JPH10150980A - プロトロンビンの精製方法 - Google Patents
プロトロンビンの精製方法Info
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- JPH10150980A JPH10150980A JP8326140A JP32614096A JPH10150980A JP H10150980 A JPH10150980 A JP H10150980A JP 8326140 A JP8326140 A JP 8326140A JP 32614096 A JP32614096 A JP 32614096A JP H10150980 A JPH10150980 A JP H10150980A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 プロトロンビンの精製において、特殊な材料
を必要とせず、原料となるプロトロンビン含有溶液から
プロトロンビンを高純度に精製する方法を提供する。 【構成】 プロトロンビンを含有する溶液を陰イオン交
換樹脂に展開しプロトロンビンを吸着させ、カルシウム
塩を含有する緩衝液により溶出すること、とりわけ、陰
イオン交換樹脂へのプロトロンビンの吸着がカルシウム
塩により強力に阻害される現象を利用することを特徴と
する。 【効果】 得られるプロトロンビンは、セリンプロテア
ーゼ阻害活性が除かれており、効率よくトロンビンへと
活性化される。この方法は、工業的規模でのプロトロン
ビン及び/もしくはトロンビンの製造に適用可能であ
る。
を必要とせず、原料となるプロトロンビン含有溶液から
プロトロンビンを高純度に精製する方法を提供する。 【構成】 プロトロンビンを含有する溶液を陰イオン交
換樹脂に展開しプロトロンビンを吸着させ、カルシウム
塩を含有する緩衝液により溶出すること、とりわけ、陰
イオン交換樹脂へのプロトロンビンの吸着がカルシウム
塩により強力に阻害される現象を利用することを特徴と
する。 【効果】 得られるプロトロンビンは、セリンプロテア
ーゼ阻害活性が除かれており、効率よくトロンビンへと
活性化される。この方法は、工業的規模でのプロトロン
ビン及び/もしくはトロンビンの製造に適用可能であ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本願発明は、プロトロンビン（血
液凝固第II因子と称することもある）の精製方法に関す
る。より詳細には、工業的規模でプロトロンビンを得る
際、または、さらに該プロトロンビンからトロンビンを
得ることを目的とする際に、陰イオン交換樹脂へのプロ
トロンビンの吸着をカルシウム塩により阻害することで
プロトロンビンを精製する方法に関する。
液凝固第II因子と称することもある）の精製方法に関す
る。より詳細には、工業的規模でプロトロンビンを得る
際、または、さらに該プロトロンビンからトロンビンを
得ることを目的とする際に、陰イオン交換樹脂へのプロ
トロンビンの吸着をカルシウム塩により阻害することで
プロトロンビンを精製する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】プロ
トロンビンは、分子量約７２,０００のセリンプロテア
ーゼ前駆体であり、血液凝固反応において活性化第Ｘ因
子により活性化されトロンビンに変換される。トロンビ
ンは約３７,０００の分子量を有するセリンプロテアー
ゼであって、血液凝固反応の最終段階で働くタンパク質
分解酵素である。トロンビンは、フィブリノゲンに作用
してフィブリンを生成することにより血液を凝固させ
る。従って、トロンビンは外科領域における局所止血剤
として、また、内科領域における上部消化管出血などの
止血剤として、臨床的に用いられている。また、組織接
着剤（フィブリン接着剤）の１成分としても応用されて
いる。
トロンビンは、分子量約７２,０００のセリンプロテア
ーゼ前駆体であり、血液凝固反応において活性化第Ｘ因
子により活性化されトロンビンに変換される。トロンビ
ンは約３７,０００の分子量を有するセリンプロテアー
ゼであって、血液凝固反応の最終段階で働くタンパク質
分解酵素である。トロンビンは、フィブリノゲンに作用
してフィブリンを生成することにより血液を凝固させ
る。従って、トロンビンは外科領域における局所止血剤
として、また、内科領域における上部消化管出血などの
止血剤として、臨床的に用いられている。また、組織接
着剤（フィブリン接着剤）の１成分としても応用されて
いる。
【０００３】トロンビンの製造では、ヒトおよびウシな
どの血漿を原料として、まず、プロトロンビンが抽出、
精製される。その後、プロトロンビン画分は、好適な活
性化方法によりトロンビンへと変換され得る。この際用
いられるプロトロンビン画分は、プロトロンビン複合体
に代表されるプロトロンビンを主成分とし活性化反応に
寄与する血液凝固第Ｘ因子等を含有するものであるが、
活性化反応後に各種の数工程を経て精製されたトロンビ
ンの比活性は、活性化反応に供せられたプロトロンビン
の純度に依存することが知られていた。すなわち、トロ
ンビンへの転化は、精製度の高いプロトロンビンを対象
とすることが有利であることが明らかにされていた。
どの血漿を原料として、まず、プロトロンビンが抽出、
精製される。その後、プロトロンビン画分は、好適な活
性化方法によりトロンビンへと変換され得る。この際用
いられるプロトロンビン画分は、プロトロンビン複合体
に代表されるプロトロンビンを主成分とし活性化反応に
寄与する血液凝固第Ｘ因子等を含有するものであるが、
活性化反応後に各種の数工程を経て精製されたトロンビ
ンの比活性は、活性化反応に供せられたプロトロンビン
の純度に依存することが知られていた。すなわち、トロ
ンビンへの転化は、精製度の高いプロトロンビンを対象
とすることが有利であることが明らかにされていた。
【０００４】プロトロンビンの従来技術に基づく精製方
法としては、日本国公開特許公報（特開平３-128398
号）などに開示されている。この方法は、具体的には、
血漿からクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿を
陰イオン交換体で処理して塩化ナトリウム溶出によりプ
ロトロンビンを調製する方法である。しかしながら、か
くして得られたプロトロンビン画分中のプロトロンビン
の純度は、満足され得る純度ではない。また、従来の陰
イオン交換体処理で得られたプロトロンビン中には、不
純夾雑タンパク質としてセリンプロテアーゼの阻害活性
を示す物質が存在しており、これがプロトロンビンから
トロンビンへの活性化に際して反応を阻害するととも
に、生成したトロンビンを阻害しトロンビンの出来高を
減少させる原因ともなっていた。また、研究材料として
プロトロンビンを高純度に精製することは可能である
が、それらの方法は工業的規模でのプロトロンビンの精
製には適用できない。
法としては、日本国公開特許公報（特開平３-128398
号）などに開示されている。この方法は、具体的には、
血漿からクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿を
陰イオン交換体で処理して塩化ナトリウム溶出によりプ
ロトロンビンを調製する方法である。しかしながら、か
くして得られたプロトロンビン画分中のプロトロンビン
の純度は、満足され得る純度ではない。また、従来の陰
イオン交換体処理で得られたプロトロンビン中には、不
純夾雑タンパク質としてセリンプロテアーゼの阻害活性
を示す物質が存在しており、これがプロトロンビンから
トロンビンへの活性化に際して反応を阻害するととも
に、生成したトロンビンを阻害しトロンビンの出来高を
減少させる原因ともなっていた。また、研究材料として
プロトロンビンを高純度に精製することは可能である
が、それらの方法は工業的規模でのプロトロンビンの精
製には適用できない。
【０００５】このような状況下、本願発明の課題は、プ
ロトロンビンの工業的規模での効率的精製方法を確立す
ることである。すなわち、本願発明の目的は、工業的規
模でプロトロンビンを得る際、もしくはそのプロトロン
ビンからさらに比活性の高いトロンビンを得る際に、簡
便かつ効率的にプロトロンビンをクロマトグラフィー精
製する方法を提供することにある。
ロトロンビンの工業的規模での効率的精製方法を確立す
ることである。すなわち、本願発明の目的は、工業的規
模でプロトロンビンを得る際、もしくはそのプロトロン
ビンからさらに比活性の高いトロンビンを得る際に、簡
便かつ効率的にプロトロンビンをクロマトグラフィー精
製する方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本願発明者等は
上述の諸問題に鑑み鋭意検討した結果、効率的なプロト
ロンビンの精製方法および該精製方法に基づくプロトロ
ンビンの製造方法に関する本願発明を完成した。以下、
本願発明をさらに詳細に説明する。本願発明の骨子は、
陰イオン交換樹脂へのプロトロンビンの吸着がカルシウ
ム塩により強力に阻害される現象を利用することを特徴
としたプロトロンビンの精製方法であり、本願発明のプ
ロトロンビンの精製方法は、プロトロンビンの有するカ
ルシウムイオン結合特性に基づく。すなわち、プロトロ
ンビンを含有する溶液を陰イオン交換樹脂に展開しプロ
トロンビンを吸着させ、カルシウム塩を含有する緩衝液
によりプロトロンビンを溶出する。あるいは、プロトロ
ンビンを含有する溶液のイオン強度を、カルシウム塩が
存在しない状態ではプロトロンビンが陰イオン交換樹脂
に吸着し得るイオン強度、例えば、塩化ナトリウム濃度
換算で０.２Ｍ以下の濃度とし、さらにカルシウム塩を
含有する組成に調整し、その後該陰イオン交換樹脂に展
開することによってプロトロンビンを素通りさせ、所望
のプロトロンビンを得る。さらに本願発明者らは、かか
る方法で得られたプロトロンビンが、トリプシン阻害活
性に代表されるセリンプロテアーゼの阻害活性を全く有
さず、トロンビンに変換される原料として極めて有利で
あり、かつ、結果として比活性の高いトロンビンが簡便
に製造できることを見出した。
上述の諸問題に鑑み鋭意検討した結果、効率的なプロト
ロンビンの精製方法および該精製方法に基づくプロトロ
ンビンの製造方法に関する本願発明を完成した。以下、
本願発明をさらに詳細に説明する。本願発明の骨子は、
陰イオン交換樹脂へのプロトロンビンの吸着がカルシウ
ム塩により強力に阻害される現象を利用することを特徴
としたプロトロンビンの精製方法であり、本願発明のプ
ロトロンビンの精製方法は、プロトロンビンの有するカ
ルシウムイオン結合特性に基づく。すなわち、プロトロ
ンビンを含有する溶液を陰イオン交換樹脂に展開しプロ
トロンビンを吸着させ、カルシウム塩を含有する緩衝液
によりプロトロンビンを溶出する。あるいは、プロトロ
ンビンを含有する溶液のイオン強度を、カルシウム塩が
存在しない状態ではプロトロンビンが陰イオン交換樹脂
に吸着し得るイオン強度、例えば、塩化ナトリウム濃度
換算で０.２Ｍ以下の濃度とし、さらにカルシウム塩を
含有する組成に調整し、その後該陰イオン交換樹脂に展
開することによってプロトロンビンを素通りさせ、所望
のプロトロンビンを得る。さらに本願発明者らは、かか
る方法で得られたプロトロンビンが、トリプシン阻害活
性に代表されるセリンプロテアーゼの阻害活性を全く有
さず、トロンビンに変換される原料として極めて有利で
あり、かつ、結果として比活性の高いトロンビンが簡便
に製造できることを見出した。
【０００７】本願発明の方法において、プロトロンビン
の出発原料となる対象物は、「血漿」または「血漿から
クリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿」である。
血漿の由来は特に問わず、例えば、ウシ由来のもの、ヒ
ト由来のもの等が挙げられるが、好ましくはヒト由来の
ものである。これらの対象物は、直接、またはプロトロ
ンビン複合体の回収工程である陰イオン交換体吸着、日
本国公開特許公報（特願昭45-50358号）記載のＰＥＧ分
画、およびその他の粗分画方法のいずれかもしくはそれ
らを組合せた方法を経た後、本願発明の陰イオン交換体
処理に付される。ここで用いられるプロトロンビン複合
体は、プロトロンビンとともにその他の血液凝固に関係
する因子を含んだものである。プロトロンビンとともに
含まれる成分としては、血液凝固第VII因子、第IX因
子、第Ｘ因子などが挙げられる。
の出発原料となる対象物は、「血漿」または「血漿から
クリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿」である。
血漿の由来は特に問わず、例えば、ウシ由来のもの、ヒ
ト由来のもの等が挙げられるが、好ましくはヒト由来の
ものである。これらの対象物は、直接、またはプロトロ
ンビン複合体の回収工程である陰イオン交換体吸着、日
本国公開特許公報（特願昭45-50358号）記載のＰＥＧ分
画、およびその他の粗分画方法のいずれかもしくはそれ
らを組合せた方法を経た後、本願発明の陰イオン交換体
処理に付される。ここで用いられるプロトロンビン複合
体は、プロトロンビンとともにその他の血液凝固に関係
する因子を含んだものである。プロトロンビンとともに
含まれる成分としては、血液凝固第VII因子、第IX因
子、第Ｘ因子などが挙げられる。
【０００８】本願発明で用いられる陰イオン交換樹脂
は、特に限定されるものではないが、好適にはファルマ
シア社製のＤＥＡＥセファロースファストフロー（DEAE
-Sepharose FF）およびＱセファロースファストフロー
（Q-Sepharose FF）等が使用される。陰イオン交換樹脂
へのプロトロンビンの吸着を阻害するカルシウム塩とし
ては、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシ
ウム等が例示される。カルシウム塩の濃度は１００ｍＭ
以下であるが、プロトロンビンとトリプシン阻害活性を
有する物質との分離能を高めるには１〜２０ｍＭ程度が
好ましい。本願発明の精製方法により得られた高純度プ
ロトロンビンは、トロンビンへの変換処理に付される。
変換処理としては、「カルシウム塩の存在下にトロンボ
プラスチンを作用させる方法」（Ｔhromb. Ｈaemost.,v
ol.42,p.972-982,1979）、「蛇毒を作用させる方法」
（Ｊ. Ｂiochem.(Tokyo),vol.83,p.559-570,1978）、
「高濃度クエン酸塩による自然転化法」（日本国公開特
許公報、特開平４-365481号、特開平５-194261号）など
の公知の方法に加え、本願発明に先立ち本願発明者らが
明らかにした「カルシウム塩の存在下にＰＥＧを作用さ
せる方法」（特願平８-227695号）を用いることができ
るが、「カルシウム塩の存在下にＰＥＧを作用させる方
法」は特に好ましい。トロンビンへの変換処理により得
られた処理物は、次にトロンビンの精製工程に付され
る。かかる精製方法としては、陽イオン交換体処理が例
示されるが、他の公知の方法によりさらに精製すること
もできる。
は、特に限定されるものではないが、好適にはファルマ
シア社製のＤＥＡＥセファロースファストフロー（DEAE
-Sepharose FF）およびＱセファロースファストフロー
（Q-Sepharose FF）等が使用される。陰イオン交換樹脂
へのプロトロンビンの吸着を阻害するカルシウム塩とし
ては、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、酢酸カルシ
ウム等が例示される。カルシウム塩の濃度は１００ｍＭ
以下であるが、プロトロンビンとトリプシン阻害活性を
有する物質との分離能を高めるには１〜２０ｍＭ程度が
好ましい。本願発明の精製方法により得られた高純度プ
ロトロンビンは、トロンビンへの変換処理に付される。
変換処理としては、「カルシウム塩の存在下にトロンボ
プラスチンを作用させる方法」（Ｔhromb. Ｈaemost.,v
ol.42,p.972-982,1979）、「蛇毒を作用させる方法」
（Ｊ. Ｂiochem.(Tokyo),vol.83,p.559-570,1978）、
「高濃度クエン酸塩による自然転化法」（日本国公開特
許公報、特開平４-365481号、特開平５-194261号）など
の公知の方法に加え、本願発明に先立ち本願発明者らが
明らかにした「カルシウム塩の存在下にＰＥＧを作用さ
せる方法」（特願平８-227695号）を用いることができ
るが、「カルシウム塩の存在下にＰＥＧを作用させる方
法」は特に好ましい。トロンビンへの変換処理により得
られた処理物は、次にトロンビンの精製工程に付され
る。かかる精製方法としては、陽イオン交換体処理が例
示されるが、他の公知の方法によりさらに精製すること
もできる。
【０００９】精製工程を経て得られたトロンビンの比活
性は、１,０００ＮＩＨ単位／Ａ280以上となることが好
ましい。ここで、ＮＩＨ単位とは日本薬局方に定めるト
ロンビンの単位に相当し、Ａ280は波長280nmにおけるタ
ンパク質溶液の吸光度を意味する。当該トロンビンは、
自体公知の手法により高比活性を有するトロンビン製剤
とすることができる。この際、必要に応じて、医薬上許
容される担体、添加剤などの添加、および除菌濾過、分
注、凍結乾燥、加熱などが通常の方法に準じて行なわれ
る。
性は、１,０００ＮＩＨ単位／Ａ280以上となることが好
ましい。ここで、ＮＩＨ単位とは日本薬局方に定めるト
ロンビンの単位に相当し、Ａ280は波長280nmにおけるタ
ンパク質溶液の吸光度を意味する。当該トロンビンは、
自体公知の手法により高比活性を有するトロンビン製剤
とすることができる。この際、必要に応じて、医薬上許
容される担体、添加剤などの添加、および除菌濾過、分
注、凍結乾燥、加熱などが通常の方法に準じて行なわれ
る。
【００１０】
【発明の効果】本願発明により、陰イオン交換樹脂とい
う汎用ゲル担体を用い、プロトロンビンが高純度に工業
的規模で精製され、さらにトロンビンへの活性化反応を
阻害するセリンプロテアーゼ阻害活性をプロトロンビン
から除去することも可能となる。さらに、本願発明の精
製方法で得られたプロトロンビンは、効率よくトロンビ
ンへと活性化される。本願発明によれば、「工業的規模
でプロトロンビン及び/もしくはトロンビンを得る際
に、特殊な材料を必要とせず、原料となるプロトロンビ
ン含有溶液からプロトロンビンを高純度に精製する」と
いう目的を達することができる。以下に、実施例並びに
比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本願発明
はこれらの例に何等限定されるものではない。
う汎用ゲル担体を用い、プロトロンビンが高純度に工業
的規模で精製され、さらにトロンビンへの活性化反応を
阻害するセリンプロテアーゼ阻害活性をプロトロンビン
から除去することも可能となる。さらに、本願発明の精
製方法で得られたプロトロンビンは、効率よくトロンビ
ンへと活性化される。本願発明によれば、「工業的規模
でプロトロンビン及び/もしくはトロンビンを得る際
に、特殊な材料を必要とせず、原料となるプロトロンビ
ン含有溶液からプロトロンビンを高純度に精製する」と
いう目的を達することができる。以下に、実施例並びに
比較例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本願発明
はこれらの例に何等限定されるものではない。
【００１１】
【実施例】実施例の記述に先立ち、本願発明において使
用されるプロトロンビン活性、トリプシン阻害活性、お
よびトロンビン活性の測定方法について概説する。 1) プロトロンビン活性 プロトロンビン活性は、プロトロンビンをエカリン（蛇
毒）で活性化しトロンビンに変換した後、トロンビンに
対する特異的合成基質Ｓ-２２３８（第一化学薬品）の
分解量を測定することにより求めた（血液と脈管、第１
２巻、第１号、第１４４-１５１ページ、１９８１年の
記載に準拠）。検体と同様に処理された正常人血漿（正
常人血漿１ｍｌ中にはプロトロンビン１血漿単位が含ま
れる）から検量線が作成され、プロトロンビン活性値は
“血漿単位／ｍｌ”で表された。
用されるプロトロンビン活性、トリプシン阻害活性、お
よびトロンビン活性の測定方法について概説する。 1) プロトロンビン活性 プロトロンビン活性は、プロトロンビンをエカリン（蛇
毒）で活性化しトロンビンに変換した後、トロンビンに
対する特異的合成基質Ｓ-２２３８（第一化学薬品）の
分解量を測定することにより求めた（血液と脈管、第１
２巻、第１号、第１４４-１５１ページ、１９８１年の
記載に準拠）。検体と同様に処理された正常人血漿（正
常人血漿１ｍｌ中にはプロトロンビン１血漿単位が含ま
れる）から検量線が作成され、プロトロンビン活性値は
“血漿単位／ｍｌ”で表された。
【００１２】2) トリプシン阻害活性 トリプシン阻害活性は、参考文献（Ｍethods in Ｅnzym
ology,vol.80,p.754-765,1981）に記載の方法に準拠し
て測定された。トリプシンが発色基質（Nα-Benzoyl-DL
-Arginine p-Nitroanilide: BAPNA）を分解すると４０
５ｎｍでの吸光度の上昇が測定される。トリプシンの阻
害活性を有するアプロチニンは、濃度依存的にこの吸光
度変化を減少させる。一定のアプロチニン濃度域では、
「アプロチニン濃度」と「１分間の吸光度変化（ΔＡ40
5／ｍｉｎ）」が直線関係を示す。これを検量線として
用い検体のトリプシン阻害能を調べることにより、検体
中のトリプシン阻害活性はアプロチニン活性相当値とし
て“ＫＩＥ／ｍｌ”で表された。
ology,vol.80,p.754-765,1981）に記載の方法に準拠し
て測定された。トリプシンが発色基質（Nα-Benzoyl-DL
-Arginine p-Nitroanilide: BAPNA）を分解すると４０
５ｎｍでの吸光度の上昇が測定される。トリプシンの阻
害活性を有するアプロチニンは、濃度依存的にこの吸光
度変化を減少させる。一定のアプロチニン濃度域では、
「アプロチニン濃度」と「１分間の吸光度変化（ΔＡ40
5／ｍｉｎ）」が直線関係を示す。これを検量線として
用い検体のトリプシン阻害能を調べることにより、検体
中のトリプシン阻害活性はアプロチニン活性相当値とし
て“ＫＩＥ／ｍｌ”で表された。
【００１３】3) トロンビン活性 トロンビン活性は、日本薬局方に記載のフィブリノゲン
凝固時間測定法に準拠して測定された（ＮＩＨ単位）。
さらに、プロトロンビン１血漿単位当たり得られたトロ
ンビン活性を活性化率として“ＮＩＨ単位／プロトロン
ビン１血漿単位”で表した。
凝固時間測定法に準拠して測定された（ＮＩＨ単位）。
さらに、プロトロンビン１血漿単位当たり得られたトロ
ンビン活性を活性化率として“ＮＩＨ単位／プロトロン
ビン１血漿単位”で表した。
【００１４】実施例１ ヒト血漿から得た脱クリオ血漿を、陰イオン交換樹脂に
吸着させた。プロトロンビン複合体を、０.７Ｍ塩化ナ
トリウムを含む緩衝液（ｐＨ７.０）で溶出・回収し、
１０％ポリエチレングリコール４,０００（ＰＥＧ４,０
００）に不溶な物質を除去するＰＥＧ分画によりプロト
ロンビン複合体を粗精製した。
吸着させた。プロトロンビン複合体を、０.７Ｍ塩化ナ
トリウムを含む緩衝液（ｐＨ７.０）で溶出・回収し、
１０％ポリエチレングリコール４,０００（ＰＥＧ４,０
００）に不溶な物質を除去するＰＥＧ分画によりプロト
ロンビン複合体を粗精製した。
【００１５】比較例１ 実施例１で得られたプロトロンビン複合体を、２５ｍＭ
Ｎａ3citrate（ｐＨ６.０）緩衝液に対して透析し、同
緩衝液で平衡化したＱ-Sepharose FFカラムに吸着させ
た後洗浄し、非結合のタンパク質を除去した。プロトロ
ンビンを含有する画分を、２５ｍＭ Ｎａ3citrate（ｐ
Ｈ６.０）緩衝液中で０〜１.０ＭのＮａＣｌ濃度勾配を
直線的に負荷することにより溶出した。Ａ280値で示さ
れる総タンパク質の溶出パターン、プロトロンビンの溶
出パターン、およびＮａＣｌ濃度勾配は、図１に示した
通りである。プロトロンビンは陰イオン交換樹脂への吸
着特性の高い夾雑タンパク質とともに１つのメインピー
クとして溶出され、クロマト工程による精製効率は高く
なかった。
Ｎａ3citrate（ｐＨ６.０）緩衝液に対して透析し、同
緩衝液で平衡化したＱ-Sepharose FFカラムに吸着させ
た後洗浄し、非結合のタンパク質を除去した。プロトロ
ンビンを含有する画分を、２５ｍＭ Ｎａ3citrate（ｐ
Ｈ６.０）緩衝液中で０〜１.０ＭのＮａＣｌ濃度勾配を
直線的に負荷することにより溶出した。Ａ280値で示さ
れる総タンパク質の溶出パターン、プロトロンビンの溶
出パターン、およびＮａＣｌ濃度勾配は、図１に示した
通りである。プロトロンビンは陰イオン交換樹脂への吸
着特性の高い夾雑タンパク質とともに１つのメインピー
クとして溶出され、クロマト工程による精製効率は高く
なかった。
【００１６】比較例２ 実施例１で得られたプロトロンビン複合体を、２５ｍＭ
Ｎａ3citrate ０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６.０）の緩衝
液に対して透析し、同緩衝液で平衡化したＱ-Sepharose
FF カラムに吸着させた後洗浄し、非結合のタンパク質
を除去した。カラム内の緩衝液を２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ
／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.５）に置換した後、プロ
トロンビンを含有する画分を２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ／
０.５ＭＮａＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液で溶出した。カ
ラムクロマトグラフィーでのプロトロンビンの回収率、
得られたプロトロンビンの純度（比活性）、および得ら
れたプロトロンビン画分中に存在するトリプシン阻害活
性値は、表１に示した通りである。
Ｎａ3citrate ０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６.０）の緩衝
液に対して透析し、同緩衝液で平衡化したＱ-Sepharose
FF カラムに吸着させた後洗浄し、非結合のタンパク質
を除去した。カラム内の緩衝液を２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ
／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.５）に置換した後、プロ
トロンビンを含有する画分を２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ／
０.５ＭＮａＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液で溶出した。カ
ラムクロマトグラフィーでのプロトロンビンの回収率、
得られたプロトロンビンの純度（比活性）、および得ら
れたプロトロンビン画分中に存在するトリプシン阻害活
性値は、表１に示した通りである。
【００１７】
【表１】
【００１８】実施例２ 実施例１で得られたプロトロンビン複合体を、２５ｍＭ
Ｎａ3citrate／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６.０）の緩衝
液に対して透析し、同緩衝液で平衡化したＱ-Sepharose
FF カラムに吸着させた後洗浄し、非結合のタンパク質
を除去した。カラム内の緩衝液を２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ
／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液に置換した
後、プロトロンビンを含有する画分を、 ２０ｍＭ Tris
-ＨＣｌ／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液中で
０〜０.１ＭのＣａＣｌ2濃度勾配を直線的に負荷するこ
とにより溶出した。Ａ280値で示される総タンパク質の
溶出パターン、プロトロンビンの溶出パターン、および
ＣａＣｌ2濃度勾配は、図２に示した通りである。プロ
トロンビンは低濃度の塩化カルシウムにより溶出され、
陰イオン交換樹脂への吸着特性の高い夾雑タンパク質と
分離された。このクロマト工程による精製効率は、比較
例１に比べ極めて高かった。
Ｎａ3citrate／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６.０）の緩衝
液に対して透析し、同緩衝液で平衡化したＱ-Sepharose
FF カラムに吸着させた後洗浄し、非結合のタンパク質
を除去した。カラム内の緩衝液を２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ
／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液に置換した
後、プロトロンビンを含有する画分を、 ２０ｍＭ Tris
-ＨＣｌ／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液中で
０〜０.１ＭのＣａＣｌ2濃度勾配を直線的に負荷するこ
とにより溶出した。Ａ280値で示される総タンパク質の
溶出パターン、プロトロンビンの溶出パターン、および
ＣａＣｌ2濃度勾配は、図２に示した通りである。プロ
トロンビンは低濃度の塩化カルシウムにより溶出され、
陰イオン交換樹脂への吸着特性の高い夾雑タンパク質と
分離された。このクロマト工程による精製効率は、比較
例１に比べ極めて高かった。
【００１９】実施例３ 実施例１で得られたプロトロンビン複合体を、２５ｍＭ
Ｎａ3citrate／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６.０）の緩衝
液に対して透析し、同緩衝液で平衡化したＱ-Sepharose
FF カラムに吸着させた後洗浄し、非結合のタンパク質
を除去した。カラム内の緩衝液を２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ
／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液に置換した
後、プロトロンビンを含有する画分を２０ｍＭ Tris-Ｈ
Ｃｌ／０.２ＭＮａＣｌ／１０ｍＭ ＣａＣｌ2（ｐＨ７.
５）で溶出した。カラムクロマトグラフィーでのプロト
ロンビンの回収率、得られたプロトロンビンの純度（比
活性）、および得られたプロトロンビン画分中に存在す
るトリプシン阻害活性値は、表２に示した通りである。
比較例２の結果を示す表１との対比で明らかなように、
本願発明に基づく精製方法により、従来法より顕著に純
度の向上したプロトロンビンが得られ、トリプシン阻害
活性を測定限界以下まで除くことも可能であった。
Ｎａ3citrate／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ６.０）の緩衝
液に対して透析し、同緩衝液で平衡化したＱ-Sepharose
FF カラムに吸着させた後洗浄し、非結合のタンパク質
を除去した。カラム内の緩衝液を２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ
／０.２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.５）の緩衝液に置換した
後、プロトロンビンを含有する画分を２０ｍＭ Tris-Ｈ
Ｃｌ／０.２ＭＮａＣｌ／１０ｍＭ ＣａＣｌ2（ｐＨ７.
５）で溶出した。カラムクロマトグラフィーでのプロト
ロンビンの回収率、得られたプロトロンビンの純度（比
活性）、および得られたプロトロンビン画分中に存在す
るトリプシン阻害活性値は、表２に示した通りである。
比較例２の結果を示す表１との対比で明らかなように、
本願発明に基づく精製方法により、従来法より顕著に純
度の向上したプロトロンビンが得られ、トリプシン阻害
活性を測定限界以下まで除くことも可能であった。
【００２０】
【表２】
【００２１】実施例４ 実施例３に従って調製したプロトロンビン（第Ｘ因子を
含む）を限外濾過膜を用いて濃縮し、塩化カルシウム、
ＰＥＧ４,０００およびグリセロールを、それぞれ終濃
度５ｍＭ、１４％および２０％で添加して、２５℃にお
いて７日間処理した。得られたトロンビンは、活性化率
８８.４（ＮＩＨ単位／プロトロンビン１血漿単位）を
示し、比活性は５２９ＮＩＨ単位／Ａ280であった。
含む）を限外濾過膜を用いて濃縮し、塩化カルシウム、
ＰＥＧ４,０００およびグリセロールを、それぞれ終濃
度５ｍＭ、１４％および２０％で添加して、２５℃にお
いて７日間処理した。得られたトロンビンは、活性化率
８８.４（ＮＩＨ単位／プロトロンビン１血漿単位）を
示し、比活性は５２９ＮＩＨ単位／Ａ280であった。
【００２２】実施例５ 実施例４で得られたトロンビンを、２０ｍＭ Tris-ＨＣ
ｌ／０.１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８.０）の緩衝液で平衡
化したSP-TOYOPEARLに吸着させた後洗浄し、非結合のタ
ンパク質を除去した。トロンビン画分を、２０ｍＭ Ｎ
ａ3citrate／１.０Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.０）の緩衝液
で溶出し、濃縮し、透析濾過し、凍結乾燥および乾燥加
熱処理を施した。得られたトロンビンの比活性は、１,
１００ＮＩＨ単位／Ａ280であった。
ｌ／０.１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８.０）の緩衝液で平衡
化したSP-TOYOPEARLに吸着させた後洗浄し、非結合のタ
ンパク質を除去した。トロンビン画分を、２０ｍＭ Ｎ
ａ3citrate／１.０Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.０）の緩衝液
で溶出し、濃縮し、透析濾過し、凍結乾燥および乾燥加
熱処理を施した。得られたトロンビンの比活性は、１,
１００ＮＩＨ単位／Ａ280であった。
【図１】 Ｑ-Sepharose FF カラムから塩化ナトリウム
濃度勾配によりプロトロンビンを溶出した際の溶出パタ
ーンを示す図である。
濃度勾配によりプロトロンビンを溶出した際の溶出パタ
ーンを示す図である。
【図２】 Ｑ-Sepharose FF カラムから０.２Ｍの塩化
ナトリウム存在下に塩化カルシウム濃度勾配を負荷する
ことによりプロトロンビンを溶出した際の溶出パターン
を示す図である。
ナトリウム存在下に塩化カルシウム濃度勾配を負荷する
ことによりプロトロンビンを溶出した際の溶出パターン
を示す図である。
Claims (11)
- 【請求項１】 プロトロンビン（血液凝固第II因子と称
することもある）を含有する溶液を陰イオン交換樹脂に
展開しプロトロンビンを吸着させ、カルシウム塩を含有
する緩衝液によりプロトロンビンを溶出することを特徴
とする、プロトロンビンの精製方法。 - 【請求項２】 前記カルシウム塩の濃度が１００ｍＭ以
下である請求項１に記載のプロトロンビンの精製方法。 - 【請求項３】 上記カルシウム塩の濃度が１〜２０ｍＭ
である請求項２に記載のプロトロンビンの精製方法。 - 【請求項４】 上記カルシウム塩が、塩化カルシウム、
水酸化カルシウムおよび酢酸カルシウムより選択される
請求項１から請求項３のいずれかに記載のプロトロンビ
ンの精製方法。 - 【請求項５】 プロトロンビンを含有する溶液のイオン
強度を、カルシウム塩が存在しない状態ではプロトロン
ビンが陰イオン交換樹脂に吸着し得るイオン強度とし、
さらにカルシウム塩を含有する組成に調整し、その後該
陰イオン交換樹脂に展開することによってプロトロンビ
ンを素通りさせることを特徴とする、プロトロンビンの
精製方法。 - 【請求項６】 前記カルシウム塩が存在しない状態での
プロトロンビンを含有する溶液のイオン強度が、塩化ナ
トリウム濃度換算で０.２Ｍ以下である請求項５記載の
プロトロンビンの精製方法。 - 【請求項７】 上記カルシウム塩の濃度が１００ｍＭ以
下である請求項５または請求項６のいずれかに記載のプ
ロトロンビンの精製方法。 - 【請求項８】 上記カルシウム塩の濃度が１〜２０ｍＭ
である請求項７に記載のプロトロンビンの精製方法。 - 【請求項９】 上記カルシウム塩が、塩化カルシウム、
水酸化カルシウムおよび酢酸カルシウムより選択される
請求項５から請求項８のいずれかに記載のプロトロンビ
ンの精製方法。 - 【請求項１０】 請求項１から請求項９のいずれかに記
載の精製方法に基づく工程を含むことを特徴とするプロ
トロンビン及び／もしくはトロンビンの製造方法。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の製造方法により得ら
れるプロトロンビン及び／もしくはトロンビン組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8326140A JPH10150980A (ja) | 1996-11-20 | 1996-11-20 | プロトロンビンの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8326140A JPH10150980A (ja) | 1996-11-20 | 1996-11-20 | プロトロンビンの精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10150980A true JPH10150980A (ja) | 1998-06-09 |
Family
ID=18184506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8326140A Pending JPH10150980A (ja) | 1996-11-20 | 1996-11-20 | プロトロンビンの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10150980A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010254606A (ja) * | 2009-04-23 | 2010-11-11 | Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd | トロンビン溶液の調製方法 |
| JP2013525411A (ja) * | 2010-04-29 | 2013-06-20 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | 陰イオン交換樹脂を用いる二価カチオン結合タンパク質の精製方法 |
| WO2016135719A1 (en) * | 2015-02-25 | 2016-09-01 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Method for purifying and quantifying thrombin and its degradation polypeptides |
| CN109593747A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-04-09 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法 |
| CN119709710A (zh) * | 2024-12-27 | 2025-03-28 | 广东双林生物制药有限公司 | 一种凝血酶原的纯化及激活方法 |
-
1996
- 1996-11-20 JP JP8326140A patent/JPH10150980A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010254606A (ja) * | 2009-04-23 | 2010-11-11 | Asahi Kasei Kuraray Medical Co Ltd | トロンビン溶液の調製方法 |
| JP2013525411A (ja) * | 2010-04-29 | 2013-06-20 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド | 陰イオン交換樹脂を用いる二価カチオン結合タンパク質の精製方法 |
| WO2016135719A1 (en) * | 2015-02-25 | 2016-09-01 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Method for purifying and quantifying thrombin and its degradation polypeptides |
| US10066224B2 (en) | 2015-02-25 | 2018-09-04 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Method for purifying and quantifying thrombin and its degradation polypeptides |
| US11008560B2 (en) | 2015-02-25 | 2021-05-18 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Method for purifying and quantifying thrombin and its degradation polypeptides |
| US11149263B2 (en) | 2015-02-25 | 2021-10-19 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Method for purifying and quantifying thrombin and its degradation polypeptides |
| US12351843B2 (en) | 2015-02-25 | 2025-07-08 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Method for purifying and quantifying thrombin and its degradation polypeptides |
| CN109593747A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-04-09 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法 |
| CN109593747B (zh) * | 2018-12-25 | 2021-08-10 | 山东泰邦生物制品有限公司 | 一种人凝血酶原复合物中间产品液态保存的方法 |
| CN119709710A (zh) * | 2024-12-27 | 2025-03-28 | 广东双林生物制药有限公司 | 一种凝血酶原的纯化及激活方法 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060117 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060606 |