JPH06174727A - 活性型血液凝固第ｘｉｉ因子の製造方法 - Google Patents
活性型血液凝固第ｘｉｉ因子の製造方法Info
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- JPH06174727A JPH06174727A JP32918092A JP32918092A JPH06174727A JP H06174727 A JPH06174727 A JP H06174727A JP 32918092 A JP32918092 A JP 32918092A JP 32918092 A JP32918092 A JP 32918092A JP H06174727 A JPH06174727 A JP H06174727A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ウシ血漿より工業的規模でＦXIIaを簡便に、
効率よく、再現性をもって回収、精製する製造方法を提
供する。 【構成】 血漿を塩析により分画し精製血漿を得る工程
と、得られた精製血漿を陽イオン交換体とｐＨ７〜９の
条件下で反応させ、ｐＨを４〜７に調節した後、上清を
除去し、次に、０．２〜０．４Ｍの塩濃度条件で溶出を
行ってＦXII ａを含む画分を得る工程と、得られたＦXI
I ａ含有画分を陰イオン交換体にｐＨ７〜９の条件下で
吸着させた後、０．１〜０．４Ｍの塩濃度の条件で溶出
を行って精製ＦXII ａを含む画分を得る工程と、得られ
た精製ＦXII ａ含有画分を、分画分子量１０００〜１０
０万のゲル濾過用担体でゲル濾過により分画し高純度の
ＦXII ａを得る工程からなるウシ活性型血液凝固ＦXII
ａの製造方法である。
効率よく、再現性をもって回収、精製する製造方法を提
供する。 【構成】 血漿を塩析により分画し精製血漿を得る工程
と、得られた精製血漿を陽イオン交換体とｐＨ７〜９の
条件下で反応させ、ｐＨを４〜７に調節した後、上清を
除去し、次に、０．２〜０．４Ｍの塩濃度条件で溶出を
行ってＦXII ａを含む画分を得る工程と、得られたＦXI
I ａ含有画分を陰イオン交換体にｐＨ７〜９の条件下で
吸着させた後、０．１〜０．４Ｍの塩濃度の条件で溶出
を行って精製ＦXII ａを含む画分を得る工程と、得られ
た精製ＦXII ａ含有画分を、分画分子量１０００〜１０
０万のゲル濾過用担体でゲル濾過により分画し高純度の
ＦXII ａを得る工程からなるウシ活性型血液凝固ＦXII
ａの製造方法である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウシ活性型血液凝固第
XII 因子の製造方法に関し、より詳細には、ウシ血漿よ
り工業的規模でＦXIIaを簡便に、効率よく、再現性をも
って回収、精製する製造方法に関する。
XII 因子の製造方法に関し、より詳細には、ウシ血漿よ
り工業的規模でＦXIIaを簡便に、効率よく、再現性をも
って回収、精製する製造方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】血液凝固は、最終的にフィブリンクロッ
トを生じさせる種々の血液成分または因子の複雑な相互
作用からなる過程である。一般に、凝固カスケードと称
される現象に関与する血液成分は、酵素的に不活性なタ
ンパク質であるプロエンザイム（proenzyme ）であり、
これらのタンパク質は、活性化された別の凝固因子の作
用によりタンパク質分解酵素に転換される。こうして転
換された凝固因子は一般に「活性化された因子」と称さ
れる。
トを生じさせる種々の血液成分または因子の複雑な相互
作用からなる過程である。一般に、凝固カスケードと称
される現象に関与する血液成分は、酵素的に不活性なタ
ンパク質であるプロエンザイム（proenzyme ）であり、
これらのタンパク質は、活性化された別の凝固因子の作
用によりタンパク質分解酵素に転換される。こうして転
換された凝固因子は一般に「活性化された因子」と称さ
れる。
【０００３】血液の凝固を助長し、それによって清浄な
止血に関与する２つの独立した系が存在する。これらの
系は各々、「内因系経路」および「外因系経路」と称さ
れる。内因系経路は、血漿中にのみ存在する因子の利用
を介してトロンビンの形成を導く反応を意味する。諸経
路における初期反応現象には凝固第XII 因子（ＦXII)、
凝固第XI因子、高分子キニノーゲンおよびプレカリクレ
インが関与していると言われている。とくにこの現象
は、ＦXII が活性化されてＦXII ａとなることから開始
されていると言われている。また、ＦXII は線溶系や補
体系にも作用することから、これらの機構の解析や活性
測定の試薬として用いられている。
止血に関与する２つの独立した系が存在する。これらの
系は各々、「内因系経路」および「外因系経路」と称さ
れる。内因系経路は、血漿中にのみ存在する因子の利用
を介してトロンビンの形成を導く反応を意味する。諸経
路における初期反応現象には凝固第XII 因子（ＦXII)、
凝固第XI因子、高分子キニノーゲンおよびプレカリクレ
インが関与していると言われている。とくにこの現象
は、ＦXII が活性化されてＦXII ａとなることから開始
されていると言われている。また、ＦXII は線溶系や補
体系にも作用することから、これらの機構の解析や活性
測定の試薬として用いられている。
【０００４】
【従来技術および解決すべき課題】ＦXII を製造する方
法としては、B.A.McMullen & K.Fujikawa(J.Biol.Chem.
260:5328,1985)およびK.Fujikawa & B.A.McMullen(J.Bi
ol.Chem.258:10924,1983）記載の方法がある。これらの
方法によると、新鮮凍結血漿からのＦXII の単離は、硫
安沈澱や陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせ
て行い、次いで、プロテアーゼによってＦXII からＦXI
Iaの消化を行い、さらに高速液体クロマトグラフィーを
含む各種クロマトグラフィーを組み合わせてＦXII を得
ていた。
法としては、B.A.McMullen & K.Fujikawa(J.Biol.Chem.
260:5328,1985)およびK.Fujikawa & B.A.McMullen(J.Bi
ol.Chem.258:10924,1983）記載の方法がある。これらの
方法によると、新鮮凍結血漿からのＦXII の単離は、硫
安沈澱や陰イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせ
て行い、次いで、プロテアーゼによってＦXII からＦXI
Iaの消化を行い、さらに高速液体クロマトグラフィーを
含む各種クロマトグラフィーを組み合わせてＦXII を得
ていた。
【０００５】これらの操作の過程ではプロテアーゼイン
ヒビターを存在させてＦXII の精製を行い、また消化に
は厳密な条件を設定し、かつこれらの数段階の精製操作
においては、高価な試薬の使用や複雑な操作を必要と
し、しかも長い時間がかかっていた。とくに、精製過程
においてカリクレインの分離が困難であった。さらに工
業的規模でＦXIIaを簡便に、効率よく、再現性をもって
回収、精製することができなかった。
ヒビターを存在させてＦXII の精製を行い、また消化に
は厳密な条件を設定し、かつこれらの数段階の精製操作
においては、高価な試薬の使用や複雑な操作を必要と
し、しかも長い時間がかかっていた。とくに、精製過程
においてカリクレインの分離が困難であった。さらに工
業的規模でＦXIIaを簡便に、効率よく、再現性をもって
回収、精製することができなかった。
【０００６】また、モノクロナール抗体を利用した方法
があるが（特公表平４−５０３００６号公報参照）、こ
れは高価な試薬を必要とする上に汎用性に乏しい方法で
ある。
があるが（特公表平４−５０３００６号公報参照）、こ
れは高価な試薬を必要とする上に汎用性に乏しい方法で
ある。
【０００７】本発明者は、上記の点に鑑み、ウシ血漿よ
り工業的規模でＦXIIaを簡便に、効率よく、再現性をも
って回収、精製する製造方法について鋭意研究を重ねた
結果、本発明を完成した。
り工業的規模でＦXIIaを簡便に、効率よく、再現性をも
って回収、精製する製造方法について鋭意研究を重ねた
結果、本発明を完成した。
【０００８】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、以
下を要旨とするものである。
下を要旨とするものである。
【０００９】本発明による方法は、下記の工程からなる
ことを特徴とするウシ活性型血液凝固第XII 因子（ＦXI
I ａ）の製造方法である。
ことを特徴とするウシ活性型血液凝固第XII 因子（ＦXI
I ａ）の製造方法である。
【００１０】第１工程：血漿を塩析により分画し精製血
漿を得る工程、 第２工程：第１工程で得られた精製血漿を陽イオン交換
体とｐＨ７〜９の条件下で反応させ、ｐＨを４〜７に調
節した後、上清を除去し、次に、０．２〜０．４Ｍの塩
濃度条件で溶出を行ってＦXII ａを含む画分を得る工
程、 第３工程：第２工程で得られたＦXII ａ含有画分を陰イ
オン交換体にｐＨ７〜９の条件下で吸着させた後、０．
１〜０．４Ｍの塩濃度の条件で溶出を行って精製ＦXII
ａを含む画分を得る工程、 第４工程：第３工程で得られた精製ＦXII ａ含有画分
を、分画分子量１０００〜１００万のゲル濾過用担体で
ゲル濾過により分画し高純度のＦXII ａを得る工程。
漿を得る工程、 第２工程：第１工程で得られた精製血漿を陽イオン交換
体とｐＨ７〜９の条件下で反応させ、ｐＨを４〜７に調
節した後、上清を除去し、次に、０．２〜０．４Ｍの塩
濃度条件で溶出を行ってＦXII ａを含む画分を得る工
程、 第３工程：第２工程で得られたＦXII ａ含有画分を陰イ
オン交換体にｐＨ７〜９の条件下で吸着させた後、０．
１〜０．４Ｍの塩濃度の条件で溶出を行って精製ＦXII
ａを含む画分を得る工程、 第４工程：第３工程で得られた精製ＦXII ａ含有画分
を、分画分子量１０００〜１００万のゲル濾過用担体で
ゲル濾過により分画し高純度のＦXII ａを得る工程。
【００１１】本発明は、大量のウシ血漿から工業的規模
で試薬用に適する高純度のＦXIIaを得るための製造方法
であって、上記第１工程から第４工程までの工程からな
るものである。
で試薬用に適する高純度のＦXIIaを得るための製造方法
であって、上記第１工程から第４工程までの工程からな
るものである。
【００１２】以下、さらに本発明について各工程ごとに
詳しく説明する。
詳しく説明する。
【００１３】第１工程：血漿を塩析により分画し精製血
漿を得る工程 この工程は、大量の血漿からＦXIIaを精製するに際し、
ＦXII およびＦXIIaを含む成分を抽出するために塩析を
行うものである。使用される塩類としては、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウムなどが例示される。塩の種類は
上記のものに限定されるものではないが、ＦXII および
ＦXIIaを効果的に回収、精製するために、それぞれの添
加量、添加条件などを吟味する必要がある。例えば、硫
酸アンモニウム（ナカライテスク社製）の場合は、血漿
１リットルに対して固形状の硫安１１４ｇを加え、スタ
ーラーにて好ましくは３０分から３時間、より好ましく
は１時間、好ましくは０℃から３０℃、より好ましくは
４℃の温度にて攪拌をした後、遠心分離処理（４０００
回転、２０分）により２０％硫安での沈殿物を取り除く
ため、上清のＦXII およびＦXIIa成分を含む画分を得
る。
漿を得る工程 この工程は、大量の血漿からＦXIIaを精製するに際し、
ＦXII およびＦXIIaを含む成分を抽出するために塩析を
行うものである。使用される塩類としては、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウムなどが例示される。塩の種類は
上記のものに限定されるものではないが、ＦXII および
ＦXIIaを効果的に回収、精製するために、それぞれの添
加量、添加条件などを吟味する必要がある。例えば、硫
酸アンモニウム（ナカライテスク社製）の場合は、血漿
１リットルに対して固形状の硫安１１４ｇを加え、スタ
ーラーにて好ましくは３０分から３時間、より好ましく
は１時間、好ましくは０℃から３０℃、より好ましくは
４℃の温度にて攪拌をした後、遠心分離処理（４０００
回転、２０分）により２０％硫安での沈殿物を取り除く
ため、上清のＦXII およびＦXIIa成分を含む画分を得
る。
【００１４】引き続いて、例えば、上清１リットルに対
して１８９ｇの固形状の硫安を添加し、スターラーにて
好ましくは３０分から３時間、より好ましくは１時間、
好ましくは０℃から３０℃、より好ましくは４℃の温度
にて攪拌をした後、再び遠心分離（４０００回転、２０
分）を行う。分離後、上清を取り除き、ＦXII およびＦ
XIIa成分を含む硫安２０〜５０％の分画の沈渣の画分を
得る。沈渣は、第２工程の前段階に用いる緩衝液で透析
する。
して１８９ｇの固形状の硫安を添加し、スターラーにて
好ましくは３０分から３時間、より好ましくは１時間、
好ましくは０℃から３０℃、より好ましくは４℃の温度
にて攪拌をした後、再び遠心分離（４０００回転、２０
分）を行う。分離後、上清を取り除き、ＦXII およびＦ
XIIa成分を含む硫安２０〜５０％の分画の沈渣の画分を
得る。沈渣は、第２工程の前段階に用いる緩衝液で透析
する。
【００１５】こうして、血漿の塩析によりＦXII および
ＦXIIaを含む精製血漿を含む画分を得る。
ＦXIIaを含む精製血漿を含む画分を得る。
【００１６】第２工程：第１工程で得られた精製血漿を
陽イオン交換体とｐＨ７〜９の条件下で反応させ、ｐＨ
を４〜７に調節した後、上清を除去し、次に、０．２〜
０．４Ｍの塩濃度条件で溶出を行ってＦXII ａを含む画
分を得る工程。
陽イオン交換体とｐＨ７〜９の条件下で反応させ、ｐＨ
を４〜７に調節した後、上清を除去し、次に、０．２〜
０．４Ｍの塩濃度条件で溶出を行ってＦXII ａを含む画
分を得る工程。
【００１７】この工程は、第１工程で得られた精製血漿
中のＦXII を酵素活性のあるＦXIIaに活性化し、さらに
ＦXIIaを精製するものである。
中のＦXII を酵素活性のあるＦXIIaに活性化し、さらに
ＦXIIaを精製するものである。
【００１８】活性化は、精製血漿を陽イオン交換体と接
触させ、反応させることにより行う。使用される陽イオ
ン交換体としては、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ，Ｓｐ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ（ファルマシア社製、ＳＰ：スルホプロ
ピル、ＣＭ：カルボキシメチル）などが例示される。交
換体の種類は上記のものに限定されるものではないが、
ＦXII をＦXIIaに活性化し、これを精製するために、そ
れぞれの添加量、反応条件などを吟味する必要がある。
例えば、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘの場合は、前工程で得
られた精製血漿１リットルに対して膨潤させたＳＰ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ７００ｍｌおよび緩衝液３００ｍｌをｐ
Ｈ７〜９の条件下で混合し、これを上記血漿と反応させ
た後、上清を除去する。この緩衝液としては、ｐＨ７〜
９、好ましくはｐＨ８．０程度のものが用いられる。反
応温度は好ましくは０〜５０℃、より好ましくは３０〜
４０℃である。緩衝液の組成はトリス系、バルビタール
系、グリシン系などいずれでもよいが、好ましくはトリ
ス系で０．０１Ｍ以上、好ましくは０．０５〜０．１Ｍ
のものが用いられる。緩衝液の塩濃度は、塩化ナトリウ
ムであれば、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ、より好ま
しくは０．１５Ｍ程度である。攪拌方法は特に制限はな
いが、好ましくはスターラーによるものがよい。反応時
間は３７℃の場合、好ましくは３０分以上、より好まし
くは約１時間である。
触させ、反応させることにより行う。使用される陽イオ
ン交換体としては、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ，Ｓｐ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ（ファルマシア社製、ＳＰ：スルホプロ
ピル、ＣＭ：カルボキシメチル）などが例示される。交
換体の種類は上記のものに限定されるものではないが、
ＦXII をＦXIIaに活性化し、これを精製するために、そ
れぞれの添加量、反応条件などを吟味する必要がある。
例えば、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘの場合は、前工程で得
られた精製血漿１リットルに対して膨潤させたＳＰ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ７００ｍｌおよび緩衝液３００ｍｌをｐ
Ｈ７〜９の条件下で混合し、これを上記血漿と反応させ
た後、上清を除去する。この緩衝液としては、ｐＨ７〜
９、好ましくはｐＨ８．０程度のものが用いられる。反
応温度は好ましくは０〜５０℃、より好ましくは３０〜
４０℃である。緩衝液の組成はトリス系、バルビタール
系、グリシン系などいずれでもよいが、好ましくはトリ
ス系で０．０１Ｍ以上、好ましくは０．０５〜０．１Ｍ
のものが用いられる。緩衝液の塩濃度は、塩化ナトリウ
ムであれば、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ、より好ま
しくは０．１５Ｍ程度である。攪拌方法は特に制限はな
いが、好ましくはスターラーによるものがよい。反応時
間は３７℃の場合、好ましくは３０分以上、より好まし
くは約１時間である。
【００１９】以上の条件下で反応を行った後、酢酸や塩
酸などの酸の添加によりｐＨを４〜７、より好ましくは
約６．０に調節する。放置後、ＦXIIa含有量の少ない上
清をデカンテーションまたは吸引などの操作で除く。
酸などの酸の添加によりｐＨを４〜７、より好ましくは
約６．０に調節する。放置後、ＦXIIa含有量の少ない上
清をデカンテーションまたは吸引などの操作で除く。
【００２０】次いで、ＦXIIaを含む陽イオン交換体懸濁
液をカラムに移し、洗浄後、緩衝液の塩濃度を高めて、
ＦXIIaを含む画分を溶出させる。この場合、緩衝液とし
ては、好ましくはｐＨ５〜８、より好ましくは約６．０
のものが用いられる。反応温度は好ましくは０〜３０
℃、より好ましくは０〜１５℃である。緩衝液の組成は
トリス系、酢酸系、バルビタール系、グリシン系などい
ずれでもよいが、好ましくは酢酸ナトリウム系で０．０
１Ｍ以上、好ましくは０．０５〜０．１Ｍのものが用い
られる。緩衝液の塩濃度は、塩化ナトリウムであれば、
好ましくは０．０５〜０．２Ｍ、より好ましくは約０．
１０Ｍである。ＦXIIaの溶出する塩化ナトリウム濃度
は、好ましくは０．２〜０．４Ｍである。
液をカラムに移し、洗浄後、緩衝液の塩濃度を高めて、
ＦXIIaを含む画分を溶出させる。この場合、緩衝液とし
ては、好ましくはｐＨ５〜８、より好ましくは約６．０
のものが用いられる。反応温度は好ましくは０〜３０
℃、より好ましくは０〜１５℃である。緩衝液の組成は
トリス系、酢酸系、バルビタール系、グリシン系などい
ずれでもよいが、好ましくは酢酸ナトリウム系で０．０
１Ｍ以上、好ましくは０．０５〜０．１Ｍのものが用い
られる。緩衝液の塩濃度は、塩化ナトリウムであれば、
好ましくは０．０５〜０．２Ｍ、より好ましくは約０．
１０Ｍである。ＦXIIaの溶出する塩化ナトリウム濃度
は、好ましくは０．２〜０．４Ｍである。
【００２１】こうして、ＦXIIaを含む画分を得る。
【００２２】第３工程：第２工程で得られたＦXIIa含有
画分を陰イオン交換体にｐＨ７〜９の条件下で吸着させ
た後、０．１〜０．４Ｍの塩濃度の条件で溶出させてＦ
XIIa含む画分を得る工程。
画分を陰イオン交換体にｐＨ７〜９の条件下で吸着させ
た後、０．１〜０．４Ｍの塩濃度の条件で溶出させてＦ
XIIa含む画分を得る工程。
【００２３】この工程は、第２工程で得られたＦXIIa含
有画分を、陰イオン交換体を用いて処理し、さらにＦXI
Iaを精製するものである。
有画分を、陰イオン交換体を用いて処理し、さらにＦXI
Iaを精製するものである。
【００２４】第２工程で得られたＦXIIaを含む精製画分
をｐＨ６〜１０の緩衝液に対して透析し、次いで予め同
緩衝液で平衡化しておいた陰イオン交換体に吸着させ、
充分な洗浄後、塩濃度を高めてＦXIIaを溶出させる。陰
イオン交換体としては、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチ
ル）基、ＱＡＥ（クオータナライズアミノエチル）基を
有するものが一般的ではあるが、これらに限定するもの
ではない。透析用およびカラム平衡化緩衝液には、０．
０５〜０．１０Ｍ程度の塩化ナトリウムを添加しておい
てもよい。精製ＦXIIaを溶出させる塩濃度は好ましくは
０．１〜０．４Ｍである。
をｐＨ６〜１０の緩衝液に対して透析し、次いで予め同
緩衝液で平衡化しておいた陰イオン交換体に吸着させ、
充分な洗浄後、塩濃度を高めてＦXIIaを溶出させる。陰
イオン交換体としては、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチ
ル）基、ＱＡＥ（クオータナライズアミノエチル）基を
有するものが一般的ではあるが、これらに限定するもの
ではない。透析用およびカラム平衡化緩衝液には、０．
０５〜０．１０Ｍ程度の塩化ナトリウムを添加しておい
てもよい。精製ＦXIIaを溶出させる塩濃度は好ましくは
０．１〜０．４Ｍである。
【００２５】第４工程：第３工程で得られたＦXIIa含有
画分を、分画分子量１０００〜１００万のゲル濾過用担
体でゲル濾過により分画し高純度のＦXIIaを得る工程。
画分を、分画分子量１０００〜１００万のゲル濾過用担
体でゲル濾過により分画し高純度のＦXIIaを得る工程。
【００２６】この工程は第３工程で得られた精製ＦXIIa
含有画分を透析し、濃縮した後、ゲル濾過用担体を用い
てゲル濾過により分画し、高純度のＦXIIaを得る工程で
ある。この場合、ゲル濾過用担体は特に限定されず、分
画分子量１０００〜１００万の可能なゲル濾過用担体で
あればよい。この担体としてはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−
１００、Ｇ−１５０（ファルマシア社製）などが一般的
であるが、これらに限定するものではない。透析用およ
びカラム平衡化用の緩衝液には、０．０５〜０．１０Ｍ
程度の塩化ナトリウムを添加しておいてもよい。緩衝液
の組成はトリス系、酢酸系、バルビタール系、グリシン
系などいずれでもよいが、好ましくはトリス系のものが
用いられる。ｐＨは好ましくは７〜９である。溶出した
ＦXIIaは必要に応じて限界濾過などの濃縮法により濃縮
することができる。
含有画分を透析し、濃縮した後、ゲル濾過用担体を用い
てゲル濾過により分画し、高純度のＦXIIaを得る工程で
ある。この場合、ゲル濾過用担体は特に限定されず、分
画分子量１０００〜１００万の可能なゲル濾過用担体で
あればよい。この担体としてはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−
１００、Ｇ−１５０（ファルマシア社製）などが一般的
であるが、これらに限定するものではない。透析用およ
びカラム平衡化用の緩衝液には、０．０５〜０．１０Ｍ
程度の塩化ナトリウムを添加しておいてもよい。緩衝液
の組成はトリス系、酢酸系、バルビタール系、グリシン
系などいずれでもよいが、好ましくはトリス系のものが
用いられる。ｐＨは好ましくは７〜９である。溶出した
ＦXIIaは必要に応じて限界濾過などの濃縮法により濃縮
することができる。
【００２７】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。
【００２８】実施例１ 第１工程 ６５ｍＭクエン酸、８５ｍＭクエン酸ナトリウム、
２％ブドウ糖を含む３００ｍｌの抗凝固剤液にウシけい
動脈から採取した血液を２．７リットル混合した。次い
で冷却遠心機にて３０００ｒｐｍで２０分間遠心処理を
行い、上清の血漿を採取した。
２％ブドウ糖を含む３００ｍｌの抗凝固剤液にウシけい
動脈から採取した血液を２．７リットル混合した。次い
で冷却遠心機にて３０００ｒｐｍで２０分間遠心処理を
行い、上清の血漿を採取した。
【００２９】 血漿を４℃に放置し、血漿１．７リッ
トルに対して固形硫安を１９４ｇ加え、スターラーにて
１時間攪拌した。次いで、混合物を冷却遠心機にて遠心
処理（４０００ｒｐｍ、３０分間）し、上清をデカンテ
ーションにより採取した。
トルに対して固形硫安を１９４ｇ加え、スターラーにて
１時間攪拌した。次いで、混合物を冷却遠心機にて遠心
処理（４０００ｒｐｍ、３０分間）し、上清をデカンテ
ーションにより採取した。
【００３０】上清の１．５リットルに対して固形硫安を
２８４ｇ添加し、スターラーにて１時間攪拌した。次い
で、混合物を冷却遠心機にて遠心処理（４０００ｒｐ
ｍ、３０分間）し、上清をデカンテーションにより廃棄
した後、残った沈殿物に純水を１リットル加え、これを
溶解した。
２８４ｇ添加し、スターラーにて１時間攪拌した。次い
で、混合物を冷却遠心機にて遠心処理（４０００ｒｐ
ｍ、３０分間）し、上清をデカンテーションにより廃棄
した後、残った沈殿物に純水を１リットル加え、これを
溶解した。
【００３１】 沈殿物溶液を純水２０リットルに対し
て透析した後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０リットルに対
して透析した。得られた抽出液は１５リットルであっ
た。
て透析した後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０リットルに対
して透析した。得られた抽出液は１５リットルであっ
た。
【００３２】第２工程 で得られた液１．５リットルを、０．１５Ｍ塩化
ナトリムウを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）にて平衡化されたＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ１リ
ットルと混合し、３７℃で１時間攪拌しながら反応させ
た。反応時間とＦXIIa活性との関係を図１に示す。反応
終了後、０．５Ｎの塩酸の添加により反応液のｐＨを
５．４とした。
ナトリムウを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）にて平衡化されたＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ１リ
ットルと混合し、３７℃で１時間攪拌しながら反応させ
た。反応時間とＦXIIa活性との関係を図１に示す。反応
終了後、０．５Ｎの塩酸の添加により反応液のｐＨを
５．４とした。
【００３３】 さらに、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ５．４を３リットル加え、４℃にて、スターラー
にて３０分間攪拌した後、１時間静置した。そして、上
清をデカンテーションにて捨てた。得られた陽イオン交
換体懸濁液は１．２リットルあった。
液ｐＨ５．４を３リットル加え、４℃にて、スターラー
にて３０分間攪拌した後、１時間静置した。そして、上
清をデカンテーションにて捨てた。得られた陽イオン交
換体懸濁液は１．２リットルあった。
【００３４】 上記懸濁液をカラムに移した後、０．
０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．４）１０リットルでこれを充分に洗浄し
た。 次いで０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）２リットルと０．４
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．４）を用い、塩濃度勾配によってＦXIIaを含
む画分を溶出した。この溶出パターンを図２に示す。
０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．４）１０リットルでこれを充分に洗浄し
た。 次いで０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．４）２リットルと０．４
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．４）を用い、塩濃度勾配によってＦXIIaを含
む画分を溶出した。この溶出パターンを図２に示す。
【００３５】第３工程 第２工程で得られたＦXIIa活性画分の溶液を０．０
５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．２）にて透析した。次いで同様の緩衝液で予
め平衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ファ
ルマシア社製）カラムに、透析した溶液を給送した。さ
らに、０．１０Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて洗浄した後、０．１０
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．２）と０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、を用いて、塩濃
度勾配による精製ＦXIIaの溶出を行った。
５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．２）にて透析した。次いで同様の緩衝液で予
め平衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ファ
ルマシア社製）カラムに、透析した溶液を給送した。さ
らに、０．１０Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）にて洗浄した後、０．１０
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．２）と０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０
５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）、を用いて、塩濃
度勾配による精製ＦXIIaの溶出を行った。
【００３６】第４工程 ＦXIIa活性の画分を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液にて透析した。次いで、
透析物を限外濾過にて濃縮し、さらに同様の緩衝液にて
平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５０でゲル濾過を
行い、高純度ＦXIIaを分取した。得られたＦXIIaのタン
白量は５．０ｍｇであった。
む０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液にて透析した。次いで、
透析物を限外濾過にて濃縮し、さらに同様の緩衝液にて
平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５０でゲル濾過を
行い、高純度ＦXIIaを分取した。得られたＦXIIaのタン
白量は５．０ｍｇであった。
【００３７】なお、実施例１におけるＦXIIa活性、ＦXI
I 活性、たんぱく定量および純度検定は、それぞれ以下
の方法により行った。
I 活性、たんぱく定量および純度検定は、それぞれ以下
の方法により行った。
【００３８】１．ＦXIIa活性：S.Iwanaga らの方法（KI
NINS-II:Biochemistry, Pathophysilogy and Clinical
Aspects, Edited by S.Fujii and T.Suzuki, Plenum Pu
blishing Co.,1979,pl49) に準拠してBoc-Glu(OBzl) −
Gly-Arg-MCA によるアミダーゼ活性により測定した。
NINS-II:Biochemistry, Pathophysilogy and Clinical
Aspects, Edited by S.Fujii and T.Suzuki, Plenum Pu
blishing Co.,1979,pl49) に準拠してBoc-Glu(OBzl) −
Gly-Arg-MCA によるアミダーゼ活性により測定した。
【００３９】２．ＦXII 活性：J.Griffin らの方法（Me
thod Enzymology Vol.45,Edited by L.Lorand, Academi
c Press, 1979,p56 ）に準拠した凝固活性法にて測定し
た。
thod Enzymology Vol.45,Edited by L.Lorand, Academi
c Press, 1979,p56 ）に準拠した凝固活性法にて測定し
た。
【００４０】３．たんぱく定量：２８０ｎｍの吸収によ
り求めた。
り求めた。
【００４１】４．純度検定 電気泳動法：ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりクマシー・ブリリアントブ
ルー染色にて行った。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりクマシー・ブリリアントブ
ルー染色にて行った。
【００４２】実施例２ 実施例１の第２工程のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘの代わり
にＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘを用い、その他の操作は全て
実施例１と同様に操作を行った。得られたＦXII a のタ
ン白量は５．６ｍｇであった。
にＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘを用い、その他の操作は全て
実施例１と同様に操作を行った。得られたＦXII a のタ
ン白量は５．６ｍｇであった。
【００４３】
【発明の効果】本発明方法によると、ウシ血漿より工業
的規模でＦXIIaを簡便に、効率よく、再現性をもって回
収、精製することができるばかりでなく、試薬として使
用できる高純度のＦXIIaを得ることができる。
的規模でＦXIIaを簡便に、効率よく、再現性をもって回
収、精製することができるばかりでなく、試薬として使
用できる高純度のＦXIIaを得ることができる。
【図１】図１は、実施例１の第２工程で濃縮血漿をＳＰ
−Ｓｅｐｈａｄｅｘにて活性化させた際のデータを示す
グラフである。
−Ｓｅｐｈａｄｅｘにて活性化させた際のデータを示す
グラフである。
【図２】図２は実施例１の第２工程でＦXIIaを精製する
時のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーの溶出
パターンを示すグラフである。
時のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーの溶出
パターンを示すグラフである。
【図３】図３は実施例１の第３工程でＦXIIaを精製する
時のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーの
溶出パターンを示すグラフである。
時のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーの
溶出パターンを示すグラフである。
【図４】図４は実施例２で精製されたＦXIIaのＳＤＳポ
リアクリルアミドゲル電気泳動のパターンを示すグラフ
である。
リアクリルアミドゲル電気泳動のパターンを示すグラフ
である。
Claims (1)
- 【請求項１】 下記の工程からなることを特徴とするウ
シ活性型血液凝固第XII 因子（ＦXII ａ）の製造方法。 第１工程：血漿を塩析により分画し精製血漿を得る工
程、 第２工程：第１工程で得られた精製血漿を陽イオン交換
体とｐＨ７〜９の条件下で反応させ、ｐＨを４〜７に調
節した後、上清を除去し、次に、０．２〜０．４Ｍの塩
濃度条件で溶出を行ってＦXII ａを含む画分を得る工
程、 第３工程：第２工程で得られたＦXII ａ含有画分を陰イ
オン交換体にｐＨ７〜９の条件下で吸着させた後、０．
１〜０．４Ｍの塩濃度の条件で溶出を行って精製ＦXII
ａを含む画分を得る工程、 第４工程：第３工程で得られた精製ＦXII ａ含有画分
を、分画分子量１０００〜１００万のゲル濾過用担体で
ゲル濾過により分画し高純度のＦXII ａを得る工程。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04329180A JP3112757B2 (ja) | 1992-12-09 | 1992-12-09 | 活性型血液凝固第ｘｉｉ因子の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04329180A JP3112757B2 (ja) | 1992-12-09 | 1992-12-09 | 活性型血液凝固第ｘｉｉ因子の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06174727A true JPH06174727A (ja) | 1994-06-24 |
| JP3112757B2 JP3112757B2 (ja) | 2000-11-27 |
Family
ID=18218550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04329180A Expired - Fee Related JP3112757B2 (ja) | 1992-12-09 | 1992-12-09 | 活性型血液凝固第ｘｉｉ因子の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3112757B2 (ja) |
-
1992
- 1992-12-09 JP JP04329180A patent/JP3112757B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3112757B2 (ja) | 2000-11-27 |
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Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070922 Year of fee payment: 7 |
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