JPH06172217A

JPH06172217A - ワクチンの免疫効果増強剤

Info

Publication number: JPH06172217A
Application number: JP3116158A
Authority: JP
Inventors: Morio Honma; 守男本間; Hiroshi Hotta; 博堀田; Katsutsugu Hagiwara; 克嗣萩原
Original assignee: Taito Co Ltd
Current assignee: Taito Co Ltd
Priority date: 1991-05-21
Filing date: 1991-05-21
Publication date: 1994-06-21
Anticipated expiration: 2019-04-26
Also published as: JP3522772B2

Abstract

(57)【要約】【構成】 β−１，３−グリコシド結合を主鎖とするグ
ルカンを含有するウイルスならびに細菌用ワクチンの免
疫効果増強剤。【効果】天然物由来のものであるため低毒性。食品又
は飼料として施与可能。必ずしも精製したものである必
要はない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、「β−１，３−グリコ
シド結合を主鎖とするグルカン」（以下、便宜上「当該
多糖」と略称する）を有効成分として含む、免疫効果増
強ワクチンに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】人類は種々のウイルスや細菌による感染
症をワクチンや抗生物質の開発により克服してきた。す
なわち、細菌感染症に対しては特効薬的な抗生物質の発
明が、既に細菌性疾患の脅威を大きく軽減している。し
かしながらウイルス感染症に対しては有効な抗生物質や
化学療法剤は比較的少なく、ポリオや種痘に代表される
ようなワクチン接種による予防法が主に行われている。

【０００３】ところでワクチンには、病原ウイルスを不
活化した「不活化ワクチン」と、弱毒化した「生ワクチ
ン」とがある。また、現在、人間用としては、ポリオ、
麻疹、風疹、オタフクカゼ、インフルエンザ、日本脳
炎、水痘、黄疸及びＢ型肝炎等のワクチンが実用化され
ている。これらのうち「不活化ワクチン」に属するもの
は、インフルエンザ、日本脳炎及びＢ型肝炎ワクチン
で、それ以外は「生ワクチン」に属する。

【０００４】ところで一般に生ワクチンは、不活化ワク
チンに比し、免疫の獲得が自然感染に近く、かつ免疫効
果も優れているが、毒力の回復する危険性や品質の不安
定性に難点があると言われている。一方、生ワクチンよ
り毒性の少ない不活化ワクチンも全く毒性がないわけで
はなく、より安全性が高く、かつ有効なコンポーネント
ワクチンの開発が、遺伝子工学的手法により活発に行わ
れている。しかしながら、それについても、実用面でい
くつかの問題点が指摘されている。

【０００５】また前記のような多くのワクチンが実用化
されているが、感染予防効果の面で十分とは言い難く、
ワクチンの免疫効果を増強させる為の方法が種々検討さ
れている。例えばアジュバントの利用もワクチンの効果
増強のための一つの手段であり、古くから知られている
フロイントの合成アジュバントも試みられているが、副
作用が強いという欠点を持っている。すなわち、安全性
の面で未だ問題が残されているのである。

【０００６】

【発明が解決しようとしている課題】既に述べたように
生ワクチンでは、弱毒株が生体内で変異を起こし強毒化
するおそれがあるということ、又、不活化ワクチンで
は、不活化操作中に抗原性に歪みが起こり思わぬ副作用
の原因になる等の、ワクチンに本質的な危険性が潜在し
ていた。

【０００７】これとは別に、ワクチンの投与が低年齢層
を対象として集団的に実施されていることもあり、宿主
側の感受性のバラツキに帰因した副作用を、いかに防ぐ
かといった点で、より一層安全でかつ有効な、ワクチン
の出現が望まれていた。また、種々のウイルスの中で、
インフルエンザウイルスのように気道表面で感染増殖す
るウイルスに対しては、血中抗体が高くとも気道内の局
所分泌抗体（IgA 抗体）が充分に存在しないとウイルス
感染の予防が困難な場合もあった。すなわち現在、イン
フルエンザの予防には不活性化ワクチンを皮下接種する
方法がとられているが、この方法は、血中抗体を高める
には有効であってもIgA 抗体を高めることにはなってい
ない。このためインフルエンザウイルスに限らず気道表
面あるいは消化管粘膜上で感染増殖するウイルスに対し
ては、血中抗体だけでなくIgA 抗体をいかに高めるかが
感染防御効果の上で重要な課題であった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、前述の如
き課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定の多糖、即
ち特定のグルカン（当該多糖）を、ワクチンと併用する
ことにより本発明の目的が達成されることを見出し、本
発明を完成するに至った。本発明者等は、ワクチンの免
疫効果を増強させることにより投与量を減少させ、ひい
ては副作用発生の頻度を減らすことが可能であろうとい
う発想の下に、まずワクチンの免疫効果の増強方法につ
いて検討を加えた。

【０００９】本発明者等は、当該多糖が注射による体内
投与により、宿主に対する優れた免疫賦活活性を有して
いること、また当該多糖の一つであるシゾフィランが、
インフルエンザウイルスにに対し免疫賦活作用に基づく
抗ウイルス作用を示すこと（近畿大学医学雑誌第６巻３
号381-391 頁1981年）等の事実に鑑み、当該多糖は血中
抗体、細胞性免疫の亢進に基づくワクチンのウイルス感
染防御効果の増強に有効であろうと考え、ワクチンと当
該多糖とを組み合せて用いることを検討した。

【００１０】更にマイタケの子実体に含まれる当該多糖
が、経口投与により免疫賦活作用を示すこと（Internat
ional Journal of Immunopharmacology, Vol 12, No.6,
675-684、1990) ならびに当該多糖の一種であるレンチ
ナンが経口投与により血液中のリンパ球サブセット（Su
bset) を変動させること（消化器と免疫、No. 20, 78〜
82頁、1988）等から、当該多糖を経口投与した時のワク
チンとの併用効果について鋭意研究を行った。

【００１１】その結果、それらの単独投与に比べ、ワク
チンと当該多糖とを併合投与すると、血中及びIgA 抗体
産生は共に増強され、また細胞性免疫の指標の一つであ
るマクロファージの活性も高められることが認められた
のである。更にまた、ワクチン使用量を大幅に減らして
も有効な感染防御効果の得られることが確認され、前述
のすべての課題を解決する事ができたのである。

【００１２】本発明でいう当該多糖とは、通常はβ−
１，３−グリコシド結合を主鎖とし、β−１，６−グリ
コシド結合を側鎖に有する分岐β−１，３−グルカンを
いう。たゞしβ−１，６結合のない直鎖β−１，３−グ
ルカンであっもよい。この種の分岐及び直鎖β−１，３
−グルカンは広く真菌類全般に分布している。特に普通
キノコと呼ばれる担子菌類の子実体に多く含まれてい
る。また担子菌類の培養液中からも高収量で得られる。

【００１３】前述したシゾフィランあるいはレンチナン
等は、キノコ由来の多糖としてよく知られている。ま
た、スクレロチウム属の生産するスクレログルカン、ア
ルカリゲネス属の産生するカードラン等もよく知られて
いる。さらに、これらβ−１，３−グルカンのあるもの
は、化学的に修飾すると免疫賦活活性が上昇する。従っ
て本発明に於てはβ−１，３−グルカンを化学的に修飾
した誘導体も、当該多糖に含まれるものとする。加うる
に、真菌類がその細胞壁構成多糖として、β−１，３−
グルカンを含むこともよく知られており、（日本醸造協
会雑誌、第82巻、第９号、598 〜685 頁、1987) 、真菌
類に属する酵母の細胞壁β−１，３−グルカンがマウス
の免疫能を増強することも報告されている（Trends in
pharmacological Sciences 4, 344-347, 1983)。それ
故、これら真菌類の細胞壁破砕物も当然、本発明の当該
多糖に包含されるものとする。

【００１４】本発明者等は、このようにシゾフィランの
産生菌でキノコの一種であるスエヒロタケの菌体破砕物
に、ワクチン増強効果を認めることができ、また真菌類
の菌体自体にもウイルス感染防御効果が存在するという
ことを確認したのである。なお中性多糖の腸内吸収は難
しいというのが通説となっており（食品加工技術Vol. 2
5, No.4, P.271, 1988）（化学と生物 Vol. 25, No.4,
P.273, 1987 ）、実際当該多糖を経口投与した場合、体
内リンパ球サブセットの変動、或は多少の腫瘍増殖抑制
効果等の免疫能の賦活を示唆する傾向は見られるもの
の、臨床的に癌治療ができるというような治療効果につ
いては、今のところ報告されていない。

【００１５】通常、当該多糖の免疫賦活作用を有効に働
かせる為には注射による体内投与が望ましいと考えられ
る。その場合には呼吸気道や消化管粘膜上で分泌される
IgA抗体の産生亢進はみられず、そのためIgA 抗体が感
染防御に重要な働きを演じるインフルエンザワクチンの
免疫能増強にはやや難点がある。一方当該多糖を経口投
与した場合には、当該多糖が呼吸気道及び消化管粘膜と
適度に接触し、それらの粘膜を刺激することによってIg
A 抗体の分泌を促し、血中抗体、細胞性免疫及びIgA 抗
体の３つの機構によって生体をウイルス感染から防御す
るようになることが認められた。例えばインフルエンザ
ワクチンに対しても有効な免疫増強効果を示すことが予
想され、事実、本発明者等は当該多糖の経口投与によ
り、インフルエンザウイルスと近縁な関係になるセンダ
イウイルスのワクチン投与に伴うIgA 抗体の有意な産生
増強と感染防御効果の増強を確認するに至ったものであ
る。

【００１６】理論に拘泥する意図はないが、本発明に於
て、当該多糖によるワクチン免疫効果の増強作用は、当
該多糖により宿主防御機構が非特異的に活性化される為
と考えられる。ちなみに、当該多糖はどのような種類の
ワクチンでもその免疫効果を亢進させ得、それ故、ウイ
ルスワクチンの種類を問わず、細菌ワクチンにも巾広く
適用可能であることが判明した。更にまた、原虫疾患、
例えばマラリア等にも有効性が期待できる。

【００１７】当該多糖の体内への投与方法は注射、経口
のいずれであってもよい。ワクチンの種類、宿主の状態
等に合わせ適宜選択すればよい。しかしながらIgA 抗体
産生の賦与、投与の際の安全性、容易さ等の観点から注
射による投与より経口投与の方が望ましい。また、当該
多糖とワクチンとをあらかじめ混合して経口投与しても
よい。

【００１８】更に、経口投与では当該多糖を高度に精製
する必要もなく、例えば当該多糖産生菌の菌体あるい
は、それらの混合物をそのまま利用できる等の利点を有
し、それにより製造コストの軽減も可能となったのであ
る。本発明に於て当該多糖の投与量は、経口投与の場合
１mg／kg〜１０００mg／kg、また注射投与の場合は0.１
mg／kg〜１００mg／kgで有効であるが、望ましくは経口
投与の場合は１０mg／kg〜２００mg／kg、注射投与の場
合は１mg／kg〜５０mg／kgである。

【００１９】

【本発明の効果】本発明の当該多糖は体内の消化酵素に
よる分解を受けにくく、非常に低毒性であって、注射に
よる投与でもほとんど副作用を示さない。従って経口投
与では毒性は皆無であるという大きな特徴を有する。加
えて本発明の当該多糖は天然物であり、低毒性であるの
で、食品あるいは動物の飼料として服用しても、そのワ
クチン増強効果は十分に期待できる。なお、当該多糖を
食品や飼料として利用する場合には、あまり精製する必
要もなく、粗製品或は多糖製造の培養液乾燥物のままで
あっても十分に所定の効果を示す。

【００２０】

【実施例】次に、本発明の詳細を実施例をもって説明す
る。実施例１シゾフィラン（以下ＳＰＧという）Schizophyllum comm
une Fries の菌体破砕物（以下菌体という）及びＳＰＧ
を３０％含有する菌体（以下ＳＰＧ含有菌体という）
を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に0.７５％又は0.
０７５％になるように溶解又は懸濁させた後、それらを
ワクチン投与の１、２、３、４、５日前及び１、２日後
マウス（ＩＣＲ、３週令、雄）に経口又は腹腔内投与し
た。試料の投与量は経口の場合0.７５％の溶解又は懸濁
液0.２ml（約１００mg／kg）、腹腔内の場合0.０７５％
の溶解又は懸濁液0.２ml（約１０mg／kg）とした。ここ
ではワクチンとしてセンダイウイルスの弱毒株であるＴ
Ｒ−５株を用い、これをエーテル麻酔下のマウスに５０
又は５００ＣＩＵ（Cell Infectious Unit :ウイルス感
染価) を経鼻投与した。即ち、ＴＲ−５株の保存液（１
０⁶ＣＩＵ／ml）をＰＢＳで１００倍及び１０００倍に
希釈し、５０ＣＩＵの場合は１０００倍希釈液５０μｌ
を、５００ＣＩＵの場合は１００倍希釈液５０μｌをそ
れぞれ経鼻投与した。ワクチン投与後、経時的（接種当
日、５日後、７日後、１４日後、２１日後）に血清を採
取し、赤血球凝集（hemagglutination : HA)反応を阻止
する赤血球凝集抑制 (hemagglutination inhibition :
HI) 反応により血清中の抗ウイルス抗体価を測定した。

【００２１】ＨＡ反応とはウイルス粒子又は、ＨＡ抗原
が赤血球に吸着、赤血球同士を結びつけ凝集させる反応
のことである。ＨＡ価の測定に当たっては、ウイルス液
の２倍階段希釈列を作り、それぞれの希釈液に一定量の
赤血球を加えて一定時間後に凝集像を調べ、凝集陽性を
呈する試験管の最高希釈倍数の逆数を以てＨＡ価（ＨＡ
Ｕ）とする。このＨＡ反応は、ウイルス液にあらかじめ
抗ウイルス抗体を加えることによって阻止される。これ
がＨＩ反応である。

【００２２】ＨＩ抗体価（ＨＩＵ）は、４ＨＡＵのウイ
ルス抗原によるＨＡ反応を完全に阻止する血清の最高希
釈倍数の逆数をもって示す。（試験方法）２倍階段希釈した血清２５μｌに、１６Ｈ
ＡＵに調整したウイルス液２５μｌを加え１時間室温に
静置した後、0.５％ニワトリ赤血球浮遊液５０μｌを加
え４℃１時間静置後、ＨＩ価を判定した。結果を表１に
示した。

【００２３】表１．ワクチン投与後の血中抗体価の推移に及ぼすＳＰＧの影響 ─────────────────────────────────── ＨＩＵ（腹腔内投与）ＨＩＵ（経口投与）試料 0 5 7 14 21 0 5 7 14 21 （感染後、日）（感染後、日） ─────────────────────────────────── ワクチン 50 CIU <16 <16 <16 <16 <16 ＮＤワクチン 500 CIU <16 <16 <16 16 16 <16 <16 <16 16 16 ワクチン 50CIU+SPG <16 <16 16 32 32 ＮＤワクチン 500CIU+SPG <16 <16 16 64 128 <16 <16 16 32 64 ワクチン500CIU + ＮＤ <16 <16 16 64 128 SPG含有菌体ワクチン500CIU+ 菌体ＮＤ <16 <16 16 32 64 ─────────────────────────────────── ＮＤ：測定しなかった。

【００２４】ワクチン単独の場合に比べ、ワクチンとＳ
ＰＧ、ＳＰＧ含有菌体あるいは菌体を併用することによ
り、血中抗体価は有意に上昇した。実施例２ＳＰＧをＰＢＳに溶解させ、0.００７５％、0.０３７５
％、0.０７５％、0.３７５％、0.７５％、1.５％及び3.
７５％の濃度になるように調製した。これらのＳＰＧ溶
液を実施例１と同様にワクチン投与の１、２、３、４、
５日前及び１日、２日後、マウスに経口投与又は腹腔内
投与し、血中抗体価の測定を行なった。

【００２５】試料の投与量は、経口投与の場合は0.０７
５％、0.３７５％、0.７５％、1.５％及び3.７５％濃度
の溶解液を0.２ml（それぞれ１０mg／kg、５０mg／kg、
１００mg／kg、２００mg／kg、及び５００mg／kg）、腹
腔内投与の場合は0.００７５％、0.０３７５％、0.０７
５％、0.３７５％、及び0.７５％濃度の溶解液を0.２ml
（それぞれ１mg／kg、５mg／kg、１０mg／kg、５０mg／
kg、及び１００mg／kg）とした。又、ワクチン接種は５
００ＣＩＵとした。表２に結果を示した。

【００２６】表２．ワクチン投与後の血中抗体価に及ぼすＳＰＧ投与量の影響 ─────────────────────────────────── ＨＩＵ（腹腔内投与）ＨＩＵ（経口投与）ＳＰＧ投与量 0 5 7 14 21 0 5 7 14 21 （mg／kg）（感染後、日）（感染後、日） ─────────────────────────────────── 0(コントロール) <16 <16 <16 16 16 <16 <16 <16 <16 <16 １ <16 <16 <16 16 16 ＮＤ５ <16 <16 16 32 32 ＮＤ１０ <16 <16 64 64 128 <16 <16 16 16 16 ５０ <16 <16 32 64 64 <16 <16 16 32 32 １００ <16 <16 16 16 32 <16 <16 32 64 128 ２００ＮＤ <16 <16 32 64 64 ５００ＮＤ <16 <16 16 64 64 ─────────────────────────────────── ＮＤ：測定しなかった。

【００２７】ＳＰＧをワクチンと併用することによりワ
クチン単独の場合よりも血中抗体価の上昇が認められ
た。ＳＰＧを腹腔内投与した場合にはＳＰＧ投与量が１
０mg／Kg、ＳＰＧを経口投与した場合にはＳＰＧ投与量
が１００mg／Kgで、それぞれ最大の血中抗体価が得られ
た。実施例３実施例１と同様の方法でＳＰＧ、菌体及びＳＰＧ含有菌
体並びにワクチンの接種（５００ＣＩＵ）を行った。ワ
クチン接種後１４日目にマウス腹腔からマクロファージ
を採取し、マクロファージの個数を顕微鏡で計数した。
また、マクロファージの活性を以下の通りに行った。線
維肉腫ＳＭＴ−５（標的細胞）と採取したマクロファー
ジ（エフェクター細胞）を１：７の割合で混合し、CO₂
培養器にて２４時間培養した。培養終了８時間前に³Ｈ
−チミジンを添加し、残存する標的細胞中に取り込まれ
た³Ｈ−チミンジン量を液体シンチレーションカウンタ
ーにて測定した。

【００２８】マクロファージの活性は以下の式で求め
た。なお、対照群の³Ｈ−チミジン量とは、マクロファージ
を加えない場合の標的細胞中に取り込まれた³Ｈ−チミ
ジン量をさす。

【００２９】表３に示す結果を得た。表３．マクロファージ活性化に対するワクチンとＳＰＧ及び菌体の影響 ─────────────────────────────────── 試料投与経路マクロファージマクロファージ／body (×10⁶) 活性（％） ─────────────────────────────────── ワクチン 500 CIU 腹腔内投与 4.５２１0.５ワクチン 500 CIU+SPG 腹腔内投与 9.３３２1.７ワクチン 500 CIU+SPG 経口投与 6.８１１9.８ワクチン 500 CIU+SPG含有菌体経口投与 7.８１２2.２ワクチン 500 CIU+ 菌体経口投与 6.３７２0.３ ─────────────────────────────────── ワクチン単独に比べ、ワクチンとＳＰＧあるいは菌体を
併用することによりマクロファージの産生増強及び活性
化が認められた。実施例４実施例１と同様の方法でＳＰＧ、菌体及びＳＰＧ含有菌
体の投与、並びにワクチン接種を行った。ワクチン接種
１４日後にマウスを殺し、気管及び気管支をＰＢＳ（リ
ン酸緩衝生理食塩水 Phosphate Bufferd Saline)１mlで
２回洗浄し、ＰＢＳ中に回収されたIgA を Enzyme Link
ed Immunosorbent Assay（ＥＬＩＳＡ法）により測定し
た。結果を表４にまとめて示した。ＥＬＩＳＡ法：プレートにセンダイウイルスを固定し、
これに被検液を反応させた。次に、パーオキシダーゼ標
識抗マウスIgA 免疫グロブリンを反応させた後、フェニ
レンジアミン２HCl を加え発色させた。ＯＤ₄₉₂を測
定、標準IgA より得た検量線より、被検液中のIgA 量を
求めた。

【００３０】表４．センダイウイルス生ワクチンによる分泌型IgA 誘導に及ぼすＳＰＧの影響 ───────────────────────────── 投与経路 IgA （Ｕ／μg) ───────────────────────────── 対照群（未処理）１５±２ワクチン 500 CIU 腹腔内投与２０±３ワクチン 500 CIU+SPG 腹腔内投与７５±７ワクチン 500 CIU+SPG 経口投与５０±６ワクチン 500 CIU+SPG含有菌体経口投与７０±９ワクチン 500 CIU+ 菌体経口投与５５±７ ───────────────────────────── ワクチン単独の場合に比べ、ワクチンとＳＰＧ、ＳＰＧ
含有菌体あるいは菌体を併用することにより分泌型IgA
の誘導が増強された。実施例５実施例１と同様の方法でＳＰＧ、菌体及びＳＰＧ含有菌
体の投与、並びにワクチンの接種を行った。弱毒ワクチ
ン接種１４日目に、センダイウイルスの強毒株（1.７×
１０⁷ＣＩＵ／ml）をＰＢＳで１５倍希釈し、その希釈
液７０μｌ（約８×１０⁴ＣＩＵ：１５ＬＤ₅₀）をエー
テル麻酔下のマウスに経鼻感染させ、強毒株感染２０日
後のマウス生存率を調べた。結果を表５に示した。ＬＤ₅₀の測定被検液を段階希釈し、その各希釈液を一群の動物に使
用、生死を調べて５０％に死亡が認められる希釈度の点
を１ＬＤ₅₀とした。

【００３１】表５．ワクチンの効果に及ぼすＳＰＧの影響 ─────────────────────────────────── 生存率（生存マウス数／被検マウス数）試料投与経路ワクチン摂取量（ＣＩＵ）０ 50 500 ─────────────────────────────────── 対照群（PBS 投与) 腹腔内投与０／10 ０／10 ３／10 〃経口投与０／10 ０／10 ２／10 ＳＰＧ腹腔内投与０／10 ８／10 ９／10 ＳＰＧ経口投与０／10 ３／９８／９ＳＰＧ含有菌体経口投与１／10 ８／９９／９菌体経口投与１／10 ５／９７／９ ─────────────────────────────────── ＳＰＧ、ＳＰＧ含有菌体あるいは菌体とワクチンを併用
することにより、ワクチン単独に比べ生存率の向上が確
認された。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 β−１，３−グリコシド結合を主鎖とす
るグルカンの有効量からなるウイルス及び細菌用ワクチ
ンの免疫効果増強剤。
【請求項２】グルカンがシゾフィランである請求項１
記載のワクチンの免疫効果増強剤。
【請求項３】グルカンがレンチナンである請求項１記
載のワクチンの免疫効果増強剤。
【請求項４】グルカンがスクレログルカンである請求
項１記載のワクチンの免疫効果増強剤。
【請求項５】グルカンがカードランである請求項１記
載のワクチンの免疫効果増強剤。
【請求項６】有効量は１mg／kg〜１０００mg／kg（経
口投与）である請求項１記載のワクチンの免疫効果増強
剤。
【請求項７】有効量は0.１mg／kg〜１０００mg／kg
（注射投与）である請求項１記載のワクチンの免疫効果
増強剤。