルムで細胞から
回収し、次いでNMR法で分析した。結果を表８
に示す。

【表】 実施例 52 この実施例では、窒素ではなく燐の制限下に
Alcaligenes eutrophus変異株NCIB11599を34℃
で好気培養した。５の醗酵器に、脱イオン水１
当り下記の組成の水性培地を仕込んだ。 （NH₄）₂SO₄ 6.2ｇ H₃PO₄（1.1M） 1.5ml MgSO₄・7H₂O 0.8ｇ FeSO₄・7H₂O 15mg 微量元素溶液（実施例１のもの） 36ml 醗酵時のPHは、4MのKOHおよび4MのNaOH
の９：１（容／容）混合物の添加により自動的に
6.8に制御した。燐の量は８ｇ／のHB重合体不
含有細胞を支持するに足るものであつた。 醗酵器に48時間振とうフラスコ培養物を接種
し、次いで５ｇ／のグルコースを添加した。す
べてのグルコースが用い尽されたとき（この時点
で細胞濃度は約2.5ｇ／）、プロピオン酸を
（300ｇ／の溶液の形で）、0.8ｇ／／時の速度
で54時間添加した。 次いで細胞を回収し、重合体をクロロホルムで
抽出し、GCMS法で分析した。結果は下記の通
りであつた。 最終細胞濃度 20ｇ／ 重合体含量 60％ ３−HVのモル％ 40モル％ 実施例 53−57 これらの実施例ではNocardia Salmoni−
color種の二つの菌株をグルコース基質で培養し、
次いで種々の酸を用いて重合体蓄積を誘導した。 各実施例において、250mlの振とうフラスコに、
脱イオン水１当り下記の成分を含む水性培地を
50ml仕込んだ。 グルコース 10ｇ K₂HPO₄ 1.9ｇ NaHPO₄ 1.56ｇ （NH₄）₂SO₄ 1.8ｇ MgSO₄・7H₂O 0.2ｇ FeCl₃・6H₂O 0.001ｇ 微量元素溶液（実施例１のもの） １ml この水性培地のPHは7.0であつた。フラスコに
微生物（表９）を接種し、回旋振とう法で30℃に
おいて24時間培養した。得られた懸濁液を次いで
遠心分離し、上澄みの水性培地を捨てた。残留し
た遠心分離ペレツト状物を上記の水性培地（但し
10ｇ／のグルコースの代りに１ｇ／の酸を用
いそして1.8ｇ／の硫酸アンモニウムを省略し
たもの）の50ml中に再懸濁させた。再懸濁した細
胞を30℃でさらに24時間振とうし、次いでその細
胞懸濁液を遠心分離した。得られた遠心分離ペレ
ツト状の細胞をメタノールで２回洗浄し、その重
合体含量を分析した。重合体はGCMS法で分析
した。結果を表９に示す。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ポリβ−ヒドロキシ酪酸エステルを蓄積でき
   る微生物を、水性培地中において水溶性の資化性
   炭素含有基質で培養し、その際に培養の少なくと
   も一部期間はその微生物によつてポリエステルが
   蓄積される条件下で培養を行うことにより熱可塑
   性ポリエステルを産生させる方法において、少な
   くともポリエステルが蓄積している培養期間部分
   中は、該資化性炭素含有基質は、該ポリエステル
   蓄積条件下で微生物によつて代謝されて、−Ｏ・
   CH（CH₃）・CH₂・CO−繰返し単位からもつぱら
   構成されるもの以外のポリエステルとなる、プロ
   ピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ク
   ロロプロピオン酸、３−エトキシプロピオン酸、
   ２−ヒドロキシ酪酸、イソ酪酸、アクリル酸及び
   奇数個の炭素原子を含む高級飽和カルボン酸から
   選択される有機酸もしくは有機酸誘導体を含むこ
   と、そして該酸もしくは酸誘導体中の化学結合炭
   素の量は該ポリエステル蓄積期間中に存在する基
   質中に全化学結合炭素の少なくとも２重量％をな
   すこと、を特徴とする上記熱可塑性ポリエステル
   産生方法。 ２ 微生物の増殖にとつて必須ではあるがポリエ
   ステルの蓄積にとつては必須ではない要素の一ま
   たはそれ以上の供給を制限した条件下で、微生物
   によりポリエステルを蓄積させる特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 ３ 重量平均分子量が10000以上であり、 −Ｏ・CH（CH₃）・CH₂・CO−の繰返し単位
   および プロピオン酸、３−ヒドロキシプロピオン
   酸、３−クロロプロピオン酸、３−エトキシプ
   ロピオン酸、２−ヒドロキシ酪酸、イソ酪酸、
   アクリル酸及び奇数個の炭素原子を含む高級飽
   和カルボン酸から選択される有機酸もしくは酸
   誘導体に基くエステル残基の繰返し単位、 を含み、かつ上記繰返し単位が全繰返し単位の
   0.1〜50モル％を構成していることを特徴とする
   ポリβ−ヒドロキシ酪酸共重合体。